Estructura de un aminoácido

Grupo carboxilo
Grupo amino (disociado)
(protonado)
-
COO
+
H3N C H
R
Carbono a
Cadena
lateral
 Estructuras a diferente pH

I II III
COOH COO- COO-
H 3N + + -

‡ˆ ˆ Hˆ + ˆ †ˆ
OH
C H H+
‡ˆ ˆ OH
ˆ -ˆ †ˆ H 3N C H H 2N C H
CH3 CH3 CH3
Forma aniónica a valores de pH
Forma catiónica a valores de pH Superiores al punto isoeléctrico
Forma de sal interna en el punto
Inferiores al punto isoeléctrico Carga neta = -1
Isoelétctrico
Carga meta = +1 Carga neta = 0
La forma dipolar, en un medio
ácido, capta protones y se
comporta como una base y en
un medio básico libera protones
y se comporta como un ácido.

El pH en el cual el aminoácido
tiende a adoptar una forma
dipolar neutra, con tantas
cargas positivas como
negativas, se denomina punto
isoeléctrico.

El carácter anfótero de los

aminoácidos permite la
regulación del pH, ya que se
comporta como un ácido o
como una base según le
convenga al organismo. 4
La forma dipolar, en un medio
ácido, capta protones y se
comporta como una base y en
un medio básico libera protones
y se comporta como un ácido.

El pH en el cual el aminoácido
tiende a adoptar una forma
dipolar neutra, con tantas
cargas positivas como
negativas, se denomina punto
isoeléctrico.

El carácter anfótero de los

aminoácidos permite la
regulación del pH, ya que se
comporta como un ácido o
como una base según le
convenga al organismo. 5
 Aminoácidos alifáticos o neutros, 1

Glicina Alanina Valina

Gly, G Ala, A Val, V
COO- COO - COO-
H3N+ C H H 3N +
C H H 3N + C H
H CH3 CH
H 3C CH3
 ALIFÁTICOS

NO POLARES

AROMÁTICOS

POLARES SIN CARGA

aa CON GRUPOS ÁCIDOS

POLARES CON CARGA

CON N BÁSICO

7
 Clasificación de
aminoácidos

Hidrófobos

Según la Hidrófilos
polaridad del
radical Ácidos

Básicos
Aminoácidos
Ácidos

Alifáticos Básicos
Según la
estructura del Aromáticos Neutros
radical
Heterocíclicos

8
Clasificación de
aminoácidos
1. Aminoácidos alifáticos. Son los aminoácidos en los
que el radical R es una cadena hidrocarbonada
abierta, que puede tener, además, grupos —COOH y
—NH2. Los aminoácidos alifáticos se clasifican en
neutros, ácidos y básicos.
1. Neutros. Si el radical R no posee grupos
carboxilo ni amino.
2. Ácidos. Si el radical R presenta grupos
carboxilo, pero no amino.
3. Básicos. Si el radical R tiene grupos amino,
pero no grupos carboxilo
2. Aminoácidos aromáticos. Son aquellos cuyo radical
R es una cadena cerrada, generalmente relacionada
con el benceno.
3. Aminoácidos heterocíclicos. Aquellos cuyo radical R
es una cadena cerrada, generalmente compleja y con
algunos átomos distintos del carbono y del hidrógeno. 9
10
 α-AMINOÁCIDOS (AA):
estructura
• Unidad estructural básica de
las proteínas
• El grupo amino está unido al
C- α , el C contiguo al grupo
carboxilo.
α
• Al C- α también está unido un
H y una cadena lateral R.
• Se han descrito más de 100
AA pero sólo 20 de ellos
participan en la síntesis de
proteínas.
AMINOÁCIDOS:
estructura
• Los AA difieren entre sí
por el grupo R (grupo
sustitutivo).
• R: adjudican diferentes
propiedades a cada
uno de los AA y
determinan su función
biológica.
 Estructura de los aminoácidos
• Por su estructura, los AA se ionizan en solución acuosa de
manera que pueden funcionar como ácidos y como bases
(anfolíticos).

• La ionización de un AA depende del pH de la solución.

• Punto isoeléctrico: pH en el cual la molécula no tiene carga neta

 Nomenclatura de los AA
Alanina Ala A Leucina * Leu L

Arginina+ Arg R Lisina* Lys K

Asparragina Asn N Metionina* Met M

Ac. Asp D Fenilalanina* Phe F

Aspartico
Cisteina Cys C Prolina Pro P

Glutamina Gln Q Serina Ser S

Ac. Glu E Treonina* Thr T

glutamico
Triptofano* Trp W
Glicina Gly G
Tirosina Tyr Y
Histidina + His H
Valina* Val V
Isoleucina* Ile I

+: Esencial en la niñez Tres letras

*: Esencial durante toda la vida Una letra
AMINOÁCIDOS
Clasificación

Propiedades químicas de
las cadenas laterales

1. Cadenas alifáticas
2. Cadenas con hidroxilo o azufre
3. Aromáticos
4. Básicos
5. Ácidos y sus amidas
 Aminoácidos con cadenas laterales alifáticos

• El grupo R se extiende más y se hace más hidrófobo.

• Los aminoácidos hidrófobos se encuentran normalmente en el
interior de las moléculas proteicas.
 Aminoácidos con cadenas laterales
hidroxilo o azufre

• Cadenas laterales son débilmente polares

• Son en general más hidrófilos que sus análogos alifáticos
• La metionina es bastante hidrófoba
• Puede producirse una oxidación entre pares de cadenas
laterales de cisteína para formar un enlace disulfuro (cistina)
 Aminoácidos básicos
• Llevan grupos básicos en sus
cadenas laterales.
• Existen a valores de pH
próximos a la neutralidad
• La histidina es el menos básico
de los tres
• Son muy polares
• Suelen hallarse normalmente
en las superficies exteriores de
las proteínas Histidina
Lisina
Arginina
 Aminoácidos ácidos y sus
amidas
• Son los únicos aminoácidos que llevan cargas negativas a pH 7.
• Están acompañados por sus amidas, la asparagina y la glutamina.
- también son hidrófilos y tienden a encontrarse en la superficie de las
moléculas de proteína, en contacto con el agua.
 Aminoácidos aromáticos
• Presentan cadenas laterales aromáticas.
• La fenilalanina junto con los AA alifáticos (val, leu, ile), es
uno de los AA más hidrófobos.
• La tirosina y el triptófano también presentan un carácter
ligeramente hidrófobo
 FORMACIÓN DE PÉPTIDOS Y
POLIPÉPTIDOS
• Los AA se unen o polimerizan por medio de
enlaces peptídicos: la unión química entre el grupo
α-carboxilo de un AA con el grupo α-amino de otro
AA, con la liberación de una molécula de agua.
• La reacción más importante de los AA es la
formación de un enlace peptídico. Éste enlace
carece de carga a cualquier pH de interés
fisiológico.
• Es un enlace covalente por formación de un enlace
amida
Enlace peptídico y formación de péptidos

DIPEPTIDO
 PÉPTIDOS Y POLIPÉPTIDOS
• Las cadenas que contienen unos pocos residuos
de AA se denominan oligopéptidos:
- 2 AA dipéptido
- 3 AA tripéptido…
• Si la cadena es muy larga se llama polipéptido.
• Grupo amino que no ha reaccionado en un
extremo (amino terminal o N-terminal)
• Grupo carboxilo sin reaccionar en el otro
extremo (carboxilo terminal o C-terminal)
 Enlace peptídico y formación de péptidos

TETRAPEPTIDO

Cada vez que se añade un AA a la cadena, debe

eliminarse una molécula de agua.
 Actividad biológica:
Péptidos
1. Péptidos vasoactivos: angiotensina II,
bradicinina
2. Hormonas: oxitocina, vasopresina,
somatostatina, TRH, GRH, ACTH,
insulina, glucagón, gastrina, secretina,
colecistoquinina, VIP (péptido intestinal
vasoactivo)
3. Neurotransmisores: encefalinas, sustancia
P
 Péptidos y oligopéptidos de interés biológico
Existen algunos péptidos cortos con función
biológica.

Entre ellos podemos citar:

• El tripéptido glutatión (que actúa como

transportador de hidrógeno en algunas
reacciones metabólicas).

• Los nanopéptidos oxitocina y vasopresina (con

actividad hormonal), la insulina y el glucagón
que regulan la concentración de glucosa en
sangre.

26
 Aminoácidos aromáticos
COO- COO- COO-
H 3N + C H
H 3N + C H Fenilalanina Tirosina H 3N + C H
CH2 Tyr, Y Triptófano
CH2 Phe, F CH2 Trp, W

NH
OH
Fenilalanina
• Función: Interviene en la producción del
Colágeno, fundamentalmente en la
estructura de la piel y el tejido conectivo, y
también en la formación de diversas
neurohormonas.
Tirosina
• Función: Es un neurotransmisor directo y
puede ser muy eficaz en el tratamiento de la
depresión, en combinación con otros
aminoácidos necesarios.
Triptófano
• Función: Está implicado en el crecimiento y
en la producción hormonal, especialmente
en la función de las glándulas de secreción
adrenal. También interviene en la síntesis de
la serotonina, neurohormona involucrada en
la relajación y el sueño.
 Hidroxiaminoácidos

COO- Serina
H 3N + C H Ser, S
CH2OH

COO-
H3N+ C H Treonina
Thr, T
H C OH
CH3
Serina
• Función: Junto con algunos aminoácidos
mencionados, interviene en la
desintoxicación del organismo, crecimiento
muscular, y metabolismo de grasas y ácidos
grasos.
Treonina
• Función: Junto con la con la L-Metionina y
el ácido L- Aspártico ayuda al hígado en sus
funciones generales de desintoxicación.
 Tioaminoácidos

COO-
+
Cisteína
H 3N C H Cys, C
CH2
SH
COO-
H 3N + C H
CH2 Metionina
Met, M
CH2
S
CH3
Cisteina
• Función: Junto con la L- cistina, la L-
Cisteina está implicada en la
desintoxicación, principalmente como
antagonista de los radicales libres. También
contribuye a mantener la salud de los
cabellos por su elevado contenido de azufre.
Metionina
• Función: Colabora en la síntesis de
proteínas y previene distrofia muscular,
artrosis, antioxidante.
Aminas secundarias (“Iminoácidos”)

-
COO
+
NH2
Prolina
Pro, P
Prolina
• Función: Está involucrada también en la
producción de colágeno y tiene gran
importancia en la reparación y
mantenimiento del músculo y huesos.
 Aminoácidos dicarboxílicos y amidas

COO-
H 3N + C H Ác.Aspártico
CH2 Asp, P
COO-

COO-
H3N+ C H Asparragina
CH2 Asn, N
CONH2
 COO- COO-
H 3N + C H H 3N + C H
CH2 CH2
CH2 CH2
COO- CONH2

Ác.Glutámico Glutamina
Glu, E Gln, Q
 Ácido Aspártico
Acido Aspártico
• Función: Es muy importante para la
desintoxicación del hígado y su correcto
funcionamiento.
• Se combina con otros aminoácidos
formando moléculas capaces de absorber
toxinas del torrente sanguíneo.
Asparagina
• Función: Interviene específicamente en los
procesos metabólicos del Sistema Nervioso
Central (SNC).
Acido Glutámico
• Función: Tiene gran importancia en el
funcionamiento del Sistema Nervioso
Central y actúa como estimulante del
sistema inmunologico.
Glutamina
• Función: Nutriente cerebral e interviene
específicamente en la utilización de la
glucosa por el cerebro.
 Aminoácidos dicarboxílicos y sus amidas

• Todos ellos son importantísimos

intermediarios en elmetabolismo
nitrogenado, sobre todo ácido glutámico y
glutamina
• Forman parte del centro activo de las
glicosidasas y de las serin enzimas.
• Proveen a la proteína de superficies aniónicas
que sirven para fijar cationes (p.e., Ca++)
 Aminoácidos dibásicos

COO - COO-
H 3N + H3N+ C H COO-
C H
CH2 Lisina CH2 Arginina H3N+ C H
Histidina
Lys, K CH2 Arg, R CH2 His, H
CH2
CH2 CH2
CH2 NH NH+
+
+ H 2N C HN
NH3
NH2
Lisina
• Función: Es uno de los más importantes
aminoácidos porque, en asociación con
varios aminoácidos más, interviene en
diversas funciones, incluyendo el
crecimiento, reparación de tejidos,
anticuerpos del sistema inmunológico y
síntesis de hormonas.
Arginina
• Función: Está implicada en la conservación
del equilibrio de nitrógeno y de dióxido de
carbono. También tiene una gran
importancia en la producción de la
Hormona del Crecimiento, directamente
involucrada en el crecimiento de los tejidos
y músculos y en el mantenimiento y
reparación del sistema inmunologico.
Histidina
• Función: En combinación con la hormona
de crecimiento (HGH) y algunos
aminoácidos asociados, contribuyen al
crecimiento y reparación de los tejidos con
un papel específicamente relacionado con el
sistema cardio-vascular.
 Aminoácidos Esenciales
• Los aminoácidos se clasifican como esenciales y
no esenciales en la dieta humana; son
aminoácidos esenciales aquellos que se requieren
en la dieta ya que no se pueden biosintetizar. Los
ocho aminoácidos esenciales son:
isoleucina leucina

lisina metionina

fenilalanina treonina

triptófano valina

Histidina sólo en niños

PROPIEDADES DE LOS
AMINOÁCIDOS

51
PROPIEDADES ÁCIDO-BASE
-COOH pK1 -COO- + H+
ÁCIDO

pK2
-NH2 + H+ -NH3+
BASE

pK1 pK2

ZWITTERIÓN

52
 Punto isoeléctrico
• A pH ácido: prevalece la especie con carga
+
• A pH básico: prevalece la especie con carga
–
• Hay un valor de pH para el cuál la carga de
la especie es cero. (zwitterión)
Punto isoeléctrico: valor de pH al
cuál la carga neta del aminoácido es cero.

53
 Propiedades químicas

• Formación de enlaces PEPTÍDICOS:

54
 Enlace Disulfuro
H O H O
N C N C
N HC HC C
CH2 CH2
SH SH

O C N H
C CH2 S S CH2 C
H N C O

N C
 PROTEÍNAS

FUNCIONES
Respuesta
Inmunitaria
Coagulación
sanguínea
 Concepto de proteínas
• La palabra proteína viene del griego protos que significa "lo más
antiguo, lo primero”.
• Las proteínas son biopolímeros (macromoléculas orgánicas) de
elevado peso molecular; compuestos químicos muy complejos que se
encuentran en todas las células vivas.
• Hay ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los
diversos tipos de proteínas los contienen en diferentes cantidades.
• Están constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H),
oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre
(S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu),
magnesio (Mg), yodo (Y).

57
 Clasificación de las proteínas

• Desde un punto de vista químico, existen dos grandes grupos

de proteínas:
1. Proteínas simples: formadas exclusivamente por a-
aminoácidos, como es el caso de la ubiquitina, una proteasa
intracelular formada por 53 AA.
2. Proteínas conjugadas: que contienen además de la cadena
polipeptídica un componente no aminoacídico llamado grupo
prostético, que puede ser un azúcar, un lípido, un ácido
nucleico o simplemente un ión inorgánico.
• La proteína en ausencia de su grupo prostético no es funcional,
y se llama apoproteína.
• La proteína unida a su grupo prostético es funcional, y se llama
holoproteína (holoproteína = apoproteína + grupo prostético).
• Son proteínas conjugadas la hemoglobina, la mioglobina, los
citocromos, etc.
 SIMPLES

Por su naturaleza química CONJUGADAS

FIBROSA
CLASIFICACIÓN DE LAS
Por la forma que adopta GLOBULAR
PROTEINAS

ENZIMAS

PROTEÍNASDE
TRANSPORTE
CONTRÁCTILES Y

Por su función Biológica MÓTILES

DE DEFENSA

REGULADORAS

NUTRIENTES

HORMONAS
59
 Clasificación

• En cuanto a su forma molecular, podemos distinguir:

1. Proteínas globulares: la cadena polipeptídica aparece enrollada
sobre sí misma dando lugar a una estructura más o menos
esférica y compacta. Ejem: Mioglobina y Hemoglobina
2. Proteínas fibrosas: tienen funciones estructurales.
• Proteínas de: piel, tejido conjuntivo, pelo y seda.
• Son siempre alargadas
• Son menos abundantes que las globulares
• Ejem: queratina, colágeno, elastina, fibroina
Niveles de organización estructural de las proteínas

Estructura 1`
(secuencia de AA)

Estructura 2` Estructura 4
Plegado de la Asociación de
cadena polipéptica varias cadenas
(local) polipeptídicas
Estructura 3`
Nivel de plegado superior
(global)
Estructura secundaria

• Se encuentran con > frecuencia son

la hélice α, la lamina β
 Estructura primaria

La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos

de la proteína.

Nos indica qué aminoácidos componen la cadena

polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se
encuentran.

La secuencia de una proteína se escribe enumerando

los aminoácidos desde el extremo N-terminal hasta el
C-terminal.

63
Estructura primaria

64
 ESTRUCTURA
SECUNDARIA
• Interacciónes entre aa que se encuentran
próximos en la cadena.
• La cadena no es lineal, adopta formas en el
espacio.
• Los aa interaccionan por puentes H.
• Tipos de estructuras secundarias:
• HÉLICE ALFA
• HOJA PLEGADA BETA
• AL AZAR.
65
Estructura secundaria

La estructura secundaria es la disposición de la

secuencia de aminoácidos o estructura primaria en el
espacio.

Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados

durante la síntesis de las proteínas, y gracias a la
capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una
disposición espacial estable, la estructura secundaria.

Son conocidos tres tipos de estructura secundaria: la

α-hélice, la hélice de colágeno y la conformación β o
lámina plegada β. La estructura secundaria de la
cadena polipeptídica depende de los aminoácidos que
la forman.
66
Estructura 2ª.
• Son rearreglos especiales originados por el
establecimiento de puentes de H entre los
grupos que conforman los enlaces peptídicos de
los AA cercanos.
• alfa hélice: es un ordenamiento helicoidal en el
que el g. R de los AA se orienta hacia el exterior
de la hélice.
- Se estabiliza por la formación de puentes de H
entre los componentes del enlace peptídico de
AA cercanos en la estructura 1ª. de la proteína.
- Ejem: proteínas fibrosas: colágeno, alfa
queratina.

• β laminar:
- El esqueleto se ordena en forma de zigzag.
- Los grupos R de AA se orientan en direcciones
opuestas con un patrón alternante y hacia afuera
- se estabiliza por puentes de H.
- Típica de proteínas fibrosas: fibroina (seda)
 α-
hélice
 La estructura secundaria en α-hélice se forma al
enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la
estructura primaria.

 Esto se debe a la formación espontánea de enlaces

de hidrógeno entre el —CO— de un aminoácido y el
—NH— del cuarto aminoácido que le sigue.

 En la α-hélice, los oxígenos de todos los grupos —

CO— quedan orientados en el mismo sentido, y los
hidrógenos de todos los grupos —NH— quedan
orientados justo en el sentido contrario.

 La α-hélice presenta 3,6 aminoácidos por vuelta y la

68
rotación es hacia la derecha.
Conformación-β

• Los aminoácidos forman una cadena en forma de zigzag.

• existen enlaces de hidrógeno intercatenarios, en los que

participan todos los enlaces peptídicos, dando una gran
estabilidad a la estructura.

• Las dos cadenas se pueden unir de dos formas distintas; paralela

y antiparalela. Esta última es un poco mas compacta y aparece
con mayor frecuencia en las proteínas.

• Si la cadena con conformación β se repliega sobre si misma, se

pueden establecer puentes de hidrógeno entre segmentos, antes
distantes, que ahora han quedado próximos. Esto da lugar a una
lámina en zigzag muy estable denominada β-lámina plegada.
Esta estructura también se puede formar entre dos o mas cadenas
polipeptídicas diferentes.
69
 ESTRUCTURA
TERCIARIA
• Las proteínas globulares no solo
poseen estructuras 2ª. sino que,
además, también se pliegan
formando estructuras terciarias
compactas.
• Es una modificación en el espacio.
• Es el plegamiento tridimensional
total de la cadena de una proteína.
• Esta conformación facilita la
solubilidad en agua y, por ende, la
realización de funciones de
transporte, enzimáticas, hormonales,
etc. Ejem: mioglobina
 Estructuras de las proteínas globulares

• La mayoría de las proteínas

están formadas por más de un
dominio;
• Dominio: región compacta,
plegada localmente, de la
estructura 3ª.
• Los principales patrones de
plegado:
1. Los producidos alrededor de un
empaquetamiento de hélices alfa
2. Los construidos sobre un
entramado de estructuras
laminas beta
 ESTRUCTURA TERCIARIA
Esta conformación se mantiene estable gracias a la
existencia de enlaces entre los radicales R de los
aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:
• Los puentes de hidrógeno
• Interacciones de Van der Waals
• Los puentes eléctricos entre AA de carga diferente
llamados también “atracciones electrostáticas”
• Las interacciones hidrófobas formación de un núcleo
hidrofóbico o interface hidrofóbica
• El puente disulfuro
 Estructura 4ª.
• Es el nivel más complejo de
organización.
• Se refiere a interacciones no
covalentes que unen varias
cadenas polipeptídicas en una sola
molécula. Ejem: la hemoglobina
que tiene 4 cadenas.
• Cada una de estas cadenas
polipeptídicas recibe el nombre de
subunidades.
• El número de subunidades
(cadenas) varía desde dos como
en la hexoquinasa, cuatro como en
la hemoglobina, o muchos como la
cápsida del virus de la poliomielitis,
que consta de 60 unidades
proteicas.
 Niveles de estructura
proteica
Estructura cuaternaria
• Homotípicas: asociación de
cadenas polipeptídicas
idénticas o casi idénticas
• Heterotípicas:
interacciones entre
subunidades con estructuras
muy distintas
 Propiedades

• Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de

orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura
tridimensional fija
• La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:
1. Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la
viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión
2. Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos
del interior aparecen en la superficie
3. Pérdida de las propiedades biológicas

ESTADO ESTADO
NATIVO DESNATURALIZA
 DESNATURALIZACION
• Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína
se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes
físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos,
pH, fuerza iónica).
• Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es
reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva
mediante cambios en:
(1) la polaridad del disolvente
(2) la fuerza iónica
(3) el pH
(4) la temperatura
ANÁLISIS DE LAS
PROTEÍNAS
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
¿CON QUÉ MÉTODOS PUEDO CUANTIFICAR
PROTEÍNA?

Los métodos principales son:

UV 280
Biuret
Lowry
Bradford
LEY DE LAMBERT-BEER

la ley explica que hay una relación exponencial

entre la transmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración de la sustancia.
METODO UV

LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE

ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE POR LOS
RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA. YA QUE LAS
CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS
PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE
UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
VENTAJAS

•MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS

VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET)

•NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y

OTRAS SALES BUFFER

•MÉTODO NO DESTRUCTIVO

•UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA DE LAS

PROTEÍNAS
DESVENTAJAS

•LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA

REGIÓN DE 280nm

•EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS

DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS.

•LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA

TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS

•SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA

UTILIZAR ESTE MÉTODO
MÉTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y

sulfato de cobre (solución alcalina fuerte), el grupo amino de
las proteínas reacciona con los iones del cobre del reactivo
dando el color púrpura, la cantidad del color producido es
proporcional al número de enlaces peptídicos, y por lo tanto a la
cantidad de proteína.
VENTAJAS:

 RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30

MINUTOS)

 ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE

PROTEÍNAS

 NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE

COLOR

 POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN

CON LA REACCIÓN DE BIURET

 NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO

PEPTÍDICAS
DESVENTAJAS:

 NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE

LOWRY

 REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR

PRUEBA

 LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO

INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

 DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE

CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS
MÉTODO DE LOWRY

El método de Lowry es un método

colorimétrico de valoración
cuantitativa de las proteínas. A la
muestra se le añade un reactivo que
forma un complejo coloreado con las
proteínas, siendo la intensidad de
color proporcional a la concentración
de proteínas, según la ley de
Lambert-Beer.
1) Los iones Cu2+, se unen a las proteínas formando
complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+ proteína tienen un
color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento
de la estructura tridimensional de la proteína,
exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van
a participar en la segunda etapa de la reacción.

2) Se lleva acabo la reducción del reactivo de Folin-

Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de
tirosina presentes en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el
ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al
ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un
complejo de color azul intenso.
VENTAJAS

•MUY SENSIBLE
•MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA
•MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS
MÉTODOS
•RELATIVAMENTE SIMPLE
•SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS
DESVENTAJAS

•EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS

(MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET)

•EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE

PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNAS

•LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO,

MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

•LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES

REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y
COMPUESTOS CON SULFIDRILO INTERFIEREN
CON LA REACCION.
MÉTODO DE BRADFORD

EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE

ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE
TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MÁXIMO DE
ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A
595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm
ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNA EN LA MUESTRA.
VENTAJAS

• MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE

COMPLETAR EN 2 MINUTOS)

• REPRODUCIBLE

• SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE

LOWRY)

• NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO

K+, Na+, Y Mg+
DESVENTAJAS

•EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE

FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE
CUARZO

•EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE

PROTEÍNAS.

•LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE

SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADO

•INTERFERENCIA CON DETERGENTES.

 ¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR
PROTEÍNAS?

ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática

REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES:

Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con

ácidos nucleícos

Para la producción de anticuerpos

PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
ANTES DE EMPEZAR!!!!

4. Contar con un método adecuado para la

detección de la proteína de interés.

Monitorear el progreso de la purificación

a. Cuantificación de proteína total

a. Detectar específicamente la proteína de interés

Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es
lograr la concentración diferencial de una proteína o
molécula de interés
 Pasos a seguir en una purificación

1. Elegir la fuente (matriz biológica)

2. Definir un ensayo específico que identifique a la
proteína (actividad biológica) (específico, sensible,
rápido y barato)
3. Extraer la proteína de la fuente (proteínas
intraceluares o extracelulares)
4. Fraccionamiento del extracto crudo (seguimiento
de cada paso)
5. Determinar la pureza y calidad del producto final
 Métodos de Precipitación con sales, precipitación
Baja resolución con temperatura y pH

Métodos cromatográficos:
filtración en gel, intercambio iónico,
Métodos de afinidad
Alta
Resolución Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante
SDS-PAGE: una técnica utilizada ampliamente para monitorear
el progreso de una purificación
A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!!
1. Ya seleccionamos la muestra biológica (fuente)

¿Cuál es el primer paso?

 MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR
Algunos ejemplos son:
1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de
tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

Congelación-descongelación, macerado con

2. Destrucción mecánica
N2 líquido

3. Lisis con detergentes

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR
VARIAS PASOS

Al final de la práctica aprenderemos a

hacer e interpretar un
CUADRO DE PURIFICACIÓN
Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural
está expuesta a
muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.

¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

 UTILIZAR:
Soluciones amortiguadoras
Inhibidores de proteasas
Bajas temperaturas (4°C)

EVITAR
Altas temperaturas
Manipular demasiado la muestra

PROCURAR
que el proceso sea lo más corto posible.
Algunos agentes estabilizadores son:
Centrifugación
 CENTRIFUCACIÓN DIFERENCIAL
VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A
DIFERENTES VELOCIDADES
La centrifugación diferencial se basa en la existencia de
diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad
de la del medio.
Precipitación con sales
Sal más usada: Sulfato de Amonio
 Cromatografía
Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar dichos componentes.
Muestra
aplicada Eluyente

Volumen
de columna

Matriz

Tapón
poroso

Eluyente Proteínas separadas

Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se
empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la
columna.

Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la

columnaLongitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se
empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como
la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de
afinidad.

Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una

columna cromatográfica.

Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar

la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.
PRINCIPIO:
 Tamaño de partícula y masa molecular.
 Mayor masa molecular eluye primero
 El gel retiene particuas de menor masa
molecular
 FASE ESTACIONARIA
En esta práctica se utilizará el gel dextrano.

Tipo Peso molecular Agua retenida Volumen de gel

Límite de (g/g gel sec) hidratado (ml/g gel
fraccionamiento seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
Cromatografía de intercambio iónico
 Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada negativamente

Intercambio aniónico

Fase estacionaria cargada positivamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
 Factores que afectan a la retención

1. Fuerza Iónica

2. pH

3. Modificadores Orgánicos
Cromatografía de Afinidad
Utiliza la alta especificidad entre las
moléculas biológicas para separar
componentes específicos de mezclas
complejas.
VENTAJAS:
No hay restricción por volumen.
Especificidad
Pureza del producto final

DESVENTAJAS:
Precio (alto)
Condiciones de elución drásticas
Ligando específico no disponible o inadecuado
 Determinación de la concentración
de proteína

Métodos espectrofotométricos

Ventajas de la técnica
Rápida
Precisa
Versátil
Fácil de usar
Eficiente en costo
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
Método de Absorción No se pierden las muestras Interfieren compuestos que
absorben en el UV
MÉTODOS
COLORIMÉTRICOS
Biuret Específico para proteínas, Poca sensibilidad
muestra pocas 1 a 6 mg/mL
interferencias es barato
Lowry Tiene bastante sensibilidad No todas las proteínas
de 0,1-1 mg/mL. reaccionan igual. Muestra
interferencias con
detergentes no iónicos,
sulfato de amonio
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con
0,5 -1,4 mg/mL detergentes
 Tipos de Electroforesis

• PAGE Nativa
• PAGE SDS
• PAGE + condiciones reductoras
• Isoelectroenfoque
• Bidimensional
Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)

A PH = 8 - 9
 ELECTROFORESIS

La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se

encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico

Puede llevarse a cabo en:

Solución

Superficie hidratada de un soporte sólido (papel o acetato de celulosa)

Matriz porosa (en gel de poliacrilamida o agarosa)

Se puede controlar el tamaño del poro efecto de tamiz molecular

Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Desnaturaliza las proteínas

Confiere cargas negativas uniéndose en proporción al tamaño de la

proteína (una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, ~1.4 g
SDS/g proteína)

Polipéptidos distintos tienen migran solo según su peso molecular

la misma densidad de carga
 logPM
X
distancia X
que migró
la
proteína
X
X
X
distancia
que migró
el
colorante
Rf

Rf = distancia que migró la proteína

distancia que migró el colorante de referencia
Determinación de PM
 Dos consideraciones importantes
1. Para una concentración de gel dada, la relación lineal entre el logPM
y el Rf es lineal solo en un rango limitado de pesos moleculares

15 % acrilamida: 12000 – 45000 Da

10 % acrilamida: 15000 – 70000 Da
5 % acrilamida: 50000 – 200000 Da
2. En esta electroforesis la proteína está desnaturalizada, por lo tanto,
el peso molecular que se obtiene puede no ser el de la proteína nativa

Proteínas con estructura cuaternaria

(formadas por más de una subunidad)

¿ y si las subunidades están unidas por puentes disulfuro?

Agregamos un reductor como el 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT)

 PM (proteína nativa)
- 2-mercaptoetanol
Proteína a: 34 KDa

Proteína b: 140 KDa

b

a c d Proteína c: 64 KDa

Proteína d: 32 KDa
+ 2-mercaptoetanol

b c
a d
Isoelectroenfoque
 Isoelectroenfoque

Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos

electrodos
ánodo
El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos

Las proteínas migran hasta alcanzar un pH

igual a su punto isoeléctrico

Es muy útil para estudiar modificaciones

postraduccionales en proteínas, trabajar
con isoenzimas, etc

cátodo
 Electroforesis en dos dimensiones

Primera dimensión: isoelectroenfoque

Segunda dimensión : SDS-PAGE

Permite analizar mezclas más complejas como extractos

celulares, muestras de sangre, etc
Bidimensional