TITULO: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE Escherichia coli

Se define medio de cultivo como un conjunto de nutrientes, hormonas de crecimiento, y otros que condicionan para el desarrollo de los microorganismos. La variedad de medios de cultivo esta directamente relacionada con la diversidad metablica de los microorganismos. Los constituyentes ms frecuentes de los medios de cultivo son: Agar.Es utilizado como agente gelificante para los medios de cultivo slido, el agar no es empleado cono nutriente. El agar bacteriolgico estructuralmente esta constituido de polisacridos que se obtiene de ciertas algas marinas, aunque se trata de un producto natural se lava y se purifica durante su elaboracin. Un gel de agar al 2% en agua licua a los 100 C y se gelifica a los 40 C. Peptonas.Las peptonas contienen pptidos y aminocidos. Se obtiene por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales. Agar Extractos Peptonas Sistemas amortiguadores Indicadores de ph Agentes reductores Agentes delectivos

Extractos.Son obtenidos a partir de carne, hgado, cerebro y semillas con agua y calor y posteriormente concentrados en forma de pasta o polvo. Estos preparados son frecuentemente liofilizados. Sistemas amortiguadores.Se utiliza soluciones buffer al medio de cultivo para mantener el pH ptimo de crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms frecuentemente utilizados en ingeniera gentica son neutrfilos, es decir, el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad.

Indicadores de pH.Estos compuestos cido base son aadidos al medio de cultivo para detectar variaciones de pH. Agentes reductores.Se aaden elementos reductores para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microarofilos o anaerobios. Entre estos agentes estn: La cisteina, tioglicolato y otros. Agentes selectivos.La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo permite el aislamiento de bacterias que han sufrido transformaciones genticas. En algunos casos, por ejemplo, se utiliza cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., en la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. Clases de medios de cultivo: Medios generales Medios de enriquecimiento Medios selectivos Medios diferenciales

Medios generales.- En stos se desarrollan una gran variedad de microorganismos. Medios de enriquecimiento.- Favorece el crecimiento de un determinado microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto celular. Medios selectivos.- Permiten el desarrollo de un microorganismo determinado, inhibiendo el desarrollo de otros. Medios diferenciales.- Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades de un microorganismo determinado. PROCEDIMIENTO Actualmente la mayora de los medios de cultivo se encuentran en el comercio, stos estn liofilizados, por tanto, es preciso rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada para un determinado volumen y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante,

En un medio slido, habitualmente se procede a fundir el agar en un bao maria antes de esterilizarlo, en ningn caso la altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Medio de cultivo slido. Extracto de levadura Triptona o peptona Cloruro de sodio Agar Agua destilada csp. Ph del medio de cultivo 7.0 5 g 10 g 10 g 15 g 1000 ml

Prepare 40 ml de medio de cultivo slido una vez fundido, despus del autoclavado, deben plaquearse en dos cajas petri un volumen aproximado de 20 ml despus de la solidificacin guardar el medio de cultivo nutritivo a 4C FLUJOGRAMA
Medio de cultivo slido Estracto de levadura Triptona o peptona Cloruro de sodio Agar Agua destilada pH 7.0

Homogenizar

Bao maria

Esterilizar

Autoclavar 25 min 121 C 1 atmosfera

Enfriar hasta 50 C

Plaquear en cajas petri Solidificar Guardar a 4 C

TITULO: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Escherichia coli

Los microorganismos son imperceptibles para el ojo humano y para observarlos es esencial el microscopio. En la observacin en el microscopio se deber tomar en cuenta el contraste y la resolucin. Los microorganismos deben de poseer un cierto grado de contraste para ser observados a travs del microscopio, para este efecto, las bacterias necesitan ser previamente teidos con tinciones simples. Para identificar caractersticas morfolgicas o estructurales de las bacterias , se emplean tinciones diferenciales. La tincin diferencial ms empleada es la tincin de Gram. El aplicar esta tcnica microscpica no es suficiente, por ello, es una necesidad conocer los ciclos biolgicos de las bacterias, stas son capaces de modificar el ambiente que las rodea, utilizando sustancias para su multiplicacin y liberando al medio metabolitos secundarios de desecho, por ejemplo, enzimas, exotocinas, y otros. Las interacciones que cada clase bacteriana establece con el entorno son propias y caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa e un determinado grupo enzimtico. Por tanto, la caracterizacin de dichas enzimas es una herramienta para la identificacin y clasificacin bacteriana. PROCEDIMIENTO Coloque frente a usted el mechero y la muestra que contiene los microorganismos, as como el resto del material. Flamee el filamento del asa, hasta que ste alcance un rojo incandescente. Realice todas las operaciones en la proximidad de la llana, introduzca el asa de siembra en la muestra. Transfiera el inculo al medio de cultivo slido (medio nutritivo ) y siembre en zigzag sobre la superficie. Incube a 37 C 24 horas o el tiempo necesario para que se desarrollen las bacterias.

Aislamiento e identificacin.Despus del desarrollo bacteriano en la caja petri, transfiera una colonia con el asa, siembre por agotamiento por estras en agar McConkey . Es un medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias no entricas. Es considerado como un medio diferencial, por que contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias son capaces de fermentar este azcar producirn un cambio en el pH del medio por la liberacin de productos cidos. Como consecuencia las colonias aparecern de color violeta, contrastando con la coloracin amarilla de las colonias de bacterias incapaces de fermentar la lactosa.

COLONIAS DE Escherichia coli LACTOSA POSITIVA

SALMONELLA LACTOSA NEGATIVA