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Microbiologia-pseudomonas y Burkholderia

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pseudomonas
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PSEUDOMONAS Y BURKHOLDERIA

1. Generalidades de Pseudomonas y Burkholderia Las especies pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Burkholderia son en general catalasa y oxidasa positivas. • Morfológicamente indistinguibles al Gram, se presentan como bacilos Gram negativos rectos o ligeramente curvos.

Su tamaño oscila entre 1 a 5 μm de largo y 0.5 a 1 μm de ancho. Son aerobios, aunque algunas cepas pueden crecer bajo condiciones anaeróbicas usando el nitrato como aceptor final de electrones. No forman esporas y son móviles con 1 o más flagelos polares a excepción de B mallei, el cual no es móvil.

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Estos grupos tienen requerimientos nutricionales mínimos y crecen en agar MacConkey como no fermentadores de lactosa. Las especies de éstos géneros pueden encontrarse ampliamente distribuidos en el ambiente; suelos, agua y formando parte de la flora normal de animales y del hombre. Debido a su habilidad de sobrevivir en ambientes húmedos y de poseer una resistencia innata a los antibióticos, este patógeno es particularmente importante en infecciones intrahospitalarias. Como son agentes patógenos oportunistas, pueden producir infecciones serias en pacientes con compromiso inmunológico; convirtiéndose así en agentes importantes de infecciones nosocomiales. La virulencia de éstos agentes radica en su capacidad de colonizar varios sitios anatómicos humanos, la propiedad para invadir tejidos y producir daño tisular. Además de la tendencia característica de invadir torrente sanguíneo.

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P aeruginosa puede encontrase produciendo: Infecciones en piel de pacientes quemados En esputos de pacientes con fibrosis quística y una gran variedad de infecciones.

P fluorescens puede producir bacteremia en pacientes transfundidos debido a su capacidad de crecer a 4ºC, ambiente bajo el cual se almacena la sangre en los Bancos de Sangre. P stutzeri y P versicularis han sido reportados produciendo bacteremias en pacientes hemodializados, por encontrarse contaminado el equipo de diálisis renal. P. alcaligenes se ha reportado produciendo endocarditis asociado a infección por contaminación de un catéter en un paciente con transplante de médula ósea. B pseudomallei produce la melioidosis en animales, transmisible a humanos. B cepacia se asocia con bacteremias e infecciones del tracto urinario, particularmente cuando se hace uso de catéteres. B mallei, B picketii y B gladioli no son importantes en infecciones en humanos. Los géneros Pseudomonas y Burkholderia pertenecen, entre otras bacterias, a un grupo conocido como bacilos Gram negativos no fermentadores - no fastidiosos. Este grupo es muy heterogéneo, se encuentran géneros móviles y no móviles, inertes a los carbohidratos y otros que son capaces de utilizar carbohidratos vía oxidativa. Pero en general, se caracterizan por ser aerobios estrictos y tener requerimientos nutricionales mínimos. Las especies de Pseudomonas se clasifican según el grado de homología que haya en el ARNr de manera que se han descrito las especies: • P. aeruginosa • P. fluorescens • P. stutzeri

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P. alcaligenes P. putida P. versicularis.

Existe otro género conocido como Burkholderia donde se han agrupado otras especies que pertenecieron anteriormente al género de las Pseudomonas. Entre ellas están: B. cepacia, B. pseudomallei, B. picketii, B. mallei entre otras. El grupo de bacilos gram negativos no fermentadores no fastidiosos incluyen los siguientes géneros:

2. Morfología colonial en medios de aislamiento primario
A continuación se describe la morfología colonial de algunas especies observada en medios selectivos y diferenciales. 1• Agar Sangre. Este medio es utilizado para el aislamiento primario de la mayoría de las cepas cultivables en el laboratorio, que producen patologías en seres humanos. A las 18 horas de incubación se observan colonias medianas de 2 a 3 mm de diámetro y brillantes. La mayoría de las cepas no producen hemólisis, pero en algunas cepas es posible apreciarla debido a la producción de una esfingomielinasa que es capaz de lisar los eritrocitos del medio. Algunas veces se puede observar la producción de pigmentos como la pioverdina, que se aprecia como una coloración verdosa que difunde en el agar. 2

3 4 5• Agar MacConkey. Igual al anterior separa las bacterias que utilizan fermentativamente la lactosa, de los que no la utilizan. Para ambos casos, tanto Pseudomonas como Burkholderia presentan colonias translúcidas lactosa negativa.

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3. Pruebas bioquímicas de identificación

1• Agar OF. Se usa para determinar el comportamiento metabólico de los bacilos gram negativos ante
diferentes carbohidratos. Se puede observar si lo utiliza o no, y si lo hace oxidativamente o fermentativamente. 2 3 Los tubos con medio OF se mantienen en agua hirviendo por 10 minutos para eliminar el oxígeno que se encuentre en el medio. Después se deja enfriar y se procede a inocular. Para el caso de la glucosa, se requiere de un tubo sellado con VASPAR y uno con atmósfera aerobia. Los demás carbohidratos NO se sellan con VASPAR.

1 Agar Almidón. Determina la producción de enzimas que producen la hidrólisis del almidón. Si la
bacteria es capaz de hidrolizar almidón, al agregarle yodo al medio, quedará un halo transparente alrededor de la colonia. Este halo evidencia así la presencia de almidón hidrolizado. Este medio se raya por estría. 2 3• Agar F. Se utiliza para determinar la producción de pioverdina pues inhibe la producción de piocianina.

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5• Agar P. Se utiliza para determinar la producción de piocianina debido a que inhibe la producción de
pioverdina. 6 4. Cronograma de actividades

DIA 1
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1• Entrega de cultivos. 2• Realizar frotis y tinción de Gram. 3• Sembrar cada bacteria en 2 placas de agar Sangre y 2 placas de agar MacConkey e incubar a 37°C y a TA.

DIA 2
1• Describir la morfología colonial de cada bacteria en los medios sembrados considerando tamaño, forma, elevación, margen, tipo de superficie, características ópticas, producción de hemólisis y producción de pigmentos.

P. aeruginosa agar sangre

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3• Realizar un frotis y fijarlo para tinción de Gram. 4• Realizar la prueba de oxidasa a partir del agar sangre. 5• Inocular los siguientes medios de cultivo para la realización de pruebas bioquímicas de identificación para cada una de las bacterias: • Agar TSI • Agar Tripticasa Soya Inclinado • Caldo Tripticasa Soya (movilidad, incubar 6 horas) • Agar P • Agar F • Agar Tripticasa Soya conteniendo 6.5%NaCl 1• Inocular dos tubos con Caldo Tripticasa Soya, Incubar uno a 37oC y otro a 42oC. 2• Incubar una placa de agar Sangre a temperatura ambiente por un período de 18-24 horas para realizar tinción de flagelos.

DIA 3
1• Realizar la tinción de flagelos utilizando el colorante de Kodaka. 2• Realizar la lectura prueba de la catalasa a partir del agar Tripticasa Soya inclinado.

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3 4 5 6 7 8 9• Realizar lectura del TSI 10 11 P. aeruguinosa TSI 12 13 14 15 16 17• Realizar la lectura de crecimiento a 35oC y a 42oC. 18• Para la lectura del agar F observar la placa bajo una luz ultravioleta (luz de Wood). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva. 19• Para la lectura del agar P para determinar la presencia de piocianina, picar el agar con un mondadientes y luego agregar 3 ml de cloroformo que posteriormente se depositan en un tubo. Observar la presencia o ausencia de una coloración azul tras un fondo blanco. La presencia de una coloración azul indica una prueba positiva. 20

5. Discusión de resultados.
1. Explique cuáles son las diferencias para la realización, lectura y la interpretación de la prueba de descarboxilación de aminoácidos para las bacterias fermentadoras y para las bacterias no fermentadoras 2. ¿Cuáles son las características morfológicas y bioquímicas que permiten diferenciar P. aeruginosa de las otras especies de Pseudomonas y de Burkholderia? 3. Si un bacilo Gram-negativo no fermentador utiliza la lactosa en el medio OF y crece en agar MacConkey, por que no se observa evidencia de la utilización de lactosa en el agar MacConkey?

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