Manual de Electroforesis de Proteinas

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTENAS Y ADN
Serie de Normas Tcnicas N 38 Lima - 2003
Serie de Normas Tcnicas N 38 Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. lvaro Vidal Rivadeneyra Viceministro Econ. Carlos Rodrguez Cervantes
Subcomit Editor
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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica Volumen 19 Nmero 4 octubre diciembre 2002 La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica es una publicacin trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la divulgacin de trabajos tericos o aportes prcticos desarrollados por tcnicos y cientficos, promueve el avance y la aplicacin de la investigacin y experiencia cientfica en salud Los artculos firmados no expresan necesariamente la opinin de la revista, siendo los autores responsables de los criterios por ellos emitidos. Todos lo derechos quedan reservados por el Instituto Nacional de Salud. Cualquier publicacin, difusin y/o distribucin de la informacin presentada queda autorizada siempre que se cite la fuente de origen. Copyright octubre diciembre 2002 INS-PER Cartula: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud 1726-4634 Versin impresa Direccin: Instituto Nacional de Salud Cpac Yupanqui 1400. Lima 11, Per. Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162 E-mail: revmedex@ins.gob.pe Pgina web: www.ins.gob.pe Editor: Dr. Leonid Lecca Garca E-mail: llecca@ins.gob.pe Depsito Legal 2000-2856
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MPR-CNSP-016
Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos de electroforesis para protenas y ADN
ELABORACIN: Blgo. Carlos Augusto Ybar Varas Divisin de Biologa Molecular Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Lima-Per
MPR-CNSP-016
AGRADECIMIENTO: Blgo. Roger Caldern Espinoza Blgo. Carlos Padilla Rojas Blgo. Christian Baldeviano Vidaln Blgo. Omar Cceres Rey Blga. Gisely Hijar Guerra Blga. Elizabeth Snchez Roman Divisin de Biologa Molecular Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Ybar Varas, Carlos. Manual de procedimientos de electroforesis para protenas y ADN / Elaborado por Carlos Ybar Varas. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2003. 59 p. : 30 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 38)
1. PROTEINAS /aislamiento y purificacin 2. ADN /aislamiento y purificacin 3. ELECTROFORESIS I. Ybar Varas, Carlos II. Instituto Nacional de Salud (Per) III. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 857 26 3 (O.C.) ISBN 9972 857 38 7 (N38) ISSN 1607 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501152003-4205 Ministerio de Salud, 2003 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2003 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.gob.pe Pgina Web: www.ins.gob.pe Publicacin aprobada con R.J. N 460-2003-J-OPD/INS Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
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II
CONTENIDO

INTRODUCCIN SECCIN 1: 1.1 1.2 1.3
V 1 1 1 1 3 5
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III
SECCIN 7: VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS 7.1 Generalidades 7.2 Buffer para electroforesis de protenas y ADN 7.3 Persulfato de amonio

SECCIN 6: 6.1 6.2 6.3
VARIANTES DE ELECTROFORESIS Electroforesis bidimensional Electroforesis de capilaridad Electroforesis en campo pulsado (PFEG)
5.7 5.8
SECCIN 5: 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN Objetivo general Electroforesis vertical Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida Preparacin de geles de agarosa para ADN Electroforesis de ADN Coloracin y visualizacin de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando bromuro de etidio Coloracin y visualizacin de ADN en geles de poliacrilamida con nitrato de plata Factores que afectan la migracin del ADN
21 21 21 22 25 27 28 30 32 35 35 35 36
37 37 37 37
SECCIN 4: 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Objetivo Materiales Ensamblaje de la cmara de electroforesis Preparacin de geles de poliacrilamida Preparacin del gel de resolucin Preparacin del gel de empacamiento Preparacin de la muestra biolgica Electroforesis Coloracin y visualizacin de las protenas usando azul brillante de coomasie Interpretacin de resultados Factores que afectan la migracin de las protenas
7 7 7 7 8 11 12 12 13 16 17 19
SECCIN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR
SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Abreviaturas y definiciones

ANEXO A:
ANEXO C:
ANEXO D:
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IV
ANEXO F:
PGINAS WEB RECOMENDADAS
ANEXO E:
EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES
PROBLEMAS MS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TXICOS

ANEXO B:
UNIDADES Y FRMULAS
PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y ELECTROFORESIS DE ADN

ANEXOS
BIBLIOGRAFA
SECCIN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS
7.4 7.5 7.6 7.7 7.8
Bromuro de etidio Agarosa Poliacrilamida al 30% Agua destilada Equipos de laboratorio
37 38 38 38 38 39 41 43
43 49
51
53 55 59
INTRODUCCIN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento. El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas. En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos electroforticos que presentan ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis bidimensional para un anlisis ms sofisticado de las protenas etc. Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros. El presente manual de procedimientos es la recopilacin de protocolos actualizados por los investigadores de la Divisin de Biologa Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, adems de los procedimientos tcnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparacin de soluciones de electroforesis, unidades y frmulas bsicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que deben considerarse durante la manipulacin de los reactivos.
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SECCIN 1 GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer los procedimientos de la tcnica de electroforesis de ADN y protenas para ser difundidas en la red de laboratorios. 1.2 CAMPO DE APLICACIN Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen anlisis y determinacin de ADN y protenas en general. 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.3.9 1.3.10 1.3.11 1.3.12 ABREVIATURAS Y DEFINICIONES ADN: cido desoxirribonucleico. ARN: cido ribonucleico. kDa: kilodaltons. nM: nanomolar. OD: densidad ptica. pb: pares de bases. PCR: reaccin en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction). pg: picogramo. rpm: revoluciones por minuto.
L: microlitro. M: micromolar.
cido desoxirribonucleico: molcula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituye el material gentico de todo tipo de clulas y virus de ADN, y tiene como funcin transmitir la informacin gentica de una generacin a otra. cido ribonucleico: molcula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimtico a nivel de ADN y durante la sntesis de protenas. aminocido: pequeas molculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su conjunto forman la estructura de las protenas. anfoterismo: propiedad de las protenas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga, dependiendo del pH y su punto isolctrico (pI).
1 Instituto Nacional de Salud
1.3.13
1.3.14 1.3.15
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1.3.16 1.3.17 1.3.18
densidad ptica: unidad de medida de absorcin de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida. desnaturalizacin de protenas: prdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y cuarternaria) de una protena, adoptando la estructura primaria nicamente. electroforesis: tcnica utilizada para separar partculas coloidales tales como protenas o cidos nuclicos a travs una matriz slida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamao y carga elctrica mediante la aplicacin de un campo elctrico (IUPAC, NHLBI, DOE). enfoque isoelctrico: tcnica en gradiente de pH montada entre un nodo y un ctodo, de donde ste ltimo tiene un pH ms alto que el primero. estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la protena compuesta de varios monmeros o polipptidos. estructura primaria de protenas: se refiere a la estructura lineal formada por la unin secuencial de aminocidos. estructura secundaria de protenas: se refiere a la estructura bidimensional formada por el plegamiento de la estructura primaria estabilizada por interacciones dbiles. estructura terciaria de protenas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la protena estabilizada por enlaces covalentes y no covalentes. grado biologa molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como nucleasas, proteasas o pirgenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas moleculares. kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las protenas en general. marcador estndar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados para determinar el tamao de una molcula de ADN de inters por comparacin despus de una electroforesis. pares de bases: cada par de nucletidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra de ADN. PCR: polimerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa; reaccin enzimtica in vitro por el cual mediante mltiples ciclos de denaturacin, alineamiento y extensin se sintetizan grandes cantidades de una regin gentica especfica. plsmido: molculas de ADN circular que se encuentran en la mayora de bacterias y otros organismos procariontes y que pueden llevar informacin gentica para el organismo que lo alberga. polimerizacin: accin qumica por el cual las molculas de acrilamida y bisacrilamida forman un entramado a manera de malla por la accin de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia gelatinosa. producto de amplificacin: Molculas de ADN sintetizadas en mltiples copias in vitro a partir de ADN molde mediante el uso de PCR.
1.3.19 1.3.20 1.3.21 1.3.22 1.3.23 1.3.24
1.3.25 1.3.26
1.3.27 1.3.28
1.3.29 1.3.30
1.3.31
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SECCIN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la caracterstica de ser txicos, irritantes, corrosivos, cancergenos, mutagnicos y neurotxicos, por lo tanto el investigador siempre deber usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos (Ver ms adelante lista de estos reactivos). La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualizacin de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W de potencia ocasiona graves daos oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deber contar con una lmina de policarbonato transparente ubicada entre la lmpara y el punto de observacin. Adems, deber usar lentes de proteccin contra rayos UV del mismo material. El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga elctrica. Aunque la mayora de cmaras de electroforesis han sido diseadas para evitar el contacto directo con la electricidad, el operador deber asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al momento de manipular el equipo. El proceso de ebullicin de las protenas en bao mara a 100C deber realizarse con extremo cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.
2.2
2.3
2.4
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SECCIN 3 MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR 3.1 El investigador deber usar guantes de ltex mientras se encuentre trabajando con ADN y protenas. Este paso ayudar a evitar la degradacin de las biomolculas por accin de las nucleasas o proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitar que el laboratorista se exponga ante algn posible riesgo de intoxicacin por material infeccioso. El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genmico y los productos de amplificacin pueden ser almacenados a 4C, mientras que el ADN plasmdico a - 20C. Las protenas deben ser conservadas a -80C o en su defecto a -20C. Todas las muestras biolgicas deben ser repartidas en alcuotas y en volmenes pequeos para evitar etapas de descongelamiento o congelamiento drsticos que ocasionaran un eventual deterioro de las molculas. Debido a la importancia que tiene la medicin de volmenes en los procedimientos de electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000 l, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650). Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con las molculas de ADN sean nuevas y estriles, a fin de evitar una posible contaminacin de la muestra con nucleasas. Es importante sealar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre y cuando estn libres de restos orgnicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulacin de las protenas, no se exige el uso de puntas nuevas pero s se recomienda esterilizarlas previamente. Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisin y calibracin (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN 12650). Los reactivos a usarse durante los procesos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos y protenas deben tener grado "biologa molecular" para asegurar el xito del procedimiento. El uso combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
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SECCIN 4 PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS 4.1 OBJETIVO Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de protenas. 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 4.2.12 4.2.13 4.2.14 4.2.15 4.2.16 4.3 4.3.1 4.3.2 MATERIALES Cmara de electroforesis vertical y accesorios. Micropipetas de 20, 200 y 1000 L. Vaso de precipitacin de 500 mL de capacidad. Flotadores para microtubos de 1,5 mL. Lmina extensible de parafina. Gradillas de plstico. Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 L. Solucin de poliacrilamida al 30% (Anexo A). Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 (Anexo A). Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8 (Anexo A). Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (Anexo A). Persulfato de amonio (APS) al 10% recin preparado (Anexo A). N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solucin stock). Agua bidestilada. Buffer de resolucin Tris-Glicina (Anexo A). Butanol-agua (Anexo A). ENSAMBLAJE DE LA CMARA DE ELECTROFORSIS El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de electroforesis vara de acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deber seguir las instrucciones que recomienda el fabricante. Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis parten del mismo principio tcnico, hemos representado grficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este equipo (Figuras N 1-4).
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4.3.3 4.3.3.1
En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes: Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara. Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible pero resistente (generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los espaciadores es determinar el grosor del gel. Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se colocarn las muestras Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores, a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser conectados. En otras cmaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis. Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades del investigador. Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya ensamblada deber estar ubicada sobre una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se vierte la solucin del gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la generacin de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar la distorsin del perfil de las bandas de las protenas al final de la electroforesis.
4.3.3.2
4.3.3.3
4.3.3.4
4.3.3.5
4.3.3.6
4.4 4.4.1
PREPARACIN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA La electroforesis de protenas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante. Es discontinuo porque est conformado por dos geles de poliacrilamida de resolucin y empacamiento que presentan diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase de separacin visible al trasluz. Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarse fcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeracin del primero para continuar con la polimerizacin del otro. El gel de empacamiento generalmente se localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarn las muestras. El gel de resolucin por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarn y se separarn las protenas.
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Vidrio grande
Ctodo
Anodo
Peine Vidrio chico Tanque de electroforesis vertical
Espaciadores
Soporte
Fuente de Poder Voltmetros
Ganchos o prensas
Reguladores de voltaje
Base de jebe Electrodos Interruptor
Figura N 1. Componentes de una cmara de electroforesis vertical
Peine
Peine
Espaciadores Vidrio grande Vidrio chico
1 - 5 cm
rea para el gel de empacamiento
rea para el gel de resolucin
Figura N 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cmara de electroforesis vertical
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1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre un soporte Peine
4. Remover el butanol con agua y aadir gel de empacamiento
Ganchos o prensas Soporte
Presin
Base de jebe 2. Aadir gel de resolucin 5. Colocar peine y dejar polimerizar Peine
3. Aadir butanol Dejar gelificando
6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada
Figura N 3. Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cmara de electroforesis vertical.
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10
Ctodo
nodo
Buffer de electroforesis
Fuente de poder Tanque de electroforesis vertical
Figura N 4. Sistema de electroforesis vertical ensamblado
4.5 4.5.1
PREPARACIN DEL GEL DE RESOLUCIN Fundamento terico El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo.
4.5.2 4.5.2.1 4.5.2.2
Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea horizontal en el vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea, colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por debajo de los dientes del peine (Figura N 2) Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades, mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A. Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados en caso de trabajar con geles pequeos de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La concentracin de poliacrilamida a usar depender de las necesidades del operador. Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
4.5.2.3
4.5.2.4
4.5.2.5
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4.5.2.6
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada. Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 L) sobre la solucin de poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin. Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin la solucin de poliacrilamida remanente. Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol. PREPARACIN DEL GEL DE EMPACAMIENTO Fundamento terico El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este proceso permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis.
4.5.2.7
4.5.2.8
4.6 4.6.1
4.6.2 4.6.2.1 4.6.2.2 4.6.2.3
Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. Mezclar los componentes del gel (Anexo A). Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solucin. Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya polimerizado. Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a derramarse. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control de la polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada. PREPARACIN DE LA MUESTRA BIOLGICA Objetivo Someter las muestras de protenas a procesos qumicos y fsicos que permitan su ptimo fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.6.2.4
4.6.2.5
4.6.2.6
4.7 4.7.1
4.7.2 4.7.2.1
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Materiales Micropipetas para volmenes de 20 L, 200 L y 1000 L.

4.7.2.2 4.7.2.3 4.7.2.4 4.7.2.5 4.7.2.6 4.7.2.7 4.7.2.8 4.7.3
Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad. Guantes. Cocinilla de asbesto. Vaso de precipitacin de 500 mL. Gradilla para tubos de 1,5 mL. Buffer de la muestra (Anexo A). Puntas de 20 L, 200 L y 1000 L. Principio del procedimiento La preparacin de la protena consiste en un proceso fisico-qumico, en el cual se rompen enlaces peptdicos y puentes disulfuro gracias a la accin de detergentes inicos, reactivos reductores y altas temperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la protena hasta su estructura primaria.
4.7.4 4.7.4.1
Procedimiento Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporcin 3:1 (tres partes de la muestra y una de buffer). Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura de 100 C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de precipitacin con agua hirviendo. Controlar la temperatura con un termmetro adecuado. Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitacin y centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis. ELECTROFORESIS Objetivo Fraccionar las protenas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un campo elctrico.
4.7.4.2
4.7.4.3 4.7.4.4
4.8 4.8.1
4.8.2 4.8.2.1 4.8.2.2

MPR-CNSP-016
Materiales Micropipetas para volmenes de 20 L. Cmara de electroforesis vertical y accesorios.

4.8.2.3 4.8.2.4 4.8.2.5 4.8.2.6 4.8.2.7 4.8.2.8 4.8.3
Fuente de poder. Buffer de electroforesis para protenas (Anexo A). Guantes. Gradilla para tubos de 1,5 mL. Puntas para micropipeta de 20 L. Envase con leja al 10% para descarte de puntas. Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las protenas a analizar, de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribucin depender de la concentracin del gel de resolucin con el que se est trabajando.
4.8.4 4.8.4.1 4.8.4.2
Procedimiento Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradacin de las molculas por la accin de las proteasas presentes en la mano. Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer de electroforesis o de resolucin para protenas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y otro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que sern conectados a una fuente poder (Figuras N 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el buffer. Mediante el uso de puntas de hasta 20 L y 30 L de capacidad proceder a depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminacin del pocillo contiguo. Considerar el uso de un marcador estndar de protenas para la medicin del peso molecular de la muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la protena, excepto cuando se trate de un marcador previamente teido en que el que se obviar el uso del buffer de la muestra. Una vez finalizada la colocacin de las protenas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje correspondientes. Para el clculo del voltaje es importante conocer la distancia en centmetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitir determinar el voltaje total. El voltaje ptimo depender de la naturaleza de la molcula de ADN que se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o corriente elctrica (medida en amperios o miliamperios) depender de la fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solucin stock, Anexo A), el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
4.8.4.3 4.8.4.4
4.8.4.5 4.8.4.6 4.8.4.7
4.8.4.8
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4.8.4.9 4.8.4.10
Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una lnea azul por el colorante del buffer) haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida. Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separacin de los vidrios que contienen el gel. Separar el gel de empacamiento del gel de resolucin realizando un corte transversal. Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientacin para ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras. Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentracin. Para desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y usar uno de los espaciadores a manera de esptula para levantarlo por una de las puntas. Coger el gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul brillante de coomasie. El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser reciclado hasta cinco veces, despus de los cuales se deber preparar una nueva solucin dado que puede afectar el tiempo de corrida de la prueba. Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergentes especiales que puedan ser fcilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37C.
CTODO
ee-
4.8.4.11 4.8.4.12 4.8.4.13 4.8.4.14
4.8.4.15
4.8.4.16
NODO
ee-
a Buffer de resolucin c b
e-
d e
e-
Gel de empacamiento Gel de resolucin
Buffer de resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 5. Interior de una cmara de electroforesis vertical en operacin: a) Durante la colocacin de la muestra en el pocillo del gel, b) Despus de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las protenas, c, d y e) las protenas migran hacia el nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas. (e-)= electrones
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15
4.9
COLORACIN Y VISUALIZACIN DE LAS PROTENAS USANDO AZUL BRILLANTE DE COOMASIE Objetivo Visualizar las protenas en el gel de poliacrilamida.
4.9.1
4.9.2 4.9.2.1 4.9.2.2 4.9.2.3 4.9.2.4 4.9.2.5 4.9.2.6 4.9.2.7 4.9.2.8 4.9.3
Materiales Frasco oscuro de 1 L para el colorante azul brillante de coomasie. Recipiente para colorear el gel. Solucin de trabajo de azul brillante de coomasie R-250 (Anexo A). Solucin de decoloracin rpida (Anexo A). Solucin de decoloracin lenta (Anexo A). Solucin glicerol-metanol (Anexo A). Agua destilada. Guantes. Principio del procedimiento El proceso de coloracin se basa en la atraccin electrosttica del enlace peptdico de las protenas sobre grupos de cido sulfnico que son los que tien la protena de color azul. Asimismo, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofbicas participan en este proceso de unin mecnica. Este paso permite la visualizacin de protenas en un rango de sensibilidad entre 0,5 g y 2 g.
4.9.4 4.9.4.1
Procedimiento Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algn tipo de contacto con los reactivos. Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o tefln, conteniendo solucin de trabajo de azul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo de incubacin depender del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentracin del gel y de la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una mxima sensibilidad de coloracin puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gel al 10% por 2 horas. Evitar la coloracin del gel por ms de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretincin que impedira la visualizacin de las protenas.
4.9.4.2
4.9.4.3
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4.9.4.4 4.9.4.5
Culminado el tiempo de incubacin, depositar el colorante en su frasco original. Cubrir el gel teido con solucin de decoloracin rpida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solucin decolorante rpida y aadir un segundo volumen de la misma solucin hasta apreciar las primeras bandas. Acto seguido, eliminar la solucin de decoloracin rpida y aadir la solucin decolorante lenta. Dejar destiendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solucin por una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiendo hasta que las bandas de las protenas puedan ser apreciadas claramente. Finalizada la remocin del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vaco o manualmente. Secado manual de geles de poliacrilamida Remojar el gel teido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotacin suave. Posteriormente, remojar una lmina de celofn de aproximadamente 15 x 15 cm en agua y colocarlo encima de un bastidor cuyo tamao depender del tamao del gel. Seguidamente, colocar el gel sobre el celofn y observar que no se formen burbujas. Cubrir el gel con un segundo celofn previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo "sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 das. Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofn que contiene el gel. Cortar y guardar el exceso de celofn. Nota importante: el celofn debe ser hidroflico y no plastificado
4.9.4.6
4.9.5 4.9.5.1
4.9.5.2
4.9.5.3
4.9.5.4 4.9.5.5
4.10 4.10.1
Interpretacin de resultados Las protenas fijadas en geles de poliacrilamida y teidas con azul brillante de coomasie se observan como bandas azules de diferentes pesos moleculares. El peso molecular de una protena se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser determinado comparando la banda con un patrn de protenas estndar de peso conocido denominado marcador de peso molecular. La distribucin de las protenas depende de la concentracin del gel, por lo tanto, el operador deber seleccionar el marcador de peso molecular ms adecuado. Algunas protenas suelen migrar anmalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su estructura como residuos de glicosilacin, fosforilacin y acetlizacin, las cuales podran retardar la migracin de las muestras.
4.10.2
4.10.3
4.10.4
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4.10.5
Las protenas degradadas (desnaturalizacin de las protenas por causa de un agente qumico catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces suelen confundirse con protenas de menor peso molecular (Figuras N 6 y 7)
1 2 3 4 5 6 7
Figura N 6. Electroforesis de protenas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5: concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 g de protena. Carriles 6 y 7: protenas degradadas.
1 97,4 66 -
45
31
21,5 -
Figura N 7. Electroforesis de protenas purificadas (Carriles 2 y 4) y protenas totales de Leishmania brazilensis.
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4.11
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIN DE LAS PROTENAS Los principales factores que afectan la migracin de las protenas durante la electroforesis son las siguientes:
4.11.1
Fuerza del campo elctrico (E) Es la fuerza que determina el movimiento o migracin de la protena a travs del campo elctrico. Su unidad de medicin es voltios/cm y es por esa razn que la tasa de migracin de una protena puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial elctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta de la molcula (Q). Puede ser calculada a travs de la siguiente frmula: E = Fa/Q E= v/d Donde: Fa = Fuerza direccional. v = voltios. d = distancia de los electrodos (en centmetros) Q = carga en (coulomb)
4.11.2
Temperatura Depende bsicamente del voltaje de la electroforesis, la concentracin de sales (poder de conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa" o smiling (Figura N 8).
Figura N 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para protenas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extrada de Internet. (http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
4.11.3
Carga neta de la molcula La presencia de aminocidos de diferentes grupos bioqumicos otorga a una determinada protena una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminocidos. Debido
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a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo elctrico, la migracin de las protenas en el gel depender bsicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las protenas aprovechando sus propiedades anfotricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las protenas, a fin de favorecer la separacin de sta nicamente por su peso molecular. 4.11.4 4.11.4.1 Tamao y forma de la molcula Las protenas tienen caractersticas moleculares que actan como factores intrnsecos durante la electroforesis alterando su migracin y generando bandas de diferentes tamaos, que no necesariamente van acorde al peso molecular real del polipptido. Ciertas modificaciones postraduccionales, multimerizacin y formacin de complejos con otro tipo de molculas generan modificaciones en el tamao de la protena dando pesos moleculares aparentes en el momento del anlisis. Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioqumica de una protena no caracterizada, perviamente deber estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el anlisis de la protena por electroforesis.
4.11.4.2
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SECCIN 5 PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN 5.1 OBJETIVO GENERAL Conocer los procedimientos bsicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN. 5.2 5.2.1 ELECTROFORESIS VERTICAL Objetivo Conocer el procedimiento tcnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida. 5.2.2 5.2.2.1 5.2.2.2 5.2.2.3 5.2.2.4 5.2.2.5 5.2.2.6 5.2.2.7 5.2.2.8 5.2.2.9 5.2.3 Materiales Cmara de electroforesis vertical y accesorios. Micropipetas de 20 , 200 L y 1 000 L. Lmina extensible de parafina. Puntas de polipropileno con capacidad para 20 , 200 y 1 000 l. Buffer de resolucin stock TBE 5X (Anexo A). Buffer de resolucin TBE 1X (Anexo A). Poliacrilamida al 30%. APS al 10%. TEMED. Ensamblaje de la cmara de electroforesis vertical El modo de ensamblar una cmara de electroforesis vertical fue detallado en la seccin 4.3. Sin embargo, toda cmara de electroforesis vertical viene acompaada de una serie de especificaciones tcnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo. 5.2.4 5.2.4.1 Preparacin del gel de resolucin El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este sistema, a diferencia de la electroforesis para protenas, no utiliza un gel de empacamiento y los componentes del gel de resolucin son totalmente diferentes. Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones.
5.2.4.2 a.
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b. c. d.
No ser necesario marcar el lmite hasta donde ser vertida la poliacrilamida, debido a que el gel usado es continuo. Realizar la preparacin del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A. Aproximadamente 5 mL de la solucin debern ser preparado en caso de trabajar con geles pequeos (aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La concentracin de poliacrilamida para ADN depender de los objetivos de trabajo del operador. Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen. Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope. Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada. ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA Objetivo Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de poliacrilamida.
e. f.
g. h. 5.3 5.3.1
5.3.2 5.3.2.1 5.3.2.2 5.3.2.3 5.3.2.4 5.3.2.5 5.3.2.6 5.3.2.7 5.3.2.8 5.3.2.9 5.3.2.10 5.3.2.11
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Materiales Micropipetas para volmenes de 20 l. Cmara de electroforesis. Fuente de poder. Poliacrilamida al 30%. TEMED. APS 10%. Buffer de electroforesis para ADN TBE (Anexo A). Buffer de la muestra para ADN (Anexo A). Guantes. Gradilla para tubos de 1,5 mL. Puntas para micropipeta de 20 l.
5.3.2.12 5.3.3
Envase para descarte de puntas. Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las molculas de ADN a analizar de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribucin ser afectada por la concentracin del gel de resolucin que se est trabajando.
5.3.4 5.3.4.1 5.3.4.2
Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las muestras, los reactivos y el equipo. Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que sern conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N 9). Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente saturados de buffer. Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volmenes de solucin que contiene el cido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de muestra 6X. Aadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alcuotas, de acuerdo al nmero de muestras que se colocarn en los pocillos, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina (Figura N 10). Acto seguido, aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente. Mediante el uso de puntas de 20 l proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminacin del pocillo contiguo (Figura N 9).
CTODO eeA NODO eeB C D E
5.3.4.3
5.3.4.4
Punta de la micropipeta depositando la muestra en el pocillo Buffer de resolucin Banda de ADN
ee-
Gel de resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 9. Interior de una cmara de electroforesis vertical para ADN en operacin. A: Durante el depsito de la muestra de ADN mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicacin del voltaje y migracin del ADN a travs del gel poliacrilamida. E: Las molculas de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiiendo el ADN con bromuro de etidio y aplicando luz ultravioleta.
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Micropipeta
Lmina extensible de parafina
Alcuotas de buffer de la muestra
Figura N 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lmina extensible de parafina antes de colocar las muestras en el gel de electroforesis.
5.3.4.5 5.3.4.6 5.3.4.7
Considerar el uso de un marcador de peso molecular estndar de ADN para la determinacin del peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante. Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje depender principalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso de productos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante sealar que en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del amperaje que depender principalmente del valor del voltaje. Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante el proceso se evidenciarn dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migracin. Ambos colores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol, respectivamente, que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamida al 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el azul de bromofenol a esta misma concentracin de poliacrilamida es equivalente a un fragmento de 45 pb (Anexo B1.3). Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por el operador (este proceso debe ser estandarizado). Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconeccin de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida. Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la separacin de los vidrios que contienen el gel. Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, pues el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de esptula para levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tincin en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C). Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergente que no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37 C.
5.3.4.8
5.3.4.9 5.3.4.10 5.3.4.11 5.3.4.12
5.3.4.13
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5.3.4.14 5.4 5.4.1
El proceso de visualizacin de ADN se describe en la seccin 5.8 PREPARACIN DE GEL DE AGAROSA PARA ADN Objetivo Realizar la electroforesis de molculas de ADN mayores de 100 pb.
5.4.2 5.4.2.1 5.4.2.2 5.4.2.3
Materiales Cmara de electroforesis horizontal y accesorios. Agarosa de porcentaje requerido por el operador (Anexo A). Buffer TAE 50X (Anexo A). Nota: Para la preparacin del gel es importante tener completamente ensamblada la cmara de electroforesis ubicndola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algn tipo de declive.
5.4.3 5.4.3.1 5.4.3.2 5.4.3.3
Preparacin del gel de resolucin Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. Preparar la agarosa de acuerdo al protocolo contemplado en el Anexo A. Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en bao mara hasta que alcance una temperatura entre 50C y 60C. Aadir agarosa en un volumen dependiente del tamao de la cmara (20mL-25 mL son suficientes para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente insertados (Figura N 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos. Despus que la agarosa haya quedado completamente solidificada, aadir el buffer de electroforesis TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N 12). Posteriormente empezar a colocar las muestras (Figuras N 10,13 y 14).
5.4.3.4
5.4.3.5
Agarosa
Peine para moldear los pocillos Figura N 11. Preparacin de la cmara de electroforesis para ADN en geles de agarosa.
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Cmara de electroforesis horizontal Buffer de electroforesis 0.5 - 1 cm. Gel de agarosa Tanque 2
Pocillo
Tanque 1
Base o contenedor del gel Electrodos Figura N 12. Corte sagital de un sistema de electroforesis de ADN en geles de agarosa. En la figura se indica el nivel del buffer con respecto al gel de agarosa.
Cmara de electroforesis Fuente de poder
Figura N 13. Sembrando ADN en la cmara de electroforesis.
NODO
Buffer de corrida
CTODO
Figura N 14. Detalle de la muestra de ADN ingresando en el pocillo de la cmara de electroforesis.
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5.5 5.5.1
ELECTROFORESIS DE ADN Objetivo Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de agarosa.
5.5.2 5.5.2.1 5.5.2.2 5.5.2.3 5.5.2.4 5.5.2.5 5.5.2.6 5.5.2.7 5.5.2.8 5.5.2.9 5.5.2.10 5.5.3
Materiales Cmara de electroforesis incluyendo gel preparado. Fuente de poder. Buffer de solucin stock ADN TAE 50X (Anexo A). Buffer de la muestra para ADN (Anexo A). Guantes. Gradilla para tubos de 1,5 mL Micropipetas para volmenes de 20 L. Puntas para micropipeta de 20 L. Envase para descarte de puntas. Lmina extensible de parafina. Principio del procedimiento En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las molculas de ADN a analizar de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribucin depender de la concentracin del gel de resolucin que se est trabajando.
5.5.4 5.5.4.1 5.5.4.2
Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones, las muestras y el equipo. Mezclar cinco volmenes de solucin conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X. Para realizar la mezcla, aadir 1 volmen de buffer de muestra, repartidos en alcuotas de acuerdo al nmero de muestras a cargar, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina (Figura N 10). Aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente. Mediante el uso de puntas de 20 L proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos, evitando la contaminacin del pocillo contiguo (Figuras N 13 y 14). Considerar el uso de un marcador estndar de ADN para la medicin del peso molecular de la muestra. Dicho marcador tambin debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentra previamente mezclado con el buffer.
5.5.4.3
5.5.4.4
MPR-CNSP-016
5.5.4.5 5.5.4.6 5.5.4.7
Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las molculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genmico y plasmdico (>2kb) se recomienda aplicar valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en la seccin 5.8. Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posicin adoptada por los indicadores azul de bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posicin permitie que el investigador tenga una idea de la ubicacin aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolucin de ADN. Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definen dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migracin. Ambos colores, azul y verde corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el buffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb. Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por el investigador. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa. El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguiente procedimiento. Limpiar la cmara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar a temperatura ambiente. COLORACIN Y VISUALIZACIN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA Y AGAROSA USANDO BROMURO DE ETIDIO Objetivo Visualizar molculas de ADN por coloracin con bromuro de etidio.
5.5.4.8
5.5.4.9
5.5.4.10 5.5.4.11 5.5.4.12
5.6 5.6.1
5.6.2 5.6.2.1 5.6.2.2 5.6.2.3 5.6.2.4
Materiales Bromuro de etidio (Anexo A). Transiluminador. Guantes. Agua destilada.
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5.6.3
Principio del procedimiento El proceso de coloracin de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposicin con rayos ultravioleta. Su sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz en el que se est visualizando. ADVERTENCIA: Debido a las propiedades mutagnicas, teratognicas y carcinognicas del bromuro de etidio, se recomienda realizar el procedimiento con guantes.
5.6.4 5.6.4.1 5.6.4.2
Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de los reactivos. Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de tefln conteniendo bromuro de etidio a una concentracin de 1g/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo. Devolver la solucin de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con abundante agua. Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV. Depositar el gel cuidadosamente sobre la pantalla del transiluminador. Visualizar el ADN usando lentes protectores contra la luz UV. Interpretacin de resultados Las molculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las molculas de ADN que son ms grandes, generalmente migran ms retardadamente que las molculas de menor peso (Figura N 15).
1 2 3
5.6.4.3
5.6.4.4 5.6.4.5 5.6.4.6 5.6.5 5.6.5.1
40001000500
Figura N 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2 y 3: molculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.
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5.6.5.2
Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estndar de peso molecular conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximada el nmero de pares de bases de la molcula a analizar. Estos marcadores comerciales adems pueden ser tiles como controles positivos del sistema de visualizacin del ADN, principalmente cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), o para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (clculos cualitativos de concentracin de ADN), etc. Descontaminacin del bromuro de etidio usando carbn activado Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solucin con papel filtro Whatman N 1. Aadir 300 mg de carbn activado sobre el papel filtro y filtrar la solucin de bromuro usado sobre el carbn. Descartar el filtrado al desage o alcantarillado. Repetir el proceso cuantas veces sea necesario durante un ao. Eliminar el carbn de un ao de antigedad as como los geles de agarosa teidos con bromuro de etidio en bolsas de plstico de bioseguridad. Incinerar. COLORACIN Y VISUALIZACIN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON NITRATO DE PLATA Ventajas y desventajas De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a travs del mtodo de tincin con plata. La ventaja de este mtodo es que es de dos a cinco veces ms sensible que el bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos txico. Del mismo modo, puede teir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final. Entre las desventajas que tiene este mtodo es que tambin utiliza reactivos peligrosos, como el formaldehdo, y requiere el uso de solucin de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas que con el tiempo resultara muy costoso. Es importante sealar que el mtodo de tincin con plata tambin puede ser aplicado para la visualizacin de protenas usando un protocolo similar que no ser descrito en este manual. Para el caso de las protenas, la sensibilidad del mtodo es de 10 a 50 veces ms alto que usando azul brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipptido). En general, el proceso de tincin con plata surge como una buena alternativa para la visualizacin de ADN y protenas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchos casos es necesario estandarizar las condiciones. Materiales Guantes.
5.6.6 5.6.6.1 5.6.6.2 5.6.6.3 5.6.6.4 5.6.6.5 5.6.6.6 5.7 5.7.1 5.7.1.1
5.7.1.2
5.7.1.3
5.7.1.4
5.7.2 5.7.2.1
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5.7.2.2 5.7.2.3 5.7.2.4 5.7.2.5 5.7.2.6 5.7.2.7 5.7.2.8 5.7.2.9 5.7.2.10 5.7.3. 5.7.3.1 5.7.3.2
Pizeta con agua destilada. Micropipetas para volmenes de 20 y 200 L. Agua bidestilada. Solucin de fijacin (Anexo A). Solucin de tincin (Anexo A). Solucin de revelado (Anexo A). Solucin de detencin (Anexo A). Formaldehdo al 37% (Anexo A). Tiosulfato de sodio (frasco stock). Procedimiento Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solucin de fijacin e incubar en agitacin constante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solucin de fijacin, en reposo durante toda la noche. Retirar el gel de la solucin de fijacin y colocarlo en un recipiente con agua destilada. Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operacin tres veces. Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lmina de plstico o placa petri por 10 a 20 segundos). Colocar el gel en la solucin de tincin y dejar en agitacin constante durante 30 minutos. Retirar el gel de la solucin de tincin y lavar en agua destilada durante 5 segundos. Aadir en el momento 150 L de formaldehdo (37% concentracin comercial) y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado para preparar la solucin de revelado y enrazar hasta 100 mL. Inmediatamente colocar el gel en la solucin de revelado (Anexo A) y dejar en agitacin constante hasta que empiecen a aparecer las bandas. Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solucin fra (4C -8C) de reactivo de parada o detencin y dejar en agitacin hasta que no aparezcan ms burbujas. Secar el gel para registrar el resultado final (Figura N 16)
5.7.3.3 5.7.3.4
5.7.3.5
5.7.3.6 5.7.3.7 5.7.3.8
5.7.3.9
5.7.3.10
5.7.3.11
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10
11
12
Figura N 16. Gel de poliacrilamida teido con plata para la visualizacin de molculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular. Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.
5.8
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIN DEL ADN Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribucin de las molculas de ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda al investigador estandarizar algunos parmetros importantes que en la prctica suelen pasar desapercibidos. Estos factores pueden ser:
5.8.1
Tamao del ADN Generalmente la tasa de migracin del ADN es inversamente proporcional al log10 del nmero de pares de bases que conforman la molcula. Esto significa que las molculas de ADN ms grandes generalmente migran ms lentamente que las ms pequeas.
5.8.2
Concentracin de la agarosa Una molcula de ADN migrar y se distribuir de modo diferente a medida que vare la concentracin de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenmeno se puede explicar matemticamente mediante la siguiente frmula: log = log o - Krt Donde logm es el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN, t es la concentracin de la agarosa, mo es la libre movilidad electrofortica del ADN y Kr es el coeficiente de retraso relacionado a las propiedades del gel y del tamao y forma de las molculas que se desplazan (Anexo B).
5.8.3
Conformacin del ADN Existen molculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformaciones estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los plsmidos que en la mayora de los casos generan estructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. En la electroforesis, estos plsmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz de agarosa de tal manera que dan la impresin de tratarse de molculas de diferente peso molecular.
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Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parmetros fsicos como la fuerza inica del buffer, el voltaje aplicado o la concentracin misma de agarosa (Figura N 17). 5.8.4 Voltaje aplicado Este parmetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilizacin de las molculas de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo elctrico (aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las molculas de ADN de alto peso molecular pero de manera indistinta. Ello genera que las molculas no se separen completamente unas de otras pese a aumentar la velocidad de la electroforsis. En consecuencia, se recomienda no aplicar ms de 5V/cm para molculas de ADN mayores de 2 Kb.
2313094166557436123222027ADN circular relajado ADN circular enrollado ADN superenrollado
Figura N 17. Electroforesis de ADN plasmdico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcador de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plsmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plsmido en agarosa al 1%. Carril 4: Plsmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmdico. En el carril 3 se puede apreciar una menor concentracin de ADN.
5.8.5
Direccin del campo elctrico Durante una electroforesis normal, las molculas de ADN migrarn a travs de una determinada direccin influenciada por un campo elctrico. Esta direccin tiene singular repercusin sobre la tasa de migracin de una molcula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la direccin de la migracin del ADN se mantendr inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la direccin del campo elctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migracin del ADN. En ese sentido, si consideramos fraccionar dos grandes molculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADN genmico) bajo un campo elctrico de una sola direccin el resultado final ser la presencia de una
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sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la direccin del campo elctrico, las molculas ms grandes de 100 kb se autoalinearn, alterarn su migracin y se podrn separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel Electrophoresis), y es bastante usado para la separacin de molculas de ADN de grandes tamaos (por encima de 100 kb). 5.8.6 Composicin de las bases y temperatura En geles de agarosa, la composicin de las bases del ADN y la temperatura no son factores que influyen sobre la migracin del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migracin de las molculas de ADN desde 4 C a 30 C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del 0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50C (cambio que puede ocurrir al aumentar el voltaje de electroforesis o por la alta fuerza inica del buffer) puede generar la licuacin del gel y en consecuencia la prdida de la muestra del ADN. 5.8.7 Presencia de agentes intercalantes Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del cido nucleico produciendo una alteracin del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante la electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primero la electroforesis y posteriormente la tincin del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitar distorsiones en la migracin del ADN. 5.8.8 Composicin del buffer de electroforesis La migracin del ADN es afectada por la composicin y la fuerza inica del buffer de electroforesis. En un caso hipottico en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar de buffer, la conductividad elctrica disminuira drsticamente por la falta de iones y, en consecuencia, la migracin del ADN sera casi nula. Si la concentracin de iones fuera excesivamente alta, la conductividad elctrica sera muy eficiente y se generara un sobrecalentamiento del buffer. El calor excesivo podra causar la licuacin de la agarosa o la denaturacin del ADN. Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los ms usados son el buffer TAE (Tris, cido actico y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las molculas de ADN migren 10% ms rpido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se sobrecalienta fcilmente a grandes voltajes. Por esta razn, este buffer es usado para la resolucin de grandes fragmentos de ADN en matrices poco concentradas.
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SECCIN 6 VARIANTES DE ELECTROFORESIS Nuevos protocolos y tcnicas basadas en la electroforesis de ADN y protenas, han venido apareciendo en los ltimos aos. Mencionaremos brevemente los ms importantes: 6.1 6.1.1 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Es un proceso de separacin e identificacin de protenas en dos dimensiones, orientando los frentes de corrida en ngulo recto uno de otro. En tal sentido, las molculas primero son separadas por su carga o punto isoelctrico (pI) por la tcnica de enfoque isoelctrico o IEF (Isoelectric Focusing). Posteriormente, las protenas son separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular por electroforesis en SDS PAGE (Figura N 18). A diferencia de la electroforesis en una dimensin en el que se puede resolver cerca de 50 bandas, la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipptidos.
6.1.2
Figura N 18. Electroforesis en dos dimensiones de protenas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/ parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).
6.2 6.2.1
ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de slica fundida cubierta con poliamida. Los tubos de slica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un dimetro de 25 a 100 m y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa. El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo elctrico, donde el calor generado es eficientemente disipado gracias a la accin de los pequeos capilares. Para este propsito, el buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente elctrica se generar un flujo de protones hacia el ctodo, proceso conocido como flujo endo-osmtico.
6.2.2
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6.2.3
Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de molculas entre las cuales tenemos: protenas, pptidos, aminocidos, cidos nucleicos, iones inorgnicos, bases orgnicas, cidos orgnicos y clulas en general. En este sistema el tiempo de separacin es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la eficiencia de separacin es muy alta (Figura N 19).
Detector Fuente de luz 280 nm
6.2.4
nodo (+)
Ctodo (-)
Buffer Foto-receptor
Buffer
Computadora con registrador
E = V/d
Figura N 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo elctrico, V = voltaje, d= distancia). La figura es una versin modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html
6.3
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFEG) Es una tcnica diseada especialmente para la separacin de ADN de alto peso molecular (>100 kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes campos elctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migracin del ADN hacia diferentes direcciones facilitando la separacin de dos grandes molculas de ADN.
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SECCIN 7 VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS 7.1 7.1.1 GENERALIDADES Se recomienda que los equipos utilizados en biologa molecular cuenten con un certificado de calidad avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el ptimo funcionamiento de las pruebas moleculares. Asimismo, los reactivos que se empleen debern ser de grado biologa molecular a fin de asegurar resultados satisfactorios despus de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que exigen mantenerse en refrigeracin, debern ser evaluados por el propio investigador que los adquiri antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condiciones de refrigeracin, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente, la polimerizacin no debe demorar ms de media hora. La acrilamida/bisacrilamida es otro reactivo importante que en polvo puede guardarse a temperatura ambiente; sin embargo, en estado de solucin puede mantenerse en refrigeracin hasta por 6 meses. Es importante verificar la calidad de los reactivos y soluciones de trabajo preparados en laboratorio. BUFFER PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y ADN Tanto el buffer de electroforesis para protenas como de ADN, debern ser preparados adecuadamente y renovados en forma peridica. En tal sentido, se recomienda preparar solucin stock de buffer de electroforesis concentrado 10 veces para protenas (Anexo A) 50 veces para ADN (Anexo A). Este paso permite conservar la reproducibilidad del experimento. PERSULFATO DE AMONIO En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscpico, es decir, suele hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deber realizarse un control peridico del frasco que lo contiene a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la prdida de sus propiedades qumicas durante el proceso de polimerizacin. Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando APS al 10% y verificar que la polimerizacin no demore por ms de media hora. Para evitar la hidratacin del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa con lmina extensible de parafina. BROMURO DE ETIDIO La solucin de trabajo (1 g/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solucin, forrar el frasco con papel aluminio y rotular.
7.1.2
7.1.3
7.1.4 7.2 7.2.1
7.3 7.3.1
7.3.2
7.3.3
7.4 7.4.1
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7.4.2
La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50 pg (Seccin 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualizacin de la mnima concentracin de ADN permitir determinar la calidad ptima del bromuro de etidio. El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la prdida de sus propiedades fluorescentes por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad. AGAROSA La continua licuacin de la agarosa incrementa su concentracin por deshidratacin alterando el perfil de las bandas al final del resultado. Por lo tanto, se recomienda preparar soluciones de agarosa en volmenes no mayores de 200 mL y verificar constantemente la turbidez de la agarosa antes de la preparacin del gel. De otro lado tambin se recomienda, verificar la presencia de residuos extraos en la solucin ya que pueden interferir con el anlisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, ser necesario preparar una nueva solucin a fin de superar este inconveniente. POLIACRILAMIDA AL 30% Esta solucin de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposicin a la luz y el cambio de temperatura fcilmente deterioran su calidad.
7.4.3
7.5 7.5.1
7.5.2
7.6
7.7 7.7.1
AGUA DESTILADA En biologa molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener ptimos resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para protena y ADN, as como tambin para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Si el investigador cuenta con un equipo de destilacin asegrese que el agua presente una resistividad elctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mnima concentracin de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza). EQUIPOS DE LABORATORIO Los equipos que se usan en biologa molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento preventivo continuo por lo menos una vez al ao. Este proceso deber ser realizado por personal tcnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compaa fabricante.
7.8 7.8.1
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SECCIN 8 REGISTROS Y ARCHIVOS Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes pasos: 8.1 Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado con la luz UV, tomar una fotografa con una cmara fotogrfica resistente a este tipo de luz. En caso de no ser posible tomar una fotografa, tratar de dibujar con un lpiz el resultado lo ms parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plstico para cuaderno, colocarlo sobre la lmina de proteccin de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio. Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede realizarse usando una cmara fotogrfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tincin con plata y secar el gel para su posterior anlisis y registro. Para el caso de protenas teidas con azul brillante de ccomasie tambin se recomienda secar el gel. Registrar los resultados obtenidos siguiendo el Esquema N 1.
8.2
8.3
8.4
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ESQUEMA N 1 RESULTADOS EXPERIMENTO N_________ FECHA: _______________ OBJETIVO DEL EXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________ CONCENTRACIN DEL GEL: CARRIL 1: _________________________________ CARRIL 2: _________________________________ CARRIL 3: _________________________________ CARRIL 4: _________________________________ CARRIL 5: _________________________________ CARRIL 6: _________________________________ CARRIL 7: _________________________________ CARRIL 8: _________________________________ CARRIL 9: _________________________________ CARRIL 10: _________________________________ CARRIL 11: _________________________________ CARRIL 12: _________________________________ CARRIL 13: _________________________________ CARRIL 14:_________________________________ OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________
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BIBLIOGRAFA Andrews, A. T. Electrophoresis of nucleic acids. In: Essential Molecular Biology. A Practical Approach. New York: T. A. Oxford University Press Ed. Brown; 1991. Berg G, Garfin D. Protein and nucleic acid blotting and inmunobiochemical detection. Biotechniques 1985; 3: 276. BIO-RAD. Acrylamide polymerization-a practical approach. US/EG Bulletin 1156, 1989. 3 pp. Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular cell biology. 2nd ed. New York: Scientific American Books; 1990. Instituto Nacional de Salud. Normas de Bioseguridad. 2 ed. Lima: Instituto National de Salud. 2002. Serie de Normas Tcnicas N 18. Maizel RM, Blexter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens parasite genes. A laboratory manual for molecular parasitology. Cambridge: Cambridge University Press; 1992. Montoya Y, Len C, Maturrano L, Muoz-Najar U, Nolasco O, Talledo M, et al. Gua de Prctica del Curso Terico-Prctico: Electroforesis de protenas y cidos nucleicos.Lima: Instituto Nacional de Salud; 1995. Montoya Y, Baldeviano C, Caballero A, Cceres O, Caldern R, De los Santos, M, et al. Gua de prctica del curso terico-prctico: electroforesis de acidos nucleicos y PCR. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1999. Montoya Y, Len C, Nolasco O, Talledo M, Padilla C, Velarde M, et al. Gua de prctica del curso terico-prctico: WESTERN BLOT y ELISA. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1999. Purves WK, Orians GH, Heller HC, Sadava D. Life: the science of biology. 5th ed. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.; 1997. Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology 3th ed. London: Ed. Consultant; 1993. Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Gel electrophoresis DNA and molecular cloning. In: Molecular cloning a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. Westermeier R. Electrophoresis in practice. VHC Publishers Inc. New York. 1993. 277 pp. Egelhofer V, Giavalisco P, Eickhoff H, Horn M, Przewieslik T, Theiss D, et al. Large-gel twodimensional electrophoresis-matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry: an analytical challenge for studying complex protein mixtures. Electrophoresis 2001; 22: 2844-55.
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ANEXOS ANEXO A A.1 A.1.1 PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS BUFFER DE LA MUESTRA 4X PARA PROTENAS Reactivos Tris 0,5 M, pH 6,8 SDS al 10 % 2-Mercaptoetanol Glicerol Azul de bromofenol Concentracin final 0,125 M 2.5 % 25 % 25 % 0,1 mg/mL
2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 1 mg
Mezclar los componentes arriba mencionados. A.1.2 BUFFER DE ELECTROFORESIS TRIS-GLICINA 10X PARA PROTENAS Reactivos STris base Glicina SDS Concentracin final 0,25 M 2M 1%
3,038 gr 15,01 gr 1 gr
Completar con 100 mL de agua bidestilada. A.1.3 SOLUCIN DE TRABAJO ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA AL 30% Reactivos Acrilamida Bisacrilamida Mezcla total Concentracin final 29,2% 0,8% 30%
29,2 gr 0,8 gr 30 gr
Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N 1 y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft. A.1.4 BUFFER TRIS 1,5 M pH= 8,8 Pesar 181,65 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a pH= 8,8 con HCl. A.1.5 BUFFER TRIS 0,5 M pH=6,8 Pesar 60,55 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a pH = 6,8 con HCl.
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A.1.6
PERSULFATO DE AMONIO (APS 10%) Pesar 100 mg y diluir en un volumen final de 1 mL con agua tridestilada. Este reactivo en polvo es altamente hidroflico, por lo tanto, es importante mantener el envase hermticamente cerrado. Esta preparacin debe ser de 1 semana de antigedad como mximo.
A.1.7
BUTANOL-AGUA Mezclar un volumen de butanol ms un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superior de la mezcla.
A.1.8
PREPARACIN DE GELES POLIACRILAMIDA DE RESOLUCIN DE ACUERDO A SU CONCENTRACIN Y VOLUMEN COMPONENTES DE LA SOLUCIN GEL AL 6 Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED COMPONENTES DE LA SOLUCIN GEL AL 8% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED GEL AL 10% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED GEL AL 12% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED 5 mL 2,6 1,0 1,3 0,05 0,025 0,0025 5 mL 2,3 1,3 1,3 0,05 0,025 0,0025 VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN 10 mL 5,3 2,0 2,5 0,1 0,05 0,05 10 mL 4,6 2,7 2,5 0,1 0,05 0,05 15 mL 7,9 3,0 3,8 0,15 0,075 0,0075 15 mL 6,9 4,0 3,8 0,15 0,075 0,0075 20 mL 10,6 4,0 5,0 0,2 0,1 0,01 20mL 9,3 5,3 5,0 0,2 0,1 0,01
1,9 4,0 5,9 7,9 1,7 3,3 5,0 6,7 1,3 2,5 3,8 5,0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,025 0,05 0,075 0,1 0,0025 0,05 0,0075 0,01 VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN 1,6 2,0 1,3 0,05 0,025 0,0025 3,3 4,0 2,5 0,1 0,05 0,05 4,9 6,0 3,8 0,15 0,075 0,0075 6,6 8,0 5,0 0,2 0,1 0,01
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GEL AL 15% Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED A.1.9
1,1 2,5 1,3 0,05 0,025 0,0025
2,3 5,0 2,5 0,1 0,05 0,05
3,4 7,5 3,8 0,15 0,075 0,0075
4,6 10,0 5,0 0,2 0,1 0,01
PREPARACIN DE GELES DE EMPACAMIENTO AL 5% DE ACUERDO A SU VOLUMEN COMPONENTES DE LA SOLUCIN Agua bidestilada Acrilamida/bisacrilamida 30% Tris 1,5 m pH 8,8 SDS 10% Persulfato de amonio 10% TEMED 3 mL 1,1 2,5 1,3 0,05 0,025 0.0025 4 Ml 2,3 5,0 2,5 0,1 0,05 0.05 6 mL 3,4 7,5 3,8 0,15 0,075 0.0075 8 mL 4,6 10,0 5,0 0,2 0,1 0.01
A.1.10
SOLUCIN DE TRABAJO DE AZUL BRILLANTE DE COMASIE R250 Disolver 0,25 g de azul brillante de coomasie R250 en 90 mL de metanol:H2O (v/v 1:1) y 10 mL de cido actico glacial. Filtrar la solucin a travs de un papel Whatman N 1 para eliminar los residuos extraos. Antes de usar dejar en reposo por una semana en un frasco oscuro.
A.1.11
SOLUCIN DE DECOLORACIN RPIDA Mezclar 10 mL de cido actico glacial con 50 mL de metanol. Llevar la solucin a 100 mL con 40 mL de agua destilada.
A.1.12
SOLUCIN DE DECOLORACIN LENTA Mezclar 10 mL de cido actico glacial con 5 mL de metanol. Llevar la solucin a 100 mL con 85 mL de agua destilada.
A.1.13
SOLUCIN GLICEROL METANOL Mezclar 4 mL de glicerol con 45mL de metanol. Llevarlo a un volumen de 100 mL de agua destilada.
A.1.14
SDS 10% Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N de NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada. Calentar a 68 C para disolver completamente el SDS.
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A.2 A.2.1
PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE ADN BUFFER DE RESOLUCIN STOCK TRIS-BORATO (TBE) 5X Reactivo Tris base cido brico EDTA 0,5M Ph 8,0 Cantidad 54 g 27,5 g 20 Ml Concentracin final 0,45 M 0,45 M 0,01 M
Llevar a un volumen de un litro con agua bidestilada A.2.2 BUFFER DE RESOLUCIN STOCK TRIS-ACETATO (TAE) 50X Preparar: Reactivo Tris base cido actico glacial EDTA 0,5M Ph8,0 Completar con 1 Litro de agua bidestilada A.2.3 BUFFER DE MUESTRA PARA ADN (6X) Preparar: Reactivo Azul de bromofenol Xilene cianol FF Sucrosa Disolver en 10 mL de TAE 1X A.2.4 PREPARACIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA ADN Mililitros de reactivo para la preparacin de geles a varias concentraciones (Volumen final 100 mL) Reactivos Acrilamida/bisacrilamida al 30% Agua bidestilada TBE 5X APS 67,7 20,0 0,7 62,7 20,0 0,7 52,7 20,0 0,7 46,0 20,0 0,70 39,3 20,0 0,7 12,7 20,0 0,7 3,5% 11,6 5,0% 16,6 8,0% 26,6 10% 33,3 12,0% 40,0 20% 66,6 Cantidad 25 mg 25 mg 4g Concentracin final 0,25% w/v 0,25% w/v 40% w/v Cantidad 242 g 571 Ml 100 Ml Concentracin final 1,9 M 57,1% 0,05 M
Aadir 35 L de TEMED por cada 100 mL de solucin.

A.2.5
AGAROSA 0,8%, 1,5% Y 2% Disolver 0,8 g, 1,5 g 2 g de agarosa en 98 mL de agua bidestilada. Adicionar a la solucin 2 mL de TAE 50X, homogeneizar y disolver la agarosa en horno microondas o en bao Mara.
A.2.6
SOLUCIN STOCK DE BROMURO DE ETIDIO (10mg/mL) Nota: El bromuro de etidio es un agente cancergeno y moderadamente txico. Usar guantes para manipular este reactivo Pesar 100 mg de bromuro de etidio en 10 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.
A.2.7
SOLUCIN DE TRABAJO DE BROMURO DE ETIDIO (1 g/mL) Diluir 100 L de bromuro de etidio a partir de la solucin stock en 100 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.
A.2.8
SOLUCIN DE FIJACIN/ DETENCIN AL 10% PARA TINCIN CON PLATA Mezclar 10 mL. de cido actico glacial y 90 mL de agua bidestilada.
A.2.9
SOLUCIN DE TINCIN CON PLATA Disolver 0,1 gr de nitrato de plata en 80 mL de agua, agregar 150 L de formaldehdo al 37%, completar la solucin hasta 100 mL.
A.2.10
SOLUCIN DE REVELADO PARA TINCIN CON PLATA Disolver 3 gr de carbonato de sodio (Na2CO3) en 100 mL de agua bidestilada. Dejar enfriar Agregar 150 L de formaldehdo al 37% y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado segundos antes de ser usado.
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ANEXO B B.1 B.1.1 UNIDADES Y FRMULAS EQUIVALENCIAS DE VALORES EN PESO 1 mg = 10-3 g 1 g = 10-6 g 1 ng = 10-9 g 1 pg = 10-12 g 1Kb de ADN equivale a 333 aminocidos de capacidad codificante = 37,000 Daltons B.1.2 VALORES PARA CUANTIFICAR ADN Y ARN Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena doble= 50 g Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena simple= 37 g Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ARN de cadena simple= 40 g B.1.3 Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentraciones de geles de poliacrilamida Acrilamida (% peso/volumen) 3,5 5,0 8,0 12,0 15,0 20,0 Rango de separacin efectiva en pb 1000 - 2000 80 - 500 40 - 200 60 - 400 25 - 150 6 - 100 Xilene Cianol FF (*) 460 260 160 70 60 45 Azul de bromofenol (*) 100 65 45 20 15 12
(*) Los nmeros dados son los tamaos aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989) B.1.4 RANGO DE SEPARACIN DEL ADN EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES CONCENTRACIONES DE AGAROSA (FUENTE: SAMBROOK et. al., 1989) Concentracin de agarosa en gel (% [w/v]) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 Eficiente rango de separacin de ADN lineal en Kilopares de bases (Kb) 5 - 60 1 - 20 0,8 - 10 0,5 - 7 0,4 - 6 0,2 - 3 0,1 - 2
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B.1.5
RANGO DE SEPARACIN DE PROTENAS EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES CONCENTRACIONES DE POLIACRILAMIDA (RADIO 29:1 DE ACRILAMIDA/ BISACRILAMIDA) Concentracin de poliacrilamida (%) 15 10 7,5 5,0 Rango lineal de separacin en Kilodaltons (kDa) 12 - 43 16 - 68 36 - 94 57 - 212
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ANEXO C C.1 MEDIDAS A SEGUIRSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TXICOS En casi todos los casos en los que se tiene contacto con los reactivos que se mencionan en la lista adjunta, es importante seguir los siguientes pasos como medida de emergencia: Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabn y abundante agua. Si hubo inhalacin, trasladarse inmediatamente hacia un rea donde haya aire fresco. Recibir asistencia mdica inmediatamente.
C.2
LISTA DE REACTIVOS USADOS EN ELECTROFORESIS CON SUS CARACTERSTICAS TXICAS Y QUMICAS CARACTERISTICA Irritante por inhalacin, corrosivo. Daino por inhalacin o por contacto con la piel. Irrita los ojos, sistema respiratorio y piel. Posible riesgo de efecto irreversible. Posible teratgeno. Puede causar dao al sistema nervioso central. Neurotxico, cancergeno, genera dao gentico heredable. No se reporta algn grado de toxicidad. Puede ocasionar asfixia por inhalacin. Neurotxico, nocivo e inflamable. Genera dao gentico heredable, irrita los ojos el sistema respiratorio y la piel. Nocivo. Txico, nocivo, puede causar severa irritacin a las vas respiratorias, piel y ojos. Nocivo. Irrita ojos y piel. No se reporta algn grado de toxicidad. Txico por inhalacin o contacto con la piel, genera severa irritacin. Txico e inflamable. Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalacin, produce quemaduras en la piel. No se reporta algn grado de toxicidad. Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalacin, produce quemaduras en la piel. Posible cancergeno, produce irritacin al sistema respiratorio y piel. Irrita ojos, piel y sistema respiratorio.
REACTIVO Acido actico glacial Acido brico
Acrilamida Agarosa Azul de bromofenol Bisacrilamida Bromuro de etidio Butanol Dodecil sulfato de sodio (SDS) EDTA Glicerol Glicina Mercaptoetanol Metanol Persulfato de amonio Sucrosa TEMED Tris Xilene cianol
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Problema Solucin (es)
Posible(s) causa (s)
Pocillos de los geles de poliacrilamida mal Mala homogeneizacin del APS y el TEMED en la Realizar la mezcla del APS y el TEMED con polimerizados. solucin de poliacrilamida.APS al 10% con ms de movimiento de rotacin lento y suave sin hacer una semana de antigedad. burbujas. Preparar nueva solucin de trabajo de APS al 10% Calentar las muestras a 100C antes de colocarlas en los pozos. No diluir mucho el buffer de la muestra con la muestra propiamente dicha. Volver a preparar buffer de la muestra. Preparar nueva solucin de trabajo de APSMezclar los componentes de tal manera que no se generen burbujas. Preparar nueva solucin de acrilamida/ bisacrilamida.
Muestra no cae eficientemente y se difunde en el Muestras de protenas no fueron calentadas a 100 buffer de electroforesis en el momento que es C antes de ser depositadas en el gel de agarosa.Buffer de la muestra tiene baja depositada en el pocillo. concentracin de glicerol o sucrosa en el medio.
Deficiente polimerizacin de los geles de Solucin de trabajo de persulfato de amonio (APS) al 10% con ms de una semana de antigedad. poliacrilamida. Poliacrilamida con ms de un mes de antigedad. Presencia de burbujas en la solucin.
ANEXO D
Se pierde volumen del buffer de la cmara de Fuga de buffer. electroforesis durante la corrida.
PROBLEMAS MS COMUNES PRESENTES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS
53
Para evitar cualquier tipo de fuga del buffer localizar el lugar de escape y untar con una capa mediana de vaselina. Medir el pH del buffer. Volver a preparar el buffer con los reactivos adecuados y si es posible volver a preparar la solucin stock 10X. Evaluar la precisin de los instrumentos de medicin (probetas, pipetas, etc.). Disminuir voltaje. Preparar nueva solucin de trabajo.
Buffer de electroforesis se calienta excesivamente Alta concentracin de sales (mayor de 1X de concentracin)pH del buffer menor de 8.Preparacin (por encima de los 60 C). del buffer de electroforesis con Tris-HCl en lugar de Tris-Base.Buffer viejo usado varias veces
Problema
Posible(s) causa (s)
Solucin (es)
Preparar geles ms delgados de tal manera que se pueda visualizar el color del recipiente que lo contiene a travs de ellos. Manipular las protenas en fro. Todo procedimiento que involucre manipulacin del ADN como de protenas debe realizarse con guantes.
Las bandas de ADN no se ven ntidamente en el Gel de agarosa muy grueso. gel. Bromuro de etidio muy diluido.
Manchas indefinidas o difusas de protena/ADN a Degradacin de la protena/ADN. lo largo de todo el gel. Efecto "smearing".
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ANEXO E E.1 E.1.1 EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solucin stock de TAE 50X Solucin Si se toma un volumen inicial de la solucin stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. Cmo calcular dicho volumen? Se tiene los siguientes datos: Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentracin inicial 1 (C1) = 10X Volumen final 2 (V2)= 500 mL Concentracin final 2 (C2) = 1X Aplicando el siguiente factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2 y reemplazando valores se tiene: V1(50X) = (1X)(500 mL) Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda: V1= 10 mL Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada E.1.2 Preparar 250 mL de agarosa al 1,5% en TAE 1X Solucin Calcular cuanto de agarosa debemos pesar y qu volumen de TAE 50X emplear para un volumen final de 250 mL de agarosa al 1,5%. Calculando el peso de la agarosa. Cuando nos referimos a agarosa al 1,5% decimos que 1,5 g de agarosa deben estar contenidos en 100 mL de volumen total de TAE 1X. En consecuencia si 1,5 g es para 100 mL x g ser para 250 mL Por regla de tres simple x = 1,5g x 250 mL = 3,75 g 100 mL Calculando volumen de TAE 50X: Recordando el factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2 El volumen inicial: V1 = (1X)(250 mL) 50X
V1 = 5 mL Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego aadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de 250 mL con agua bidestilada.
E.1.3
Preparar 450 mL de buffer TBE 1X a partir de un stock de 10X Solucin Empleando la frmula conocida: V1 x C1 = C2 x V2 V1 = (1X) (450 mL) 10X V1 = 45 mL Rp.- Usaremos 45 mL de TBE 10 X para preparar 450 mL de TBE 1X
E.1.4
Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentracin de 1g/l a partir de una solucin stock de 10 mg/mL. Solucin En este caso tambin usar la frmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1) Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 g/L Convirtiendo 10 mg/mL a g/L: En 10 mg hay 10 000 g. En 1 mL hay 1000 L. Dividiendo: 10 000 g = 10 g/L = C1 1000 L Reemplazando en (1) V1 (10 g/L) = (1 g/L)(100 mL) V1 = 10 mL Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con 990 mL de agua bidestilada.
E.1.5
Preparar 50 mL de una solucin de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol Solucin El EDTA es un agente quelante cuya presentacin comercial es en forma de polvo. En consecuencia, debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solucin de 0,5 M. Aplicando la siguiente frmula: W = M x PM x V.........................(a) Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros. Datos: PM del EDTA = 336,2 g/Mol. Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro. Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt): 1 Lt contiene 1000 mL x Lt habr en 50 mL
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Aplicando regla de tres simple: x = (50 mL) (1Lt) = 0,05 Lt 1000 mL Reemplazando y despejando unidades(a): W = (0,5Moles) (336,2g) (0,05 Lt) Lt Moles W = 8,405 g Rp.- Diluir 8,405 g de EDTA en 50 mL de agua para preparar una solucin 0,5 M de EDTA. E.1.6 Preparar 10 mL de una solucin de butanol-agua en proporcin 1:1 Solucin Cuando se refiere a una proporcin 1:1 significa que se debe realizar una mezcla de volmenes proporcionalmente iguales entre ambas soluciones. As tenemos: Butanol = 5 mL Agua = 5 mL Volumen final 10 mL Rp.- Mezclar 5 mL de butanol ms 5 mL de agua. E.1.7 Qu volumen de una solucin stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumen de 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8? Solucin Aplicando la frmula y reemplazando valores: V1 x C1 = C2 x V2 (V1 ) (5M) = (1,5M) (250 mL) V1 = 75 mL Rp.- Se necesita un volumen de 75 mL de Tris 5M pH= 8,8. E.1.8 Cunto de acrilamida y bisacrilamida se necesita para preparar 100 mL de una solucin al 30% si se desea mantener una proporcin de 29:1 de acrilamida:bisacrilamida respectivamente? Solucin La proporcin 29:1de acrilamida/bisacrilamida indica que son 29 partes de acrilamida sobre 1 de bisacrilamida. Asimismo, nos indica que la concentracin final de la solucin ser de 30%, es decir 30 partes de la mezcla en un total de 100 partes de la solucin. As tenemos: 29:1 = 29 g de acrilamida + 1g de bisacrilamida. Volumen final = 100 mL Rp.- Se necesitan 29 g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida.
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ANEXO F F.1 F.1.1 PAGINAS WEB RECOMENDADAS ELECTROFORESIS EN GENERAL: DNA Electrophoresis. http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm. Polyacrilamide gel electrophoresis (Page): http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact Electroforesis vertical: http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf Electrophoresis lecture notes. http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF. Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book. http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images to correct for geometric distortions of the spot pattern. http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf BIOSEGURIDAD: ORS chemical safety. Decontamination of Ethidium Bromide. http://www.northwestern.edu/research-safety/chem/ethid2.htm Sinclair Bob. An Eye for a Dye. Safe and sensitive new stains replace ethidium bromide for routine nucleic acid detection. (2000) The Scientist 14[8]:31. Pag Web: http://www.the-scientist.com/yr2000/apr/profile_000417.html(Previa subscripcin gratutita) UNIDADES Y FRMULAS: Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu. http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html PROTEMICA: Introduction to Proteomics. Pg. Web: http://www.bb.iastate.edu/~chitnis/joe/papers/wilder.html
F.1.2
F.1.3
F.1.4
MPR-CNSP-016
59
ARTES Y DISEOS LASER S.R.Ltda. Calle Las Turquesas 263-265-269 Balconcillo Lima 13 - Per Telf.: 265-8320 Telefax: 266-0075
Setiembre 2003 Tiraje: 3,000 ejemplares
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD SEDE CENTRAL Cpac Yupanqui N 1400, Jess Mara Lima 11, Apartado N 451 Telf.: (51-1) 471 9920 - Fax: (51-1) 471 0179 E-mail: postmaster@ins.gob.pe Pgina Web: www.ins.gob.pe

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTENAS Y ADN

Serie de Normas Tcnicas N 38 Lima - 2003

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Presidente Dra. Ada Palacios Ramrez

Editor Dr. Leonid Lecca Garca

Asistente Editorial Lic. Daniel Crdenas Rojas

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INTRODUCCIN SECCIN 1: 1.1 1.2 1.3

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SECCIN 6: 6.1 6.2 6.3

SECCIN 5: 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6

SECCIN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR

SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Abreviaturas y definiciones

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PGINAS WEB RECOMENDADAS

EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES

PROBLEMAS MS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TXICOS

PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y ELECTROFORESIS DE ADN

SECCIN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS

7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

Bromuro de etidio Agarosa Poliacrilamida al 30% Agua destilada Equipos de laboratorio

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1.3.16 1.3.17 1.3.18

1.3.19 1.3.20 1.3.21 1.3.22 1.3.23 1.3.24

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Peine Vidrio chico Tanque de electroforesis vertical

Fuente de Poder Voltmetros

Base de jebe Electrodos Interruptor

Figura N 1. Componentes de una cmara de electroforesis vertical

Espaciadores Vidrio grande Vidrio chico

rea para el gel de empacamiento

rea para el gel de resolucin

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1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre un soporte Peine

4. Remover el butanol con agua y aadir gel de empacamiento

Ganchos o prensas Soporte