PRCTICA DETERMINACIN DE ETANOL EN BEBIDAS ALCOHLICAS POR CROMATOGRAFA DE GASES (CG)

Introduccin Las bebidas alcohlicas contienen principalmente etanol el cual se produce por fermentacin alcohlica de la materia prima vegetal (fruta, caa de azcar, melaza, sorgo, maz, trigo, cebada, yuca, camote, papa, etc.) con levaduras del gnero Saccharomyces; estas bebidas pueden ser sometidas o no a destilacin. Las bebidas producidas nicamente por fermentacin alcohlica son: los vinos, las cervezas, el sake, la sidra, el tepache, etc., en las que el contenido de alcohol no pasa de 18-20 grados y las producidas por destilacin del producto de fermentacin son: los licores, los aguardientes, el brandy, el ron, el tequila, el vodka, el whisky, etc. El metanol y el acetaldehdo son productos secundarios del proceso de fermentacin y se encuentran presentes en bebidas alcohlicas en pequeas cantidades comparadas con el etanol. Algunas bebidas alcohlicas que existen en el mercado son producidas sin buenas prcticas de control de calidad de las materias primas y del producto terminado. Actualmente se han reportado casos de intoxicacin y muerte causada por el consumo de bebidas contaminadas con metanol. Entre los controles de calidad que se les hacen a las bebidas alcohlicas fermentadas y destiladas son la determinacin de etanol, metanol y acetaldehdo por Cromatografa Gas-Lquido.

Objetivo Analizar el porcentaje de etanol y la presencia de metanol en diferentes bebidas alcohlicas mediante la tcnica de estndar interno por cromatografa de gases (CG).

Instrumentacin. La cromatografa de gases (GC) es una tcnica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. Existen dos tipos de cromatografa de gases:

a) La cromatografa GasSlido (GSC). b) La cromatografa GasLquido (GLC): siendo sta la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte y la retencin de los analitos se produce mediante el proceso de particin.

Los componentes principales de un sistema cromatogrfico de gases son: el inyector, la columna y el detector. Adems se utiliza un gas acarreador, un horno dnde se coloca la columna, las vlvulas correspondientes para controlar el flujo del gas acarreador. En algunos casos es de gran utilidad contar con un sistema de muestreo automtico. La Figura 14.1 muestra un esquema de un cromatgrafo de gases.

Figura 14.1. Esquema general de un cromatgrafo de gases.

a) Inyector:

El objetivo principal de cualquier inyeccin es introducir la muestra en la columna. Las muestras lquidas sern inyectadas con pequeas jeringas de vidrio (volumen 110 L para columnas capilares y 50 L para columnas empacadas). Las muestras gaseosas se pueden inyectar con jeringas de vidrio con volmenes entre 1 y 10 L. Una mejor forma es inyectar muestras gaseosas es con la ayuda de un loop de volumen definido, similar a los que se usan en la cromatografa de lquidos. En todos los casos, la inyeccin tiene que ser reproducible sin perturbacin del estado de equilibrio en la columna, la muestra tiene que ser vaporizada en una pequea zona y debe producir picos estrechos para cada compuesto. Existen cuatro tipos de inyectores: con divisor (split), sin divisor (splitless), megaboro y on-column. Los dos primeros usan un inyector comn llamado split/splitess. Cada tipo de inyector es adecuado para un tipo particular de muestra. Un inyector split/splitess consiste de un tubo de vidrio (liner) el cual crea un ambiente inerte dentro del inyector y donde la muestra se vaporiza. La temperatura del inyector debe ser lo suficientemente alta para asegurar la vaporizacin instantnea sin degradacin de la muestra. Para la mayora de las muestras, son suficientes 200-250 C como temperatura de inyeccin. El vapor de la muestra se mezcla con el gas acarreador y es transportado hacia la columna. b) Columna: La separacin se lleva a cabo en la columna por medio de interaccin fisicoqumica de los componentes de la mezcla con las fases mvil y estacionaria. La separacin depende del tipo de fase estacionaria, del espesor de la pelcula estacionaria y del dimetro interno de la columna (factores que estn interrelacionados), y de la longitud de la columna. La seleccin de la fase estacionaria se basa en el siguiente principio qumico: una columna no polar es mejor para la separacin de analitos no polares, las columnas polares, efectivamente, separan analitos polares. Estn disponibles dos tipos de columnas: las columnas capilares y las columnas empacadas. Ambas poseen un adsorbente, y sus superficies estn cubiertas con una pelcula lquida como fase estacionaria. Las columnas empacadas estn completamente llenas con el adsorbente mientras que las columnas capilares mayormente usadas para anlisis con GC son columnas tubulares abiertas. Estn compuestas de tres partes: un tubo de vidrio o de slica fundida (1) cubierto con la fase estacionaria (2), y la superficie externa que consiste de un recubrimiento de poliamida (3) que protege a la columna contra fracturas. El espesor de la pelcula de la fase estacionaria influye directamente en el carcter de retencin y en la capacidad de una columna. El incremento en el espesor de la columna conlleva un incremento en la retencin del soluto. La capacidad de una

columna est definida como la cantidad mxima de un compuesto, el cual puede ser inyectado en una columna antes que suceda la distorsin del pico. La capacidad est directamente relacionada con el espesor de la pelcula, el dimetro y la polaridad de la fase estacionaria. La capacidad aumentada es resultado del aumento del dimetro y del espesor de la pelcula. Entre ms soluble es un soluto en la fase estacionaria mayor la capacidad para el soluto. Hay dos opciones de espesor de pelcula de la fase estacionaria. Las columnas con pelculas gruesas (espesor 1-5 m) son especialmente adecuadas para analitos con bajos puntos de ebullicin. Las columnas con pelculas delgadas (espesor 0,1-0,25 m) son mejores para analitos con altos puntos de ebullicin, baja volatilidad o muestras simples. Los analitos eluyen a baja temperatura y en mejor tiempo. El dimetro de la columna tiene un impacto directo en la eficiencia, los tiempos de retencin y la capacidad de muestra de la columna. Los dimetros de columna ms pequeos tienen mayor eficiencia que los grandes, los cuales tienen, sin embargo, una mayor capacidad para la muestra. El dimetro interno de las columnas capilares se ubica entre 0.15 mm y 0.53 mm. El tiempo de retencin est directamente influenciado por la longitud de la columna. Columnas largas dan mayores tiempos de retencin. La longitud de la columna capilar se ubica entre 10 y 100 m, las ms usadas son de 25 60 m. La temperatura de la columna tambin influye en la separacin. Una alta temperatura induce una disminucin del coeficiente de distribucin y del tiempo de retencin. Simultneamente, la viscosidad del gas acarreador aumenta, lo cual conlleva un incremento del tiempo muerto y una disminucin del flujo de gas. c) Detector: El detector convierte los analitos en una seal elctrica la cual debera ser lineal dependiendo de la concentracin de los analitos. Todas las mediciones deben realizarse en el intervalo lineal del detector. La cuantificacin de los compuestos puede llevarse a cabo por medio de una calibracin multipuntual. Para todos los detectores, se necesita uno o ms gases como gases reactivos, de combustin, auxiliarles y de enmascaramiento. Por el ejemplo: 1. El Detector de Ionizacin de Flama (FID) seala los compuestos con enlaces C-H. La muestra es quemada en una flama aire/H2 y los iones producidos cambian la conductividad elctrica. La conductividad elctrica de la flama aire/H2 es baja debido a la baja ionizacin. Las molculas orgnicas usualmente se queman con formacin de iones y liberacin de electrones, incrementando de esta forma la conductividad elctrica de la flama. 2. El Detector de Captura de Electrones (ECD) seala los compuestos electronegativos que pueden atrapar electrones (emitidos del 63Ni) y por lo tanto reducir la corriente. El ECD es ms sensible que el FID, as que es usado para muestras con concentraciones bajas de analito.

3. Algunos otros detectores son: Detector de conductividad trmica (TCD), detector de emisin atmica (AED), detector fotomtrico de llama (PFD), Detector de fotoionizacin (PID), detector de masas (MS), etc.

Materiales y Reactivos. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de flama (FID). Jeringa de inyeccin de 10 L para cromatografa de gases. Sistema de Headspace para tratamiento de estndares y muestras. Matraz volumtrico de 100 mL. Vasos de precipitado de 50 mL. Metanol absoluto. Etanol absoluto. Propanol grado CG.

Procedimiento. 1) Establecer las condiciones adecuadas en el equipo para el anlisis de alcoholes. a) Parmetros del equipo GC con Columna capilar polar: Temperatura de horno: 55 C. Temperatura del Inyector: 200 C. Temperatura del detector: 200 C. Gas Acarreador: Nitrgeno 80 psi. Flujo: 20 mL/min. Flama: Hidrgeno (60 psi) Aire (60 psi). Volumen de inyeccin: 1 L. 2) Preparar 5 soluciones estndar en mezcla de metanol y etanol en agua con las siguientes concentraciones 10, 20, 40, 60 y 80 % (v/v) para realizar la curva de calibracin. 3) Tomar 10 mL del estndar mezcla preparado y agregar 1.0 mL del estndar interno de propanol en un vial, tapar el vial y llevar a bao mara a una temperatura entre 70 y 80 C por 5 minutos. 4) Introducir la jeringa y tomar 1 L de la fase gaseosa. 5) Inyectar cada estndar y registre el cromatograma de cada estndar mezcla. 6) Realizar la curva de calibracin con los valores de rea y altura registrada para cada estndar al tiempo de retencin del metanol, etanol y propanol. Graficar la relacin de rea o altura de los picos analito/estndar interno vs concentracin. 7) Inyectar 1 L de la muestra problema determine el rea y altura correspondiente.

8) De la curva de calibracin determinar el porcentaje (%) de metanol y etanol que le corresponde al valor del rea y altura registrada por la muestra problema y en caso de estar presentes en la muestra problema.

Nota. El instructor explicar las partes bsicas y el manejo del equipo cromatogrfico. Adems de los ajustes necesarios de operacin.

Disposicin de reactivos. Coloque los residuos generados en esta prctica en el colector C. Los reactivos y soluciones sobrantes regresarlos al auxiliar de laboratorio.

Reporte 1. 2. 3. 4. Incluir el cromatograma obtenido de los estndares y de la muestra problema. Indicar el tiempo de retencin para cada analito. Realizar la curva de calibracin por rea y altura. Determinar la concentracin en porcentaje de metanol y etanol presente en la muestra problema y su intervalo de confianza, si fue posible realizar al menos 3 rplicas de la muestra. 5. Incluir todos los clculos desarrollados. 6. Reportar la bibliografa consultada.

Cuestionario. 1. Realizar una tabla indicando las caractersticas de los detectores que pueden ser utilizados en CG y sus aplicaciones (incluyendo los ya comentados). 2. Investigar en qu consiste la cromatografa gas-slido 3. Investigar en qu consiste la cromatografa gas-lquido. 4. Investigar en qu consiste el mtodo de estndar interno y usos. 5. En qu se basa el anlisis cualitativo y cuantitativo en cromatografa de gases? 6. Cul es el lmite mximo de metanol permitido por la legislacin oficial mexicana en bebidas alcohlicas?