NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 5224
2003-11-26

ACEITES Y GRASAS VEGETALES Y ANIMALES COMESTIBLES. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE TRIGLICRIDOS POLIMERIZADOS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE EXCLUSIN DE ALTO RENDIMIENTO

E:

ANIMAL AND VEGETABLE FATS AND OILS. DETERMINATION OF POLYMERIZED TRIGLYCERIDES CONTENT BY HIGH PERFORMANCE SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (HPSEC)

CORRESPONDENCIA:

esta norma es una adopcin idntica (IDT) por traduccin de la ISO 16931:2001 determinacin de triglicridos; cromatografa; grasa; alimentacin; grasa vegetal; grasa animal; aceite vegetal; aceite animal; grasas y aceites.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 67.200.10
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

Editada 2003-12-11

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 5224 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2003-11-26. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 49 Aceites y Grasas Vegetales y Animales comestibles. ACEGRASAS S.A. CARULLA VIVERO S.A. COMERCIALIZADORA INTERNACIONAL SANTANDEREANA DE ACEITES S.A. C.I.S. ACEITES S.A. COMESTIBLES RICOS FBRICA DE GRASAS Y PRODUCTOS QUMICOS S.A. -GRASCOFEDEPALMA INDEPENDIENTE - NATALIA GARNICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas:

ASINAL LTDA. ASOCIACIN NACIONAL DE INDUSTRIALES COLOMBINA S.A. COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. COMPAA NACIONAL DE LEVADURAS CORP PRODUCTS INTERNATIONAL DISA S.A. FABRICA DE ACEITES Y MARGARINAS DEL MAGDALENA FEDEPALMA (CENIPALMA) FEDERACIN NACIONAL DE CULTIVADORES DE PALMA DE ACEITE FIRMENICH S.A.

INDUSTRIAS ALIMENTICIAS NOEL ZENU S.A. INDUSTRIAS DEL MAZ S.A. INVIMA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. LLOREDA S.A. LUCTA GRANCOLOMBIANA LTDA. MANUELITA S.A. DIVISIN ACEITES Y GRASAS MAURICIO OTLORA INDEPENDIENTE MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MINISTERIO DE AGRICULTURA

MINISTERIO DE COMERCIO INDUSTRIA Y TURISMO (MINISTERIO DE DESARROLLO) MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL (MINISTERIO DE SALUD) NESTLE DE COLOMBIA S.A. NULAB LTDA. PRODUCTOS RAMO RENTAFRIO S.A. SACEITES S.A.

SOCIEDAD INDUSTRIAL DE GRASAS Y VEGETALES SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y COMERCIO UNILEVER ANDINA COLOMBIA S.A. UNILEVER BESTFOODS UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA UNIVERSIDAD DEL VALLE UNIVERSIDAD INCA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 5224

ACEITES Y GRASAS VEGETALES Y ANIMALES COMESTIBLES. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE TRIGLICRIDOS POLIMERIZADOS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE EXCLUSIN DE ALTO RENDIMIENTO

1.

OBJETO

La presente norma especifica un mtodo que usa HPSEC para determinar el contenido de triglicridos polimerizados en aceites y grasas que contienen al menos 3 % (del rea total de los picos ) de estos polmeros. Este mtodo es aplicable a grasas para frer, y a grasas y aceites que han sido tratados trmicamente. Tambin se puede aplicar a la determinacin de polmeros en grasas para alimentos para animales.
NOTA 1 Los triglicridos polimerizados (estrictamente hablando, triglicridos dimricos y oligomricos) se forman durante el calentamiento de grasas y aceites, y as el mtodo sirve para evaluar el deterioro trmico de las grasas para frer, con el uso. NOTA 2 En el caso de anlisis de grasas de alimentos para animales, el mtodo de extraccin usado puede influir en el resultado (vase la norma ISO 6492). NOTA 3 Los niveles de del contenido de triglicridos polimerizados, dependen de las condiciones de uso (temperatura del aceite y naturaleza del producto a frer).

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS

El siguiente documento normativo contiene disposiciones que, mediante referencia en este documento normativo a este texto, constituye disposiciones de la misma. En el momento de su publicacin era vigente la edicin indicada. Todas las normas estn sujetas a revisin, por lo tanto, se invita a las partes que realicen acuerdos con base en esta norma, a investigar la posibilidad de aplicar las ediciones ms recientes del siguiente documento. Los miembros de IEC e ISO llevan registros actualizados de las normas internacionales. NTC 5033:2002, Grasas y aceites animales y vegetales. Preparacin de la muestra para ensayo. (ISO 661:1989).

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3. TRMINOS Y DEFINICINES

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Para los propsitos de esta norma, se aplica el siguiente trmino y definicin: 3.1 triglicridos polimerizados componentes de grasas y aceites sometidos a calentamiento que se determinan por HPSEC bajo las condiciones especificadas en esta norma.
NOTA El contenido se expresa como un porcentaje de todos los picos de acilglicridos eludos (TAG, PTAG, DAG y MAG).

4.

PRINCIPIO

Se disuelve la muestra en tetrahidrofurano, luego los triglicridos polimerizados se separan por cromatografa por permeacin en gel, de acuerdo con su tamao molecular. La deteccin de los componentes se lleva a cabo por medio de un detector de ndice de refraccin. 5. REACTIVOS

Se usan slo reactivos de grado analtico reconocido. 5.1 Tetrahidrofurano, posiblemente estabilizado con BHT (0,1 %), desgasificado.

Es importante que el tetrahidrofurano usado para disolver la muestra tenga el mismo contenido de agua que el eluente, de lo contrario puede aparecer un pico negativo. 5.2 5.3 Tolueno Sulfato de sodio anhidro

6.

EQUIPO

El equipo de laboratorio usual, y en particular, el siguiente: 6.1 Depsito para el solvente, con capacidad aproximada de 250 ml, con un filtro en lnea de fase mvil (tamao de poro 1 m). 6.2 Bomba para HPLC, con una tasa de flujo volumtrico mnima de 0,5 ml/min.

6.3 Vlvula de inyeccin con un bucle (loop) de 10 l y una jeringa adecuada con un volumen de 50 l a 100 l o un automuestreador con un loop de 10 l. 6.4 Columna de acero inoxidable de 300 mm de longitud, y 7,5 mm a 7,8 mm de dimetro interno, empaquetada con una gel esfrica de alto rendimiento, hecha de copolmero de estireno-divinilbenceno; dimetro de partculas: 5 m; tamao de poro 10 nm o su equivalente en trminos de potencia de exclusin y resolucin (vase el numeral 10.1). Se recomienda un dispositivo de control de temperatura, para mantener la temperatura de la columna entre 30 C y 35 C.

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Si es necesario, la columna se debera almacenar en tolueno (vase el numeral 5.2). 6.5 Detector de ndice de refraccin a temperatura controlada, con una sensibilidad a escala total, de al menos 1 x 10-4 del ndice de refraccin. La temperatura ideal del detector debe ser estable y estar entre 5 C y 10 C por encima de la temperatura ambiente. 6.6 Registrador y/o integrador, o sistema de datos de cromatografa computarizados (CDS), para permitir la visualizacin y cuantificacin exacta de las reas de pico.

7.

MUESTREO

El muestreo no es parte del mtodo especificado en esta norma. En la norma ISO 5555 (NTC 217) se presenta un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que no haya sufrido dao o cambios durante su transporte o almacenamiento. 8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con la norma ISO 661 (NTC 5033). 9. PROCEDIMIENTO

NOTA Si se requiere verificar si se cumple el lmite de repetibilidad (vase el numeral 11.2), se llevan a cabo dos determinaciones sencillas, de acuerdo con los numerales 9.1 y 9.2.

9.1

ACONDICIONAMIENTO DEL EQUIPO DE HPLC

Se recomienda seguir cuidadosamente las recomendaciones del fabricante. Encienda el sistema y bombee tetrahidrofurano a una tasa de flujo de volumen entre 0,5 ml/min y 1 ml/min, para purgar el sistema completo hasta la vlvula de inyeccin. Conecte la columna a la vlvula de inyeccin y lave con 30 ml de tetrahidrofurano aproximadamente. Conecte la columna a la celda de muestra del detector, y llene la celda de referencia con tetrahidrofurano. Ajuste el flujo de fase mvil entre 0,5 ml/min y 1,0 ml/min. Espere hasta que se obtenga la adecuada estabilizacin del sistema (no hay una desviacin apreciable de la lnea de referencia). Si la composicin de la columna es como se indica, se debera obtener un sistema de estabilizacin aceptable en aproximadamente 15 min. Con otras columnas empaquetadas, la estabilizacin del sistema puede ser ms difcil. Por ejemplo, el cambio de la fase mvil debera hacerse progresivamente del tolueno al tetrahidrofurano, con mezclas diferentes, cada una con 25 % ms de tetrahidrofurano. Normalmente se obtiene una estabilizacin aceptable en 12 h aproximadamente. 9.2 PREPARACIN Y ANLISIS DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Pese aproximadamente 50 mg de grasa o aceite y adicione de 1 ml a 3 ml de tetrahidrofurano y homogenizar. Agregue 50 mg de sulfato de sodio anhidro y deje reposar de 2 min a 5 min, y pase esto por un filtro de 1 m. Usando la jeringa, tome de 50 l a 100 l de esta solucin. Llene el bucle (loop) de inyeccin, inyecte y encienda el integrador. 3

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Si se usa un automuestreador, llene los tubos de muestra, accione el automuestreador y encienda el integrador o sistema de tratamiento de datos . Con una tasa de flujo de fase mvil de 1 ml/min, el tiempo de anlisis es de 10 min aproximadamente. La eficiencia de la columna, determinada como el nmero de platos tericos (N) para los triglicridos monomricos, debera ser al menos 6 000. 10. 10.1 EXPRESIN DE LOS RESULTADOS ANLISIS CUANTITATIVO

El patrn cromatogrfico de la determinacin muestra un pico principal representativo de los triglicridos monomricos (masa molecular aproximada 900) y uno o varios picos con tiempos de retencin ms cortos representativos de triglicridos polimerizados (dmeros y oligmeros superiores). En condiciones adecuadas, los triglicridos (TAG) y triglicridos polimerizados (PTAG) se pueden separar con una buena resolucin [vase la Figura 1a) y b)] incluso a niveles bajos de triglicridos polimerizados. Sin embargo, en algunos casos (que parecen estar relacionados con fenmenos de degradacin complejos), el patrn pico que antecede los picos de triglicridos puede ser menos claro, con las consiguientes dificultades para los clculos [Figura 1 c)].

TAG

TAG
TAG

PTAG

PTAG

D W d
a) Contenido de PTAG 1 % b) Contenido de PTAG 10 % c) Contenido de PTAG 10 %

PTAG

Figura 1. HPSEC de triglicridos (TAG) y triglicridos polimerizados (PTAG)

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10.2 ANLISIS CUANTITATIVO

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Los clculos se realizan utilizando el mtodo de estndar interno, suponiendo que todos los componentes de la muestra que han eluido tienen el mismo coeficiente de respuesta. El contenido de triglicridos polimerizados se calcula de la frmula:

PPTAG =

A A

PTAG tot

x 100 %

en donde PPTAG APTAG Atot = = = es el porcentaje de triglicridos polimerizados, con base en las reas pico. es la suma de reas de los picos de triglicridos polimerizados. es la suma de las reas de todos los picos representativos de acilglicridos (TAG, PTAG, DAG y MAG).

Para calcular APTAG son posibles los dos casos siguientes: Una buena resolucin entre picos (R 1) Los mtodos generales de integracin (manual y electrnica) se pueden usar para calcular reas individuales y totales. b) Una deficiente resolucin entre picos (R < 1) Se supone que todos los componentes eludos antes (dr 0,5 w) (vase ms adelante) son triglicridos polimerizados. La resolucin se calcula de:
R = D W

a)

en donde: D = distancia, en milmetros, entre los picos mximos de los triglicridos no polimerizados (TAG) y los triglicridos polimerizados adyacentes (PTAG). ancho, en milmetros, del pico de los triglicridos en la lnea base, medido entre los puntos de interseccin entre las tangentes y la lnea base . es la distancia de retencin, en milmetros, desde el comienzo del cromatograma al pico mximo para los triglicridos.

dr

El integrador de datos se debe ajustar cuidadosamente usando integracin electrnica (integracin horizontal inversa), para integrar todas las superficies entre la curva y la lnea de referencia. Si se usa una tcnica manual, es necesario determinar el rea pico de los glicridos mediante triangulacin. 5

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Los resultados se expresan con un lugar decimal. 11. 11.1 PRECISIN ENSAYOS INTERLABORATORIO

En el Anexo A se resumen los detalles de los ensayos interlaboratorio acerca de la precisin del mtodo. Es posible que los valores obtenidos de estos ensayos interlaboratorio no sean aplicables a rangos de concentracin y matrices diferentes de los dados. 11.2 REPETIBILIDAD

Cuando los valores de dos resultados de ensayos sencillos e independientes, obtenidos usando el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo, en un intervalo de tiempo corto, estn dentro del mismo rango de los valores medios de la Tabla A.1, la diferencia absoluta entre los dos resultados de ensayo obtenidos ser, en mximo el 5 % de los casos, mayor que el lmite de repetibilidad (r), que generalmente se puede obtener mediante interpolacin lineal de los valores de la Tabla A.1. 11.3 REPRODUCIBILIDAD

Cuando los valores de dos resultados de ensayos sencillos obtenidos usando el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico en diferentes laboratorios, con diferentes operadores y diferentes equipos, estn dentro del rango de los valores dados en la Tabla A.1, la diferencia absoluta entre los dos resultados de ensayo obtenidos ser, en mximo el 5 % de los casos, mayor que el lmite de reproducibilidad (R), que generalmente se puede obtener mediante interpolacin lineal de los valores de la Tabla A.1. 12. REPORTE DE ENSAYO

El reporte de ensayo debe especificar:

Toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra. El mtodo de muestreo usado, si se conoce. El mtodo de ensayo usado, con referencia a esta norma. Todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influenciado los resultados de los ensayos. Los resultados de ensayo obtenidos, o si la repetibilidad se ha verificado, el resultado final obtenido.

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ANEXO A (Informativo)

RESULTADOS DE ENSAYOS INTERLABORATORIO

Dos ensayos interlaboratorio realizados a nivel internacional en 1986 y 1987 por la Comisin IUPAC sobre aceites, Grasas y Derivados, en el cual participaron 10 y 17 laboratorios respectivamente, con dos resultados de ensayo para cada muestra, dieron los resultados estadsticos (evaluados de acuerdo con la ISO 57251) resumidos en la Tabla A.1.
Tabla A.1 Muestra D 17 16 32 5,2 0,1 2,9 0,3 0,3 6,7 1,0

Nmero de laboratorios Nmero de laboratorios conservados despus de eliminar los atpicos Nmero de resultados aceptados Contenido medio de triglicridos polimerizados (porcentaje de triglicridos totales), % a Desviacin estndar de repetibilidad, sr Coeficiente de variacin de la repetibilidad a Lmite de repetibilidad, r (2,8 sr) a Desviacin estndar de reproducibilidad, sR Coeficiente de variacin de reproducibilidad a Lmite de reproducibilidad, R (2,8 sR)
a

A 17 15 30 1,8 0,1 5,5 0,3 0,4 23,7 1,2

B 10 9 18 2,4 0,07 2,8 0,19 0,61 25,9 1,7

C 10 10 20 3,6 0,12 3,3 0,34 0,45 12,5 1,25

F 16 16 32 9,7 0,3 3,2 0,9 0,4 4,6 1,3

G 16 15 30 10,0 0,2 2,2 0,6 1,2 12,2 3,5

H 10 10 20 22,0 0,18 0,8 0,51 1,48 6,8 4,2

Expresado como porcentaje de glicridos totales

La ISO 5725:1986 (ahora anulada) se us para obtener datos de precisin.

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BIBLIOGRAFA

[1] [2]

ISO 5555:1991, Animal and Vegetable Fats and Oils. ISO 5725:1986, Precision of Test Methods Determination of Repeatability and Reproducibility for a Standard Method by Inter-Laboratory Tests. ISO 5725-1:1994, Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results Part 1: General Principles and Definitions. ISO 5725-2: 1994, Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and Results Part 2: Basic Method for the Determination of Repeatability and Reproducibility of a Standard Measurement Method. ISO 6492:1999, Animal Feeding Stuffs Determination of Fat Content.

[3]

[4]

[5]

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DOCUMENTO DE REFERENCIA

NTC 5224

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Animal and Vegetable Fats and Oils Determination of Polymerized Triglycerides Content by High-Performance Size-Exclusion Chromatography (HPSEC). ISO, 2001, 8 p. (ISO 16931).