GLORIA GUTIRREZ-VENEGAS CRISTINA HERNNDEZ-BERMDEZ

2011

Procedimientos Experimentales del Laboratorio de Bioqumica.

Primera Edicin 2011. Gloria Gutirrez Venegas , Cristina Hernndez Bermdez. Gestor de Derechos Autorales: Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

El campo de la salud est en un continuo cambio. A medida que surgen nuevas investigaciones que aportan informacin para ser utilizada en la prctica clnica, se propician cambios y adaptaciones a los libros de texto. Los autores de esta obra han revisado que los contenidos sean verificables. Sin embargo, sugerimos se consulten otras obras. Proyecto Financiado por PAPIME (PE-203810) Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico UNAM. Editorial Buena Onda.

ndice Tema Pgina

Introduccin _________________ 5 Presentacin de Equipo ________ 7 Titulacin cido Base _________ 10 Cromatografa de Aminocidos __ 18 Cuantificacin de Protenas _____ 33 Actividad de la Amilasa Salival __ Velocidad de Recambio Salival y Cuantificacin de Carbohidratos _ 46 Electroforesis de Protenas ______ 51 Aislamiento de cidos nucleicos _ 57 Transformacin, Aislamiento de Plsmido y Digestin __________ 61 Aislamiento de Plsmido _______ 65 39

Digestin

Electroforesis

de

Plsmido ____________________ 67 Titulacin de Saliva ____________ 71 Cintica de Lisozima Salival _____ 73 Relacin de la Caries con las UFC de Lactobacillus acidophillus en saliva _______________________ 76 Opern Lac __________________ 79 Ficha Bioseguridad cido

clorhdrico ___________________ 81 Hidrxido de Sodio ____________ 85 Ninhidrina ___________________ 89 Bromuro de Etidio _____________ 95 Trminos y Definiciones ________ 98 Bibliografa _________________ 103

Introduccin.
La asignatura de Bioqumica se imparte en el Primer ao de la Carrera de Odontologa en la UNAM. La importancia de esta asignatura radica en que est relacionada con todas aquellas transformaciones que se realizan en lo seres vivos y debido a que abarca el estudio en las diferentes clulas, tejidos y rganos en diferentes especies, su estudio es de gran importancia en la prctica Odontolgica. As mismo, existe una estrecha interrelacin entre el contenido temtico de esta asignatura con las materias que conforman al grupo de materias Bsicas, Preclnicas y Clnicas. En el curso terico, adems de los contenidos temticos relativos con la Bioqumica se revisan otros temas como la composicin qumica de la saliva, los procesos de mineralizacin dental, la estructura y composicin del periodonto y la bioqumica de dos de las enfermedades dentales que tienen una gran prevalencia; a saber, la caries y la enfermedad periodontal. El estudio de la Bioqumica en la Facultad de Odontologa, ha tenido un avance continuo, desde que se instal el laboratorio de Bioqumica en el ao de 1996, se han realizado mejoras sustantivas tanto en la

infraestructura y como en el Manual de Prcticas. Lo que permite que se revise aunque de manera somera las principales herramientas que se utilizan en el mbito de Bioqumica. Por otra parte, se ha buscado que los contenidos temticos del Manual de Prcticas de Bioqumica, estn

en estrecha relacin con muestras biolgicas obtenidas de la cavidad oral. El impulso del laboratorio de Bioqumica ha permitido introducir a los estudiantes de la Facultad de Odontologa en el manejo del Mtodo Cientfico y en fomentar su participacin en una actividad alternativa a su prctica profesional que consiste en formar a futuros cientficos o profesionales que tengan una necesidad de bsqueda de nuevos conocimientos. De igual manera, nos hemos propuesto la

responsabilidad de participar en consolidar la preparacin en el mbito de las ciencias bsicas a los Cirujanos Dentistas. Por otra parte, el laboratorio de Bioqumica tiene la necesidad de iniciar a los alumnos en el manejo de las herramientas fundamentales de la Bioqumica, aclarando dudas e invitndolos a reflexionar sobre los tpicos que se analizan en Bioqumica y su relacin con el campo Odontolgico. Nuestra intencin es ayudar a los estudiantes en fomentar el aprendizaje autnomo. Finalmente, este texto titulado Procedimientos Experimentales de Laboratorio de Bioqumica y est dirigido a los profesores que imparten la enseanza experimental en Bioqumica y tiene el objetivo de introducirlos de manera directa en los temas que se revisarn en clase y mostrar los clculos y volmenes que se requieren la preparacin de los reactivos que se utilizan en las prcticas y los resultados esperados en cada una de ellas.

Presentacin de Equipo y Clculo de Factores de Dilucin.

Diluciones: Considrese el caso de una solucin salina a la que se le medir su concentracin de cloruro, calcio y magnesio. A la que le realizarn diluciones antes de conocer la concentracin de los componentes. Para la realizacin este procedimiento se tomarn 50 ml de la solucin y se depositarn en un matraz aforado y que la muestra se diluye hasta completar un volumen final de 500 ml con agua destilada, (a esta

disolucin se denominar Solucin A). La solucin A, se homogeniza y se toman 10 ml de esta solucin en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua destilada a 250 ml, (Solucin B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solucin B y se encuentra que en ella las concentraciones para calcio, magnesio y cloruro son

respectivamente 15, 45 y 85 ppm, cual ser entonces la concentracin de estos elementos en la muestra original? Si se toman 10 ml de la solucin A y se diluyen a un volumen de 250 ml con agua destilada, todas las substancias que se hallaban disueltas en A, estarn ahora en la solucin B, 25 veces mas diluidas. En general, en las operaciones de dilucin, el volumen final al cual se lleva una dilucin, dividido por el tamao de la alcuota, se conoce como el Factor de Dilucin. El factor de dilucin es el nmero por el cual se debe

multiplicar la concentracin de un soluto en una solucin diluida, para reproducir la concentracin de la muestra original.

Factor de dilucin =

Volumen total --------------------------Volumen de alcuota

As, el factor de dilucin para pasar de la muestra original a la Solucin A, ser igual a 250 mls / 25 mls = 10. A su vez, el factor de dilucin para pasar de la Solucin A, a la Solucin B, sera igual a 250 mls / 10 mls = 25. Por lo tanto, el factor de dilucin para pasar de la muestra original a la Solucin B, ser igual a 10 x 25 = 250. Esto significa que la concentracin en la muestra original es 250 veces mayor que la concentracin en la solucin B, donde se realiza la medida.

Realizacin de diluciones centesimales:

Si el factor de dilucin es de 1/100. Se toma una parte de la solucin original, y 99 partes del disolvente. Si se desean realizar 10 ml de una dilucin centesimal se procede de la siguiente forma: Se toma 0,1 ml de la solucin madre y se pone en un tubo, y se aade 9,9 ml del disolvente (se realiza una regla de tres: 100 es a 1 de planta, y 10 ml es a X. Se tapa y se agita 100 veces. Obtendremos as la primera dilucin centecimal (CM). La 1 CM se vuelve a tomar 0,1 ml. Al tubo con la 1 CM, y se aade 9,9 ml de disolvente. Se agita 100 veces y obtenemos la 2 CM; as sucesivamente, hasta la dilucin deseada.

Realizacin diluciones decimales: El factor de dilucin es de 1/10. Se toma una parte de la solucin madre y 9 partes del disolvente. Para realizar 10 ml de una dilucin decimal, se procede de la siguiente forma: Se toman 10 ml de la solucin madre y se ponen en un tubo; al que se aade 9 ml de disolucin. (10 es a 1, y 10 es a X.). Se toma 1 ml de solucin madre y 9 partes del disolvente. Se agita 10 veces, y obtendremos la primera dilucin decimal, la primera dilucin (1DH). De la primera dilucin (1DH), se toma 1ml que se pone en otro tubo, al que se aade 9ml de disolvente; obteniendo la segunda disolucin (2 DH), y as sucesivamente.

Elaboracin de Reactivos.
Reactivos Cloruro de sodio (NaCl) 5mM Azul de timol 5% Agua destilada
Preparacin de la solucin de NaCl

Por equipo 0.2 mL 0.5 mL 1.8 mL

Por todos los grupos 31 mL 77.5 mL 279 mL

9.05 mg disolver en 31 mL de agua destilada

Titulacin cido Base.

La titulacin, es una metodologa ampliamente utilizada en el mbito de la qumica analtica. Consiste en la realizacin de un mtodo de anlisis volumtrico que se utiliza para establecer la concentracin de las sustancias que estn presentes en una muestra. Es una metodologa ampliamente utilizada tanto para las reacciones cido-base como de oxidacin-reduccin. En la titulacin cido base se produce una reaccin de neutralizacin, cuyo producto final consiste en la formacin de una sal y agua, lo que conlleva a que se establezca el equilibrio qumico cido base conjugado. Un ventaja importante de la titulacin cido base consiste en determinar la concentracin del compuesto que habr de ser titulado. Para conocer la concentracin de un cido debe medirse cuidadosamente el volumen del cido (matraz aforado) y debe vaciarse en un vaso de precipitados al cual se le adicionan unas gotas de indicador, posteriormente en la bureta se coloca una concentracin conocida de base estndar. Se adicionan volmenes conocidos de la base al cido y se mide el pH y se reportan las diferencias en la coloracin. Cuando se presenta igual concentracin del cido y de la base, la titulacin ha alcanzado el punto de equivalencia, es decir es el punto en el que las concentraciones del cido y la base son iguales. Un indicador adecuado para evaluar el punto de equivalencia es la fenolftalena, que a pH fuertemente cido es naranja, a pH de 0 a 8.2 es
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incolora y vira a rosa cuando se encuentra en un medio bsico, finalmente a pH superior a 12 es nuevamente incolora. La concentracin del cido o de la base se calcula utilizando la relacin entre el producto del volumen por la normalidad, que es igual para todas las soluciones que reaccionan completamente. V cido x N cido = V base x N base

Esta ecuacin es una expresin del principio de equivalencia . Recordemos que: Normalidad = Nm. equivalente Volumen Puesto que un equivalente de cualquier cido neutralizar el equivalente de cualquier base, se comprende que cualquier nmero de equivalentes de cido neutralizar exactamente el nmero de equivalentes de una base. Nm. Equivalente cido = Nm. Equivalente base El nmero de equivalentes de una sustancia en solucin es igual a la normalidad por el volumen .

Nm. Equivalente = N x V

La ecuacin del Principio de equivalencia nos permite el clculo de la normalidad o del volumen de un cido o una base.

Para determinar la concentracin de un cido se mide con cuidado un volumen especfico de la solucin mediante una bureta y se coloca en un matraz. Despus se le adicionan unas gotas de indicador cido-base.
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Posteriormente se le agrega, desde otra bureta, de forma cuidadosa y con lentitud, una base de concentracin conocida, llamada "base estndar", hasta que una gota adicional de base modifica el color del colorante indicador. ste es el punto final de la titulacin. El punto donde han reaccionado cantidades estequiometrcamente iguales de cido y base se conoce como "punto de equivalencia". (El punto final y el punto de equivalencia no son forzosamente iguales y vara segn el compuesto se vaya a titular). Es preciso seleccionar un indicador apropiado para la titulacin, de modo que el punto final est tan cerca al punto de equivalencia como sea posible. Un ejemplo es la fenolftalena, que pasa de color rosa en medio bsico a incolora en medio cido. En el punto de viraje, llamado "punto final", se considera que el nmero de moles de cido monoprtico y de base monohidroxlica que han reaccionado es el mismo. Seleccin del indicador: En esta reaccin el punto de equivalencia tiene un pH = 7, por lo que el indicador adecuado sera el azul de bromotimol (cuyo rango de 6.0 a 7.6); sin embargo se usa el anaranjado de metilo (3.2 a 4.4) debido al rango de vire, ya que de esta manera se evitan errores al pasarse de volumen durante la titulacin, puesto que el azul de bromotimol reacciona con el CO2 del medio cambiando continuamente el pH de la solucin y aparentando no llegar nunca al punto final (el color cambia constantemente de azul, punto final, a amarillo y viceversa) Tabla I.

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Tabla I Indicadores de pH
Indicador Rojo para-metileno 2,6 Nitrofenol Azul de Bromofenol Verde de Bromocresol Rojo de Metileno Azul de Bromotimol Azul de Timol Fenolftalena Color a pH cido Incoloro Incoloro Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Incoloro Intervalo de pH 0.1 0.8 2.0 4.0 3.0 4.0 3.8 5.4 4.2 6.2 6.0 7.6 8.0 9.6 8.0 9.8 Color a pH bsico Amarillo Amarillo Azul prpura Azul Amarillo Azul Azul Rojo violeta.

Cul es el volumen de cido clorhdrico HCl 0.5 N que se requiere para neutralizar 20 ml de una solucin 0.3 N de hidrxido de sodio NaOH? Datos. NHCl = 0.5 eq. / l VHCl = ? Frmula: Va x N a = V b x N b Sustitucin V HCl =20 ml x 0.3 eq. / l 0.5 eq. / l V NaOH = 20 ml N NaOH = 0.3 eq. / l Despeje: V HCl = 12 ml Va = V b x N b Na

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Preparacin de Reactivos. Reactivos Por equipo cido actico (CH3COOH) 5 mL cido Clorhdrico (HCl) 5 mL Hidrxido de sodio (NaOH) 15 mL* 1M Azul de bromotimol al 1% 2 gotas *Dividir en dos porciones de 15 mL cada una Preparacin de la solucin de NaOH 1 M Cantidad de NaOH a pesar para preparar 1L de solucin 1 M Por todos los grupos 775 mL 775 mL 1 L* 320 gotas

Disolver en agua destilada y aforar a 1L Preparacin de la solucin de cido actico (CH3COOH) y cido clorhdrico (HCl)
Preparacin de la solucin de cido actico (CH3COOH) y clorhdrico (HCl) cido

cido clorhdrico (HCl)

Medir 37.86 mL de HCl y agregar 775 mL de agua. Se sugiere poner primero el agua e ir goteando poco a poco el acido debido a la reaccin exotrmica que se genera.

cido actico (CH3COOH)

Medir 23.3 mL de cido actico (CH3COOH) y agregar 775 mL de agua destilada Valoraciones experimentales llevadas a cabo en el Laboratorio de Bioqumica. Unidad de Posgrado e Investigacin. Facultad de Odontologa

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Valoraciones experimentales llevadas a cabo en el Laboratorio de Bioqumica. Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin. Facultad de Odontologa

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Titulacin de cido clorhdrico (HCl)

Vol. (mL) NaOH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11.5 12 12.5 13

pH 0.83 0.84 0.86 0.88 0.91 0.96 1.03 1.13 1.25 1.48 2.01 11.53 11.84 12.02 12.21 12.3
Titulacin HCl

pH

Volumen de NaOH ( mL )

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Titulacin de cido actico (CH3COOH)

Vol. (mL) NaOH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 17.5 18 18.5 19

pH 2.44 2.91 3.29 3.55 3.74 3.91 4.05 4.17 4.3 4.4 4.53 4.67 4.8 4.94 5.1 5.32 5.67 6.93 10.87 11.49 11.86 12.1

Titulacin CH3COOH

pH

Volumen NaOH ( mL )

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Cromatografa de Aminocidos.

La cromatografa es una tcnica de separacin de molculas que presenta

distintas variantes. En trminos generales, en toda separacin cromatogrfica hay dos fases una mvil (slida, lquida o gas) y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto ntimo. La muestra comprende la fase mvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la mvil. Los componentes presentes en la mezcla que se van a separar, debern recorrer la fase estacionaria a diferentes tiempos, con lo que se produce la separacin. As mismo la separacin de la muestra va a estar en relacin a las propiedades de la fase estacionaria. As como de los tiempos de retencin, ya que un componente que est la mayor parte del tiempo en la fase mvil se mover ms rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta. Clasificacin Lquido - Slido Fase Estacionaria Slido inerte (gel, slice, almina) Intercambio inico Lquido Lquido Resina (Almina) Lquido absorbido en un soporte slido Gas Lquido Capa lquida absorbida en un soporte slido Gas. Soluciones acuosas. Lquido. Fase Mvil Disolventes.

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La ms utilizada en qumica orgnica es la cromatografa lquido-slido en sus dos variantes: cromatografa en columna (CC) y cromatografa de capa fina (TLC). Cromatografa lquido-slido La cromatografa en capa fina consiste en la utilizacin de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Se requieren placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas (en la caso de la slicagel). La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ster < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas Ventajas de la cromatografa en capa fina La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que es ms precisa y ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre
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papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos. Adsorbentes Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente (yeso). Algunos de los adsorbentes ms utilizados son: Celulosa Almidn Azcares Gel de slice (silicagel) xido de aluminio (almina) Carbn activo (carbn en polvo) Kieselguhr Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales. Silicagel Se denomina tambin gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, presenta un pH dbilmente cido, que oscila entre 4 - 5. Por lo que no deber ser utilizado en sustancias que se corrompan o son inestables a pH cido. Los geles de slice normales suelen contener

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impurezas de hierro y/o aluminio, este factor tambin se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40 micras y el tamao de poro vara de 20 a 150. Generalmente para su uso se agrega un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice. Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografa de fase reversa (silanizado). Almina La almina u xido de aluminio es un compuesto bsico que se extrae a partir de la bauxita y el pH bsico se debe a que quedan algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina. La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas, bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez a los componentes polares.

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Preparacin de placas. El adsorbente se debe hidratar en agua y esta mezcla forma una suspensin por lo que debe agitarse de manera mecnica. La proporcin de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Por lo general se utilizan dos partes de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrn de consultarse la instrucciones del fabricante. Como soporte se pueden utilizar lminas de vidrio, pero en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros compuestos orgnicos ms flexibles como el aluminio. Dependiendo del tipo de separacin que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un tamao de placa u otro. En general para realizar una separacin preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20 x 20 cm, 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adicin de compuestos tales como disoluciones amortiguadoras. En la preparacin de las placas tambin se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. Se puede adicionar nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de: 0.1 - 0.2 mm para separaciones analticas. 0.5 - 2 mm para separaciones preparativas.

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Es importante que la mezcla quede homognea ya que la placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al desarrollo de la cromatografa. Existen aparatos que tienen funcin extensora y que se utilizan para crear placas homogneas del espesor deseado. Si no se dispone de extensor, el proceso a seguir es el siguiente: 1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. 2. Agitar enrgicamente. 3. Extender la mezcla es un extremo de la placa. 4. Utilizar el extensor para aplicarla de manera homognea en la placa. 5. Reporsar y en ocasiones para su activacin la placa deber ser horneada como se describe a continuacin. Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo despus de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentndolas durante 30 - 60 minutos a 105 - 110 centgrado. Es importante mencionar que las placas de celulosa se deben calentar menos de 10 minutos y a una temperatura mxima de 105 grado centgrados para expulsar el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se produciran por efecto del cambio de temperatura. Aplicacin de las muestras Las muestras debern estar en solucin, y de preferencia en un disolvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin bajo para que se evapore despus de la aplicacin. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva.
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Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. Para la aplicacin se recomienda la utilizacin de micropipetas y microjeringas o bien tubos capilares. La muestra se aplica tocando la punta del capilar (micropipeta, jeringa, etc) sobre la placa preparada. Es importante que la muestra se aplique dejando una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. Aplicada la muestra se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar. Eleccin de la fase mvil La eleccin de la fase mvil depender del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. Principales eluyentes utilizados como fase mvil en orden creciente de polaridad: ter de petrleo. ter dietlico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.* Etanol. Cloroformo.*

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Metanol. Diclorometano. Agua. cido actico.

*compuestos cancergenos.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores: Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez ms polares. a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente. b) Aplicando un eluyente poco polar. c) Aplicando un eluyente ms polar. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta determinar el o los ms apropiado. Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite
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desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera ms eficaz. Desarrollo de la cromatografa El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en una cmara para cromatografa. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las paredes se tapizan con papel impregnado del eluyente. Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de Rf. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de Rf. Despus del desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire caliente. La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente de elucin, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente de elucin nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

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Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una cmara que contenga un gas inerte o aislada de la luz. Localizacin de sustancias Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos: Mtodos qumicos. Mtodos fsicos. Mtodos qumicos Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no puede realizarse el baado del cromatograma. Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillomarrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras.

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El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado. Adems de estos reveladores generales, existen otros ms especficos como: 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehdos y cetonas). Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminocidos). Mtodos fsicos. El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.

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Constantes de Factor de Corrimiento: Rf La constante Rf (Ratio of Front) es una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como: La distancia recorrida por el compuesto (se mide generalmente desde el centro de la mancha), los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los Rf sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un Rf entre 0.65 y 0.7. Cromatografa de aminocidos. La reaccin con ninhidrina se emplea para detectar y valorar cuantitativamente los aminocidos en cantidades pequeas. La calefaccin con exceso de ninhidrina origina un producto purpreo con todos los aminocidos que poseen un grupo -amino libre, mientras que se forma un producto amarillo cuando se trata de prolina, aminocido en el que el grupo amino se halla sustituido.

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Preparacin de Reactivos: Acetona: cido actico: Agua 13:2:4

Reactivos Acetona (CH3CO)CH3 Acido actico (CH3COOH) Agua destilada Aminocidos ( 0.1 mg /ml) Ninhidrina 1% Solucin problema Por equipo 3.25 mL 0.5 mL 1 mL 0.2 mL 1 mL -----------------Por todos los grupos 528 mL 88 mL 168 mL 31 mL 150 mL ------------------

Preparacin del eluyente mezclar: 3.25 mL de acetona + 0.5 mL de cido actico + 1 mL de agua. ( se prepara al momento) La Ninhidrina se aplica cpb para que se moje todo el papel filtro. Protocolo experimental realizado en el Laboratorio de Bioqumica. Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin. Facultad de Odontologa. Los aminocidos utilizados en este protocolo fueron diluidos 1:10 es decir 100 L en 900 L de agua destilada.

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Resultados Esperados. Cromatograma: Sellar el vaso de precipitados sellado con Kleen-pack.

1 Alanina 2 Leucina. 3 Glicina

1 2 3 4

Leucina Triptfano Arginina Prolina

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Stock de cada aminocido 5 mg/ml. En solucin (1:1) de cido clorhdrico (HCl) 0.01N / Etanol 90%

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Cuantificacin de Protenas.

La determinacin de la concentracin de protenas en una muestra biolgica es un procedimiento rutinario que se realiza en un laboratorios de investigacin y que es de gran utilidad para los procedimientos de western-blot, purificacin de protenas, diagnstico de enfermedades y para otra serie de propsitos. Existen muchos mtodos para la cuantificacin de protenas. Entre los que se encuentran: la absorbencia en luz UV; formacin de derivados qumicos; la unin de protenas con los colorantes. Entre los mtodos colormetros para la deteccin de protenas se encuentran: Biuret, Lowry, cido bicinconnico (BCA); as como los derivados fluorimtricos como o-ftalaldehdo. En estos mtodos la intensidad de la coloracin de directamente proporcional a la cantidad de protenas. Estas reacciones son bastante especficas y existen un grupo limitado de reactivos que interfieren con ellas. La eleccin de los mtodos vara de acuerdo a la sensibilidad de la reaccin y la cantidad de protena presente en la muestra que se desea evaluar. Identificacin de protenas mediante la reaccin el Biuret La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre (CuSO4) en medio alcalino (hidrxido de sodio (NaOH), tartrato de sodio
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potasio o

hidrxido de potasio (KOH)). La reaccin se basa en la

formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones cobre (Cu2+) y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. La reaccin debe su nombre al Biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas. Mtodo Bradford. Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. Este colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (detecta 1 - 15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas. cido Bicinconnico: El cido bicinconnico (sal sdica), es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con iones Cu+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas, es sencillo,

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rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. Mtodo Lowry. Este procedimiento involucra la formacin de un complejo Cobre-protena en un medio alcalino. El complejo reduce al reactivo fosfomolbdicofosfotungstato lo que produce una coloracin azul. Este mtodo de cuantificacin muestra interferencias con detergentes inicos y sulfato de amonio. Curva Patrn. Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de protenas presente en una muestra incgnita. En determinaciones colorimtricas, se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un espectrofotmetro o colormetro en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color. La absorbencia de una muestra es el resultado tanto de la concentracin de muestra sujeta a estudio como de los otros componentes presentes en la solucin. Por lo general, a esos otros componentes se les denomina interferencias, a fin de descartar las interferencias es necesario hacer una solucin que contenga a todos los componentes con excepcin del que se desea medir. A esta muestra se le denomina blanco y la absorbancia de

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ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.

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Preparacin de Reactivos
Reactivos Solucin salina al 38% Suero Albumina stock 10mg/mL Agua destilada Reactivo de Biuret Saliva Por equipo 1.5 mL 3 mL 4.5 mL 36 mL --------------Por todos los grupos 232.5 mL 465 mL 697.5 mL 5.600 L -----------

Preparacin del Reactivo de Biuret 1L

Disolver 1.50 g de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5 H2O) y 6.0 g de Tartrato de sodio-potasio (NaKC4O6* 4 H2O)4 en 500 mL de agua desionizada. Adicionar 300 mL de Hidrxido de sodio (NaOH) al 10 %, aforar a 1L

Para la preparacin de los 5.6 litros pesar lo siguiente: Disolver 8.4 g de Sulfato de cobre pentahidratado y 33.6 g de Tartrato de sodiopostasio en 2.8 L de agua desionizada. Adicionar 1,680 mL de Hidrxido de sodio al 10% aforar a 5.6 L

Preparacin de Hidrxido de sodio (NaOH) al 10%

Disolver 30 g de hidrxido de sodio (NaOH) en 300 mL de agua destilada. Protocolo experimental realizado en el Laboratorio de Bioqumica. Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin. Facultad de Odontologa.

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Resultados Esperados.
Laboratorio de Bioqumica. Posgrado e Investigacin. Facultad de Odontologa. Espectrofotmetro SEQUOIA del laboratorio S-1 Facultad de Odontologa. Tubo 1 2 3 4 5 6 Muestras 7 8 9 ABS 0 0.15 0.366 0.501 0.67 0.685 0.206 0.09 0.572 Conc. mg/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.209 0.041 0.738

Curva patrn para la cuantificacin de protenas

ABS

y = 0.687x + 0.0622 R = 0.9425 Suero albmina de bovino (mg/mL)

Clculo para obtener la concentracin de Protena en la muestra a partir de la curva patrn. Ecuacin de la recta

Despeje de la ecuacin

Ejemplo:

Concentracin de protena en la muestra 1 X = 0.39 mg/mL

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Actividad de la Amilasa Salival.

Almidn.

Es un hidrato de carbono complejo, inodoro e inspido. El almidn es el principal carbohidrato de reserva en la mayora de las plantas y semillas. En las hojas el almidn se acumula en los cloroplastos, donde es un producto directo de la fotosntesis. En los rganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos, en los cuales se forma despus de la translocacin de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas. En los vegetales, el almidn se encuentra en uno o ms granos amilceos en un plastidio. La cantidad de almidn en diversos tejidos depende de muchos factores genticos y ambientales. El almidn se acumula a la luz del da cuando la fotosntesis excede las tasas combinadas de respiracin y translocacin, despus parte del almidn es utilizado durante a noche. Se presentan dos tipos de almidn: amilosa y amilopectina, ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces -1, 4. Las uniones -1, 4 hacen que las cadenas de almidn se enrollen en forma de hlices. La amilopectina consta de molculas muy ramificadas, cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces -1, 6). La amilosa es ms pequea y contiene de cientos a miles de unidades de glucosa, nmero que depende de la especie y las condiciones ambientales. La formacin de almidn ocurre sobre todo por un proceso que implica la

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donacin repetida de unidades de glucosa provenientes de un azcar nucleotdico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de adenosina, ADPG. Hidrlisis d el almidn. La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las primeras enzimas son una amilasa, y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces -1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas amilasas son activadas por Ca++, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero
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solo sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas. Las reacciones hidrolticas no son reversibles, de modo que no se pueden detectar sntesis de almidn por amilasas. Las amilasas estn diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que estn germinando, ricas en almidn. Es probable que la -amilasa tenga ms importancia que la -amilasa para la hidrlisis de almidn. Gran parte de la -amilasa se localiza dentro de los cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidn que atacara. Acta tanto en el da como por la noche aunque, por supuesto, durante la luz de da hay produccin neta de almidn por la fotosntesis. La amilopectina solo es degradada parcialmente por la accin del almidn fosforilasa. La reaccin procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones -1,6 de las ramificaciones, por lo que de nuevo que dan dextrinas. La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminacin repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La almidn fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difcil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidn en las clulas de inters.

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Mtodo de Tincin con Lugol: Este mtodo se usa para identificar polisacridos (almidn y

glucgeno). El lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) de color plido, al reaccionar con un polisacrido, toma un color violeta. En realidad no se produce un cambio qumico, sino de conformacin molecular, el yodo del lugol se introduce entre las caciones del almidn, modificando su coloracin violeta. En el ltimo paso del protocolo, al calentar y enfriar, hacemos que vare configuracin vara diferentes vira a ramifiuna

absorbancia

la estructura molecular del almidn, al enfriarse, la liberndose el yodo y

perdiendo as el color caracterstico, al

volver a calentar, reaparece el color, pues la estructura molecular se recompone.

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Preparacin de Reactivos.
Reactivos Lugol Agua Almidn Por equipo 1.5 mL 12.5 mL 0.5 mL Preparacin de Lugol Por todos los grupos 232.5 mL 2 L 77.5 mL

Disolver 1g de Yodo (I) + 2 g de Yoduro de potasio (KI), en 300mL de agua. Preparacin de la solucin stock de almidn la cual se preparar durante la clase debido a que se contamina fcilmente. Pesar 100 mg de almidn y disolverlos en 1 mL de agua.

0.5 mL/1mL

0.25 mL/1mL

0.1 mL/1mL

100 mg/mL

50 mg/mL

25 mg/mL

10 mg/mL

5 mg/mL

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Resultados Esperados. Cursos Temporales. ( Absorbencia vs. Tpo )

y = -0.0009x + 0.4394 R = 0.9891

y = -0.0013x + 0.3734 R = 0.9898

y = -0.001x + 0.5118 R = 0.9769

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vo ( mg/ mL / min )

y = 3.7094ln(x) + 8.6255 R = 0.8827

Series1 Logartmica (Series1)

Concentracin de Sustrato ( M )

Vo [S] (mg/mL) (mg/mL/min) Vo Almidn (mg/mL/min) 0.5 4.8 1 10 2.5 13 5 13.5

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Velocidad de Recambio Salival y Cuantificacin de Carbohidratos.

La saliva es un fludo de suma importancia en la cavidad oral ya que sirve entre otras funciones para la formacin del bolo alimenticio y otra serie de efectos no por ello menos importantes y que se describen a continuacin. Lubricacin : el serosidad de la saliva es muy eficaz para comida masticada y la formacin del bolo, lo que permite que los alimentos se deslicen de forma eficaz a travs del esfago, sin ocasionar ningn tipo de ulceracin. As mismo a los alimentos secos los solubiliza. Mantiene la higiene oral: El flujo de saliva permite que se mantenga limpia la cavidad oral debido a que entre sus constituyentes se encuentra la lisozima que degrada la pared celular de los microorganismos y de esta forma impide la colonizacin de los diferentes tejidos. Inicia digestin del almidn: las clulas acinares serosas secretan alfaamilasa que pueden comenzar a digerir el almidn en maltosa dieta. La amilasa no est presente, o presente slo en cantidades muy pequeas, en la saliva de los carnvoros o ganado. Presenta funcin de amortiguamiento del pH: mantiene el pH constante y de esta forma la ingesta de alimentos cidos no provocan daos en el esmalte dental.
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Enfriamiento por evaporacin: la saliva ayuda en la evaporacin de lquidos, tal funcin es de gran importancia en la fisiologa de los caninos. La caries dental es una enfermedad que represent un problema importante de salud pblica a finales del siglo XIX y se recrudeci en la dcada de los cincuenta. Es una enfermedad transmisible e irreversible que afecta al 90% de la poblacin. Entre los factores de riesgo se encuentran: un alto riesgo por Streptococcus mutans, alto gradod e infeccin por Lactobacillus, experiencia anterior de caries, dificiente resistencia del esmalte, deficiente capacidad de mineralizacin, mala higiene bucal, baja capacidad amortiguadora dieta cariognica. En cuanto a la dieta cariognica es uno de los principales factores promotores de la caries. Se debe considerar el contenido de azcar, caractersticas fsicas de alimnto, solubilidad, retencin, capacidad para estimular el flujo salival y cambios qumicos en la saliva, la textura, la frecuencia y horario de su consumo y tiempor de permanencia en la boca; todos estos parmetros afectan la baja capacidad amortiguadora salival. As mismo la saliva viscosa es menos efectiva en el aclaramiento de carbohidratos, favoreciendo la desmineralizacin.

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Preparacin de Reactivos.

Reactivos Reactivo de arsenomolibdato Reactivo de cobre mezclado Solucin stock de glucosa Agua desionizada Muestra de saliva

Por equipo 8 mL 8 mL -----------6.5 mL --------------

Curva patrn 12 mL 12 mL 1.5m mL 10.5

Por todos los grupos 1,420 L 1,420L 30 mL 1,165 L --------------

Preparacin del reactivo de arsenomolibdato 1, 500 L

Disolver 75 g de molibdato de amonio ((NH4)6Mo7O24*4H2O) en 1,356 L de agua destilada y agregar 64 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado. Agregar 3g de Na2HAsO4*7H2O disueltos en 80 mL de agua. El reactivo se debe de guardar en un frasco color mbar e incubar a 37 C de 24-48 hrs. Debido a que la mezcla de cido sulfrico (H2SO4) con agua es una reaccin exotrmica, se recomienda poner gota a gota el cido sulfrico (H 2SO4) en el agua y no el agua en cido sulfrico (H2SO4).
Preparacin del reactivo de cobre mezclado 1, 500 L

Disolver 42 g de Na2 HPO4 anhidro y 6 g de tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 1,050 L de agua destilada. Agregar 150 mL de Hidrxido de sodio (NaOH) 1N agitando y 120 mL de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) al 10%. Una vez homogenizada la mezcla agregar 270 g de Sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro y diluir a 1,500 L de agua destilada. Dejar reposar el reactivo 24 hrs y luego decantar el sobrenadante.
Preparacin de la solucin de Hidrxido de sodio (NaOH) 1N

Disolver los 6 g de Hidrxido de sodio en 150 mL de agua destilada Dado que el Hidrxido de sodio tiene solo 1 equivalente la normalidad y molaridad es igual.
Preparacin de la solucin de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) al 10%

Disolver 12 g de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) en 120 mL de agua destilada

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Concentracin Absorbancia 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Muestras 1 2 3 0.124 0.883 0.196 0.102 0.124 0.147 0.187 0.25

Cuantificacin de Carbohidratos

Absorbancia

y = 0.359x + 0.0543 R = 0.945

Concentracin Almidn ( mg/mL )

Clculo para obtener la concentracin de Glucosa en la muestra a partir de la curva patrn. Ecuacin de la recta

Despeje de la ecuacin

Ejemplo:

Concentracin de carbohidratos en la muestra 1 X 0.47 mg/mL

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HISTOGRAMA

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Electroforesis de Protenas.
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas

positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro. La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metiln-bis-acrilamida), en una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. 51

El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las concentraciones de los monmeros. En el gel separador, la movilidad es restringida por el tamao del poro, el cual depende de la concentracin de monmeros del gel. As, si se requiere resolver componentes de muy alto PM, se utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles de poro menor, ej. 15-20% son tiles en la separacin de pptidos y protenas pequeas. Los geles de poro intermedio (10-12%) proveen una separacin adecuada para protenas de ~10.000-90.000 daltons.

Factor de Corrimiento. La movilidad electrofortica relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un grfico con estndares de PM conocido, se obtiene una lnea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestin, entre la distancia recorrida por el colorante azul de bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). E Determinacin del peso molecular de una protena "incgnita", mediante SDS-PAGE. Las muestras fueron reducidas con 2-mercaptoetanol, y corrida en un gel al 12% de concentracin.

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________________________________________________________________
Marcador PM Distancia (mm) Rf (vs.70 mm) ______________________________________________________________________ Albmina bovina 66.000 6,5 0,092 Ovalbmina 45.000 13,0 0,186 Gliceraldeh-3-P-DH 36.000 18,0 0,257 Anhidrasa carbnica 29.000 25,0 0,357 Tripsingeno 24.000 28,5 0,407 Inhibidor de tripsina 20.100 38,0 0,543 -Lactalbmina 14.200 50,0 0,714 Banda incgnita 44,0 0,623 _____________________________________________________________________

Para la grfica de los pesos moleculares se recomienda utilizar papel semilogartmico (X = Rf y y= Log PM). La muestra problema se interpola por regresin lineal en los puntos adecuados. PM (Kda)

y = -26.96ln(x) + 3.2352 R = 0.9636

Movilidad Relativa ( Rf)

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Elaboracin de Reactivos.
Elaboracin del Gel de Acrilamida al 10% por grupo
Reactivos Bis acrilamida Trisma base pH 8.8 Agua TEMED Persulfato de amonio Dodecil sulfato de sodio (SDS) Bis acrilamida Trisma base pH 6.8 Agua TEMED Persulfato de amonio Dodecil sulfato de sodio (SDS) GEL SEPARADOR Por grupo 1666 L 1875 L 1425 L 5 L 25 L 150 L GEL CONCENTRADOR 1250 L 1875 L 4200 L 7.5 L 25 L 75 L Por todos los grupos 25 mL 28 mL 21.3 mL 0.008 mL 0.375 mL 2.25 mL 19 mL 28 mL 63 mL 0.12 mL 0.39 mL 1.1 mL

Preparacin de la solucin de Acrilamida al 30% Bis acrilamida 8%.

Pesar 15 g de acrilamida y 4 g de Bis-acrilamida. Disolver los reactivos en 15 mL de agua y aforar a 50 mL

Preparacin de la solucin Trisma base 1.5 M pH 8.8

Disolver 5 g de Tris en poco de agua destilada, ajustar el pH 8.8 y llevar a un volumen de 28 mL

Preparacin de la solucin Trisma base 0.5 M pH 6.8

Disolver 1.7 g de Tris en un poco de agua destilada, ajustar el pH 6.8 y llevar a un volumen de 28mL
Preparacin del persulfato de amonio.

Pesar 12.4 g de persulfato de amonio y disolverlo en 124 mL de agua destilada

Preparacion del Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10 % para un total de 4 mL

Pesar 0.4 Dodecil sulfato de sodio y disolverlo en 4 mL de agua.

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Solucin amortiguadora para las muestras 5x.

Tris 0.226 g Glicerol 3.75 mL Azul de Bromofenol 0.25 % 1.5 mL. Para la preparacin de Azul de Bromofenol pesar 6.25 mg de azul de Bromofenol y disolver en 2.5 mL de agua. Pesar y medir cada uno de los reactivos indicados y aforar a un volumen de 7.8 mL. A cada una de las muestra se le agregara 10 L de solucin amortiguadora
Buffer de corrida

Tris 12.13 g Glicina 57.63 Dodecil sulfato de sodio 4.0 g Pesar las cantidades indicadas disolver en un poco de agua y ajustar el pH 8.3 aforar a 1L de agua.

Solucin Teidora de protenas.

Preparar 100 mL
Preparacin de la solucin de azul de coomasie al 2 %

Pesar 0.6 g de azul de Coomasie y disolverlos en 30 mL de agua destilada. Agregar 30 mL de cido sulfrico (H2SO4), mezclar y dejar reposar. La solucin anterior se filtra con papel Whatman no 1 y se le agregan 10 mL de hidrxido de potasio (KOH) 10 N, la solucin debe de virar a un color prpura oscuro. A esta solucin se le agregarn 30 mL de TCA 100% y la solucin azul queda lista con un volumen final de 100 mL

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Resultados Esperados.

1 2 3 4 1 Marcadores de Peso molecular. 2,3,4 Muestras de paciente

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Aislamiento de cidos Nucleicos.

El proceso de aislamiento del cido desoxirribonucleico (ADN) depende del tamao de la muestra y la fuente. Aunque los mtodos de extraccin varan en principio comparten algunas de las etapas del proceso de extraccin. La extraccin del ADN es ampliamente utilizada para el anlisis gentico, para fines cientficos, mdicos o forenses. Los cientficos usan el ADN para obtencin de genes, anlisis y mecanismos de control. Por otra parte, en el mbito de la medicina forense es de gran utilidad para la identificacin de cadveres, como evidencias en delitos y en pruebas de paternidad. Durante el proceso de aislamiento del DNA, deben ser eliminadas otras molculas como las protenas, lpidos, polisacridos y en l a medida en la que todos estos componentes se eliminen se obtendr un DNA ms puro y la calidad de los ensayos y sus resultados sern ms certeros. El DNA se puede obtener de cualquier muestra y las fuentes de obtencin diversa como la sangre, el cabello, huesos, uas, saliva, clulas epiteliales, orina etc. Al ser tan variada la muestra de la cual se puede extraer el DNA los mtodos de obtencin deben ajustarse a la muestra en donde se encuentra el DNA. El proceso de aislamiento del DNA comienza con la lisis de tejidos o clulas, con los cual se permite la desnaturalizacin de protenas,

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degradacin de membranas y liberacin de cido nucleicos. La lisis se realiza en soluciones contienen sales, detergentes y proteasas. Otras muestras, como las plantas requieren ser congeladas en nitrgeno lquidos y posteriormente pulverizadas en polvo fino. O bien en los huesos debe eliminarse el mineral antes de extraer el DNA. Las soluciones de lisis contienen por lo general cloruro de sodio, tris, etilendiaminotetra-cetico (EDTA), dodecil sulfato de sodio y la proteinasa K. Los compuestos

orgnicos son disueltos en disolventes orgnicos como fenol, cloroformo, alcohol isoamlico. La obtencin del DNA de muestras obtenidas en hisopos bucales se procesan en tubos eppendorf y las muestras son sometidas a desnaturalizacin con hidrxido de sodio o por ebullicin a 100 grados centgrados, ambos procesos son seguidos de equilibrar el pH de la solucin con amortiguador de acetato de potasio.

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Elaboracin de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos Solucin SAS* 20 mL 3. 100 L Tris 0.4 M pH 8.5 5 mL 775 mL Lauril sulfato de sodio al 5 mL 775 mL 4% EDTA salino* 0.5 mL 77. 5 mL Solucin CSC* 11 mL 1.70 L Etanol 3 mL 465 Ml *SAS (Tris 0.01 M, Sacarosa 0.3 M, Cloruro de magnesio 0.005M y mercaptoetanol 0.005M)
Preparacin de la solucin Tris (C4H11NO3) 0.01 M

Preparacin de la solucin de sacarosa (C12H 22O 11) 0.3 M

Preparacin de la solucin de Cloruro de Magnesio (MgCl2) 0.005 M

Preparacin del -mercaptoetanol (C2H6OS) 0.005 M

Disolver las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos en 1.5 L de agua y aforar a 3.1 L de agua destilada
Preparacin de la solucin Tris (C4H11NO3) 0.4 M pH 8.5

Disolver 37.6 g de Tris en 775 mL de agua. Depender del pH inicial que tenga la solucin para ajustar este a pH 8.5 con cido clorhdrico (HCl) o Hidrxido de Sodio (NaOH).
Preparacin de la solucin de Lauril Sulfato de Sodio (NaC 12 H 25SO 4) al 4%

Pesar 31 g de Lauril Sulfato de sodio (NaC 12 H 25SO 4) y disolverlo en 775 mL de agua destilada. *EDTA salino (EDTA 0.1 M y Cloruro de sodio 0.15 M pH 8.0)

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Preparacin del EDTA 0.1 M

Preparacin de la solucin de cloruro de sodio (NaCl) 0.15 M pH 8.0

Disolver las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos indicados en 77.5 mL de agua destilada. Determinar el pH inicial de la solucin y ajustar el pH con cido clorhdrico (HCl) o Hidrxido de Sodio (NaOH) segn sea el caso. *CSC (Citrato de sodio 0.15M y Cloruro de sodio 1.5 M)
Preparacin de citrato de sodio (C6H5Na3 O7) 0.15 M

Preparacin de la solucin de cloruro de sodio (NaCl) 1.5 M

Disolver las cantidades indicada de cada uno de los reactivos en 1.7 L de agua destilada

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Transformacin, Aislamiento de Plsmido y Digestin.

En este laboratorio se realizar transformacin gentica en cepas de E. coli . La transformacin gentica ocurre cuando una clula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material gentico ( DNA). Esta nueva informacin gentica muchas veces provee al organismo de una nueva caracterstica que se puede identificar luego de ocurrida la transformacin. En este laboratorio se utilizar un procedimiento de transformacin para incorporar en la bacteria E. coli con un plsmido que contiene el gene que codifica para una protena fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extrado de una medusa o agua viva que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La protena fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformacin, bajo la accin de un inductor especfico la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la protena fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. En esta actividad se realizar el proceso de mover un gene de un organismo a otro con la ayuda de un plsmido. Las bacteria dems de poseer un cromosoma grande, comnmente poseen pequeos pedazos circulares de DNA llamados plsmidos (uno o ms de estos). El ADN del plsmido usualmente contiene genes para una o ms caractersticas que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plsmidos entre ellas permitiendo as compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. En este ejercicio usted utilizara el plsmido pIVEX que contiene el gene para hacer la GFP. Usted introducir el pIVEX a la bacteria E coli (C41). Los plasmidos pIVEX contienen adems un gene de resistencia al antibitico ampicilina (amp). pIVEX tambin incorpora un sistema especial de regulacin gentica. Este sistema puede ser usado para el control de la expresin de la protena fluorescente en clulas transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en clulas

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transformadas al aadir isopropil--D-1-tiogalactsido (IPTG) al medio de cultivo donde crecen las clulas. Luego de realizar la transformacin se crecen las clulas en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de clulas transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresin del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con IPTG y con ampicilina se vern fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

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Elaboracin de Reactivos.
Medio Luria Bertani (lquido).
Reactivo Medio Lquido Luria-Bertani Cloruro de Calcio (1 M) Por equipo 2mL 0.02 Por Grupo 20 mL 0.2 Para todos los grupos. 250 mL 2.5

Medio Lquido Luria Bertani. Medio Luria- Betani. g/ 250 mL Triptona 2.5 g

Extracto de levadura 1.25 g NaCl 1.25 g

CaCl2 CaCl2 (110.98) 1 M esterilizar en autoclave aparte. Pesar 16.64 g de CaCl2 y aforar disolver en 150 mL de agua.

Medio Luria-Bertani / CaCl2. Procedimiento: Adicionar 1.25 g de Triptona y 0.75 g de extracto de levadura a 250 mL de agua. Esterilizar en autoclave. En condiciones estriles adicionar 2.5 mL de cloruro de calcio (CaCl2).NOTA: Indicar en la etiqueta que se le adicion calcio. Medio Luria Bertani (slido) g/L 10 g de triptona 5 g de Extracto de levadura 5 g de cloruro de sodio 1 mL de 1N NaOH 15 g de Agar.

Solucin Stock Amplicilina ( 1000 x)

Por cada litro de medio adicionar 1 mL de la solucin estril de ampicilina. Nota: se adiciona cuando el medio alcance una temperatura de 45 grados centgrados, se homogeniza la solucin y se vierten 20 mL por cada caja petri.

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Solucin Stock IPTG (1000 x) Por cada litro de medio adicionar 1 mL de la solucin estril de IPTG. Nota: se adiciona cuando el medio alcance una temperatura de 45 grados centgrados; se homogeniza la solucin y se vierten 20 mL por cada caja petri.

Reactivo Medio LB/slido Medio LB/ slido (Ampicilina + IPTG) Ampicilina (1000 x) IPTG ( 1000x)

Por equipo 20 mL 20 mL 20 L 20 L

Por grupo 200 mL 200 mL 200 L 200 L

Por todos los grupos. 2.5 L 2.5 L 2.5 mL 2.5 mL

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Aislamiento de Plsmido.
Los plsmidos se encuentran en bacterias y constituyen molculas de DNA extracromosmico circular y por lo general son estructuras pequeas. Una de sus caractersticas es que se pueden replicar de manera autnoma e independiente del DNA genmico. Aunque no son estructuras necesarias para que la bacterias puedan sobrevivir si son indispensables para conferirles a las bacterias ventajas adaptativas. Los plsmidos son herramientas en estudios de biologa molecular y de ingeniera gentica porque se utilizan como vectores de clonacin por la sencillez de su estructura. La estrategia en trminos generales consiste en clonar un gene de inters en el plsmido, formando un vector recombinante. Para que los plsmidos puedan ser utilizados como vectores de clonacin deben incluir algunas caractersticas entre las que se encuentran que contengan su propio origen de replicacin, debe poseer sitios de clonacin mltiple y un mapa de restriccin caracterstico. Se igual forma debe contener marcadores genticos que permitan seleccionar a las bacterias que contienen al vector recombinante. Por las propiedades fsico-qumicas de los plsmidos se proceder a su aislamiento mediante la tcnica de hidrlisis alcalina.

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Elaboracin de Reactivos. Medio LB + Ampicilina ( 100 mL). 1.0 g. de triptona. 0.5 g de extracto de levadura 0.5 g de cloruro de sodio Solucin GTE (Glucosa/ Tris/ EDTA) 50 mM Glucosa 25 mM Tris-Cl pH 8.0 10 mM EDTA. Amortiguador TE 10 mM Tris-Cl pH 7.5 1mM EDTA pH 8.0 Solucin de Acetato de Potasio pH 4.8 29.5 mL de cido actico Pastillas de KOH hasta ajustar el pH 4.8 Aforar con agua a 100 mL. Almacenar a temperatura ambiente no autoclavar. Etanol 70%. Tomar 90 mL de etanol absoluto y aforar a 300 mL con agua.

Reactivo Medio LB/slido NaOH/SDS Ampicilina (1000 x) Acetato de Potasio Buffer TE Isopropanol Etanol 70%

Por equipo 2.0 mL 200 L 2.0 L 150 L 50 L 400 l 200 L

Por grupo 20 2000 L 20 L 1500 L 500 L 4000 l 2000 L

Por todos los grupos. 250 mL 25 mL 250 L 20 mL 10 mL 60 mL 30 mL

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Digestin y Electroforesis de Plsmido.

Las enzimas de restriccin, de denominan tambin endonucleasas, cortan los enlaces fosfodister del material gentico a partir de secuencias de reconocimiento, cortan el cido desoxirribonucleico (DNA) de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Las endonucleasas fueron descubiertas por Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por lo que en el ao 1978 obtuvieron el premio Nobel. Y gracias a sus hallazgos se desarroll el campo de la tecnologa del ADN recombinante. Se purifican de organismos procariticos (bacterias), actan como un mecanismo de defensa, degradan material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

1.

Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modifican (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

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2.

Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Slo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP. Designacin

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej: Eco RI E = gnero Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos

de cortes: Rasos o Extremos cohesivos. Las enzimas de restriccin son ampliamente utilizadas en la elaboracin de mapas de restriccin de plsmidos, obtencin de fragmentos para ensayos de Southern o Northern Blot. Clonacin de Fragmentos.

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Preparacin de Reactivos.

Digestin de Plsmidos.
Reactivos 1 H2O (L) Buffer de Digestin (10x) DNA (PIVEX) Bgl I (1 U/L) Pst I (1 U/L) VOLUMEN TOTAL 5 ___ ___ 40 5 1 __ 40 5 ___ 1 40 5 1 1 40 50 __ ___ 400 50 10 ___ 400 50 ___ 10 400 50 10 10 400 31 4 Por grupo 2 30 4 3 30 4 4 29 4 1 310 40 Por todos los grupos 2 300 40 3 300 40 4 290 40

SE SUGIERE QUE SE REALICE LA DIGETIN PARA UNA MUESTRA Y SI AL OBSERVAR EN AGAROSA LA DIGESTIN ES ADECUADA, PREPARAR LA DIGESTIN PARA TODA LA GENERACIN.

SE SUGIERE INCUBAR 1 HR A 37 GRADOS CENTGRADOS.

Electroforesis.

Reactivos Agarosa 1% Bromuro de etidio Buffer TBE pH 8.2

Por grupo 20 mL 10 g 500 mL

Por todos los grupos 300 150 g 7.5 L

Preparacin de agarosa al 1%

Pesar 1 g de agarosa y disolver en 100 mL de Buffer TBE 1x.

Preparacin del Buffer TBE 1x para todos los grupos

Tris base 76.5 g EDTA 6.9 g cido Brico 41.2 g Disolver en un poco de agua destilada, ajustar el pH 8.2 y aforar a 7.5 L

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DIGESTIN DE PIVEX

Marcadores: 1.- Hypper ladder I 2.- BglII (lineal) 3.- PstI (lineal) 4.- SalI (lineal) 5.- BglII+PstI (3,385+992 bp) 6.- BglII+SalI (3,402+975 bp) 7.- Sin digerir

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Titulacin de Saliva.
La caries dental es una enfermedad que se produce por las caractersticas inherentes al husped y a la presencia de los mircroorganismos de la placa dentobacteriana, lo que conlleva a la destruccin del diente. Entre los factores involucrados en el desarrollo de la caries se encuentran los microorganismos, el medio ambiente, la susceptibilidad del husped y el tiempo. Desde hace muchas dcadas, el estudio de la saliva ha sido motivo de gran inters debido a que se ha descubierto que este fludo tiene propiedades muy importantes que contribuyen a la homeostasis de la cavidad bucal. Entre las mltiples funciones de la saliva es encuentra su capacidad para interferir en la adherencia bacteriana y mantenimiento del pH bucal. El pH de la cavidad bucal y de la placa dentobacteriana estn relacionados porque la saliva contiene un par cido base que le permite tener una amplia capacidad de amortiguamiento. Entre los sistemas amortiguadores se encuentra el de bicarbonatos y fosfatos. Aunque es importante resaltar que la presencia de amoniaco y protenas contribuyen a la capacidad amortiguadora. As mismo a pH cido los cristales de hidroxiapatita se disuelven y los individuos son ms propensos al desarrollo de caries.

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Preparacin de Reactivos.

Reactivos cido lctico(H3C-CH(OH)-COOH) 0.05N Hidrxido de sodio (NaOH) 0.05N Azul de Bromotimol 10%

Por equipo 25 mL 25 mL 0.5 mL

Por todos los grupos 3.8 L 3.8 L 77.5 mL

Preparacin de la solucin de cido lctico 0.05N

Disolver los 17.1 g de cido Lctico en 3,8 L de agua destilada.

Preparacin de la solucin de Hidrxido de sodio (NaOH) 0.05N

Disolver los 7. 6 g de Hidrxido de sodio en 3.8L de agua destilada. Preparacin del azul de Bromotimol al 10% Pesar 10 g de azul de Bromotimol y disolverlo en 100 mL de agua

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Cintica de la Lisozima Salival.

La pared celular de las bacterias Gram-positivas est compuesta de un gran nmero de capas de peptidoglicano, que constituye el 90% de la estructura de las paredes celulares. El peptidoglicano es un polmero formado unidades alternas de -(1-4)-N-acetil-D-glucosamin y de cido N-acetilmurmico conformando un polmero lineal y algunas ramificaciones de tetrapptidos formados por L-alanina, D-glutmico, Llisina y D-alanina. Los entrecruzamientos de los tetraptidos permiten la formacin de una estructura en forma de malla que rodea la membrana plasmtica. En el caso de los organismos Gram-negativos, la pared est rodeada de una membrana de fosfolpidos presenta algunas otras estructuras como lipopolisacridos.

Por otra parte, la lisozima es una protena formada por una cadena polipeptdica de peso molecular de 143 kD, que hidroliza el enlace (1-4) entre el N-acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina. Las bacterias Grampositivas son ms susceptibles a la hidrlisis porque presentan paredes muy voluminosas. Las bacterias Gram-negativas son menos susceptibles debido a la presencia de una membrana externa, sin embargo las hidrlisis se puede realizar si las clulas se tratan con un agente quelante como el cido etilendiaminotetra-actico (EDTA), ya que quela los iones metlicos de las membrana externa. La actividad de la lisozima est en funcin tanto del pH como de la fuerza inica. El rango de pH de actividad mxima de la enzima se encuentra en el rango de 6 a 9 y en un valor de pH igual 6.2 se presenta su mxima actividad y en lo que se refiere a la fuerza inica el margen de actividad oscila entre 20 y 100 mM. Para el procedimiento de lisis de la pared celular es conveniente preparar soluciones de lisozima que contengan 500,000 unidades/mL en 10mM Tris-HCl, pH 8.0

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La enzima es soluble en agua y estable por un mes en rangos de temperatura de 2 a 8 grados C . Si se utilizan 25 L de esta solucin lisar Escherichia coli de un mL de medio de cultivo que ha sido resuspendido en 350 L de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 con 0.1 M NaCl, 1mM EDTA y 5% (p/v) de Tritn x-100. Incubando a 37 grados centgrados por 30 minutos.

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Preparacin de Reactivos: Reactivos Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 NaCl 0.15 M Lisozima

Por equipo 41 mL 6 mL 0.5 mL

Por grupo 6.4 L 930 mL 77.5 mL

Preparacin del amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.0

8.0 g de NaCl 0.2 g de KCl 11.5 g de Na2HPO4 2g de KH2PO4 Pesar las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos disolver en 500 mL de agua destilada y ajustar el pH 7.0 aforar a 1 L con agua destilada.
Preparacin de la solucin de cloruro de sodio (NaCl) 0.15M

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Relacin de la caries con las unidades formadoras de colonias de Lactobacillus acidophillus en saliva.

Una meta importante en los trabajadores de la salud es la prevencin de enfermedades y el mbito de la odontologa no es la excepcin. El riesgo de que ocurra la caries en la poblacin mexicana es elevada. La evaluacin de la probabilidad de que la poblacin desarrolle caries requiere de la vigilancia permanente en la salud dental. Lo que conlleva a la identificacin de pacientes que requieren de servicios preventivos as como la deteccin temprana de los individuos que tengan alto de desarrollar la caries. La ventaja de detectar a tiempo la caries se refleja tanto en trminos de salud bucal como en la economa. Por lo que apenas resulta necesario hallar mtodos predictivos que permitan la identificacin de individuos con alto riesgo de desarrollar caries dental, y de esta forma aplicar medidas preventivas. De igual manera abocarse en el cuidado ms intensivo para el grupo de alto riesgo. Entre los estudios se han realizado, se encuentran los hbitos dietticos, el control de placa, pruebas bacteriales. Son estas ltimas las buscan relacionar la incidencia de la caries con las unidades formadoras de colonias de microorganismos altamente cariognicos a saber Streptococcus mutans y Lactobacillus.

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Preparacin de Reactivos.

Medios de Cultivo Bacteriano Medio Bacto mitis salivarius Medio de cultivo Rogosa

Por equipo 2 caja Petri con 20 mL de medio 2 cajas Petri con 20 mL de medio

Por todos los grupos 310 cajas petri con 20 mL de medio 310 cajas petri con 20 mL de medio

Preparacin de Medio de Bacto mitis salivarius 1L, el cual alcanzar para preparar 40 cajas por grupo.

Bacto triptona..10 g Bacto peptona.5g Bacto dextrosa.1g Bacto sacarosa.50g Dipotasa.4g Tripan azul..0.0075g Cristal violeta...0.0008 g Bacto agar..15g pH final 7.0 Disolver en 1L de agua destilada y agregar 150 g de sacarosa (enriquece el medio). Calentar el medio hasta que se disuelva, al calentar cuidar que este no hierva por que tiende a desparramarse Esterilizar 15 minutos a una presin de 15 libras y una temperatura de (121-124C) Cuando alcance una temperatura de 45 C adicionar 1 mL de telurito- Bacitracina. Vaciar 20 mL de medio por cada caja petri, dejar que solidifique y guardar en el refrigerador hasta que sean usadas.
Preparacin Medio de cultivo Rogosa

Bacto triptona10 g Extracto de levadura5 g Bacto dextrosa10 g Bacto arabinosa..5 g

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Bacto sacarosa..5 g Acetato de sodio.15 g Citrato de amonio..2 g Fosfato monobsico..6 g Sulfato de magnesio...0.57 g Sulfato ferroso0.03 g Monoelato de sorbitol1 g Bacto agar.15 g pH final 5.4 Por cada 1000 mL, de agua bidestilada, se agregan 75 g del medio Rogosa. Se homogeniza en un agitador magntico y se calienta hasta hervir. Se deja enfriar a 45 Cy se adicionan 1.32 mL de cido actico y se vuelve a hervir de 2 a 3 minutos. Vaciar en cajas petri 20 mL de medio, dejar que solidifique y guardar en el refrigerador hasta que sean usadas

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Opern de Lactosa de Lactobacillus acidophillus

En la dcada de los sesenta gracias a las valisas investigaciones realizadas por Francis Jacob y por Jaques L. Monod nos permitieron aclarar que la sntesis de protenas no esta circunscrita al RNA ribosmico. Estos investigadores predijeron que las clulas tenan un

RNA mensajero que se sintetizaba a partir de un DNA que actuaba como molde. Jacob y Monod utilizaron como modelo de estudio a la bacteria

Escherichia coli y el objetivo de su estudio consisti en determinar como las bacterias degradaban el carbohidrato lactosa como fuente de carbono. Encontraron que el metabolismo de lactosa estaba controlado por tres enzimas y que los genes que codificaban para estas protenas estn agrupados en forma consecutiva en le genoma bacteriano. A este conjunto de genes se les denomin opern. Los elementos del Opern Lac est constituido por tres genes estructurales. Gen lac z: codifica para la enzima -galactosidasa, cuya funcin es la catlisis de la lactosa en glucosa y galactosa. Gen lac y: codifica para el transportador denominado galactsido permeada, cuya funcin es el ingreso de -galactsidos en el citoplasma bacteriano.
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Gen lac a: codifica para la enzima tiogalactsido transferasa, que cataliza la transferencia de grupo acetil del acetil Coenzima A al grupo hidroxilo en posicin 6 de un aceptor tiogalactsido. As mismo en el operon, encuentran otras regiones que funcionan en la regulacin de la transcripcin. Promotor: regin del DNA, precedente a los genes estructurales y es el sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripcin. Operador: regin del DNA localizada ente el promotor y el comienzo de los genes estructurales. Es el sitio de reconocimiento de la protena represora Lac I. Gen represor: llamado tambin lac I, codifica para la protena represora Laci I, esta protena reconoce a la regin operadora e impide la transcripcin de los genes que estn bajo el control de este promotor pero estimula la unin de la RNA polimerasa formando un Complejo Cerrado. El represor se retira en presencia del inductor que es la lactosa , lo que ocasiona que RNA polimerasa forme un Complejo Abierto y de esta forma iniciar la transcripcin.

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Preparacin de Reactivos. Reactivos Solucin de glucosa al 10% Solucin de lactosa al 10% Solucin de sorbitol al 10% Buffer de fosfatos pH 7 SDS al 1% Cloroformo o-nitrofenil--galactosido al 1% Carbonato de sodio (Na2CO3) 1M

Por equipo 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 1 mL

Por todos los grupos 155 mL 155 mL 155 mL 155 mL 77.5 mL 77.5 mL 77.5 mL 155 mL

Preparacin de la solucin de Glucosa al 10%

Pesar 15.5 g de glucosa y disolverlos en 155 mL de agua destilada

Preparacin de la solucin de Lactosa al 10%

Pesar 15.5 g de lactosa y disolverlos en 155 mL de agua destilada

Preparacin de la solucin de sorbitol al 10%

Pesar 15.5 g de sorbitol y disolverlos en 155 mL de agua destilada

Preparacin del Buffer de fosfatos pH 7 Preparacin de la solucin Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 1%

Pesar 0.775 g de Dodecil Sulfato de Sodio y disolver en 77.5 mL de agua destilada.

Preparacin de o-nitrofenil--galactosido al 1%

Pesar 0.775 g de o-nitrofenil--galactosido y disolver en 77.5 mL de agua destilada.

Preparacin del Carbonato de sodio (Na2CO3)1 M

Pesar la cantidad indicad de reactivo y disolverlo en 155 mL de agua destilada.

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Ficha de Bioseguridad.
Acido Clorhdrico. ( HCl )

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Hidrxido de Sodio ( NaOH)

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Hidrxido de Sodio ( NaOH )

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Ninhidrina

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Bromuro de Etidio.

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Trminos y Definiciones:
cido Dbil: se disocia slo parcialmente y en el equilibrio, existen en la solucin tanto el cido como su base conjugada. cido Fuerte: se disocia completamente en agua; un mol de un cido fuerte HA se disuelve en agua produciendo un mol de H+ y un mol de su base conjugada, A-, y nada del cido protonado HA. cido segn Arrhenius: sustancia que aumenta la concentracin de catin hidronio, H3O+, cuando se disuelve en agua. cido segn Bronsted Lowry: es una especie que dona un protn a una base. cido segn Lewis: especie que acepta un par de electrones de otra especie; es un aceptor de par de electrones. Acidos nuclicos: biomolculas formadas por macropolmeros de nucletidos, o polinucletidos. Est presente en todas las clulas y constituye la base material de la herencia que se transmite de una a otra generacin. Existen dos tipos, el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonuclico (ARN). ADN = Acido Desoxirribonucleico: cido nucleico formado por nucletidos en los que el azcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina, citosina y guanina. Excepto en los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica la informacin para la reproduccin y funcionamiento de las clulas y para la replicacin de la propia molcula de ADN. Representa la copia de seguridad o depsito de la informacin gentica primaria, que en las clulas eucariticas est confinada en la caja fuerte del ncleo. ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta protenica o lipdica. Para la transferencia de genes, suele estar constituida por un plsmido bacteriano que contiene el gen a transferir. Se inyecta directamente en el tejido objetivo donde se expresa generalmente sin integrarse en el genoma de las clulas husped. Alcuota: fraccin exacta de una solucin cuyo volumen se conoce tambin con precisin. Aminocido: molcula orgnica que contiene los grupos amino y carboxilo. Son los

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monmeros de las protenas. De su diversidad como del enorme nmero de combinaciones y longitudes resulta la enorme variedad de protenas existentes. Analito: Son especies qumicas cuya presencia o concentracin se desea conocer. El analito es una especie qumica que puede ser identificado y cuantificado, es decir, determinar su cantidad y concentracin en un proceso de medicin qumica, constituye un tipo particular de mensurando en la metrologa qumica. Biologa Molecular: parte de la biologa que trata de los fenmenos biolgicos a nivel molecular. En sentido restringido comprende la interpretacin de dichos fenmenos sobre la base de la participacin de las protenas y cidos nucleicos. Conjugacin bacteriana: Transmisin de caracteres genticos de una bacteria a otra, de una donante o macho a una bacteria aceptora o hembra (Hayes). La presencia en una bacteria de una variedad de plsmido, el factor F, afirma el carcter "macho de esta bacteria. Conceptos relacionados: plsmido, factor F, factor R. Constante de Equilibrio: K es una expresin de las concentraciones del equilibrio de las molculas o iones en solucin. Cromatografa: es un mtodo muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Cromatograma. grfico que analiza los compuestos que se separan por cromatografa. Enzimas de restriccin: enzimas bacterianas sintetizadas como reaccin defensiva frente ala invasin de ADN extrao, como, por ejemplo, bacterifagos ADN, a los que degrada mientras que el propio est protegido por metilaciones especficas. Cada una de estas enzimas escinden el ADN siempre en el mismo sitio, en loci especficos o secuencias objetivo. Son las tijeras de la ingeniera gentica que abrieron las puertas a la manipulacin gentica. Estandarizacin o normalizacin: proceso mediante el cual se determina la concentracin a la solucin estndar. Se utiliza para titular una muestra de patrn primario. exactitud; se mide con una pipeta. Exones: secuencias de ADN especficas de genes, que codifican secuencias de aminocidos en las protenas. 99

Gen operador: el que pone en funcionamiento el gen estructural. Gen regulador: el que modifica la accin del operador. Gen represor: el que reprime el operador. Gen: unidad fsica y funcional del material hereditario que determina un carcter del individuo y que se transmite de generacin en generacin. Su base material la constituye una porcin de cromosoma (locus) que codifica la informacin mediante secuencias de ADN. Genoma: conjunto de todos los genes de un organismo, de todo el patrimonio gentico almacenado en el conjunto de su ADN o de sus cromosomas. Husped: animal o vegetal que alberga o nutre otro organismo (parsito). En manipulacin gentica, organismo de tipo microbiano, animal o planta cuyo metabolismo se usa para la reproduccin de un virus, plsmido o cualquier otra forma de ADN extrao a ese organismo y que incorpora elementos de ADN recombinado. Indicador: reactivo auxiliar que exhibe un cambio como consecuencia de los cambios en concentracin de las especies qumicas. Intrones: secuencias de ADN que no codifican genes y cuya funcin es desconocida. El 90% del genoma humano no es codificante. Kilobase (Kb): unidad empleada para medir la longitud de los fragmentos de ADN constituidos por una serie de bases. 1 Kb = 1.000 bases. Manipulacin gentica: formacin de nuevas combinaciones de material hereditario por insercin de molculas de cido nucleico, obtenidas fuera de la clula, en el interior de cualquier virus, plsmido bacteriano u otro sistema vector fuera de la clula. De esta forma se permite su incorporacin a un organismo husped en el que no aparecen de forma natural pero en el que dichas molculas son capaces de reproducirse de forma continuada. Al referirse al proceso en s, puede hablarse de manipulacin gentica, ingeniera gentica o tecnologa de ADN recombinante. Tambin admite la denominacin de clonacin molecular o clonacin de genes, dado que la formacin de material heredable puede propagarse o crecer mediante el cultivo de una lnea de organismos genticamente idnticos. Ninhidrina: La ninhidrina es el hidrato de tricetohidrindeno, y es un oxidante muy fuerte que provoca la descarboxilacin oxidativa y desaminacin del aminocido, formando el aldehdo correspondiente, CO2, amonio y una forma reducida de la 100

ninhidrina llamada hidrindantina. Nuclesido: combinacin de un azcar pentosa con una base nitrogenada prica o pirimidnica. Nucletido: monmero de los cidos nucleicos, integrado por la combinacin de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrlisis de cidos nucleicos por accin de nucleasas. Operador: segmento especial del DNA adyacente al promotor que forma parte de la regin controladora de la transcripcin de un opern. El operador interacciona con la protena represora regulando de esta manera el proceso de la transcripcin sincronizada del opern correspondiente. Opern: conjunto del gen operador con los genes estructurales que controla la expresin de genes. Plsmido: molculas formadas de ADN se naturaleza extracromosmica, de forma circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Plsmido: forma no celular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias. Actan y se replican de forma independiente al ADN bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a otras. Igual que los provirus no producen enfermedades pero inducen pequeas mutaciones en las clulas. Se utilizan como vectores en manipulacin gentica. Protena: biomolculas formadas por macropolmeros de aminocidos, o

macropolipptidos. Actan como enzimas, hormonas y estructuras contrctiles que atribuyen a los organismos sus propias caractersticas de tamao, potencial metablico, color y capacidades fsicas. Punto de equivalencia: momento en que se completa la reaccin entre el analito y el titulante, se completa la reaccin. Punto final: momento en que se juzga que se complet la reaccin entre el titulante y el analito, se observa un cambio asociado al punto de equivalencia. Solucin estndar o patrn: solucin de concentracin conocida. Es estable, reacciona con el analito en forma rpida, completa y selectiva.

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Tiempo de retencin en cromatografa: en la cromatografa: tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de concentracin del analito alcanza el detector; es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna; es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico. Tiempo Muerto en Cromatografa: tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector; es el tiempo de migracin de la especie no retenida; es el tiempo necesario para que, por termino medio, una molcula de la fase mvil pase a travs de la columna. Titulacin directa: se aade titulante hasta que la reaccin se completa. Titulacin en retroceso: la muestra se trata con un exceso de solucin de concentracin conocida y luego con otra solucin patrn se determina el exceso Transformacin Bacteriana: Transformacin bacteriana: uno de los procesos naturales de transferencia de material gentico de una bacteria a otra, junto con la conjugacin y la transduccin, que es una integracin directa del ADN. experimentalmente consiste en hacer penetrar un fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una recombinacin gentica. Por extensin (abusiva) se habla a veces de transformacin para designar un proceso idntico que afecta a las clulas eucariticas (levaduras, clulas animales y vegetales). Valoracin o titulacin: proceso en el que se determina el volumen de solucin estndar que reacciona con el analito. Vector: portador, que transfiere un agente de un husped a otro. Sistema que permite la transferencia, la expresin y la replicacin de un ADN extrao en clulas husped para una posterior clonacin o transgnesis. Se trata de una molcula de ADN (plsmido bacteriano, microsoma artificial de levadura o de bacteria) o de un virus defectuoso. Por extensin, un vector designa todo sistema de transferencia del gen, por ejemplo, un sistema sinttico como el de los liposomas. Volumetra: Es la parte del anlisis que se basa en la reaccin entre volmenes de dos soluciones, una de las cuales es de concentracin conocida.

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