Lowenstein- Jensen

El medio Löwenstein-Jensen es un medio sólido selectivo para el aislamiento y desarrollo

de bacterias del género Mycobacterium, tales como Mycobacterium tuberculosis, M.
avium, entre otras, a excepción de la especie leprae, que no es cultivable. Las bacterias del
género Mycobacterium no crecen en medios de cultivo convencionales, por tanto, fue
necesario diseñar un medio especial para su aislamiento. El medio original fue creado por
Löwenstein y luego fue modificado por Jensen.

El medio Löwenstein-Jensen actualmente contiene almidón de papata, asparragina, citrato

magnésico, fosfato monopotásico, sulfato magnésico, verde de malaquita, ácido nalidíxico,
cicloheximida, lincomicina, huevos batidos, glicerina y agua.

Las micobacterias se aíslan normalmente de sitios que no son estériles, como esputos,
orina, abscesos, entre otros. Esto quiere decir que la mayoría de las muestras contendrán
microbiota habitual del área, más el patógeno.

Es por ello que el medio Löwenstein-Jensen contiene una serie de inhibidores en su

composición representados por el verde de malaquita, antibióticos y anti fúngicos.

Además, las muestras que provienen de sitio no estériles deben ser descontaminadas y
neutralizadas antes de ser sembradas en el medio Löwenstein-Jensen.

Casas Comerciales

 Laboratorio MICROKIT
 Merck
 MDM científica

Composición

 Almidón de patata........................... 30.0

  Asparagina......................................3.6
 Citrato de magnesia........................ 0.6
 Sulfato de magnesia........................0.24
 Fosfato monopotásico.....................2.4
 Verde malaquita.............................. 0.4
 Glicerina..........................................12 ml
 Emulsión de huevo..........................1.000 ml
 Agua destilada ............................... 1.640 ml
Lowenstein Jensen TP10000V Cultivo y diferenciación de especies de Mycobacteria

El medio Löwenstein-Jensen contiene verde de malaquita, que es un inhibidor de la

microbiota normal que acompaña la muestra. Pero además contiene ácido nalidíxico (35
µg/mL), que inhibe la microbiota Gram negativa, cicloheximida (400 µg/mL), que inhibe
los hongos y levaduras saprófitos, y lincomicina (2µ/mL), que inhibe la microbiota Gram
positiva.

Algunas casas comerciales prefieren añadir la siguiente combinación de antibióticos:

polimixina B 200.000 unidades/L, anfotericina B 10 mg/L, carbenicilina 50 mg/L y
trimetoprima 10 mg/L.

Este medio no contiene agar, por tanto, la solidificación del medio ocurre por la
coagulación de la albúmina presente en el huevo durante la esterilización

RESULTADOS
 1. Resultado negativo: donde no se observa el desarrollo de la bacteria luego de la
semana 8 de inoculación.
2. Resultado positivo: se va a interpretar como: positivo 1 cruz: es donde solo se va a
observar de 20 a 100 colonias separadas; positivo 2 cruz: se observan más de 100
colonias y positivo 3 cruz cuando las colonias van hacer incontables.
3. Es solo que la contaminación del tubo se va a observa entre amarrillas y negro.

Preparación

Pese 37,3 g del medio deshidratado en 600 ml de agua destilada a la que previamente se le
ha adicionado 12 ml de glicerol. Se calienta la mezcla, agitando frecuentemente hasta su
disolución total. Autoclavar el medio a 121 ° C por 15 minutos.

Por otra parte, se debe preparar una suspensión homogénea de 1000 ml de huevos frescos
en condiciones asépticas. Adicionar la suspensión de huevo a los 600 ml de medio
preparado a una temperatura de 50 – 60 °C, evitando las burbujas de aire.

Las soluciones de antibióticos también se le agregan después de la esterilización en la

autoclave.

Vierta el medio en tubos de ensayo estériles con tapón de rosca. Calentar los tubos a 85°C
por 45 minutos en posición inclinada.

El color del medio preparado es verde aguamarina y puede presentar puntos blanquecinos
por la presencia de lípidos del huevo.

El pH del medio debe quedar en 7,2 ± 0,2

Guardar los tubos en nevera y protegidos de la luz directa hasta su uso. Atemperar antes de
sembrar.
Existe una modificación del medio denominado «modificación de Gruft del Löwenstein
Jensen». Este contiene los mismos compuestos que el medio clásico, pero se le agrega
RNA-5mg/100 mL, y como inhibidores contiene verde de malaquita 0,025 g/100 mL,
penicilina 50 U/mL y ácido nalidíxico 35 ug/mL.

Usos

El medio Löwenstein-Jensen se usa para el aislamiento de micobacterias, a partir de

diversos tipos de muestras. Se recomienda realizar una tinción de Ziehl-Neelsen a toda
muestra en la que se sospeche la presencia de micobacterias.

Algunas muestras provienen de sitios estériles, pero otras no. Las muestras no estériles
deben ser descontaminadas según sea el caso:

Esputo

Las muestras de esputos se deben descontaminar de la siguiente manera: determine la

cantidad de muestra de esputo en ml y agregue a la muestra la misma cantidad de NaOH al
4% e incube a 37°C.

Agite la mezcla frecuentemente en un período de 30 minutos. Posteriormente centrifugue a

3000 RPM por 30 minutos.

Descartar el sobrenadante sobre una solución de desinfectante fenólico. Usar el sedimento

para sembrar, pero antes se debe neutralizar el pH.

Para neutralizar el sedimento se utiliza H2SO4 al 5% en presencia del indicador rojo de

fenol hasta llevar a un pH neutro que origina un color salmón.

Lavado gástrico, lavado bronquial y aspirado bronquial

En este caso se debe centrifugar la muestra a 3000 RPM por 30 minutos. Se descarta el
sobrenadante y se usa el sedimento. Para descontaminar el sedimento se adiciona 3 ml de
NaOH al 4% y se agita frecuentemente a 37°C por un lapso de media hora.

Centrifugar nuevamente, se descarta el sobrenadante y se usa el sedimento. Este último se

debe neutralizar como fue explicado en la muestra de esputo.

Orina

Dejar sedimentar la muestra en la nevera durante 24 horas. Separar el sobrenadante. El

sedimento restante debe centrifugarse por 30 minutos a 3000 RMP. Descartar nuevamente
el sobrenadante y reconstituir el sedimento con 3 ml de solución fisiológica estéril.

Adicionar 3 ml de NaOH al 4% y proceder a la descontaminación y neutralización tal como

se ha descrito antes.

Incubación

Los tubos inoculados se incuban en aerobiosis a 37°C, con la tapa un poco floja e
inclinados a 5° aproximadamente y protegidos de la luz. Se puede enriquecer el ambiente
con dióxido de carbono al 5–10%. Revisar los cultivos dos veces por semana hasta la
aparición de colonias.

Cuando la muestra haya sido absorbida se ajustan las tapas. El tiempo máximo de
incubación es de 8 semanas, si al cabo de este tiempo no hay crecimiento se reporta como
negativo.

Control de calidad

Como control de calidad se pueden usar las siguientes cepas:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC

12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC
19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC
25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Para las tres primeras especies mencionadas se espera un excelente desarrollo, para M.
fortuitum el crecimiento debe ser bueno, mientras que para M. bovis se espera un
crecimiento escaso o nulo. En tanto que, las especies diferentes al género Mycobacterium
deben ser inhibidas en su totalidad.

Limitaciones

El medio preparado debe protegerse de la luz, la exposición prolongada a la luz hace que el
medio vire de verde a azul, en este caso ya no se puede utilizar el medio. Esto se debe a que
el verde de malaquita es fotosensible.

El medio, como contiene huevo, puede ser fácilmente contaminado si no se manipula

asépticamente. Puede ser disuelto si se contamina con bacterias proteolíticas.

El cultivo y manipulación de bacterias del género Mycobacterium requiere de un personal

calificado, que sea consciente de las medidas de bioseguridad que debe cumplir para evitar
ser contaminado o contaminar a otros.

No se debe usar HCl en el paso de la neutralización debido a la formación de cloruro de

sodio, que puede ser tóxico para el bacilo de Koch.

Las muestras deben mantenerse refrigeradas y protegidas de la luz mientras no sean

procesadas

Bibliografía

www.lifeder.com 

mdmcientifica.com