VitaFast Vitamin B2 (Riboflavine ) P1007

Total content (natural + added vitamin B2) in food (see 6.5. manual)
Vitamina B2 o Ribloflavina: es una vitamina perteneciente al complejo B. Se puede encontrar en
ciertos alimentos como la leche, la carne, los huevos, las nueces, la harina enriquecida y las
verduras de color verde. El complejo de vitamina B generalmente incluye la vitamina B1 (tiamina),
la vitamina B2 (riboflavina), la vitamina B3 (niacina/niacinamida), la vitamina B5 (cido
pantotnico), la vitamina B6 (piridoxina), la vitamina B12 (cianocobalamina) y el cido flico. La
riboflavina es utilizada para la prevencin de bajos niveles de riboflavina (deficiencia de
riboflavina), para el cncer cervical y los dolores de cabeza. Funciones. Tambin se utiliza para el
tratamiento de la deficiencia de riboflavina, del acn, de los calambres musculares, del ardor en
los pies, del sndrome del tnel carpiano y para trastornos de la sangre. Algunas personas usan la
riboflavina para las enfermedades oculares como la fatiga ocular, las cataratas y el
glaucoma.Tambin se utiliza para aumentar los niveles de energa; estimular el sistema
inmunolgico; para el mantenimiento sano del cabello, de la piel, de las mucosas y de las uas;
para frenar el envejecimiento; para aumentar el rendimiento deportivo; para la promocin de la
funcin reproductiva saludable; para las aftas; para la prdida de memoria, incluyendo la
enfermedad de Alzheimer; para las lceras; las quemaduras; el alcoholismo; la enfermedad
heptica; la anemia de clulas falciformes; y para el tratamiento de la acidosis lctica debido al
tratamiento con una clase de medicamentos contra el SIDA medicamentos INTR.
Principio de la tcnica
Es un mtodo microbiolgico para la determinacin cuantitativa de la vitamina B2 total (aadida y
natural) en los alimentos, los piensos y en los productos farmacuticos. El sistema de probe is
conformed a las norms internationals.
La vitamina B
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se extrae de la muestra y el extracto se diluye. El Medio de ensayo y el extracto se
pipetea en los pocillos de una placa de microtitulacin que est recubierta con Lactobacillus
rhamnosus. El crecimiento de los Lactobacillus rhamnosus depende del suministro de vitamina B2.
Segn la adicin de vitamina B2, ya sea como estndar o como un compuesto de la muestra, la
bacterias crecen hasta que se consume la vitamina. La incubacin se realiza en la oscuridad a 37
C durante 44 a 48 h.
La intensidad del metabolismo o el crecimiento de Lactobacillus rhamnosus en relacin con la
vitamina B2 se mide como la turbidez y se compara con una curva estndar. La medicin se realiza
utilizando un lector de placas de microtitulacin a 610-630 nm (como alternativa a 540-550 nm)

Reactivos adicionales necesarios
- Agua desionizada
- Diastasa taka , aspergillus oryzae ; (por ejemplo Fluka 86250 )
- Fosfatasa cida, tipo II : de patata ( por ejemplo, Sigma P3752 )
- Buffer citrato pH 4,5: pesar 1,5 g de monohidrato de cido ctrico en un vaso de precipitados de
100 ml, disolver el cido ctrico con aproximadamente 50 ml de agua desionizada bajo agitacin ;
aadir 12 ml de NaOH 1 mol / l (o 0,48 g de NaOH ); El pH debe ser 4,5 ( corregir con HCl 0,1 mol /
l); trasvasar la solucin en un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua desionizada
el buffer puede ser almacenado 3 das a 2 - 8 C.
- HCl 0,1 mol / l y 1,0 mol / l
Preparacin de la muestra
o Las muestras y los estndares deben realizarse por triplicado
o Si se desconoce la matriz alimentaria debe trabajarse con dos diluciones de la muestra
o Las muestras deben almacenarse a 4C y en protegidas de la luz.
o La extraccin se lleva a cabo pesando 1 g de la muestra y aadiendo 40 ml de agua
destilada, siendo 40 el factor de dilucin
o Cuando se lleva a cabo una extraccin enzimtica se recomienda correr un blanco de
reactivo para asegurarse que los reactivos enzimticos no contengan vitamina B2 e
interfiera con los resultados finales.
o Solamente los extractos de muestras estriles o diluciones estriles de las mismas se
deben pipetear sobre la placa de microtitulacin. Las diluciones deben estar preparados
con agua estril del kit de prueba. Una filtracin estril de la muestra o el extracto de la
muestra siempre es necesario para:
- Muestras como zumos de frutas y bebidas isotnicas, que no se calientan durante extraccin de
la muestra (excepto cuando la muestra se calienta durante 30 min a 95 C en un bao de agua)
- Muestras que contienen hierbas y especias, as como la miel y el t
- Mezclas de vitaminas, premezclas, tabletas (muestras altamente enriquecido, ver 6.3) (excepto
cuando la muestra se calienta 30 min a 95 C en un bao de agua)
- Muestras con bajas concentraciones de vitamina que son muy coloreadas (la etapa de filtracin
elimina la coloracin)
- Si la filtracin no es posible debido a partculas slidas o debido a grumos, la centrifugacin debe
llevarse a cabo antes de la etapa de filtracin estril (mayor de 8000 x g durante 5 min)
- La filtracin estril de la muestra no es necesario si
la extraccin de la muestra se lleva a cabo a 95 C durante 30 min. Sin embargo, la
muestras extradas tienen que ser diluidas con agua estril desde el kit de prueba
(el medio de ensayo tiene que ser siempre filtrada)
Ejemplo para los factores de dilucin del extracto de la muestra: Muestra slida con una
concentracin marcada de 3 mg de vitamina B2 / 100 g
La dilucin del extracto debe estar en el medio de la curva estndar.
Por lo tanto, la concentracin esperada se divide por el estndar 2.
Clculo:
3 mg / 0,08 mg = 37,5 factor de dilucin de 40 (1: 40)
Pasos de dilucin:
a) 1:10 (solucin de extraccin 0,1 ml de muestra + 0,9 ml de agua estril de la prueba kit)
b) 1: 4 (0,25 ml de a) + 0,75 ml de agua estril desde el kit de prueba)

6.1. Alto contenido de vitamina B2 en muestras lquidas (jugos multivitamnicos, fitness, bebidas)
Aadir 1 ml de muestra en un frasco de centrfuga estril de 50 ml, completar hasta 20 ml
con Redist o agua desionizada y ajustar el pH a 4,5.
Alternativamente en lugar de agua un tampn de citrato se puede utilizar (sin ajuste de pH
es necesario); a 1 ml de la muestra se aaden 20 ml de citrato de pH 4,5 y agitar.
Aadir 10 mg de fosfatasa cida de patata y agitar bien. Incubar 1 h en la oscuridad
(incubadora o bao de agua) a 37 C, agitando a veces. Llenar hasta exactamente 40 ml
con Redist o desionizada y agitar. Luego extraer 30 minutos a 95 C en un bao de agua.
Durante la extraccin del vial tiene que agitarse bien al menos cinco veces. Es importante
asegurarse de que el vial est bien cerrado. Enfriar rpidamente por debajo de 30 C.
Dependiendo del grado de concentracin, diluir adicionalmente en 1,5 ml (o 2,0 ml) estril
viales de reaccin con agua estril desde el kit de prueba.

6.2. Alto contenido de vitamina B2 en golosinas y caramelos
Pesar unos 15 - 20 g de golosinas o caramelos en un vial de centrfuga de 50 ml estril,
aadir aproximadamente 40 ml Redist o agua desionizada y disolver la muestra a 95 C en
el bao de agua. Enfriar rpidamente por debajo de 30 C.
Transferir la solucin con Redist o agua desionizada cuantitativamente a un matraz
volumtrico de 100 ml y llenar hasta la marca con Redist o agua desionizada.
Transferir el volumen correspondiente a 1 g de material de ensayo (ver ejemplo a
continuacin) en un vial de centrfuga de 50 ml y llenar hasta aprox. 20 ml con Redist. o
agua desionizada y se ajustar el pH a 4,5.
Alternativamente en lugar de agua se puede utilizar 20 ml buffer citrato pH 4.5 (sin pH
ajuste de pH necesario).
Aadir 10 mg de fosfatasa cida de patata y agitar bien. Incubar 1 h en la oscuridad
(incubadora o bao de agua) a 37 C (98,6 F), agitar a veces.
Llenar hasta exactamente 40 ml con Redist. o desionizada y agitar. Luego extraer a 30
minutos a 95 C en un bao de agua. Durante la extraccin del vial tiene que agitarse bien
al menos cinco veces. Es importante asegurarse de que el vial est bien cerrado. Enfre
rpidamente por debajo de 30 C y dependiendo del grado de concentracin, diluir
adicionalmente en 1,5 ml (o 2,0 ml) estril viales de reaccin con agua estril del kit de
prueba.
Ejemplo: Peso de la muestra 17 g
Clculo: 100 ml / 17 g de peso de la muestra = 5,88 ml / g
1 g de muestra est contenida en 5,88 ml. As transferir 5,88 ml en una centrfuga de 50 ml vial y continuar
como se describe anteriormente.
6.3. Alto contenido de vitamina B2 en cpsulas, pldoras y mezclas de vitaminas
En primer lugar el peso de la cpsula o pastilla tiene que ser determinado (promedio de 5-10
cpsulas o pastillas). Luego las pldoras se homogeneizan en un mortero o mezclador. Las cpsulas
se cortan y se extraen abiertas.
6.3.1 Ejemplo de preparacin con 1 g tamao de la muestra y pre - extraccin
Pesar 1 g de pldoras, mezcla de vitaminas, premezcla o abra la cpsula en un vaso de
vidrio de 500 ml, aadir alrededor de 400 ml Redist o desionizada, agitar bien y ajustar pH
4,5 con HCl.
Aadir 50 mg de fosfatasa cida de patata, agitar e incubar 1 h en la oscuridad (incubadora
o bao de agua) a 37 C.
Luego se extrae durante 30 minutos a 95 C (203 F) en un bao de agua. Durante
extraccin, el frasco de vidrio tiene que ser agitado por lo menos cinco veces. Enfriar
rpidamente por debajo de 30 C.
Transferir la solucin de la muestra con Redist. o agua desionizada cuantitativamente a un
matraz aforado de 1000 ml, llenar hasta la marca con Redist. o desionizada y agitar.
Transferir 1 ml en un vial de 50 ml y llenar exactamente a 40 ml con Redist o agua
desionizada.
Agitar y filtrar de manera estril (como alternativa: calentar la muestra 30 min a 95 C en
un bao de agua, a partir de entonces enfriar rpidamente por debajo de 30 C) y,
dependiendo en el intervalo de concentracin, diluir adicionalmente en 1,5 ml (o 2,0 ml)
en viales estriles con agua estril del kit de prueba.
Atencin: Para el clculo del resultado, tiene que ser considerado el factor de dilucin de 1000 (1 g
hasta 1000 ml). El paso de dilucin 1 ml hasta 40 ml ya est incluido en la curva estndar.




6.4 Contenido de vitamina total en productos lcteos, alimentos para bebs, carne y productos
crnicos
Pesar exactamente 1 g ( ml ) de la muestra homogeneizada en un vial de centrfuga de 50
ml, aadir 20 ml de agua desionizada , agitar y ajustar a pH 4,5 con HCl. Alternativamente
en lugar de agua se puede utilizar un buffer de citrato para la extraccin (sin ser necesario
ajustar el pH): a 1 g de muestra aadir 20 ml de citrato, pH 4,5 y agitar.
Para muestras con baja concentracin de vitamina B pueden pesarse 5 g.
Aadir 300 mg taka diastasa , 10 mg de fosfatasa cida de patata , agitar bien e incubar 1
hora a 37 C en la oscuridad (agitar unas veces) ; llenar hasta 40 ml con agua desionizada y
colocar 30 minutos en bao de agua a 95 C ; enfriar rpidamente por debajo de 30 C.
Transferir 1 ml de la extraccin de la muestra en un vial de reaccin de 1,5 ml estril y
centrifugar 5 min (a ms de 8000 x g).
6.5. Alto contenido de vitamina B2 aadida en cereales, alimentos para bebs, pan, harina, carne y
productos crnicos
Pesar 1 g (ml) de la muestra homogeneizada en un vial de 50 ml de centrfuga, llenar hasta
20 ml con Redist o desionizada, agitar bien y ajustar el pH a 4,5 con HCl. Alternativamente
en lugar de agua un tampn de citrato se puede utilizar para la extraccin (sin ajuste de
pH necesario); a 1 g (ml) de muestra aadir 20 ml de tampn de citrato pH 4,5 y agitar.
Aadir 10 mg de fosfatasa cida de patata y agitar bien. Incubar 1 h en la oscuridad
(incubadora o bao de agua) a 37 C, agitar varias veces.
Llenar hasta exactamente 40 ml con Redist. o desionizada y agitar. Luego extraer 30
minutos a 95 C en un bao de agua. Durante la extraccin el vial tiene que agitarse bien al
menos cinco veces. Es importante asegurarse de que el vial est bien cerrado. Enfriar
rpidamente por debajo de 30 C.
Centrifugar (5 min> 8.000 xg) y, dependiendo del grado de concentracin, adems diluir el
sobrenadante en 1,5 ml (o 2,0 ml) viales de reaccin estriles con agua estril desde el kit
de prueba

6.6 Contenido de vitamina total (vitamina B2 nativa y agregada) de cereales
Las muestras de cereales requieren un tratamiento en autoclave para extraer eficazmente la
vitamina B2 nativa.
Pesar 1 g de muestra en un vial de 50 ml de centrfuga estril, aadir aproximadamente 20 ml de
Redist o desionizada, agitar y ajustar el pH a entre 5 - 6.
Autoclavar 30 minutos a 121 C (no cerrar el tapn de rosca totalmente). Dejar enfriar y llenar
hasta 40 ml con Redist o agua desionizada. Luego agitar y filtrar de manera estril. Finalmente,
dependiendo del grado de concentracin, diluir an ms el filtrado o sobrenadante claro en 1,5 ml
(o 2,0 ml) en viales de reaccin estriles con agua estril del kit de prueba.
6.7. Contenido de vitamina total (vitamina B2 nativo y agregado) en levaduras y productos de
levadura
Pesar 1 g (ml) de la muestra homogeneizada en un vial de centrfuga de 50 ml estril,
aadir 10 ml de 0,1 mol /L H
2
SO
4
. Agitar bien y autoclavar 30 minutos a 121 C (No cierre
la tapa de rosca totalmente). Enfriar rpidamente a 30 C y aadir 3 ml de solucin de
acetato de sodio 2,5 moL/L y agitar.
Para la solucin de muestra aadir 300 mg diastasa taka y 10 mg de fosfatasa cida de
papa y agitar de nuevo. Incubar durante la noche 12 - 16 horas a 37 C en la oscuridad.
Luego llenar hasta exactamente 40 ml con agua desionizada o Redist.
Extraer 30 minutos a 95 C en un bao de agua. Durante la extraccin el vial tiene que
agitarse bien al menos cinco veces. Es importante asegurarse de que el vial est bien
cerrado. Enfre rpidamente por debajo de 30 C y centrifugar (5 min> 8.000 xg)
Dependiendo de la gama de concentracin, diluir el sobrenadante claro en 1,5 ml (o 2,0
ml) viales de reaccin estriles con agua estril del kit de prueba.
Preparacin del ensayo y Curva Estndar
Agua estril: empujar la tapa de color hacia arriba, tire de la derecha y girar toda la tapa para
quitarla. Cada estndar de vitamina B2 es suficiente para 3 pozos. Los estndares deben ser
preparados en el da.
- Abrir la botella estndar de vitamina B2, coloque la tapa hacia abajo con la apertura hacia arriba
- Aadir ml x (x = vase la norma certificado de garanta de calidad y la etiqueta botella) agua
estril (del kit de prueba) a la botella estndar. Cerrar el frasco con la tapa y disolver el estndar
por agitacin = concentrado estndar
- Tomar 6 viales estriles (1,5 o 2,0 ml) y preparar la una curva estndar de acuerdo con el
siguiente esquema:

Medio de Ensayo
Retirar el desecante utilizando pinzas
Aadir 10 ml de agua estril (de kit de prueba ) a la botella medio. Cerrar y agitar bien
Calentar 5 min a 95 C, enfriar rpidamente por debajo de 30 C.
Filtrar a travs de un filtro de 0,2 micras en un vial de centrfuga estril de 15 ml.
Dilucin de las muestra
Realizar clculos de dilucin
Llenar la placa de microtitulacin
Diluir el sobrenadante de la muestra extrada con agua estril (del kit de prueba) en 1,5 ml
viales de reaccin

Placa de microtitulacin
Colocar las tiras necesarias en el soporte
Devolver las tiras no utilizadas junto con el desecante de la bolsa de aluminio y sellarla
bien
Pipetear 150 ul de medio de ensayo
Pipetear 150 ul de Estndar / muestra diluida (para cada solucin de muestra patrn o
dilucin utilizar nueva punta )
Cubrir las tiras bien con lmina adhesiva, asegurarse que los pocillos estn cerrados
hermticamente.
Incubar 44-48 horas a 37 C ( en la oscuridad)

Medicin
Preparar el software de archivo de datos (estndares , muestras , diluciones )
Presione hacia abajo la lmina adhesiva una vez ms
Coloque la microplaca al revs sobre una mesa y disolver los microorganismos
cuidadosamente por agitacin de la placa en la superficie de la mesa
Invertir la placa a la posicin regular y quitar la lmina adhesiva (mantener las tiras en el
marco)
Eliminar las burbujas a travs de la punta o aguja.
Leer ( 610-630 nm , alternativamente al 540-550 nm ) , utilizar 4 - software parmetro el
blanco no tiene que ser eliminado)
La medicin es correcta en la condicin que
DO BLANCO < OD STANDARD 1
DO standard 5 > 0.6 OD

El factor de dilucin de la muestra (40) ya est incluido en la curva estndar (ver
Certificado Aseguramiento de la Calidad). En la frmula solo hay que tener en cuenta un
factor de dilucin adicional del extracto y un peso de muestra diferente.

(

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Medicin para cpsulas, pldoras y mezcla de vitaminas:

Observaciones:
Almacenar el kit y los reactivos a 2-4 C