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Validacion Metodos Analiticos
Validacion Metodos Analiticos
Fuentes: The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Eurachem Guide, 1998 y Gua para la validacin de mtodos de ensayo. OAA.DC-LE-05
Introduccin
La validacin de un mtodo es un requisito importante en la prctica de los anlisis qumicos. Sin embargo, se suele considerar a la validacin de un mtodo como algo que solamente se puede hacer en colaboracin con otros laboratorios y en consecuencia, no se hace. Esta gua apunta a los laboratorios que necesitan validar mtodos y que no tienen la posibilidad inmediata de participar en ensayos colaborativos
Qu es validacin de un mtodo?
Validacin es la confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista (IRAM 32)
Es el proceso de definir un requisito analtico y de confirmar que el mtodo en consideracin es apto para lo que requiere la aplicacin Est implcito que los estudios para determinar los parmetros de aptitud del mtodo se hacen
usando equipamiento que funciona y que est calibrado correctamente (within specification) El operador es competente en ese campo de trabajo y tiene el conocimiento suficiente tal que es capaz de tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones que surgen a medida que avanza el estudio
Muchos de los parmetros de la aptitud del mtodo que se asocian con la validacin son de hecho evaluados, por lo menos aproximadamente, como parte del desarrollo del mtodo
Muy frecuentemente no es posible determinar exactamente dnde termina el desarrollo de un mtodo y dnde comienza la validacin de ese mtodo
2.
Por la obligacin profesional del analista 1. El cliente espera confiar en los resultados informados y generalmente los cuestiona cuando aparece algn conflicto (aqu el analista debe demostrar que ha informado la respuesta correcta para la parte analtica del problema del cliente la validacin del mtodo permite demostrar que el mtodo is fit for purpose 2. Por la confianza con que el cliente necesita tomar decisiones en base a los resultados analticos aqu se debe validar la aptitud del mtodo y estimar la incertidumbre del resultado de un modo que sea ampliamente reconocido, internamente consistente y fcil de interpretar. (Mucha de la informacin requerida para evaluar la incertidumbre se puede obtener durante la validacin del mtodo) 3. La toma de muestras: si el laboratorio no puede tomar la muestra o no tiene influencia sobre ello, los resultados deben informarse sobre la base de las muestras como fueron recibidas y destacar este hecho en el informe
2. 3.
El analito est disperso o localizado) El analito est presente en ms de una forma? Interesa si el analito es extractable, libre o total?
Cul es el analito de inters y en qu Confirmacin de la identidad, lmite de nivel ( %, ug, etc)? deteccin, lmite de cuantificacin, rango de trabajo Cun exacta y precisa debe ser la respuesta? /qu grado de incertidumbre se permite y cmo debe ser expresada? Recuperacin, exactitud, precisin de la repetibilidad, precisin de la reproducibilidad
Analizar muestras con cantidades agregadas de las interferencias esperadas en presencia de los analitos de inters
Lmite de deteccin
Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con cierto nivel de confianza especificado.
Para un resultado analtico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real del analito. La seal de fondo es producida por el blanco y exhibe ruido. El lmite de deteccin (LD) corresponde a una seal k veces la desviacin estndar del ruido de fondo. Tpicamente el valor de K es igual a 4 (LD=3F). Los valores por encima del LD pueden ser atribudos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables. (OAA; DC-LE-05)
Para una validacin normalmente es suficiente proveer una indicacin del nivel al cual la deteccin se vuelve problemtica.
Lmite de cuantificacin
Es la menor cantidad que puede ser determinada cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza. Para el anlisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que slo se emplean valores atribuibles al analito. El lmite de cuantificacin es entre 3 y 10 veces el lmite de deteccin segn cada caso (OAA, DCLE-05)
Examinar visualmente para identificar el rango lineal y los extremos sup e inf del intervalo de trabajo
La distribucin aleatoria sobre la lnea recta confirma linealidad Tendencias sistemticas indican no-linealidad
Exactitud
Proximidad entre el resultado de una medicin y el valor verdadero del mesurando (OAA DCLE-05) La validacin de un mtodo busca cuantificar la exactitud probable de los resultados evaluando los efectos sistemticos y azarosos sobre los resultados As, la exactitud se estudia normalmente como certeza y precisin
Exactitud (cont.)
Certeza (de un mtodo) es una expresin de cun cerca est la media de un conjunto de resultados (producidos por el mtodo) del valor verdadero. Normalmente se expresa en trminos de sesgo Precisin es una medida de cun cerca estn los resultados unos de otros, y generalmente se expresa por medidas como la desviacin estndar, que describe la dispersin de los resultados
Exactitud y certeza
Procedimiento segn el OAA - Usar material de referencia certificado, preferentemente con una matriz semejante a la de la muestra - Solo en el caso de no existir un material adecuado se puede realizar un ensayo de recuperacin - Cuando sea posible, se realizan un mnimo de 10 repeticiones del ensayo 3 das consecutivos - Se compara el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia certificado (), teniendo en cuenta la incertidumbre asociada de ese material - El mdulo de la diferencia da como resultado el sesgo del mtodo s = |X - |
Precisin
Proximidad entre valores de una magnitud obtenidos por mediciones replicadas, en condiciones especficas (IRAM 34552-1) Las dos medidas de precisin ms comunes son repetibilidad y reproducibilidad, que representan los dos extremos de la presicin que se pueden obtener
Precisin (cont)
Repetibilidad = la ms pequea precisin esperada. Da una idea del tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el mtodo es desarrollado por un mismo analista en un mismo equipo a lo largo de un periodo de tiempo corto. Ej., la variabilidad esperada entre los resultados cuando la muestra es analizada por duplicado Reproducibilidad = la precisin ms grande esperada. Una muestra analizada por varios laboratorios. Formalmente, excluye la variacin respecto del tiempo.
Precisin (cont)
(Precisin intermedia = un anlisis realizado por laboratoristas diferentes en un mismo laboratorio durante un periodo de tiempo prolongado) Generalmente la precisin se establece en trminos de desviacin estndar o desviacin estndar relativa La repetibilidad y la reproducibilidad dependen de la concentracin de analito y en consecuencia, debieran determinarse para varias concentraciones
Analizar
Calcular
Comentarios
Estndares, materiales de referencia o muestras fortificadas, en varias concentraciones a lo largo del intervalo de trabajo a. Mismo analista, equipo, laboratorio. Corto periodo de tiempo b. Diferentes analistas y equipos, mismo laboratorio, mayor tiempo c. Diferentes analistas, equipos, laboratorios, mayor periodo de tiempo 10 Desv estndar para cada concentracin Desv estndar para cada concentracin Desv estndar para cada concentracin Se determina la desv estndar de la repetibilidad para c/concent Se determina la desv estndar de la reproducibilidad intralaboratorio para c/concent Se determina la desv estndar de la reproducibilidad interlaboratorio para c/concent. Requiere estudios colaborativos
10
10
Repetibilidad y Reproducibilidad
A partir de la desviacin estndar de la repetibilidad ( o sr) es til calcular el lmite de repetibilidad r, el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de repetibilidad. A partir de la desviacin estndar de la reproducibilidad ( o sr) es til calcular el lmite de reproducibilidad R, el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de reproducibilidad.
Medicin de la incertidumbre
Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando (OAA. DC-LE-05) Generalmente es una desviacin estndar o un intervalo de confianza y su estimacin toma en cuenta todos los efectos reconocidos que operan sobre el resultado
Sensibilidad
Cambio en la respuesta de un instrumento de medicin dividido por el cambio en el estmulo correspondiente (ejemplo de estmulo: cantidad de mesurando presente) (IUPAC) Es el cambio de la respuesta del instrumental que se corresponde con el cambio de la concentracin del analito. Dentro del rango lineal de un mtodo, si se intercepta la curva de respuesta, la sensibilidad es un parmetro til para calcular y usar en la frmula de cuantificacin. A veces se usa la sensibilidad para referirse al lmite de deteccin del equipo, pero esto no se aprueba generalmente.
Robustez
Medida de la capacidad de un procedimiento analtico para no ser afectado por variaciones pequeas pero deliberadas en los parmetros del mtodo y que provee una indicacin de su fiabilidad durante su uso habitual (ICH Q2A) Ensayo de robustez: interlaboratorio para estudiar el comportamiento de un procedimiento analtico cuando se hacen pequeos cambios en las condiciones ambientales y/o de operacin. Involucra variaciones deliberadas en el mtodo. Permite identificar aquellas variables que provocarn cambios significativos y que deberan ser controladas ms estrictamente Los ensayos de robustez generalmente se aplican para investigar los efectos sobre la precisin y la exactitud.
Recuperacin
Fraccin de analito que se agrega a una muestra de ensayo (fortificada o spiked) antes del anlisis. Objetivo: evaluar la eficiencia del mtodo para detectar todo el analito presente en una muestra
En teora
Los mtodos normalizados son producidos mediante algn tipo de estudio en colaboracin, comparativo, y los organismos de normalizacin que los llevan a cabo, tienen frecuentemente expertos estadsticos que aseguran que esos estudios de validacin estn correctamente diseados, realizados y evaluados. Sin embargo es peligroso asumir que slo porque un mtodo est normalizado uno tiene la garanta de que esa validacin ser adecuada.
2. 3.
Evaluar cuntas muestras es conveniente procesar al mismo tiempo. Es mejor analizar bien pocas muestras que tratar de analizar muchas y tener que repetir casi todas Asegurarse de que todas las cosas (reactivos, equipamiento, etc.)para el mtodo estn disponibles antes de comenzar el trabajo Cuando se adapta o cambia un mtodo validado por otro, se necesita revalidar ese mtodo
Aseguramiento de la calidad: se relaciona con todas las medidas que toma un laboratorio para asegurar y controlar su calidad Control de calidad: describe las medidas individuales relacionadas con el monitoreo y control de operaciones analticas particulares
La validacin de un mtodo brinda una idea de las capacidades y limitaciones de la performance de ese mtodo que se pueden experimentar durante el uso rutinario Durante la validacin el mtodo se aplica a muestras de contenido conocido Una vez que el mtodo tiene un uso rutinario, se aplica para muestras de contenido desconocido En la prctica, se recomienda continuar midiendo esas muestras de composicin conocida con cada batch de muestras como parte del proceso de control de la calidad. El control de calidad puede realizarse dentro del laboratorio o de manera externa (interlaboratorios)