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ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ISSN 1984-4433
Resumen
Se describen diversas caractersticas qumicas de las fragancias florales y se presentan ejemplos de
aplicacin de los mtodos de espacio de cabeza, destilativos y extractivos ms usados comnmente
para el aislamiento de estas mezclas de compuestos orgnicos voltiles cuya concentracin vara entre
picogramos y microgramos por litro. Para el anlisis GC-MS de las fragancias florales se presentan
recomendaciones sobre su separacin, deteccin e identificacin, acompaadas de ejemplos.
Palabras clave
Fragancia floral; microextraccin en fase slida; cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas;
compuestos orgnicos voltiles.
1 Introduccin
Uno de los campos de estudio de productos
naturales comprende un rea muy interesante: la
obtencin y el anlisis de las fragancias florales,
que pueden ser monitoreadas tanto in vivo, como
ex vivo[1]. El estudio de metabolitos secundarios
voltiles, que emanan las flores, es importante en
muchas reas de las ciencias biolgicas y qumicas, en agricultura, para el control de plagas, en
el estudio de interacciones planta-insecto, alelopata, en ciencias analticas (preparacin de
muestras y cromatografa), en industrias farmacutica, de perfumes y cosmtica, sabores y fragancias, entre otras. El inters creciente en este
campo de investigacin se refleja en que en los
ltimos 20 aos, el nmero de artculos cientficos publicados por ao sobre el tema, creci de 7
(1993) a 158 (2012)[2].
Las fragancias florales son mezclas complejas, producto del metabolismo de una planta en
florecimiento; estn compuestas por centenares
de molculas de diferente origen bioqumico, con
distintas caractersticas fsico-qumicas (polaridad, volatilidad, solubilidad); contienen diversos
grupos funcionales (hidrocarburos, alcoholes,
aldehdos, cetonas, cidos, steres, etc.) y pueden
encontrarse en concentraciones muy dismiles
(desde partes por trilln, ppt, hasta partes por
milln, ppm). Son sustancias predominantemente lipoflicas, con peso molecular menor de
300 Da, apolares o medianamente polares, con
presin de vapor alta. La nariz humana puede
ser ms sensible -que un sistema de deteccin
cromatogrfico-, a algunas sustancias de fragancia floral, presentes a nivel de trazas; por ello,
es necesario llevar a cabo el proceso de extraccin y concentracin de la fragancia floral de tal
manera, que sus componentes sean detectablesy
puedan ser identificados. Esto constituye un reto
analtico muy grande. Hoy en da, este reto se
resuelve aplicando diferentes estrategias: tcnicas
8
3 Mtodos de obtencin de
fragancias florales
Antes de proceder a recolectar los voltiles
de flores, es importante establecer si su monitoreo se har in vivo (en el campo) o ex vivo. El
montaje experimental para cada propsito ser
diferente. Algunas tcnicas de extraccin no son
aplicables en el campo para monitoreo de flores
in vivo. Es importante tambin tener conocimiento previo sobre la cantidad de voltiles que
emite la flor, ya que de la cantidad depender el
sistema de extraccin y concentracin empleado.
El buqu de sustancias voltiles producidas por
las flores puede tener de uno a ms de cien compuestos, pero, generalmente, contiene de 20 a 60
sustancias diferentes[1]. La cantidad de voltiles
emitidos va desde los niveles bajos de picogramos hasta ms de 30 g/L[8]. Algunos mtodos de
recoleccin de voltiles florales pueden tener un
diseo automatizado que permite el monitoreo
durante 24 horas o por periodos ms largos. Sin
embargo, la mayora de las tcnicas de extraccin
hacen una captura momentnea, un snapshot,
de los voltiles florales emitidos[9,10].
Los mtodos de extraccin de los metabolitos secundarios voltiles de las flores se pueden dividir en tres categoras grandes, a saber:
(I) Tcnicas de headspace (headspace, HS, por
sus siglas en ingls, o espacio de cabeza) en
modos esttico o dinmico; (II) Tcnicas destilativas, entre ellas, destilacin por arrastre con
vapor, destilacin con agua-vapor, hidrodestilacin, hidrodestilacin asistida por la radiacin
4 Anlisis cromatogrfico de
fragancias florales
Las sustancias que conforman la fraccin
voltil aislada de las flores son de bajo peso
molecular (<300 Da) y conforman mezclas de
componentes con diversa polaridad y concentracin; gracias a la naturaleza de los compuestos
voltiles, su anlisis se hace por cromatografa de
gases (GC). Debido a la complejidad de algunas
Scientia Chromatographica 2013; 5(1):7-25
2Metil propanal
2-Propenal
2-Butenal
2-Metil butanal
3-Metil butanal
2-Pentenal
Hexanal
2-Hexenal
Heptanal
2-Heptenal
Octanal
Octenal
(E)-2-Octenal
Nonanal
2-Nonenal
Decanal
(E)-2-Decenal
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Propanal
Aldehdos
Compuestos
Hedychium
coronarium
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Tabla1 Compuestos aislados por HS-SPME y detectados por GC-MS en emisiones de flores de diferentes plantas.
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
14
2-Metil propanol
3-Pentanona
Penten-3-ona
2-Metil-butan-1-ol
6-Metil-5-hepten-2-ona
2-Butanona
Acetato de 2-metilbutilo
Acetato de 2-pentenilo
Acetato de pentilo
Acetato de 3-hexenilo
Acetato de hexilo
Acetato de heptilo
Acetato de octilo
Acetato de decilo
Acetato de decenilo
Acetato de dodecilo
Acetato de dodecenilo
1-Hexanol
2-Hexanol
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Hedychium
coronarium
Propanol
Compuestos
Tabla1 Continuacin...
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
Heptanol
Octanol
Nonanol
Decanol
Dodecanol
Tridecanol
Pentadecanol
Dimetil sulfuro
+
+
+
+
+
+
+
2-Metil-butinitrilo
1-Nitro-2-metilbutano
(Z)-2-Metilbutilaldoxima
(E)-2-Metilbutilaldoxima
(Z)-3-Metilbutilaldoxima
(E)-3-Metilbutilaldoxima
Indol
Fenilacetonitrilo
Compuestos nitrogenados
1-Octen-3-ol
Compuestos azufrados
(Z)-3-Hexen-1-ol
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Hedychium
coronarium
3-Hexanol
Compuestos
Tabla1 Continuacin...
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
16
+
+
+
+
(E)-b-Ocimeno
allo-Ocimeno
Hidrato de (E)-sabineno
-Terpineno
Terpinoleno
Carvona
Linalol
(Z)-xido de linalol
xido de nerol
Limoneno
(Z)-b-Ocimeno
b-Mirceno
b-Pineno
Sabineno
1,8-Cineol
-Pineno
p-Cimeno
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Hedychium
coronarium
-Tuyeno
Monoterpenoides
Antranilato de metilo
Compuestos
Tabla1 Continuacin...
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
+
+
Terpinen-4-ol
-Terpineol
Neral
Nerol
Geranial
Geraniol
3,7-Dimetil-3,6-octadien-1-ol
p-Cimen-1-ol
Acetato de nerilo
+
+
(E)-b-Cariofileno
xido de cariofileno
-Humuleno
(E,E)--Farneseno
(E,E)-Farnesol
Acetato de farnesilo
Sesquiterpenoides
Citronelal
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Hedychium
coronarium
Citronelol
Compuestos
Tabla1 Continuacin...
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
18
Biciclogermacreno
+
+
+
+
+
+
Benzaldehdo
4-Metoxi benzaldehdo
Alcohol benclico
Alcohol b-feniletlico
Fenilacetaldehdo
Benzoato de metilo
Benzoato de etilo
Acetato de bencilo
Acetato de cinamilo
Salicilato de metilo
Salicilato de bencilo
Eugenol
Metil eugenol
Metil isoeugenol
Benzoato de 3-metilbutilo
Benzoato de 3-hexenilo
Benzoato de bencilo
Bencenoides y fenilpropanoides
Germacreno D
Amrica Central
India, Nepal
Rubicea
Posoqueria
longiflora
Zingibercea
Hedychium
coronarium
Farnesal
Compuestos
Tabla1 Continuacin...
Sanseviera
guineensis
Asparagcea
Yemen, Etiopa
frica Occidental
Origen geogrfico
Rubicea
Familia botnica
Coffea
arabica
Mxico
Asparagcea
Polianthes
tuberosa
Solancea
Brugmansia
suaveolens
mezclas de voltiles aislados de flores y a la presencia en ellas de sustancias isomricas (isomera geomtrica, de posicin, estereoisomera), se
recomienda hacer su anlisis en columnas capilares de slice fundida, preferiblemente largas, de
50 o 60 m, con dimetros internos (D.I.) de 0.25,
0.22 o 0.20 mm. Los dimetros internos menores, aunque permiten aumentar la resolucin,
eventualmente, pueden comprometer tambin la
sensibilidad. Se usan columnas con el grosor de
la fase estacionaria (df) igual o mayor de 0.25 m,
todo ello, para que la forma de picos, su separacin y la sensibilidad, necesaria para su deteccin reproducible, sean adecuadas.
Generalmente, para la inyeccin de la muestra (T del inyector, usualmente, de 230-250C),
se puede usar la relacin de split de 1:30, pero,
cuando las concentraciones de algunos componentes de inters son bajas, es conveniente la
inyeccin en modo splitless. Cuando se emplea
el modo de inyeccin splitless, para disminuir la
dispersin o el ensanchamiento de los picos de
sustancias muy voltiles, se puede hacer la inyeccin en el modo de splitless pulsado; es cuando la
presin de entrada del gas de arrastre, durante la
transferencia de la muestra por el liner, se incrementa unas 2-3 veces. Teniendo en cuenta la
presencia de algunas sustancias termolbiles, la
inyeccin on-column o con la programacin de
temperatura (con PTV, programmed-temperature
vaporizer, por sus siglas en ingls), podra ser
una buena alternativa.
Para el anlisis de las fracciones voltiles, la
temperatura inicial de la columna de 35-50C
sera la recomendable; la naturaleza de la muestra
(compuestos voltiles) no exige que la temperatura final de la columna sea alta, la de 200-250C
ser suficiente para eluir los componentes ms
retenidos. La velocidad de calentamiento de la
columna es funcin de su longitud: a mayor longitud, ms lentamente hay que calentar la colu-
Figura3 Cromatogramas tpicos de la fragancia de flores de caf aislada por HS-SPME (CAR/PDMS, 65 m;
60C, tiempo de exposicin de la fibra30 min). A. Columna cromatogrfica apolar DB-5MS (60 m x 0.25 mm
x 0.25 mm). Detector selectivo de masas (MSD, EI, 70 eV); B. Fragmento ampliado del mismo cromatograma,
donde se observa la separacin deficiente de limoneno (LRI=1030), alcohol benclico (LRI=1031) y 1,8-cineol
(LRI=1032); C. Columna cromatogrfica polar DB-WAX (60 m x 0.25 mm x 0.25 m). Detector selectivo de
masas (MSD, EI, 70 eV); D. Fragmento ampliado del mismo cromatograma, donde se observa la separacin
mejor de limoneno y 1,8-cineol; el alcohol benclico tiene un tiempo de retencin mucho ms largo (tR =34.1
min, LRI=1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno, tal como sucede en la columna apolar (B).
Figura4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI, 70 eV) de los sesquiterpenos isomricos, b-cariofileno
y -humuleno, que presentan patrones de fragmentacin claramente distinguibles [Tomado de: NIST Chemistry
WebBook, NIST Standard Reference Database Number 69, http://webbook.nist.gov]. Sus ndices de retencin
lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares, e.g., DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5
[5%-fenil poli(metilsiloxano)][31,34], lo que ayuda a diferenciarlos por su retencin en la columna, apolar o polar.
Figura5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI, 70 eV) de safrol e isosafrol, que presentan patrones
de fragmentacin muy similares [tomado de: NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database
Number 69, http://webbook.nist.gov], que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas.
22
Agradecimientos
Los autores agradecen la financiacin
del Patrimonio Autnomo Fondo Nacional de
Financiamiento para la Ciencia, la Tecnologa y
la Innovacin, Francisco Jos de Caldas, contrato
RC 0572-2012. Tambin agradecen a Martha
Cervantes, M.Sc., por su colaboracin con bsquedas bibliogrficas.
Referencias
1
compositional variation of the essential oil of ylangylang (Cananga odorata Hook Fil. Et Thomson, forma
genuina) during flower development. Journal of High
Resolution Chromatography1995;18:101-104.
19 Stashenko EE, Quiroz N, Martnez JR. HRGC/FID/
NPD and HRGC/MSD study of Colombian ylangylang (Cananga odorata) oils obtained by different
extraction techniques. Journal of High Resolution
24
35 Pherobase.
Database
Semiochemicals.
of
Pheromones
Available
from:
and
http://www.
pherobase.com.
2013;
18:1783-1797.
http://dx.doi.
org/10.3390/molecules18021783