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AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTEINAS A PARTIR DE MATERIALES BIOLOGICOS

OBJETIVO: Aislar y purificar protenas a partir de diversos materiales biolgicos FUNDAMENTO: Los mtodos utilizados habitualmente para la separacin de protenas puras se basan en su distinta solubilidad en determinadas condiciones (pH prximo o alejado de su punto isoelctrico, tamao molecular, fuerza inica del medio, etc.) de modo que, por regla general, se favorece la eliminacin de materiales que puedan interferir, precipitando a continuacin la protena deseada y dejando los restantes componentes de la muestra biolgica en el sobrenadante, para su eliminacin. Los mtodos de separacin son diversos. As, la casena, la principal protena de la leche se precipita simplemente por variacin del pH, hasta llegar al punto isoelctrico donde es insoluble en agua. La caserna es, en realidad una mezcla heterognea de fosfoprotenas que se encuentra en una proporcin del 3.5 % en la leche y constituye un alimento muy completo pues posee todos los aminocidos esenciales para un crecimiento y desarrollo normales. La ovoalbmina el principal componente de la clara de huevo (64 %), se obtiene tras precipitar las ovoglobulinas con sulfato amnico y ajuste del pH al punto isoelctrico donde su solubilidad es menor y precipita. La vitelina, una fosfoprotena que se encuentra en la yema de huevo, se obtiene por eliminacin de los lpidos que la acompaan y por disminucin de la fuerza inica del medio. La miosina, una globulina tpica, forma parte del sistema de protenas contrctiles de las miofibrillas del msculo estriado. Como globulina se solubiliza en una solucin salina de fuerza inica baja y precipita al disminuir notoriamente la fuerza inica. El mismo efecto se utiliza para extraer una globulina de un tejido vegetal. La ureasa (cdigo 3.5.1.5) fue la primera enzima cristalina obtenida en forma pura por Sumner, en 1926, a partir de la soya, siguiendo el mismo procedimiento que seguiremos aqu, o sea mediante precipitacin con acetona, a partir del extracto de semillas de soya. La base de la separacin de las protenas que hemos mencionado es el hecho de que la solubilidad de los solutos ionizables, sean protenas o sales inorgnicas sencillas, se modifica por la presencia de otros iones. Cada ion en solucin se encuentra rodeado por una "atmsfera inica" de iones de carga opuesta que puede modificar notablemente la solubilidad de una sustancia inica dada. En general, la solubilidad de una protena aumenta por la presencia de fuerzas inicas relativamente bajas de sales neutras y disminuye por la presencia de fuerzas inicas altas. Normalmente, como sal neutra se utiliza sulfato de amonio para aumentar o disminuir la solubilidad de una protena. La fuerza inica, |x, depende de la concentracin y la carga de los iones. Matemticamente se define como n - y2sc,zi2 donde C ^ concentracin molar del ion z == nmero de cargas de este ion De acuerdo a la frmula, la fuerza inica de un ion polivalente como el sulfato de amonio, (Nt^^SO^ , donde z >1, es bastante mayor que la fuerza inica de un ion monovalente como el NaCI donde z =33 1 . El efecto facilitador de las sales neutras sobre la solubilidad se llama solubilizacin salina o saltng in, en tanto que la disminucin de la solubilidad en presencia de fuerzas inicas elevadas constituye la precipitacin salina o salting out. La solubilizacin salina estabiliza los grupos cargados en las protenas mientras que la precipitacin salina se presenta por una competicin, por el agua, entre la protena y la sal. Al aumentar la concentracin de sal sta desplaza al agua, que se transforma en agua de hidratacin alrededor de los iones cargados de la sal. La consecuencia final es la precipitacin de la protena.

250 ml NaC1 10% 500 mL LiCl 0.7 M 500 mL KC1 0.6 M Mantener en nevera hasta su uso 20 mL tampn de citrato 0.5 M, pH 6.0. Para prepararlo se disuelven en agua 1.208 g de cido ctrico cristalizado y 13.014 g de de citrato trisdico cristalizado, hasta completar 100 mL de solucin. Si no se dispone de citrato trisdico, se pueden disolver 1.208 g de cido ctrico cristalizado en unos 50 mL de agua destilada y se adiciona hidrxido sdico 1 N, gota a gota y con agitacin continua, hasta que el pH-metro marque 6.0. Luego se diluye con agua destilada hasta 100 mL.25 mL tampn de citrato 0.05 M, pH 6.0. El tampn anterior se diluye 10 veces 10 ml tolueno 1 g citrato sdico 10 mg heparina 30 mL sangre fresca de res o humana PROCEDIMIENTO: Obtencin de casena: En un vaso de precipitados de 125 mL vierta 30 mL de leche. Agregue cido actico al 25 %, gota a gota, agitando despus de cada adicin, hasta que se observe la precipitacin floculada de la casena. En este momento el pH debe ser aproximadamente 4.8. Centrifugue a 2000 rpm durante cinco minutos. Si es necesario, agregue un pequeo volumen de agua destilada al vaso de precipitados para pasar todo el slido al tubo de centrfuga. Deseche el sobrenadante. Por dos veces redisuelva el residuo en 30 mL de agua destilada y centrifugue de nuevo. En ambos casos elimine el sobrenadante. Resuspenda el residuo en 20 mL de etanol al 95 % y centrifugue de nuevo. Elimine el sobrenadante. Prepare 20 mL de una mezcla etanol-ter 1:1 y en esa mezcla resuspenda el nuevo residuo. Centrifugue y elimine el sobrenadante. Resuspenda en 20 mL de ter y pase el conjunto a un vidrio de reloj grande o a otro recipiente previamente pesado. Deje secar al aire y pese el conjunto. Por diferencia de pesadas determine la cantidad de casena obtenida. Guarde el polvo blanco obtenido para la prctica de "Caracterizacin de protenas".

MATERIALES Y REACTIVOS: Centrfuga Vidrio de reloj grande Probeta de 50 ml Termmetro Gasa Media de nylon pH-metro Embudo de vidrio Vaso de precipitados de 100 mL Erlenmeyer de 125 mL 2 erlenmeyer de 21 Hielo 100 mL de leche 200 g de carne fresca 100 g de semilla de soya 50 mL etanol al 95 % Conservarlo en nevera I00 mLNaOH 0.lN (760 g/1) 250 mL acetona 50 mL NaCI 0.95 %

nevera bao Mara probeta de 100 mL tijeras algodn guantes de ciruga balanza vaso de precipitados de 500 mL agitador de vidrio erlenmeyer de 500 mL papel de filtro trompa de vaco embudo de separacin de 500 ml 2huevos 50 g de semillas vegetales 50 mL de cido actico al 25 % 100 mL etanol al 50 %. 500 mL ter etlico 250 mL de solucin saturada de sulfato de amonio

Obtencin de ovoalbmina de clara de huevo: Pase una clara de huevo a travs de una malla de media de nylon y recbalas en un vaso de precipitados previamente tarado. Determine el peso de la clara de huevo. Aada un volumen de tantos mililitros de solucin saturada de sulfato de amonio como gramos de clara de huevo haya recogido. Esta adicin se debe realizar con lentitud, casi gota a gota, mientras se agita vigorosamente. Las ovoglobulinas y la ovomucina (principal responsable de la viscosidad de la clara de huevo) precipitan fcilmente y se pueden separar por centrifugacin a 3000 rpm, durante cinco minutos. El sobrenadante se filtra a travs de una mota de algodn situada en el vrtice de un embudo y al filtrado se le aade solucin saturada de sulfato de amonio., gota a gota, hasta que el lquido est totalmente turbio. En este punto se aade cido actico al 25 %, gota a gota y con agitacin continua hasta que el pH de la solucin est prximo a 4.5 (comprobar con papel indicador) que es el punto isoelctrico de la ovoalbmina, A este pH se produce la precipitacin de la protena. El precipitado se separa por centrifugacin a 3000 rpm durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y redisuelva el precipitado, agitando con una varilla, en unos 20 ml de agua destilada. Transfiera a otro recipiente filtrando a travs de un embudo con una mota de algodn. All, aada lentamente, y con agitacin, 20 mL de acetona. El precipitado que se forma se separa por centrifugacin. Pase el residuo a un vidrio de reloj u otro recipiente previamente pesado, adicinele 20 mL de ter y deje secar al aire. Pese el polvo obtenido y gurdelo para la prctica de "Caracterizacin de protenas". Obtencin de miosina: La carne que, en todo momento se debe conservar fra, se muele a mquina o se trocea finamente con unas tijeras (utilice guantes de ciruga) separando los tendones, masas de tejido adiposo y otros contaminantes. Se pesan 100 g de esta carne picada y se les adicionan 300 mL de cloruro de litio 0.7 M (o 300 mL de KC1 0.6 M) previamente enfriado. Se mezcla el conjunto y se agita constantemente, dentro de un bao de hielo, durante una media hora (el grado de molienda de la carne es crtico; cuanto mejor picada y aplastada est, ms adecuada es la disolucin. A continuacin se filtra el conjunto a travs de un embudo con algodn, con el fin de retener las partculas de carne no disueltas. Se recibe el filtrado en un erlenmeyer grande (de dos litros de capacidad) y se le aaden lentamente y mezclando bien, 1200 mL de agua destilada. Se filtra el conjunto a travs de un embudo de algodn. Si el filtrado no es claro se debe volver a filtrar a travs de una nueva mota de algodn. El liquido claro se reparte, en dos partes iguales, en dos erlenmeyers de 2 1 y se aaden 1.2 1 de agua destilada en cada uno (volumen total del conjunto: 4 litros aproximadamente) lentamente y agitando bien. Se dejan los recipientes en la nevera durante una noche. La miosina debe precipitar en este intervalo ya que la fuerza inica es ahora tan baja que no mantiene la protena en solucin. Al da siguiente se decanta el lquido sobrenadante y se recobra un gel de miosina por centrifugacin a 13000 rpm, durante cinco minutos. Guarde este gel para la prctica de "Caracterizacin de protenas". Obtencin de hemoglobina: A 20 mL de sangre fresca agregue 3 mg de heparina o 30 mg de citrato sdico, agite bien y centrifugue a 2000 rpm durante 20 minutos. Descarte el plasma sobrenadante. Se resuspende el precipitado de eritrocitos en un volumen aproximadamente igual de cloruro sdico al 0.95 % y centrifugue de nuevo, durante 10 minutos, para eliminar los restos de plasma. El residuo se resuspende en agua destilada hasta un volumen total de 50 mL. Se agregan 5 mL de tolueno y se mantiene el conjunto a 37 C durante 15 minutos, con agitacin fuerte y constante. Se centrifuga de nuevo a 2000 rpm, durante 10 minutos, y se descartan el precipitado y la fase orgnica que contiene buena parte de los lpidos- Se transfiere la disolucin de hemoglobina a un bao de hielo y se mide su volumen, se agita fuertemente durante tres minutos y se le aade un volumen de etanol fro al 50 %, gota a gota, agitando el conjunto con una varilla para que la precipitacin sea uniforme. Se centrifuga y el residuo se guarda para la prctica de "Caracterizacin de protenas".

Obtencin de vitelina: Pese las yemas (sin restos de clara ni membranas) de dos huevos y mzclelas con tantos mililitros de cloruro de sodio al 10 % como gramos de peso tuviera la muestra, mezclando muy activamente el conjunto hasta que sea bien homogneo. Mida el volumen y pase el conjunto a un embudo de separacin. Adicione, con cuidado, un volumen doble de ter. Se hace girar el embudo de la posicin vertical a una posicin invertida, varias veces, sin agitar. Despus de cada inversin se iguala la presin interna dentro del embudo, con la presin atmosfrica, abriendo alternativamente la tapa o la llave del embudo. Se desecha la fraccin etrea y se repite la operacin dos veces ms o hasta que el ter no se coloree de amarillo. La fase acuosa se diluye con 15 volmenes de agua destilada en un recipiente grande, agitando el conjunto para que todo quede en una concentracin uniforme. Se aprecia un ligero precipitado de vitelina que se puede dejar sedimentar durante la noche dentro de la nevera. Antes de guardar en la nevera agregue a la solucin 0.5 mL de tolueno por cada litro de agua para evitar la putrefaccin bacteriana. Pasado este tiempo se decanta la mayor parte del lquido y se recoge la vitelina por centrifugacin a 5000 rpm, durante cinco minutos. La protena se suspende en unos 15 mL de acetona-agua (1:1), deshaciendo los posibles grumos con una varilla. Se centrifuga de nuevo, se descarta el sobrenadante se lava el precipitado con unos 15 mL de acetona pura y se vuelve a centrifugar. Se elimina el sobrenadante y el residuo se pasa a un vaso de precipitados pequeo, previamente pesado. Para facilitar el paso de un recipiente a otro se pueden utilizar pequeas porciones de ter. Se elimina la mayor cantidad posible de lquido por decantacin y el resto se deja secar al aire. Se pesa el polvo seco que queda y se guarda para la prctica de "'Caracterizacin de protenas". Obtencin de ureasa: Se muelen 100 g de semillas de soya frescas (deben conservar la capacidad de germinar) hasta convertirlas en harina muy fina. La harina se transfiere a un erlenmeyer de 500 mL que contenga 300 mL de agua, se deja que se disuelva durante dos horas, agitando de vez en cuando para resuspender la harina. El sobrenadante claro se recoge por filtracin o centrifugacin a 3000 rpm, durante cinco minutos. S el sobrenadante no est claro debe repetirse la filtracin. A continuacin se concentra el lquido hasta unos 50-75 mL por evaporacin en la trompa de vaco en un bao de agua a unos 30-35 C. Se filtra de nuevo la disolucin y el sobrenadante claro se precipita con 0.6 volmenes de acetona pura y fra (conservada previamente en nevera). Se deja en nevera unas dos horas, se decanta el lquido claro y se centrifuga el resto. El precipitado de ureasa se disuelve en 10 mL de tampn de citrato 0.05 M, pH 6.0. Se agita suavemente durante dos horas, a temperatura ambiente. Se centrifuga el conjunto y se elimina el precipitado. El sobrenadante se guarda para la prctica de Caracterizacin de protenas" RESULTADOS: Cules son las caractersticas fsicas de la solucin o del polvo de protena obtenido? Cul es el porcentaje de la protena aislada (en los casos en que se obtuvo un polvo) con respecto a la muestra biolgica utilizada? Compare ese valor con el que se encuentra en la literatura En el caso de la ureasa, cmo podra comprobar que se obtuvo esta protena?