PRCTICA 10: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli, FLUOROCULT LMX

El caldo Fluorocult LMX descrito por Manafi y Kneifel (1989) es modificado por el sustrato
utilizado. La alta calidad nutricional se debe a la incorporacin de un buffer fosfatado en el caldo,
garantizando un alto ndice de crecimiento de los coliformes presentes mientras que el lauril
sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivos en un alto grado. Por la adicin del
sustrato cromognico 5-bromo-4-cloro-3-indol--D-galactopiranosida (X-GAL), el cual es destruido
por los coliformes y el sustrato fluorognico 4-metil-umbeliferil--D-glucoronidasa (MUG), el cual
es altamente especfico para Escherichia coli, es posible la deteccin simultnea de coliformes
totales y Escherichia coli.
La presencia de coliformes se indica por un color azul verdoso en el caldo y Escherichia coli por un
azul fluorescente bajo longitud de onda larga UV. Despus la reaccin positiva de indol confirma la
presencia de Escherichia coli aumentada por la concentracin de triptofano en el caldo. La sntesis
de la enzima es ampliada por el 1-isopropil--D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) e incrementa la
actividad de -D-galactosidasa.
Materiales

15 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult por cada muestra (aguas no potables)

10 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult por cada muestra (aguas potables)
Pipetas de 1 mL estriles
Pipeta automtica de 10 l
Puntas estriles
Incubadora a 35C
Lmpara UV
Reactivo de Kovacs

Nota: Si la muestra es tratada con cloro, por cada 100 mL de muestra aadir 0.1 mL de tiosulfato
de sodio al 10%
Procedimiento
Homogenizar la muestra (agua no potable)
-A los primeros 5 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult aadir 10 mL de muestra
-A los 5 siguientes tubos aadir 1 mL de muestra
-A los 5 ltimos tubos aadir 0.1 mL de muestra
-Incubar a 35C por 24 horas
-Interpretar los resultados.
Homogenizar la muestra (agua potable)
-A los primeros 10 tubos con 10 mL de caldo Fluorocult aadir 10 mL de muestra
-Incubar a 35C por 24 horas
-Interpretar los resultados.

Interpretacin de resultados:
Coliformes Totales: El caldo se torna azul verdoso (reaccin de X-GAL)
Escherichia coli: Leve fluorescencia en el caldo (reaccin MUG), visible bajo la luz UV
(366 nanmetros).
Confirmar la presencia de Escherichia coli, con el reactivo de KOVACS , mediante la reaccin de
Indol. El sobrenadante se torna rojo en dos minutos si la reaccin es positiva.
Si la fluorescencia es negativa despus de 24 horas de incubacin, no se debe aadir el reactivo
de KOVACS, pues este reactivo alcohlico destruye las condiciones de crecimiento del medio.
Continuar la incubacin por 24 horas adicionales. Chequear los resultados por fluorescencia y
reaccin de Indol.
Leer en la tabla de NMP para 5 tubos x 3. TABLA 9221: IV
Leer en la tabla de NMP para 10 tubos TABLA 9221: II
Cepa Control

Cambio de color a azul Fluorescencia

verdoso
+
+

Escherichia coli
ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC +
13883
Enterobacter cloacae
+
ATCC 13047
Citrobacter freundii
+
ATCC 8090
Citrobacter freundii
+
ATCC 6750
Shigella flexneri
ATCC 12022
Salmonella typhimurium ATCC 14028

Indol
+

TABLA 9221: IV. MPN INDEX AND 95% CONFIDENCE LIMITS FOR VARIOUS
POSITIVE RESULT WHEN FIVE TUBES ARE USED PER DILUTION
Combinacin
de NMP/
Lmites de 95% de Combinacin
de
tubos positivos
100mL
confianza
tubos positivos
Inferior
Superior
0
0
0
< 1.8
6.8
4
0
3
0
0
1
1.8
0.090
6.8
4
1
0
0
1
0
1.8
0.090
6.9
4
1
1
0
1
1
3.6
0.70
10
4
1
2
0
2
0
3.7
0.70
10
4
1
3
0
2
1
5.5
1.8
15
4
2
0
0
3
0
5.6
1.8
15
4
2
1
1
0
0
2.0
0.10
10
4
2
2
1
0
1
4.0
0.70
10
4
2
3
1
0
2
6.0
1.8
15
4
3
0
1
1
0
4.0
0.71
12
4
3
1
1
1
1
6.1
1.8
15
4
3
2
1
1
2
8.1
3.4
22
4
4
0
1
2
0
6.1
1.8
15
4
4
1
1
2
1
8.2
3.4
22
4
4
2
1
3
0
8.3
3.4
22
4
5
0
1
3
1
10
3.5
22
4
5
1
1
4
0
10
3.5
22
5
0
0
2
0
0
4.5
0.79
15
5
0
1
2
0
1
6.8
1.8
15
5
0
2
2
0
2
9.1
3.4
22
5
0
3
2
1
0
6.8
1.8
17
5
1
0
2
1
1
9.2
3.4
22
5
1
1
2
1
2
12
4.1
26
5
1
2
2
2
0
9.3
3.4
22
5
1
3
2
2
1
12
4.1
26
5
2
0
2
2
2
14
5.9
36
5
2
1
2
3
0
12
4.1
26
5
2
2
2
3
1
14
5.9
36
5
2
3
2
4
0
15
5.9
36
5
2
4
3
0
0
7.8
2.1
22
5
3
0
3
0
1
11
3.5
23
5
3
1
3
0
2
13
5.6
35
5
3
2
3
1
0
11
3.5
26
5
3
3
3
1
1
14
5.6
36
5
3
4
3
1
2
17
6.0
36
5
4
0
3
2
0
14
5.7
36
5
4
1
3
2
1
17
6.8
40
5
4
2
3
2
2
20
6.8
40
5
4
3
3
3
0
17
6.8
40
5
4
4
3
3
1
21
6.8
40
5
4
5

COMBINATION OF
NMP/
100mL
25
17
21
26
31
22
26
32
38
27
33
39
34
40
47
41
48
23
31
43
58
33
46
63
84
49
70
94
120
150
79
110
140
170
210
130
170
220
280
350
430

Lmites de 95% de
confianza
Inferior
Superior
9.8
70
6.0
40
6.8
42
9.8
70
10
70
6.8
50
9.8
70
10
70
14
100
9.9
70
10
70
14
100
14
100
14
100
15
120
14
100
15
120
6.8
70
10
70
14
100
22
150
10
100
14
120
22
150
34
220
15
150
22
170
34
230
36
250
58
400
22
220
34
250
52
400
70
400
70
400
36
400
58
400
70
440
100
710
100
710
150
1100

3
3
3
3
4
4
4

3
2
24
9.8
70
5
5
0
4
0
21
6.8
40
5
5
1
4
1
24
9.8
70
5
5
2
5
0
25
9.8
70
5
5
3
0
0
13
4.1
35
5
5
4
0
1
17
5.9
36
5
5
5
0
2
21
6.8
40
Tomado de Standard Methods (Edicin 21)
Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (2005)

240
350
540
920
1600
> 1600

70
100
150
220
400
700

TABLA 9221: II MPN Index and 95% Confidence Limits for All Combinations of Positive and
Negative Result when ten 10 ml portions are used.
No. Of tubes giving
positive reaction out
of 10 (10 ml each)

MPN Index/100ml

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

<1.1
1.1
2.2
3.6
5.1
6.9
9.2
12
16
23
>23

95% Confidence Limits

(Exact)
Lower
Uper
0.051
0.37
0.91
1.6
2.5
3.3
4.8
5.8
8.1
13

3.4
5.9
8.2
9.7
13
15
19
24
34
53
-

710
1100
1700
2600
4600
-