PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

Alvaro Rueda 4-772-1613 Bolvar Chen 4-773-587 Krisly Snchez 4-771-654

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina
BIOQUMICA
OBJETIVOS:
Determinar los pKa de un aminocido y utilizarlo como punto de referencia para determinar su
punto isoelctrico.
Establecer la importancia del punto isoelctrico de las protenas en el desarrollo de procesos
fisiolgicos en nuestro cuerpo.
Determinar el punto isoelctrico de una protena mediante la tcnica de precipitacin.
Determinar la importancia de algunos aminocidos y protenas como sustancias amortiguadoras.

MARCO TERICO:
Aunque la mayora de los grupos carboxilo y grupos amnicos de los aminocidos se bloquean cuando
estos se unen para formar las uniones peptdicas, siempre quedan libres algunos de estos grupos, ya
sea en los extremos de las cadenas polipeptdicas, o en las cadenas laterales de los aminocidos
cidos y bsicos. La disociacin de los grupos ionizables que estn presentes en las protenas, ocurre
como en el caso de los grupos ionizables de los aminocidos individuales, y es gobernada por el pH
del medio en el que se encuentra la protena. A pH 7,0 o en valores cercanos a esta condicin, que
son los habituales en la mayora de la clulas, los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico
se encuentran en sus formas bsicas cargadas negativamente, mientras que los aminocidos lisina y
arginina estn presentes en sus formas acdicas, cargadas positivamente. La contribucin de los grupos
sulfhdrico de la cistena y fenlico de la tirosina, es mnimo; por ejemplo el grupo fenlico de la tirosina
se encuentra ionizado en un 0,1 %. La carga total de la molcula proteica depende pues, del pH de la
solucin y del nmero relativo de cada aminocido en la molcula. As cuando el pH de la solucin es
tal que la carga neta de la molcula proteica es cero, es decir, cuando el nmero total de cargas
positivas presentes en la molcula iguala al nmero de cargas negativas, se llama a este valor de pH,
punto isoelctrico o pH isoelctrico de la protena. (Bioquimica, Antonio Pea, Limusa 2004)
MATERIALES
Descripcin
Bureta

Capacidad
25 mL

Cantidad
1

Soporte

Pinzas de bureta

Vasos qumicos

250y 500 mL

Pipeta

25 mL

Potencimetro de
pH

REACTIVOS
Descripcin Frmula

Concen
tracin
0.5%

Cantidad

Toxicidad

25 mL

No txica

cido
Glutmico

C5H504

Lisina

C6H14N2O2 0.5%

25 mL

cido
clorhdrico

HCl

2%

7 mL

Hidrxido de
sodio

NaOH

0.2 M

44 mL

50 mL

95%

50 mL

Leche

Etanol

C2H5OH

Propiedades fisicoqumicas

Pertenece al grupo de los llamados

aminocidos cidos, o con carga
negativa a pH fisiolgico, debido a
su segundo grupo carboxlico en su
cadena secundaria
No txica
Acta como neurotransmisor
inhibidor en el central. Utilizada -in
vitro- como medio gstrico, en
solucin 0.4M, amortiguada al pH
estomacal para determinar
bioaccesibilidad
Irritante,
Disolucin acuosa del gas cloruro de
provoca
hidrgeno (HCl). Es muy corrosivo y
quemaduras cido. Punto de ebullicin de 48C;
lquido incoloro o amarillento.
Irritante
Slido blanco cristalino sin olor que
absorbe humedad del aire.
Corrosivo, se usa para fabricar
jabones, rayn, papel, explosivos,
pinturas y productos de petrleo
No txica
Est compuesta principalmente por
agua, materia grasa, protenas,
hidratos de carbono (lactosa), calcio,
minerales y sal
Txico
Lquido incoloro, con punto de
ebullicin a 100C y punto de
congelacin de 0C.

PROCEDIMIENTO
1. TITULACIN DE AMINOCIDOS

Colocar 25 mL de
solucin de Lisina
en vaso quimico de
250 mL

Titular con NaOH al

2 M 1 mL cada vez.

Repetir el
procedimiento con
una solucin de
cido glutmico.

Graficar los
resultados.

Medir el pH con un
potenciometro hasta
alcanzar 10

2. DETERMINACIN DEL PH DE LA CESENA DE LA LECHE

Diluir 50 mL de
leche en 150 mL
de agua en un
vaso qumico de
500 mL

Titular con HCl

al 2% hasta
obtener un pH
de 4.8

RESULTADOS
1. Titulacin de aminocidos
1.1 Lisina
Volumen Norma
mEq=
NaOH
-lidad (v (mL))(N)
(mL)
0
0.2
0.00
1
0.2
0.20
2
0.2
0.40
3
0.2
0.60
4
0.2
0.80
5
0.2
1.00
6
0.2
1.20
7
0.2
1.40
8
0.2
1.60
9
0.2
1.80
10
0.2
2.00

pH

2.2
2.2
2.2
2.2
2.2
2.3
2.4
2.4
2.5
3.1
9.7

Graficar los
resultados.

1.2 Acido Glutmico

Volumen NormaNaOH
lidad
(mL)
0
0.2
1
0.2
2
0.2
3
0.2
4
0.2
5
0.2
6
0.2
7
0.2
8
0.2
9
0.2
10
0.2

mEq=
(v (mL))(N)

pH

0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00

3
3.4
3.5
3.9
4.2
4.4
4.7
5.1
8.1
9.3
9.9

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2

2.20
2.40
2.60
2.80
3.00
3.20
3.40
3.60
3.80
4.00
4.20

11.7
12.3
12.5
12.7
12.9
12.9
13.0
13.1
13.1
13.1
13.1

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0,2
0,2

pH vs mEq

pH vs mEq

14

14

12

12

10

10

pH

pH

10.4
10.8
11.5
12.2
12.5
12.8
12.9
12.9
13.0
13.0
13.0
13.1
13.1

2.20
2.40
2.60
2.80
3.00
3.20
3.40
3.60
3.80
4.00
4.20
4.40
4.60

8
6

0
0

mEq de NaOH

ACIDO GLUTMICO

mEq de NaOH

LISINA

ACIDO GLUTAMICO

LISINA
+

, + ,
=
= ,

= ,
+

+
=
=

=
=

. + ,
=
= .

= .
=

+
=
=

=
=

Determinacin de pI de la casena de la leche

HCl al 2% / Ml
pH
0

6.5

6.6

6.3

6.1

5.5

5.3

5.2

4.8

DISCUSION
Al graficar el pH obtenido al agregar cierto mEq de NaOH a un volumen de aminocido en este caso
lisina y acido glutmico, se puedo observar que ambas curvas iniciaban con un lento ascenso, seguido
por un rpido y un lento y estacionario ascenso finalmente. A pH bajos, todos los grupos del

aminocido estn en su forma protonada, de forma que la carga neta del aminocido es de signo
positivo. A pH altos estos mismos grupos se encuentran en forma de base conjugada, por lo que la
carga neta en este caso ser de signo negativo. Entre esta zona y la otra habr un pH en el que la
cantidad de carga negativa ser igual a la positiva; llamado punto isoelctrico o pH isoelctrico de la
protena, que es una contaste caracterstica de la misma. (Biomleculas, Enrique Battaner
Arias,2009). En base a esto podemos decir que la curva de lento crecimiento se debe a la capacidad
amortiguadora de ambos aminocidos. Al encontrarse en un pH acido los aminocidos tendrn una
carga positiva porque el grupo carboxilo es capaz de aceptar iones H, y el grupo amino queda cargado
positivamente. Al agregarse pequeas cantidades de base el grupo amino comienza a despotronarse
para unirse a los iones hidroxilo de la base agregada y el aminocido queda cargado negativamente.
El punto medio entre los dos puntos de rpido ascenso en la grfica representa el punto isoelctrico.
En este punto las cargas positivas y negativas del aminocido son iguales.
Los aminocidos que poseen grupos aminos o grupos carboxilos adicionales en sus molculas
presentan puntos isoelctricos que reflejan su tendencia a ser protonados o a perder un protn
adicional, respectivamente. La lisina tiene tres valores de pKa, pKa: 2,18 para el grupo carboxilo, 8,95
para el grupo alfa amino y 10,53 para el grupo amino del carbono 6, el grupo-amino.
El punto isoelctrico de la lisina es 9,74, el grupo -amino de la lisina es ms bsico que el grupo amino
en posicin alfa y que, por lo tanto, el zwterion de la lisina tiene protonado el grupo amino del carbono6,
la representacin de la variacin de concentracin de distintas formas de la lisina frente al pH muestra
de cruce ya que la forma completamente protonado de la lisina posee tres puntos que pueden perder
un protn y por lo tanto, tres valores de pKa. El punto isoelctrico de la lisina sugiere que este
aminocido debe poseer una carga neta positiva a pH 7, un pH similar al de las clulas. nicamente
cuando el pH de la solucin aumenta por encima de 9,74 la mayora de las molculas de lisina se
convertirn en la forma zwitterinica y no tendrn carga neta.
El cido glutmico posee un punto isoelctrico de 3,2. El grupo carboxlico en el carbono 4 es similar a
un grupo carboxlico aliftico y tiene un pKa de 4,25. El otro grupo carboxlico aliftico tiene un pKa de
2,19 y el grupo amino protonado un pKa de 9,67 (Qumica Orgnica: Estructura y Reactividad,
Volumen 2, Seyhan Ege, pg. 1201-1202)
En el cuadro de la determinacin del pI de la casena se aprecia las variaciones de pH de la casena a
medida que se le adicionaban 1,0 mL de HCl 2%. Partimos de un pH de 6.5; adicionamos 7 mL de, HCl
2% para que se diera la formacin de la casena llegando a un pH de 4.80. El pH en el que precipitan
las protenas de la leche (casena) es el punto isoelctrico (pI), en este caso nuestro valor de pI
(experimental) es de 4.80, consultando encontramos el valor de pI (terico) corresponde a 4.60 para
la leche, nuestro valor es muy cercano al terico, de diferencia solo tenemos 0.20. Este resultado
cercano se puede deber a posibles errores en la titulacin, o bien diferentes propiedades en la leche,
como la marca la cual pudo haber influido debido a que a veces no se conservan las mismas
concentraciones proteicas en las diferentes marcas de la leche, y tienden a variar un poco en la
CONCLUSIONES
El pKa es la fuerza que tienen las molculas de disociarse, un cido ser ms fuerte cuanto
menor es su pKa y en una base ocurre al revs, siendo ms fuerte cuanto mayor es su pKa..
Las curva de titulacin nos permiti determinar el pKa, y por medio de este, el punto isoelctrico
del aminocido lisina y acido glutmico. El conocer el comportamiento cido-base de los
aminocidos es de vital importancia para realizar este procedimiento.
El pH en el que precipitan las protenas se denomina punto isoelctrico (pI), ya que se
encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y
la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que la partculas se agregan
produciendo una menor solubilidad.
Mediante la titulacin con cido clorhdrico logramos alcanzar el punto isoelctrico de la casena
donde es menos solubles, en base a esa menor solubilidad, la casena se precipita y se puede
aislar, que en la experiencia el pl fue en un pH de 4.8, en este punto la casena se separa del
resto de los componentes de la muestra de leche formando un precipitado. Se utiliza alcohol

para el lavado posterior del precipitado de la protena obtenida, debido a que la casena es
insoluble en l alcohol y adems el alcohol remueve la grasa de la leche, eliminando las
impurezas del que pueda contener la muestra de casena.
BIBLIOGRAFIA
Antonio Pea, Bioqumica, editorial Limusa (2004), 157 pag.
Qumica Orgnica: Estructura y Reactividad, Volumen 2, Seyhan Ege, pg. 1201-1202
Brown, T. LcMay, H. Bursten, B. Murphy, 2009; Qumica La Ciencia Central, decimotercera
edicin. Pearson Educacin
Punto isoelctrico, publicado por Dapne (11,2011), recuperado el 15 de abril de 2014 en
http://biokimik2011.blogspot.com/2011/09/separacion-y-cuantificacion-de.html

CUESTIONARIO
1. Por qu no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se prepararon
de aminocidos?
Las protenas son buenos amortiguadores por que los aminocidos que lo constituyen se comportan
como cidos dbiles .El gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras ms estabilizada y
estructurada esta la protena mayor cantidad de volumen se requiere para lograr varia el pH de la
solucin cumpliendo as la propiedad amortiguadora que poseen las protenas. En cambio cuando se
desnaturaliza la protena el gasto de HCl es mucho menor debido a que no alcanza mantener el pH
constante. Como la concentracin de cido clorhdrico es de 0.1M, no se logra alcanzar un pH 1 debido
a la estabilidad de los aminocidos y a la baja concentracin del cido clorhdrico.
2. Compare los puntos isoelctricos de la glicina y los pptidos glicil-glicina y glicil-glicilglicina? Que concluye sobre estos resultados:
Glicina

. + .
= .

La glicina es un aminocido no esencial, lo que significa que tiene igual cantidades de grupo amino
como cido, al formar enlaces glicina-glicina, se forma una macromolcula por perdida de agua y su
valor de pI no se altera bruscamente debido a que es el aminocido ms pequeo y neutro
3. Porque las molculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto
isoelctrico?
Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales
insolubles a ese pH. Las molculas se hacen menos solubles en el punto isoelctrico debido a que el
punto isoelctrico representa el equilibrio de las cargas positivas y negativas presentando una carga
neta de cero y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que las partculas se
agregan.
4. En la precipitacin de la casena, qu pasara si se aade muy rpido el cido y si se
alcanza un pH ms bajo de 4.8. Qu se debe hacer en este caso?

Si se le aade cido muy rpido y se alcanza un pH ms bajo de 4.8, la casena se vuelve nuevamente
soluble en este medio y desaparecera el precipitado. En este caso se deben aadir una solucin de
pH bsico para compensar la disminucin de pH o tambin se le aade ms leche para disminuir la
solucin cida.
5. Por qu es necesario lavar la casena precipitada con alcohol (etanol 95%) y ter?
La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua
como etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales
de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolvente orgnicos
intercambian con el interior hidrofbico de la protena, y desorganizan la estructura terciaria provocando
su desnaturalizacin y precipitacin.