BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos electroforéticos
 ELECTROFORESIS

Se basa en la migración diferencial de partículas cargadas sometidas

a un campo eléctrico. Método muy útil en la separación de biomolé-
culas cargadas (aminoácidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos).
Método esencialmente analítico.

Las moléculas migrarán hacia el polo positivo (ánodo) o negativo

(cátodo) dependiendo de su carga eléctrica.

El equipo básico consta de una FUENTE DE PODER y de una

UNIDAD ELECTROFORETICA.

Las unidades electroforéticas pueden ser horizontales o verticales, y

las separaciones pueden hacerse en medios líquidos o sólidos (geles).
Son sistemas
de aplicación
limitada
Los sistemas más usados emplean soportes sólidos y las muestras
son aplicadas como manchas o bandas (de allí el nombre de
"electroforesis en zona“).
TIPOS DE SOPORTE UTILIZADOS EN LA ELECTROFORESIS
EN ZONA

Papel filtro: poco usado hoy; baja resolución

Acetato de celulosa: empleado preferentemente en laboratorios

clínicos para el análisis de proteínas plasmáticas.

Poliacrilamida: muy utilizado en la separación de proteínas y

ácidos nucleicos (p. ej. secuenciación de DNA).

Agarosa: empleado en la separación de ácidos nucleicos.

 (NH4) S2O8

PERSULFATO DE AMONIO
REACCIONES INVOLUCRADAS EN LA SINTESIS DE
POLIACRILAMIDA

- El TEMED cataliza la descomposición del ión persulfato

con la generación de radicales libres:

S2O8-2 + e- → SO42- + SO4-.

- A continuación ocurre la polimerización de la acrilamida.

Si se representa al radical libre como R. y a la acrilamida como
M, el proceso se puede esquematizar:

R. + M → RM. RM. + M → RMM. etc.

Se forman así largas cadenas de poliacrilamida. La introducción

de bisacrilamida le da el carácter de red tridimensional.
acrilamida bis-acrilamida
 ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

Nativa: las proteínas se separan principalmente de acuerdo a su

carga eléctrica. Relativamente poco usada; menos resolutiva.

Desnaturante: se desnaturan las proteínas mediante un detergente

(dodecil sulfato de sodio, SDS) y mercaptoetanol (que rompe los
puentes disulfuro).
El SDS le aporta muchas cargas negativas a la proteína. La separación
es por tamaño ya que todas las moléculas tienen carga negativa e igual
razón masa/carga. Los canalículos del gel permiten el paso más rápido
de las proteínas más pequeñas.
Es un método muy usado por ser económico y muy resolutivo.
Aplicaciones: Análisis de mezclas de proteínas (si se observa una banda
se presume que la proteína está pura).
Determinación del peso molecular de proteínas (subunidad).
Se usan dos tipos de geles: A) gel concentrador; concentra a las proteínas (baja
fricción por la baja concentración de acrilamida).
B) Gel de resolución; la alta concentración de acrilamida permite separar por
tamaño.
 TINCION DE LOS GELES

El más utilizado es el Azul de Coomassie, que al unirse a las proteínas

las tiñe de color azul.

Si la cantidad de proteína en la muestra es muy pequeña (menos de 100

nanogramos por banda) se prefiere utilizar tinción con nitrato de plata.
Ejemplo de electroforesis en gel desnaturante
 116

66,2

45

35

25

18,4

Purificación de la enzima arabinofuranosidasa 2 de Penicillium

purpurogenum
 ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

Como matriz se utiliza agarosa. Al enfriar una solución de agarosa

se forman puentes de H entre los grupos OH de las unidades de
poligalactosa generando un gel rígido con porosidad bastante uniforme.
El tamaño de los poros puede controlarse por el porcentaje de agarosa
utilizada. No se requiere el uso de “geles concentradores” pues los ácidos
nucleicos tienen un coeficiente de fricción muy alto y focalizan
rápidamente.

Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que migrarán al ánodo,
y se separan de acuerdo al tamaño. El uso de estándares de tamaño
conocido (número de pares de bases) permite estimar el tamaño de las
muestras incógnitas. Se utiliza habitualmente bromuro de etidio para
visualizar las bandas, que se reconocen por su fluorescencia en luz
ultravioleta.
SEPARACION DE DNA MEDIANTE GELES DE AGAROSA
 ISOELECTROENFOQUE

Técnica electroforética que separa macromoléculas en base a su

punto isoeléctrico (pI).

En un gel de poliacrilamida se establece un gradiente de pH mediante

el uso de anfolitos (polímeros pequeños (~5 000 Da) conteniendo grupos
ácidos y bases débiles distribuidos al azar). Al aplicar un voltaje, el
flujo de corriente se debe principalmente a los anfolitos, que migran de
acuerdo a su distribución de cargas hasta alcanzar una posición en que
el pH corresponde a su punto isoeléctrico. Los anfolitos actuarán como
amortiguadores locales y establecerán así el gradiente de pH. Al introducir
proteínas al sistema, ellas migrarán de acuerdo a su carga hasta alcanzar el pH
correspondiente a su pI y allí se detienen y focalizan.

Se usan geles de poliacrilamida de alta porosidad para permitir el

paso libre de las proteínas (evitar su separación por tamaño).
Los anfolitos de pI más alto se desplazan más hacia el cátodo

pH más alto pH más bajo

Cátodo ánodo
 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Combina dos técnicas:

Primera dimensión, isoelectroenfoque; separación por punto
isoeléctrico.
Segunda dimensión, electroforesis desnaturante; separa por
tamaño.

Muy utilizado en proteómica (separación analítica de las

proteínas de una célula o tejido). Hasta 5000 proteínas se han separado
por esta técnica. Util en la comparación de tejidos sanos y enfermos,
células normales y cancerosas, etc.
Electroforesis bidimensional de sobrenadantes
de cultivo de Penicillium purpurogenum

Coseta Xilano acetilado

4-------------pH----------------7 4------------pH--------------7

Tinción con SYPRO Ruby

 ELECTROFORESIS CAPILAR

Electroforesis en microescala. Utiliza microlitros de reactivos y

nanolitros de muestras, con sensibilidad de detección de hasta
femtomoles (10-15 moles).

Se la utiliza en la separación de una gran variedad de sustancias

biológicas.

Para obtener una buena separación se utiliza alto voltaje (10-50 kV)
y capilares de 50 a 100 cm de largo.
El método más usado es el de “solución libre” con detectores UV.
La separación es principalmente por “flujo electroosmótico”.
ánodo cátodo
Los capilares tienen grupos silanol ionizables (pI = 1,5) en contacto con el
amortiguador, los que atraen cargas positivas. Al aplicar un voltaje, estos
cationes migran hacia el cátodo arrastrando agua. A pH neutro o básico
este flujo electroosmótico es más fuerte que la migración electroforética,
por lo que todas las moléculas son arrastradas hacia el cátodo.
APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR
 CAUSAS DEL FLUJO ELECTROOSMOTICO

The cause of electroosmotic flow is an electrical double layer that forms

at the stationary/solution interface. In capillary electrophoresis, the
narrow channels are made up of silica, and silanol groups form the inner
surface of the capillary column. These silanol groups are ionized above
pH3. Thus, the inner surface of the channel is negatively charged. In
solutions containing ions, the cations will migrate to the negatively
charged wall. This forms the electric double layer. When an electrical
potential is applied to the column, with an anode at one end of the
column and a cathode at another, the cations will migrate towards the
cathode. Since these cations are solvated and clustered at the walls of the
channel, they drag the rest of the solution with them, even the anions.
This results in an electroosmotic flow, not to be confused with the
electrophoretic migration.
 Figure 1 illustrates the charged
silanol groups which produce
electroosmotic flow in bare-
fused silica capillaries.

Electroosmotic flow (EOF) is a consequence of the surface charge on the

capillary wall. Bare fused silica capillaries have ionizable silanol groups in
contact with the separation buffer. As the pH of fused silica is about 1.5,
any pH above this will generate measurable EOF. Although EOF may be
desirable for mixed analyte separations, for DNA sequencing it works to
degrade resolution and the reproducibility of migration time. For this reason
it is essential to substantially reduce or eliminate EOF in order to effectively
improve separation performance.