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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA
METODOS EN BIOTECNOLOGIA

CROMATOGRAFA DE GASES

Biol. Laura Patricia Olgun Prez Biol. Hctor M. Rodrguez Magadn

8 de Junio de 2004

2 CONTENIDO Antecedentes/Historia Mecanismos de la cromatografa Fundamentos tericos Nomenclatura Fase mvil Puerto de inyeccin Horno de la columna Fase estacionaria Soporte Columna cromatogrfica Detectores Mtodos Anlisis cualitativo Mtodos de coincidencia Aplicaciones Comida, saborizantes y fragancias Qumicos y petrleo Ambientales Mdicas y biolgicas Industria Otras aplicaciones Aplicaciones prcticas Cromatografa de gases como mtodo principal Innovaciones Pginas web Bibliografa 1 2 2 5 6 6 7 8 9 10 15 20 20 21 31 31 34 35 35 37 38 38 40 41 45 45

Antecedentes/Historia
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una direccin definida. Los componentes son separados por sus diferentes tazas de migracin (IUPAC). La cromatografa puede ser clasificada por su utilidad y en base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos. De acuerdo a su utilidad la cromatografa se clasifica en: analtica, utilizada para determinar los qumicos presentes en una mezcla y en que concentracin; y preparativa, utilizada para purificar grandes cantidades de qumicos. La primera tcnica cromatogrfica fue ideada por el botnico ruso Mikhail Tswett en 1906, quien utiliz almina para separar los pigmentos coloreados de las hojas de las plantas. Tswett en su experimento original, meti dentro de un tubo de vidrio un fino polvo (sacarosa) para producir una columna de una altura deseada. Posteriormente, extrajo los pigmentos de hojas y los coloc en un solvente (ter de petrleo) y agreg un poco de la solucin dentro de la columna. Cuando toda la solucin haba pasado a travs de la columna se form una estrecha zona inicial bajo la capa inicial del adsorbente. Despus agreg ms solvente y aplic presin en la parte de arriba de la columna. Mientras el solvente iba pasando a travs de la columna, los pigmentos se iban separando individualmente (Fig. 1). La clave del xito de la columna de Tswett, fue la aplicacin de la mezcla dentro de la columna en una zona inicial estrecha y la posterior aplicacin del solvente fresco.

Fig. 1. Columna cromatogrfica de Tsweet3. Y = amarillo, G = verde

2 En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el anlisis de polienos. Los primeros en utilizar un gas como fase mvil fueron A. T. James y A. J. Martin en 1952, para separar cidos grasos cortos. Posteriormente Dabrio, en 1971, la utiliz para separar metilaminas, aminas alifticas y homlogos de piridina.

Mecanismos de la cromatografa
El movimiento de las substancias durante la cromatografa es el resultado de dos fuerzas oponibles, la fuerza de manejo de la fase mvil y la fuerza resistente o accin de retardo del sorbente. La fuerza de manejo mueve las substancias del origen de la columna en direccin del flujo de la fase mvil. La accin de retardo impide el movimiento de las substancias arrastrndolas del flujo y adhirindolas al adsorbente. Las molculas se encuentran alternando entre estar pegadas al adsorbente o despegadas en el flujo, esto da como consecuencia que pese a que el flujo es constante, solo una fraccin de las molculas se estn moviendo. Las substancias que se mueven ms lentamente es porque estn siendo unidas ms fuertemente a la fase estacionaria, mientras que aquellas que se mueven ms rpidamente es por que son menos solubles o de poca afinidad. La habilidad de tener una migracin diferencial entre los componentes de la mezcla es el resultado de la selectividad del sistema cromatogrfico. El flujo de la fase mvil no es selectivo en el sentido de que no afecta el movimiento de los solutos. Como parte del sistema cromatogrfico, sin embargo, la fase mvil debe ser un poco selectiva para ayudar a la absorcin de los solutos con la fase estacionaria. La fase estacionaria tambin juega un papel importante dentro del cromatograma debido a su accin resistiva como una fuerza selectiva de la velocidad de flujo de los solutos.

Fundamentos tericos
Se han propuesto muchas teoras con complejos modelos matemticos para explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas. Las ms estudiadas son: Teora de las placas tericas (Martin y Synge) Teora cintica (Van Deenter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer) Teora desarrollada para columnas capilares (Golay)

La principal es la teora de las placas tericas (theoretical plates theory), la cual plantea que una columna cromatogrfica est constituda por una serie de placas contenidas en la fase estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa; que el volumen de fase mvil entre placas es constante; que las dos fases estn en equilibrio en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribucin es constante e independiente de la concentracin del soluto. Desventaja: adems de que se basa en muchas suposiciones, la principal desventaja es la falta de conexin entre la eficiencia de la columna y las propiedades fisicoqumicas de la partcula.

La ecuacin de esta teora1: N=16(tr/w)2

N= nmero de placas tericas, adimensional tr= tiempo de retencin de un compuesto, minutos w= ancho del pico a media altura, minutos

La teora cintica considera el comportamiento en un proceso cromatogrfico en funcin de los factores cinticos que intervienen: Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las diferentes rutas que puede tomar el analito durante su migracin a travs del empaque. Difusin axial o longitudinal del soluto en la fase mvil. Resistencia a la transferencia de masas entre la fase mvil y la fase estacionaria. La ecuacin de Van Deemter1: HETP o H=A+B/u+Cu
HETP o h= altura equivalente a una placa terica, milmetros. u= L/ tr aire promedio de la velocidad lineal, cm/seg A= 2dp difusin aparente B= 2Dm coeficiente del trmino debido a la difusin molecular C= (8/)(k/[1+ k]2)(df/Ds) coeficiente del trmino debido a la resistencia a la transferencia de masas

En la teora para las columnas capilares se considera que la difusin aparente no contribuye de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El coeficiente relacionado con la difusin molecular tiene un valor de uno debido a que la distancia que recorre la partcula es igual a la longitud de la columna. El trmino relacionado con la transferencia de masas viene dado en funcin del dimetro de la columna, pues en este tipo de columna es ms importante que el tamao de partcula de relleno. La ecuacin de esta teora es un caso particular de la ecuacin de la teora cintica, en este caso se omite el trmino A pues su valor es despreciable; se relacionan las magnitudes que caracterizan la geometra del soporte y el trmino C se presenta de manera distinta pues en este tipo de columna es ms importante la fase mvil que el tamao de partcula.

Circulacin del gas portador La ley de Darcy1 correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por una columna con el gradiente de presin. u= - (k/) (dP/ dz)
u= velocidad lineal en un punto de la columna z=distancia a la entrada de la columna = viscosidad del gas dP= gradiente de presin de un elemento dz= longitud de columna k=constante de permeabilidad.

Las respectivas integraciones de la ecuacin permiten obtener una que relaciona el valor de la presin con la posicin de la columna, otra que indica la velocidad media, la compresibilidad o factor de obstruccin Coeficiente de reparto (K) Propiedad termodinmica del sistema soluto-fase estacionaria-fase mvil independiente del proceso cromatogrfico. Concentracin de soluto en la fase estacionaria frente a concentracin de soluto en fase mvil a temperatura constante. Factor de capacidad (k) Depende de las propiedades termodinmicas del sistema (K) y adems es funcin de las caractersticas de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una molcula determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase mvil Relacin frontal (Rf) La relacin frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo fenmeno. Representa la relacin entre las velocidades medias del soluto y la fase mvil en su recorrido por la columna. Tiempo muerto ( tm) Es el tiempo de retencin de una sustancia insoluble en la fase estacionaria (K=0).

5 Volumen de retencin (VR) Es el volumen de fase mvil necesario para transportar el soluto de un extremo a otro de la columna. Se denomina volumen de retencin neto al volumen verdadero y corregido, el cual se obtiene a partir de la ecuacin que involucra adems la compresibilidad del gas portador. El volumen de retencin especfico est delimitado por la temperatura. Retencin relativa (rx:p) Conservan las propiedades del coeficiente de reparto y son fciles de calcular, su manejo se dificulta al momento de elegir un patrn adecuado. Se utiliza para disminuir el efecto de errores, sobre todo, en el conocimiento del peso de la fase estacionaria en la columna. Resolucin Cada sustancia se desplaza a una velocidad caracterstica dada por el valor de su relacin frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa terica. Por tratarse de un mtodo donde se separa por elucin es mejor referirse a tiempo de elucin ms que a distancias recorridas. Eficacia Una columna ser ms eficaz mientras mayor sea el nmero de placas tericas que tenga. Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer condiciones similares de trabajo.

Nomenclatura
Desde el primer cromatgrafo de Tswett hasta los cromatgrafos de ahora siguen utilizando la misma nomenclatura para sus componentes: Un tubo de metal o vidrio se llena con un slido activo (adsorbente) para formar una columna cromatogrfica. La mezcla a separar es aplicada en una zona inicial y es lavada con un solvente, lquido de lavado o revelador. La serie de resultados se denomina cromatograma, y el lavado de la zona inicial para formar el cromatograma es la formacin o desarrollo del mismo. Cuando el agente a detectar se trata con un agente qumico para formar un color, se dice que la cromatografa est siendo revelada. La combinacin del solvente, la mezcla y el adsorbente son llamados sistema cromatogrfico. Cada sistema cromatogrfico est compuesto por una fase mvil (solvente) y una fase estacionaria (la columna).

6 Si los componentes de la mezcla son analizados cuantitativamente, recibe el nombre de evaluacin o cuantificacin. Si el soluto es separado del adsorbente por lavado antes del anlisis, entonces se le llama elucin y al agente a ser analizado se le llama eluyente, al lquido que sale de la columna se le nombra efluente. Cuando la fase mvil es lquida, la tcnica suele recibir un nombre relacionado con la forma en que se dispone la fase estacionaria (columna, capa fina, papel, etc.). Existen tres formas de desarrollar este proceso: elucin, anlisis frontal y desplazamiento. Cuando la fase mvil es un gas, solamente se utilizan columnas y el proceso siempre se realiza por elucin. La forma ms usual de hacer cromatografa de gases es utilizando un lquido como fase estacionaria; recibe entonces el nombre de cromatografa gas-lquido (CGL). Tambin se utilizan absorbentes, dando lugar a la cromatografa gas-slido (CGS), pero en mucho menor proporcin. La cromatografa de gases es una tcnica analtica que puede ser utilizada para separar compuestos orgnicos basada en sus volatilidades. Tambin provee informacin cualitativa y cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son separados por sus diferencias de particin entre la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio. Un cromatgrafo de gases consiste de: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Fase mvil. Puerto de inyeccin. Horno de la columna. Columnas Fase estacionaria. Detector. Sistema de registro de datos.

Fase mvil (mobile phases) Gaseosa, lquida o fluido supercrtico (potencia disolvente de los fluidos a temperaturas y presiones superiores al punto crtico). Estas fases son generalmente gases inertes como Helio, Argn o Nitrgeno. El gas portador lleva las molculas del analito a travs de la columna, este movimiento es inhibido por la adsorcin que presenta el analito tanto en las paredes de la columna cuanto en los materiales empaquetados en la misma. Puerto de inyeccin (inyection port) Es un dispositivo que permite la introduccin de la muestra en la corriente del gas portador. Existe cierta variedad de diseos segn el tipo de muestra que se trata de analizar. El ms comn es el inyector de lquidos, que puede utilizarse para slidos (en disolucin) y gases

7 (mediante jeringas especiales). El inyector se trata de una cmara situada a la entrada de la columna y calentada independientemente de sta (a temperatura superior del punto de ebullicin del componente ms voltil de la muestra, generalmente), que suele tener una membrana de caucho a travs de la cual se introduce la muestra con la ayuda de una microjeringa hipodrmica. Inyeccin de la muestra evaporada e introducirla a la columna a travs de un septo de plstico (estable a la temperatura de inyeccin, debe ser reemplazado peridicamente). Temperatura de inyeccin debe ser de 10 a 50 mayor a la temperatura de la columna. Jeringas: varios estilos disponibles. Aguja fija, removible. Varios tamaos y ngulos. Volmenes de la muestra desde 1 l, lquidos de 0.1-10 l y gases 0.5-5 ml. Inyeccin rpida para introducirla en una sola descarga y no debe haber aire al momento del llenado. Precisin de la inyeccin +/-1%. Incremento de la precisin al utilizar circuitos (gas sampling loops) y vlvulas para introducir cantidades constantes. Equipo no caro y requiere temperatura constante. La tcnica de inyeccin de muestra recomendada para lquidos en cromatografa de gases es el mtodo de flujo del solvente. El solvente puro es introducido a la jeringa seguido de una bolsa de aire, despus se coloca la solucin muestra, y finalmente otra bolsa de aire. Se lee el volumen de la muestra y posteriormente se inyecta al cromatgrafo. Horno de la columna En el interior se sita la columna, donde se debe tener una buena regulacin de la temperatura. Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto de inyeccin, y en el otro al detector. La columna debe estar en el centro del horno sin tener contacto con las paredes (Fig. 2).

Percha de la columna Columna de capilaridad

Fig. 2. Horno con columna capilar.

Fase estacionaria (stacionary phase) La fase estacionaria es la encargada de separar los componentes de la muestra. Esta puede ser un slido o un lquido, dispuestos sobre un slido que acta como soporte (columna). El slido de la fase estacionaria puede ser de aluminio, slica gel, carbn o tierra de diatomeas; y el lquido de la fase estacionaria debe tener una baja viscosidad y una alta y diferencial solubilidad. Cuando la fase estacionaria es un slido, la interaccin que puede tener con la fase mvil se puede clasificar en: Adsorcin, intercambio inico y de filtracin sobre geles porosos. Cuando es un lquido, la interaccin con la fase mvil recibe el nombre de reparto, esta ltima es la forma ms usual de hacer cromatografa de gases. Para obtener la mejor resolucin de dos substancias dentro de la columna, se requiere tener una fase estacionaria donde su retencin relativa sea mayor a la unidad. Esto depende del punto de ebullicin y el coeficiente de actividad de los solutos en dicha fase. De aqu que en series homlogas el orden de elucin sea el de los puntos de ebullicin crecientes, independientemente de la fase empleada, salvo en casos especiales. Por otra parte, dos sustancias de punto de ebullicin idntico, pero de estructura qumica diferente, podrn separarse fcilmente con base en su distinta solubilidad. Para la eleccin de la fase estacionaria se deben de tener en cuenta las siguientes consideraciones: Los lmites de temperatura del lquido elegido, considerando su viscosidad y volatilidad. Un descenso en la temperatura de la columna aumenta el tiempo de retencin de los solutos y en ocasiones puede mejorar las separaciones. Pero cuando la viscosidad de la fase estacionaria se hace demasiado alta, o se alcanza el punto de fusin, generalmente la eficacia de la columna baja enormemente. La posibilidad de reacciones irreversibles con la columna. Este fenmeno podra impedir el uso de una fase que para diferentes solutos resultara excelente. Por ejemplo, los cidos no pueden analizarse en fases de carcter bsico, ni los aldehdos en THEED (tetrahidroxietiletilendiamina), pues reaccionan para formar acetales, que se quedan en la columna. Con frecuencia la reaccin no ocurre con la fase misma, sino con impurezas en ella. La fuerza de interaccin soluto-solvente que han de influir en los coeficientes de actividad de los componentes de la mezcla. La eleccin de la fase se hace teniendo en cuenta la polaridad de los solutos a separar y de su tiempo de retencin en la fase a medida que su polaridad aumenta. La eleccin de la fase estacionaria depender no solo de la presencia de polaridad dentro de los solutos, sino ms bien de una visin de conjunto de la mezcla compleja que se desee separar. Puesto que el grado de separacin de dos sustancias depende de sus respectivos coeficientes de reparto en la fase estacionaria, cada mezcla particular debe tener, al menos tericamente, una fase que efecte la separacin mejor que las dems. Dependiendo del

9 tipo de material es la temperatura mxima a la que se puede trabajar. Las fases se pueden clasificar en: No polares: para separar sustancias poco o nada polares. El ms utilizado son las gomas de silicona OV-1, OV-101 o SE-30, para trabajar hasta ms de 300C donde se consiguen eficacias de columna extraordinarias. Con carcter ligeramente polar: utilizacin general, buena selectividad para mezclas mixtas. Sebacato de dietil (2 etil hexilo), aceite de silicona, gomas de silicona. De polaridad media o alta: no aptos para hidrocarburos no aromticos. Aceite de Ucon LB-550X, polifenil ter, Carbowax 1 540, succinato de butanodiol.

Columnas con fase mixta: para resolucin de separaciones parciales con dos o ms lquidos. Posibilidad de separar hasta 50 sustancias mezclando dos, tres y cuatro lquidos para formar la columna final. Aunque es ms laboriosa y poco prctica la representacin grfica esto ha sido simplificado al utilizar programas computacionales. Soporte (Support) La funcin bsica del soporte slido es sostener la fase estacionaria. El soporte debe de tener elevada superficie por unidad de volumen, estabilidad trmica, dureza mecnica, inactividad qumica y baja resistencia al paso de un gas. La mayora est hecho de tierra de diatomeas (diatomita o Kieselguhr), principalmente se trata de slice hidratada microamorfa, la calcinacin de esta tierra dar lugar a diversos productos segn la forma y temperatura de tratamiento. Fundente carbonato sdico, productos blancos utilizados para filtracin. Celita, Celatom. Tiene menor actividad superficial residual. El cromosorbo G es utilizado en columnas con poca fase estacionaria y se obtienen mejores eficacias. El cromosorbo A es utilizado en escala preparativa. Sin fundente y a mayor temperatura, productos rosados utilizado para ladrillos refractarios. Sil-O-Cel, Sterchamol, C-22. Son de mayor superficie y mejor resistencia mecnica, pero son los que presentan mayor actividad superficial residual. Todos los soportes porosos tiene cierta actividad residual debida a la presencia de iones metlicos o defectos de superficie, y a los grupos OH de las molculas. Esta actividad modifica el desarrollo normal del cromatograma, por lo tanto este efecto debe ser disminiudo desactivando el soporte. Una manera es cubrirlos con la misma fase estacionaria, la cua se adsorbe fuertemente en estos puntos y el efecto sobre el soluto es menor. Tambin se puede hacer por lavado cido

10 o bsico, aunque el sistema ms utilizado es hacer reaccionar los grupos hidroxilo de la superficie del soporte con reactivos adecuados. El ms comn es la silanizacin, en el que se hace reaccionar con dimetil diclorosilano, y pueden encontrarse comercialmente con el mismo nombre que el material original (Cromosorbo) o nombres especializados. Aunque para casos extremos pueden presentarse an fenmenos de adsorcin que se eliminan aadiendo una pequea cantidad de fase estacionaria muy polar (Carbowax). Columna cromatogrfica Las columnas estn hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o enrrolladas. Excepto para las de vidrio, las columnas son empacadas mientras se estn doblando. Las columnas analticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm. de dimetro. Segn se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que alcance la relacin de fases se originan los diferentes tipos de columnas. La separacin de la mezcla se realiza dentro de la columna, por lo tanto, es la parte ms importante del cromatgrafo. La primera columna utilizada fue una de relleno (James & Martin, 1952), posteriormente fue introducida la columna capilar, siendo as los dos extremos en la gama de columnas utilizadas en la cromatografa de gases. El criterio para la diferenciacin de columnas es con base en dos propiedades de stas: Relacin de fases: volumen de fase mvil/volumen de fase estacionaria; Vm/Vs Permeabilidad: representada por una constante dependiente de las caractersticas geomtricas de la columna; k

Con base en estas dos caractersticas se encuentran los siguientes tipos de columnas, en las que Vm/Vs y k aumetan en orden progresivo1: 1. 2. 3. 4. Clsicas de relleno Capilares rellenas Capilares de capa porosa Capilares abiertas

La eleccin de las columnas es lo ms crtico, existen dos diferencias fundamentales que deben ser cosideradas para la eleccin de la columna: la cantidad de muestra que admiten (capacidad de carga) y los valores de los flujos del gas portador. La capacidad de carga se define como la cantidad de muestra que se puede inyectar sin prdida apreciable de eficacia y est relacionado con la cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la columna.

11 Las columnas empaquetadas contienen un soporte slido inerte con una cubierta delgada de la fase lquida. El soporte slido es frecuentemente tierra de diatomeas. La fase lquida puede tener una viscosidad baja y una alta solubilidad para la mezcla de componentes. Las columnas de capilaridad originalmente contenan una pelcula del lquido cubriendo la pared interna de la columna de vidrio o metal. Las columnas de capilaridad ahora contienen una capa de revestimiento slido dentro de ella con poro en el centro. Estas columnas son mejores porque se les puede aplicar una velocidad ptima de flujo ms rpida (aprox. de 25 ml por min en lugar de 1 ml por min). Debido a este tipo de columnas, los anlisis han podido ser ms sensibles. La cantidad de muestra que admite una columna capilar sin que sufra sobrecarga es mucho menor que en una columna clsica. La sobrecarga se alcanza cuando la concentracin de soluto en la fase estacionaria es tan grande que la isoterma de distribucin deja de ser lineal. 1.- Columnas clsicas de relleno Constitudas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con la superficie recubierta por una pelcula de la fase estacionaria. Longitud 1-10 m Dimetro interno 2-4 mm hasta 5 cm en escala preparativa Tamao de la partcula de relleno diez veces menor que el dimetro del tubo Capacidad de carga grande Relacin de fases pequea Permeablilidad baja A mayor tamao de partcula del relleno mayor ser su permeabilidad, cuanto ms rugosa sea su superficie mayor capacidad de carga se obtendr. Por esta razn es el nico tipo de columna que se usa a escala preparativa. La suspensin del soporte en la disolucin de la fase estacionaria debe agitarse mecnicamente y, si es necesario, calentar ligeramente para evaporar la mayor parte del solvente. El tubo de la columna debe estar perfectamente limpio, para rellenarlo se debe introducir un extremo de sta en el relleno preparado con la ayuda de un embudo, mientras que por el otro extremo se hace vaco con una bomba. Como tapones es conveniente utilizar lana de vidrio o cuarzo y una malla metlica fina (Fig. 3). 2.- Columnas capilares rellenas Se distinguen de las columnas clsicas de relleno por le dimetro interno del tubo, no excede un milmetro. Adems, la relacin entre los dimetros del tubo y de la partcula de

12 relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea un relleno ms irregular y una permeabilidad del orden de diez veces superior. Longitud de 10-50 m. Dimetro interno de 1 mm. Tamao de la partcula de relleno de 3 a 5 veces Capacidad de carga pequea Relacin de fases grande Permeablilidad mayor que las clsicas Al ser mayor la permeabilidad pueden construirse columnas ms largas (10-50 m). Guichon (1966) y Halasz (1967) han hecho estudios muy detallados de este tipo de columna. Este tipo de columnas no est comercializado, debido a lo difcil de introducir un soporte en un tubo capilar metlico de esa longitud. Por el contrario, es ms sencillo cuando se trata de tubos de vidrio. Se rellena un tubo Pyrex con el soporte elegido antes de estirarlo, entonces al capilar resultante contiene ya el soporte en su interior. La fase estacionaria se introduce de manera similar a las columnas capilares abiertas (Fig. 3). 3.- Columnas capilares de capa porosa En este caso el soporte es depositado en la pared interior del tubo, despus es recubierto por la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vaca. Longitud de 25-200 m Dimetro interno de 0.1-0.5 mm Tamao de la partcula de relleno vara entre el de un soporte clsico y las partculas de carbono producidas por la pirlisis de una sustancia orgnica. Permeablilidad valores mximos (al igual que las capilares abiertas) El procedimiento depender de la naturaleza de la columna y del soporte. Columna metlica: se prepara una suspensin del soporte, se llena la columna con la suspensin, se cierra un extremo y se evapora el agente dispersante quedando as adheridos a la pared del capilar. Columna de vidrio: similar al de columnas capilares rellenas. La diferencia consiste en introducir una varilla de acero inoxidable un el tubo de vidrio y situar el soporte entre ambos. Despus se procede al estirado manteniendo fija la varilla (Fig. 3). 4.- Columnas capilares abiertas Tambin conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla (Golay, 1958). La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que acta como soporte.

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Longitud hasta 200 m, los ms utilizados varan entre 50-100 m Dimetro interno 0.1-0.5 mm Capacidad de carga muy pequea Relacin de fases es la ms alta Debido a la pequea cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la columna tiene una capacidad de carga muy pequea. Necesita detrectores ms sensibles. La naturaleza del tubo y el procedimiento seguido para su limpieza son de gran importancia en este tipo de columnas, ya que la pared del mismo sirve como soporte y su capacidad de retencin del solvente influir notablemente en la uniformidad de la pelcula formada. Uno de los mtodos consiste en llenar el tubo con una disolucin diluida de la fase estacionaria en un disolvente voltil, cerrar un extremo e introducirla en una estufa con una temperatura superior al punto de ebullicin del solvente, la fase quedar depositada sobre la pared del capilar. Temperatura programada. Entre homlogos el tiempo de retencin aumenta exponencialmente con el nmero de carbonos. Conforme aumenta el tiempo de retencin, el ancho aumenta y la altura disminuye haciendo imposible la deteccin despus de que algunos picos han eludo. Como la solubilidad de un gas en un lquido disminuye conforme la temperatura se eleva, se puede reducir la retencin de un material aumentando la temperatura de la columna. Se debe considerar la solubilidad, cambios en la volatilidad y estabilidad de los solutos, cambios en el flujo y estabilidad de la fase estacionaria. La temperatura debe de estar dentro de Tmin/Tmax de la columna. Algunos GC permiten programacin ms compleja que el simple incremento gradual de la temperatura. Determinar la temperatura inicial y el tiempo basado en la mejor separacin posible de los primeros picos. Repetir uno para los ltimos picos para encontrar la mejor temperatura y tiempo. Experimentar con varias rampas para el resto de los componentes. Los flujos del gas portador que se utilizan en columnas capilares suelen ser del orden de 0.5-3 ml/min, mientras que en una columna clsica ascienden a un orden de 30-100 ml/min. Para poder utilizar la columna capilar con xito ser necesario intoducir entre el inyector y la columna un dispositivo denominado divisor de flujo, cuya finalidad es permitir la entrada en la columna de una pequea fraccin solamente del flujo que pasa por el sistema de inyeccin. La relacin de divisin (flujo al exterior/flujo que pasa por la columna) suele oscilar entre 50 y 120. Esto permite disminuir la cantidad de muestra que pasa por la columna (que queda reducida a la fraccin que indica la relacin de divisin) y aumentar la velocidad lineal del gas portador en el sistema de inyeccin en la cantidad indicada por la relacin de la divisin (la difusin molecular en esta parte del instrumento se hace muy pequea).

14 Entre los factores que disminuyen la eficacia de una columna se encuentran: Longitud de la columna. Limita en cuanto a las velocidades lineales del gas portador, originando tiempos de anlisis muy largos y sin mejorar la resolucin. Dimetro de la columna. Ms importante en columnas capilares abiertas, por la resistencia que opone la fase mvil a la transferencia de masas. Tamao de la partcula de relleno. Naturaleza de las fases. Fase estacionaria: no afecta. Gas portador: viscosidad y valores del coeficiente de difusin en la fase mvil. Cantidad de fase estacionaria. A menor cantidad mayor eficacia. Temperatura de la columna. Al aumentar esta disminuye la eficacia al afectar directamente en el coeficiente de reparto. Velocidad del gas portador. Una velocidad elevada es la ptima. Cantidad de muestra inyectada.

Clsica de relleno

Capilar de capa porosa

Capilar abierta

Tubo o Fase estacionaria Grano de soporte Fig. 3. Tipos de columnas cromatogrficas.

15 Detectores Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas acarreador, convirtiendo una seal no medible directamente en una seal elaborable de una propiedad fsica. Esta seal es elaborada por una comparacin entre el gas acarreador puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente separados en la columna, esto es traducido en una seal elctrica que es amplificada y registrada al momento de salir de la columna. Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad), tiene una respuesta lineal (linearidad) sobre un amplio rango de concentracin y es relativamente insensible a variaciones de flujo y temperatura (rango dinmico lineal). Pueden ser clasificados por: Grado de selectividad: universales que responden a la mayora de los solutos; especficos-selectivos con respuesta a un grupo particular de sustancias. Recuperacin de la muestra: en referencia a si la muestra es destruda o no. Modo de respuesta: dependientes de flujo de masa (cantidad de soluto independientemente de la cantidad de gas portador); dependientes de concentracin (cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador). Proceso de deteccin: ionizacin; ptico-espectroscpico; electroqumico.

Los detectores ms ampliamente utilizados son el detector de conductividad trmica (TCD) y el detector de ionizacin de flama (FID). Detector de conductividad trmica (TCD thermal conductivity detector) Consiste de dos celdas metlicas idnticas, cada una conteniendo un filamento de alambre de tungsteno o de tungsteno con lmina de oro. El efluente fluye a travs de una celda y el gas portador (He o H2) fluye a travs de la otra. En un lado de la muestra el gas fluye por el filamento mientras que en el lado de referencia el gas puede pasar sobre el alambre del filamento y difundir a travs de l. Los filamentos son calentados por una corriente elctrica. La temperatura del elemento censor depende de la conductividad trmica del gas que fluye alrededor. Cambios en conductividad trmica, como cuando las molculas orgnicas desplazan un poco al gas portador, provocan un incremento en la temperatura del elemento el cual est siendo monitoreado como un cambio en la resistencia. Dos pares del TCD son utilizados en cromatgrafos de gases, un par localizado en la salida de la columna para detectar los componentes separados mientras van saliendo, el otro par localizados antes del inyector o en una columna de referencia separando las resistencias de los dos pares y estn acomodados en un circuito de puente. Para un mximo de sensibilidad, la temperatura del filamento es incrementada, la temperatura y la velocidad del flujo son disminuidas y se escoge un gas con mayor

16 conductividad trmica (la mayora de los gases orgnicos tienen calores de conductividad bajos). Este es un mtodo no destructivo dependiente de concentracin, con selectividad universal, con un lmite de deteccin de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de deteccin es debido al cambio de resistencia del cable basado en la termoconductividad del gas cuando fluye a travs de la columna (Fig. 4).

Fig. 4. Detector de conductividad trmica6

Detector de ionizacin de flama (FID flame ionization detector) El FID consiste de una flama hidrgeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen de la columna pasan a travs de la flama, la cual rompe las molculas orgnicas y produce iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una seal elctrica. Es extremadamente sensible en un amplio rango dinmico. La nica desventaja es que destruye la muestra. La muestra debe ser un combustible, esta entra en la base del detector, se mezcla con el hidrgeno y entra a la flama. Hay compuestos con poca o sin respuesta al FID, compuesto como el NH3, CS2, Nox, CO, CO2, O2, H2O, N2, compuestos perhalogenados, etc. La respuesta est basada en el nmero de carbonos y otros elementos tales como halgenos y el oxgeno presentes que reducen la combustin.

17 Este es un mtodo destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para compuestos orgnicos, con un lmite de deteccin de ~ 100pg/seg. Su modo de deteccin es debido a la produccin de iones en una flama resultando en una corriente que puede ser medida (Fig. 5).

Fig. 5. Detector de ionizacin de flama6

Detector fotomtrico de flama (FPD flame photometric detector) Es uno de los ms usados en los mtodos selectivos de cromatografa de gases. El FPD consiste de una flama reductora que produce especies quimioluminiscentes. Estas especies emiten una luz caracterstica que es ptimamente filtrada por la longitud de onda deseada, la cual determina que componentes son los detectados. La luz filtrada es medida por un fotomultiplicador (PMT) y transducida a una seal. Se puede agregar un segundo fotomultiplicador, el cual permite una deteccin simultnea de una segunda seal. Los filtros para FPD pueden ser seleccionados para diferentes componentes, pero los ms comunes son para la deteccin de sulfurados y fosforados en mezclas complejas. La

18 selectividad de FPD clsicos (como una porcin por peso del carbono) es 105 para sulfurados y 106 para fosforados. La cromatografa de gases con FPD puede ser usada para detectar componentes sulfurados en extractos crudos de aceite y en contaminantes de gas natural. Tambin puede ser utilizado para detectar pesticidas y herbicidas organofosforados, as como de componentes sulfurados voltiles en el anlisis de alimentos. Este es un mtodo destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para S, P, Sn, B, As, Ge,Se, Cr; con un lmite de deteccin de ~ 100pg/seg. Su modo de deteccin es debido a la produccin longitudes de onda particulares resultando en una corriente que puede ser medida.

Fig. 6 Detector fotomtrico de flama6

19 Detector de captura de electrones (ECD electron capture detector) Es altamente sensible a compuestos halogenados y por lo tanto muy til en la deteccin de pesticidas. Da un poco de respuesta a hidrocarburos y otros carbonilos conjugados. Para este tipo de cromatografa la muestra debe contener una fase gaseosa electrfora. Este es un sistema donde se detectan partculas por absorcin de especies que contienen halgenos, nitrilos, nitratos, organometales y dobles enlaces conjugados. Las partculas son emitidas por una fuente de 63Ni, los electrforos las absorben reduciendo la corriente, siendo esta la base de la respuesta(Fig. 7).

Fig. 7 Detector de captura de electrones6

Detector de fotoionizacin (PID photoionization GC detector) Este tipo de detector es muy selectivo para los compuestos con hidrocarburos aromticos o con heterotomos, los cuales tienen potenciales de ionizacin. Utiliza luz ultravioleta para ionizar un analito, la longitud de onda oscila entre 106-150 nm. Los iones producidos son colectados por electrodos siendo la corriente generada una medida de la concentracin del analito. Este es un mtodo no destructivo dependiente de concentracin, con selectividad para compuestos alifticos, aromticos, heterocclicos, organosulfurados y algunos organometlicos, cetonas, steres, aldehdos y aminas; con un lmite de deteccin de ~2pg/seg. Su modo de deteccin es debido a los potenciales de ionizacin de los compuestos analizados (Fig. 8).

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Fig. 8 Detector de fotoionizacin6

Mtodos
Anlisis cualitativo La cromatografa de gases es uno de los mtodos fsicos de separacin ms eficaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de informacin: posicin, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posicin, un solo parmetro expresado cuantitativamente expresado como dato de retencin, suministra la informacin cualitativa y los otros proporcionan la informacin cuantitativa. Para simplificar el problema del anlisis cualitativo se supone que el cromatograma se ha registrado en las condiciones ptimas, los picos estn totalmente separados con resolucin superior a la unidad y que cada uno de ellos corresponde a un solo compuesto. En los casos favorables es posible identificar los componentes por la posicin de los picos, pero por lo general la ambigedad es tan grande que el analista ha de completar la informacin con la obtenida por otros mtodos analticos, siendo preferibles las tcnicas multiparamtricas, como la espectrometra de masas o la espectroscopa de infrarrojo.

21 En la siguiente tabla se resumen los procedimientos utilizados para identificar los picos cromatogrficos. No existe un mtodo general aplicable a todos los problemas prcticos, la informacin cromatogrfica cualitativa depende del conocimiento previo de la composicin de las muestras y casi siempre se han de combinar varias de las operaciones incluidas en la tabla para seguir identificaciones fiables. A pesar de los inconvenientes del mtodo, la cromatografa de gases en combinacin con otras tcnicas es el instrumento ms eficaz conocido hasta la fecha para determinar la composicin cualitativa de mezclas complejas de compuestos orgnicos. Tabla. 1 Identificacin cualitativa por cromatografa de gases2.

Solamente se estudia la identificacin por procedimientos cromatogrficos teniendo siempre en cuenta que se ha de completar, excepto en los casos favorables, por anlisis con otros mtodos. Entre los ms eficientes estn el de pasar directamente los efluentes a un espectrmetro de masas, o de infrarrojo, colocados a la salida de la columna y el de condensacin y anlisis por otras tcnicas instrumentales o qumicas.

Mtodos de coincidencia El mtodo ms simple de identificacin cromatogrfica consiste en comparar el volumen de retencin de un compuesto problema con el de un patrn, determinado en las mismas condiciones operativas y en la misma columna. Como estas condiciones son difciles de mantener constantes en cromatogramas registrados sucesivamente y todava ms difciles en das diferentes, es mejor aadir el patrn como un marcador a la muestra problema y comprobar si no coincide con alguno de los picos originales. Si por el contrario, aumenta la

22 altura de alguno de ellos, es una evidencia de la coincidencia de los volmenes de retencin. La respuesta negativa no es ambigua; se puede afirmar que ninguno de los componentes de la muestra es el patrn. Pero en caso contrario la ambigedad es muy grande, sobre todo si se analizan compuestos que no han sido previamente estudiados por cromatografa de gases. Al estudiar la probabilidad de que el pico que coincide con el patrn sea el patrn, la certeza es la identificacin de que un pico depende de sustancias eluidas cerca del mismo con las que puede confundirse. Expresando cuantitativamente esta observacin intuitiva se tiene2: = h/(V1r-V2r)/Vr = nmero total de picos/nmero total de divisiones Si se sabe de antemano que la mezcla solamente contiene carbono e hidrgeno, dato suministrado por el anlisis elemental orgnico, h sera el nmero posible de hidrocarburos eluidos entre los volmenes de retencin V1r y V2r. La menor diferencia de volmenes de retencin detectable, Vr al nivel de confianza de 95 % vale 4Vr (Vr es el error tpico de las medidas duplicadas del volumen de retencin). En otras palabras si en un cromatograma fuera posible incluir todos los eluyentes posibles entre V1r y V2r el nmero de sustancias que dentro del error experimental seran simultneamente eluidas sera , o en densidad de los picos. En la prctica la distribucin de picos sigue la distribucin de Poisson2. pn = e-pn/n! en la que pn es la probabilidad de encontrar n solutos en el intervalo unitario Vr Para reducir las identificaciones errneas a 1 en 1000, solamente sern permisibles 4 eluyentes. Esto significa que en la mayora de los casos prcticos es imposible la identificacin en ste nivel con una sola columna a partir de los datos de retencin. La nica manera de eliminar esta dificultad es reducir , y por tanto, pes. Esto es equivalente a reducir Vr o h. La primera alternativa implica mejorar la precisin de las determinaciones de rutina de las medidas de retencin a un nivel superior al 1%, muy difcil de conseguir en la practica. Por otra parte, es posible reducir fcilmente por medio de otro tipo de informacin, anlisis elemental, tcnicas instrumentales o separacin en otras columnas cromatogrficas. Son evidentes las razones de la separacin en varias columnas, pero una discusin semicuantitativa aclara las limitaciones del tratamiento estadstico.

23 La probabilidad que se eluyan simultneamente picos conteniendo ms de un componente en dos columnas diferentes A y B est dada por2: pesA+B = pesA*pesB como pesB <1 se deduce que pesA+B < pesA; y por ello la separacin en dos columnas ha reducido la probabilidad de identificacin errnea debida a la elucin simultnea. Siguiendo este procedimiento y separando en suficiente nmero de columnas es posible reducir pes a un valor muy pequeo. Sin embargo, para que se cumpla el procedimiento estadstico la distribucin de los eluyentes ha de ser aleatoria, no ser vlido el razonamiento si el volumen de retencin en la columna A est relacionado con el de la columna B. Por lo tanto, el empleo de varias columnas reduce la probabilidad de identificacin errnea, ms marcadamente cuando las columnas tienen comportamiento muy diferente.

Retencin relativa Los volmenes de retencin dependen de un gran nmero de variables operativas, debido a esto es difcil conseguir respuesta idntica an en columnas preparadas en las mismas condiciones; por lo tanto, para identificar sustancias a partir de datos bibliogrficos se han de expresar las retenciones como variables reproducibles por diferentes equipos e investigadores. Se han utilizado dos procedimientos generales: a) Clculo de los volmenes de retencin especficos b) Determinacin de retenciones relativas a patrones Es difcil determinar rutinariamente el volumen de retencin especfico porque se necesita conocer con exactitud el peso de la fase estacionaria de la columna. En la prctica del anlisis cualitativo se emplea corrientemente la retencin relativa. Los componentes y el patrn han de registrarse en el mismo cromatograma. El clculo es muy sencillo, se limita a la realizacin de dos medidas de distancia, una desde el mximo del pico del problema al pico del aire, y otra entre los mximos del patrn y el aire. La retencin relativa de un compuesto es independiente de la longitud de la columna, del flujo del gas portador y de la cantidad de fase estacionaria; dependiendo solamente de la temperatura de separacin y de la naturaleza de la fase estacionaria. Un inconveniente de la identificacin por retenciones relativas es el gran nmero de sustancias empleadas como referencia, que hace difcil determinar la coincidencia de los datos publicados por diferentes autores. Es casi imposible en la prctica fijar un solo patrn

24 de referencia y su seleccin queda a disposicin del especialista, por lo que existe gran nmero de datos de poca aplicacin a problemas particulares.

Optimizacin de flujos en capilaridad split/splitless en cromatografa de gases Por definicin estndar, una cromatografa de gases es optimizada cuando la sensibilidad y resolucin de una mezcla compleja es activado en el menor tiempo posible. Una cromatografa de gases optimizada que est bien calibrada cuando 1) las soluciones estndar de diferentes concentraciones son lineales, 2) los estndares a las mismas concentraciones se reproducen en un periodo de tiempo especfico y 3) bajos niveles de concentracin de picos tempranos y tardos, acompaados con el menor ruido, son indicativos de una cromatografa bien calibrada. Si alguno de los criterios antes mencionados no se completan, todo debe ser repetido. Un sistema optimizado es muy difcil de mantener. Un cambio directo en el flujo, puede modificar completamente la forma de los picos y alterar toda la eficiencia de la columna. Complicaciones mayores se obtienen cuando se utiliza un sistema de dos columnas y una de ellas afecta el funcionamiento de la otra. Desafortunadamente, esto frecuentemente aumenta el tiempo de anlisis. La dificultad con la optimizacin es que esto involucra muchas variables: 1) parmetros fijados como la longitud de la columna, dimetro interno, y capacidad de adhesin de la pelcula; 2) parmetros operacionales como la temperatura de la columna, acarreador y flujo de gas, o los modos de inyeccin. Optimizacin del flujo acarreador para mejorar la resolucin de la columna La resolucin y separacin de los picos son dos de los factores ms importantes para la resolucin de la columna. Resolucin es la capacidad de la columna para separar dos picos adyacentes, dependientes de la selectividad y eficiencia. La eficiencia es la relacin entre la longitud del tiempo que gasta el soluto en salir de la columna y la anchura del pico sobre la elucin. Esto es determinado por el nmero efectivo de placas tericas las cuales son secciones ideales de la columna donde los solutos se equilibran entre la fase estacionaria lquida y la fase gaseosa mvil. Expresado como4: N = 5,54 [(tr-to)/w1/2] 2 Donde tr es el tiempo de retencin del soluto, to es el tiempo de retencin de una sustancia sin retencin o tiempo de volumen muerto, y w1/2 es el ancho del pico del soluto. Un valor alto de N indica una gran capacidad de retencin del soluto de la fase estacionaria y una gran eficiencia de la columna. La presencia de un volumen muerto grande (to) esconde la eficiencia de la columna pero puede ser reducido incrementando la velocidad lineal del flujo del gas acarreador. La asociacin entre la velocidad lineal y eficiencia de

25 columnas de capilaridad puede ser ilustrado ms claramente sustituyendo la altura equivalente a una placa terica (H) por nmero efectivo de placas tericas (N). En este modelo, (N) est relacionado a la longitud de la columna (L) de acuerdo a H (HETP) = L/N. La figura 9 muestra (H) como una funcin de la velocidad promedio (u) donde Hmin y umin estn bajo condiciones de flujo optimizados.

Fig. 9 Punto general de Van Deemter4. Para disminuir la viscosidad e incrementar la eficiencia de la columna, se debe seleccionar una velocidad de flujo lineal. En este valor, el tiempo de corrida es el ms corto con una muy baja prdida de eficiencia. De acuerdo a umin la eficiencia mxima es obtenida pero solo gastando mayor tiempo de corrida. La velocidades bajo umin caen en la parte de la curva donde la eficiencia y el tiempo de corrida son los peores. En general, todos los solutos se optimizan en algunos puntos directamente sobre umin pero molculas grandes se optimizan en velocidades ms bajas que molculas pequeas. El grado en el cual la velocidad lineal puede mejorar el comportamiento de la columna cuando la programacin de la temperatura es especfica al gas acarreador como se muestra en la figura 10. Claramente, el hidrgeno es la mejor eleccin para obtener la separacin ms grande en el periodo de tiempo ms corto debido a su menor viscosidad que otros gases en temperaturas ms altas. El helio, es una eleccin ms prctica porque no se necesitan precauciones de ventilaciones.

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. Fig.10 Efectos de usar diferentes gases acarreadores en el punto Van Deemeter4. Antes de marcar el uso de flujo de acarreadores, se ajusta la fuente del acarreador que es por lo menos 20 psi ms grande que la presin de la cabeza de la columna. Esto es para minimizar la resistencia del flujo de la columna para suplementar lneas y garantizar una velocidad de flujo volumtrico constante entre el inyector, la columna y el detector. Para medir la velocidad lineal, se inyecta una sustancia no retenible a la temperatura donde hay mayor elucin. Si a esto se le optimiza la temperatura, estar arriba del 50 % de la eficiencia que puede ser perdida cuando se hacen rangos de 50 hasta 200 C. La velocidad lineal es calculada usando la siguiente ecuacin y entonces un valor promedio se obtiene de un mnimo de tres mediciones4. Cuando la velocidad lineal se optimiza para el helio ser aproximadamente 21-40 cm/seg y para el hidrgeno de 50-80 cm/seg. U (cm/seg) = longitud de la columna/RT del pico de lo no retenido Es importante considerar el disfraz de la velocidad del flujo de gas cuando se optimiza la velocidad lineal del acarreador, especialmente desde que el disfraz afecta la forma del pico, linearidad y reproducibilidad. Esto podra ser porque la velocidad es optimizada pero no parece ser porque el disfraz del flujo no lo est. Las velocidades de flujo varan de acuerdo al disfraz del gas y el tipo de detector. Por ejemplo, con ECD el detector de gas necesita mantener un equilibrio de concentracin de electrones trmicos y un barrido efectivo de gas acarreador-soluto. La sensibilidad ECD es inversamente proporcional al flujo, aunque un flujo fuerte se requiera para el barrido de

27 sustancias altamente retenidas para producir picos agudos. Para mantener una sensibilidad satisfactoria en las velocidades de flujo en el ECD se utiliza 95 % de argn y 5 % de metano como fuente de gas. La resolucin, la simetra de los picos y la sensibilidad podran ser monitoreadas para confirmar que la cromatografa de gases est calibrada correctamente y la velocidad lineal est optimizada. La cantidad requerida de resolucin y la simetra del pico es especfica al mtodo de anlisis. Normalmente, una buena resolucin se encuentra entre 0.5-1.0 y un rango aceptable PGF est entre 0.8 a 1.2 cuando estn determinados por 1 y 2 (ver abajo). 1) Resolucin= rt2-rt1/ Avg (w2+w1) rt2 rt1 es la diferencia en los tiempos de retencin entre los dos picos, w2 es el ancho del pico 2 y w1 es el ancho del pico 1. 2) PGF = 1.83 * el pico a 1/2 de altura / pico a 1/10 de altura 3) La sensibilidad est relacionada con la altura del pico a la base del mismo. Una porcin de 3:1 indica una sensibilidad adecuada.

Optimizacin de tiempo de purga y velocidad de split Las muestras con splitless son frecuentemente usadas para anlisis de componentes donde una gran cantidad de muestra es inyectada a la columna. Durante el muestreo con splitless, la muestra se inyecta dentro de la columna caliente y forma un vapor que consiste de muestra, solvente y gas. Parte del gas sale por el respirador al pasar en el alineador. El respirador del split se apaga en ste punto y se vuelve a prender despus de 20 a 60 seg. para prevenir que los vapores entren en contacto con la cabeza de la columna y sean retenidos ah. El tiempo de purga, o el tiempo que el respirador del split es abierto despus de la inyeccin, es crtico para la discriminacin y reproducibilidad del cromatograma. El muestreo con splitless puede ser optimizado usando concentracin de muestra / solvente para volver a concentrar la muestra en la columna caliente. Esta tcnica es extremadamente til para adelgazar los picos y eliminar las trazas de solvente y la interferencia de vapor retenido momentneamente en la fase estacionaria. El solvente humedece la fase estacionaria para retener a los solutos, por lo cual, esto permite una rpida elucin de los solutos. Para que ocurra la retencin, la temperatura inicial del horno debe ser 20C abajo del punto de ebullicin del solvente. Sin embargo, con solventes como el cloruro de metileno (punto de ebullicin de 40C), la concentracin del solvente no es prctica porque la temperatura inicial del horno estar a menos de la temperatura del cuarto. En este caso, el analizador debe aceptar los picos que

28 estn entre los solutos que eluyen al principio o tratar varias tcnicas de inyeccin que sean compatibles con el muestreo tipo splitless. Una cabeza del alineador desactivada, sin lana de slica es preferida para una mezcla ligera de la muestra con el solvente. Ocasionalmente, la lana puede ser usada para ayudar a la volatilizacin de los componentes de alto peso molecular. Un alineador de cuello de ganso es una alternativa viable para un alineador delgado, diseado especficamente para mejorar la eficiencia del splitless y disminuir la degradacin de la muestra. Una columna moderadamente polar desactivada, puesta 1 o 2 cm abajo del punto de inyeccin, podra ser utilizada siempre con splitless para minimizar el pegado de los picos y para tener una migracin uniforme del solvente. Para tener un tiempo de purga ptimo, se comienza con un rango de purga de 0.2 a 1.5 min. Si el tiempo es muy corto, menos de 0.1 min. los componentes ms pesados no se volatilizarn lo suficiente o no se creara la concentracin del solvente. Si hay una gran diferencia entre el punto de ebullicin del solvente y el del soluto, el tiempo de purga necesitar estar cercano a 0.2 min. Ajustar el tiempo de purga en incrementos de 0.1 min. hasta alcanzar el mximo de sensibilidad del soluto sin que haya trazas del solvente. El muestreo tipo split es el mtodo ms popular porque inyectar muestras de 0.1 a 2 l no impide que haya una buena altura y sensibilidad en el pico. Si se obtiene la cantidad mxima de eficiencia de la columna, las reas del pico ms pequeas asociadas con el muestreo tipo split reflejan una reduccin en lo ancho lugar de lo alto del pico. Mejorar la simetra del pico permite una mejor reproducibilidad y por lo cual da una mejor cuantificacin del rea de los picos. Otra ventaja del split, es que se pueden usar columnas ms estrechas para tener una mejor resolucin sin tener que volver a muestrear la columna. Quiz el nico inconveniente del split es que la cantidad inyectada a la columna podra no ser representativa si la muestra no es completamente vaporizada. Esto es porque la muestra entra en el alineador con el respirador split abierto y el extracto de la muestra y el acarreador son purgados antes de que entren a la columna. Por esta razn, el mtodo de inyeccin split puede ser monitoreado siempre corriendo soluciones estndares de concentraciones conocidas y analizar su reproducibilidad. La cantidad purgada en el respirador del split est determinado por la velocidad del split4:
Velocidad del split (ml/min)= Promedio del flujo del split+ promedio de flujo de columna/promedio de flujo de columna

Una velocidad de 100:1 indica que el 99 % de la muestra, el solvente y el acarreador se purgaron a travs del respirador del split. Para incrementar el flujo a travs del respirador se disminuye la presin o el flujo del acarreador a travs de la columna. Las diferencias en el peso molecular, concentracin de la muestra, temperatura inicial del programa y volumen de inyeccin afectan el split. Algunas de estas discrepancias pueden ser minimizadas al seleccionar un alineador de inyeccin adecuado. Un alineador inerte, empaquetado ligeramente con lana de slica, es esencial para completar la filtracin de

29 residuos no analizables y garantizar el calentamiento adecuado, mezclado y expansin del vapor. Esto es particularmente importante cuando se inyectan componentes de alto punto de ebullicin. Para mejorar la velocidad del split, colocar la temperatura del horno a la temperatura inicial y ajustar flujo del respirador del split hasta que est en 10 a 15 ml/min. El flujo a travs del respirador de purga pude estar entre 0.5 a 6 ml/min. y el flujo del acarreador en 2 a 5 ml/min. al final del detector. Combinacin de temperatura y programacin de temperatura para completar la optimizacin La adicin de control electrnico de presin a la programacin de la temperatura mejora dramticamente la separacin, reduce el tiempo de corrida y se obtiene una velocidad ptima lineal para el soluto. Esto es porque la presin puede ser regulada precisamente y el flujo programado continuamente durante la columna. El EPC puede ser corrido a presin constante con un solo punto de entrada en toda la columna. Esto es similar a lo que el gauger mecnico hace, excepto que los flujos son ms estacionarios, permitiendo una restauracin ms rpida del equilibrio del flujo despus de un periodo de apagado. El EPC puede ser tambin programado para tener una corrida de flujo constante, donde la presin es ajustada automticamente a los cambios de temperatura para corregir el volumen del gas dentro de la columna dado a que el calor se expande al incrementar la temperatura. En general, el flujo y presin constantes, promueven una elucin ms rpida de componentes de alto peso molecular en temperaturas ms bajas con mejor resolucin. La habilidad para correrlo a temperaturas bajas reduce significantemente la degradacin termal y mejora la longevidad de la columna. Para optimizar el flujo constante, la presin de la cabeza de la columna debe incrementar 3.5 veces a la cantidad original en la columna por cada 200C para compensar un incremento en la viscosidad. Esto garantiza una alta eficiencia y un flujo constante, la cual, bajo presin constante, puede gotear ms del 50 %. Hay varios factores a considerar cuando se programa un EPC, particularmente la longitud de la columna, dimetro interno, velocidad de split y el goteo de la presin desde la cabeza hasta la cola de la columna. El siguiente es un clculo para mejorar el EPC y establecer una presin en la cabeza necesaria para mantener un flujo constante mientras la temperatura se incrementa de T1 a T24: Pi2 = [(T2/T1)1.7(pi2-po2)1+po2]1/2 Donde Pi es la presin gauge inicial + 1 atm y po es la presin de salida a 1 atm.

30 La programacin de la presin envuelve simples y mltiples campos los cuales entran en el panel de control en la misma manera como un programa de temperatura. Los cambios en la presin pueden ocurrir en temperatura y tiempos especficos durante una corrida, permitiendo una mejor optimizacin. Algunos puntos que garantizan una programacin exitosa son: 1. Seleccionar columnas que tengan mayor eficiencia que la requerida para la separacin. 2. La temperatura del horno inicial podra ser lo suficientemente baja como para permitir separar componentes de bajo punto de ebullicin pero ms alta que la temperatura mnima para la fase estacionaria de la columna. 3. Correr mezclas complejas en temperaturas iniciales bajas para dispersar os picos. 4. Siempre introducir un tiempo de sostenido inicial para soluto de rpida elucin. 5. Incrementar las rampas de presin y temperatura para reducir los espacios en blanco entre grupos. Comenzar con rampas de temperatura. Si los ltimos picos de elucin son resueltos pobremente, reducir la temperatura e incrementar la presin. Al incrementar la presin durante la inyeccin, el volumen de expansin de vapor puede ser controlado para prevenir el regreso el cual podra ocurrir si la cantidad inyectada excede la capacidad del buffer en la cabeza del alineador. En el pulso de presin, la cabeza de presin es aumentada un poco despus de la inyeccin, y se programa una inclinacin para el remanente de la corrida. Esto actualmente mejora el muestreo splitless porque expansin de volmenes ms pequeos son producidos dado al menor tiempo gastado en la cabeza. No hay suficiente tiempo para que el vapor se expanda hasta el inicio del alineador y salga por el respirador del purgador. Puesto que el tiempo que la muestra permanece en el alineador es reducido, hay menos contacto con sitios activos de superficies catalticas del alineador. Hay menos adsorcin del alineador y descomposicin de la muestra y por lo tanto la resolucin del pico es mejorada. Ocasionalmente, la delimitacin de los picos puede ocurrir con pulsos de presin, especialmente si usas concentracin de solventes debido a que la velocidad del flujo tiende a interferir con la concentracin de la muestra en la columna. Esto puede ser solucionado variando el tiempo de purga, los pulsos de presin y la temperatura del horno. Cuando se usa EPC con inyeccin tipo split, la velocidad del split puede ser programada para cambiar durante la corrida o entre los mtodos en una secuencia. Tambin, puede ser programado para apagarlo entre corridas para conservar la cantidad de gas acarreador. Si se aplican pulsos de presin a la inyeccin tipo split, incrementa el flujo el cual podra reducir la velocidad de split. Con la programacin de la temperatura y presin se han optimizado y mejorado los procedimientos de corrida. Los programas computarizados como el ezGC &#153 proveen aproximaciones ms cercanas para condiciones ya optimizadas. Esto no remplaza los mtodos ya desarrollados pero puede eliminar los tiempos de corrida sesgados.

31 El software requiere que dos programas extremos sean usados como un rango 1) Una presin o temperatura alta con un rampeo rpido y 2) una presin y temperatura inicial con un rampeo bajo. Los resultados entran al programa, con la longitud de la columna, la presin sobre el dimetro de la columna, la velocidad lineal, de tiempo muerto y otros parmetros. Una serie de algormetros determinan los mejores programas basados en la termodinmica de retencin para ndices y clculos.

Aplicaciones
Un intento para crear una compilacin de aplicaciones deseadas para generar un manual debe ser selectivo, en consecuencia la compilacin casi siempre puede estar incompleta por cromatgrafos individuales debido a la omisin de ejemplos que se consideran crticos para algunos campos especficos. Por otra parte, algunos de los ejemplos incluidos pueden ser criticados porque los eventos de separacin en la cromatografa de gases pueden ser muy rpidos y en muchos casos es posible generar resultados que son superiores a los mostrados en las ilustraciones. Los avances que han permitido mejorar los mtodos incluye a) mejores mtodos de preparacin y almacenamiento de las muestras, b) mejoras en la instrumentacin comercial, incluyendo entradas superiores que llevan a cabo un mejor proceso de inyeccin de la muestra y c) la disponibilidad de mejores columnas desactivadas en un rango ms amplio de dimetros y cubiertas de una gran variedad de fases estacionarias. Las guas de aplicaciones para fases estacionarias en los anlisis de las diferentes reas se muestran en catlogos tales como Supelco, Applied Science, Analabs, etc. Otra forma de clasificar las aplicaciones en la cromatografa de gases es dividir los datos de la literatura en reas de inters, pese a que la sobrelapacin de algunos sea inevitable, una serie de grados de redundancia puede ser evitada por la asignacin de cuatro grandes categoras: a) Comida, sabores y fragancias. Productos naturales y las feromonas, anlisis de pesticidas; separacin de enantimeros. b) Petrleo y qumicos. cidos grasos; combustibles sintticos, carbn y aceites; separacin de enantimeros. c) Ambientales. Contaminantes de agua, aire y tierra; halometanos en el agua hasta las dioxinas en la tierra; anlisis de pesticidas; separacin de enantimeros. d) Mdicas y biolgicas. cidos grasos; niveles de alcohol y drogas en la sangre; anlisis de pesticidas; separacin de enantimeros. Aplicaciones en comida, saborizantes y fragancias En la mayora de las investigaciones hechas sobre saborizantes se realizan por cromatografa de gases, y las correlaciones sensoriales que se requieren para que haya significancia en la determinacin de sabores deben ser medidas por patrones de

32 cromatografa de gases. El anlisis puede ser complicado debido a que los compuestos de inters volatilizan usualmente en muy bajas concentraciones, y son frecuentemente dispersados dentro de una matriz que contiene materiales los cuales podran, si se quedan dentro de la columna, acortar la vida de la muestra en un grado considerable. La cromatografa puede ser extremadamente compleja y frecuentemente influenciada por los mtodos de preparacin de la muestra. La cromatografa de gases es ampliamente utilizada en el anlisis de aceites esenciales, donde la complejidad de la muestra puede ser en verdad un gran reto. Muchos de estos productos son frgiles e importantes comercialmente y se utiliza la cromatografa de gases para cuantificar componentes especficos que podran ser indicativos de calidad del aceite y para detectar adicin de compuestos clandestinos como antioxidantes as como componentes utilizados como diluyentes. Un ejemplo de esto puede ser el aceite de limn al cual se adulteraba por la adicin de turpentina. De aqu que la cromatografa de gases es usada no solo para establecer cuales son los materiales normales que contiene cada muestra, sino tambin aquellos componentes cuya concentracin aumenta el abuso del aceite (ejemplo: el p-cymeno). La complejidad el aceite es tan alta que no se podra analizar su composicin por una simple columna cromatogrfica, por lo que se usan columnas especializadas de polimetilsiloxano con diferentes fases estacionarias, para producir una mejor separacin de los compuestos as como un tiempo de vida ms largo. Otro uso importante de la cromatografa de gases ha sido en el anlisis de vinos adulterados. Por ejemplo, en los vinos europeos fue de gran importancia en la deteccin de dietilenglicol. El dietilenglicol es un material txico y se ha encontrado en niveles de 60 g/L en los vinos. Tambin se pueden detectar contaminantes dentro de la comida empaquetada por cromatografa de gases. Estos contaminantes estn relacionados con trazas de solventes residuales usados en las pelculas plastificadas del empaquetamiento (por ejemplo, el 2-etilhexanol). El dibromo de etileno (EDB) ha sido utilizado ampliamente para inhibir la infestacin de insectos en comida empaquetada, pero se demostr que este compuesto es carcinognico en altos niveles. Debido a la gran complejidad de las muestras de comida, la deteccin de estos EDBs puede ser un problema, por lo que se han optimizado fases estacionarias que permiten un aumento en la retencin relativa y velocidad parcial de la volatilidad de los compuestos, dando prioridad a la salida de los contaminantes. Tabla 2. Columnas recomendadas para cromatografa de comida, sabores y fragancias4 Solutos Fase estacionaria Tipo de columna cidos grasos voltiles en 10% SP-1000/1%H3PO4 PEGa agua (C2 a C5) cidos grasos bacterianos 3% SP-2100, Silar 5CP 1, 5, 225. Aminocidos OV-17, OV-210 17 Carbohidratos 2330, 2340 225, 275

33 Aplicaciones relacionadas a qumicos y petrleo Los anlisis de productos del petrleo incluyen la separacin de mezclas de gases ligeros hasta la caracterizacin de aceites crudos y materiales producidos en la licuacin del carbn. La diferenciacin de hidrocarburos parafnicos, olefnicos y aromticos son metas normales, y algunas veces se requiere la deteccin de componentes nitrogenados y sulfurados. Las preparaciones de hidrocarburos derivados de aceites o carbn licuado pueden ser extremadamente complejas y tambin pueden incluir una variedad de otros grupos funcionales. La cromatografa multidimensional puede ser requerida para el anlisis de estas mezclas complejas, la cual da una gran estimacin de ciertos aditivos de octanos. Las columnas empaquetadas todava son utilizadas para algunas separaciones de hidrocarburos ligeros, mezclas de gases, componentes sulfurados y nitrogenados de bajo peso molecular; alcoholes y halocarbonos de bajo peso molecular. Estas columnas normalmente se empaquetan con almina o algunos polmeros porosos como los cromosorbos. Las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos hidrocarbonados estn limitados generalmente a fuerzas de dispersin; por ejemplo, la fase estacionaria de metilpolisiloxano, cuya interaccin con los solutos est limitada a las fuerzas de dispersin, funciona bien para la separacin de estos componentes. Mooney, et al. (1982) 4 demostaron la separacin de hidrocarbonos de bajo peso molecular en un sistema de vlvula de entrada, usando una columna de pelcula apretada en condiciones subambientales. Estas columnas son especialmente tiles para mezclas de baja ebullicin. Tambin se han diseado separaciones interesantes utilizando columnas tubulares de capa porosa (PLOT) cubiertas con almina. Estas columnas incrementan la retencin de los hidrocarburos de bajo peso molecular en altas temperaturas. Se disearon sistemas de multicolumnas de vlvula de entrada, con potencial de reflujo y/o redireccin de fracciones individuales a tubos abiertos, microempaquetados y columnas PLOT, para llevar a cabo separaciones que son difciles de duplicar con equipos convencionales o columnas tubulares abiertas. La cromatografa multidimensional se utiliza para la separacin de algunos componentes menores como los aditivos antiknock en gasolinas. Levy y Yancey (1986) 4, describieron un sistema para cuantificar aditivos oxigenados con las bases de caractersticas de retencin cuando las inyecciones de gasolina eran simultneamente agregadas a dos columnas diferentes. Las pruebas de solventes han sido todo un reto, debido a la cantidad masiva del constituyente principal que debe ser inyectado a la columna si la deteccin es para los constituyentes menores; por ejemplo, el rango dinmico del sistema debe ser suficientemente amplio para acomodar estas diferencias cuantitativas en los componentes.

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Aplicaciones ambientales Los anlisis ambientales se enfocan a la deteccin y/o cuantificacin de muchas substancias diferentes en una diversidad de matrices. Estos anlisis pueden ir desde qumicos de pesticidas y herbicidas hasta hidrocarburos aromticos polinucleares (PAHs), compuestos clorados mezclados en el aire, agua y tierra. En muchos casos el problema inicial es la obtencin y preparacin de la muestra. Las muestras de agua son muy variables, desde agua potable hasta aguas industriales. En muchos casos las agencias de regulacin de calidad tienen procedimientos estndar especficos para el anlisis de materiales dados en una matriz dada. Con algunas excepciones los mtodos de anlisis oficiales son menos sensitivos y consumen mayor tiempo que los mtodos que se desarrollaron en los comienzos de la cromatografa. En Estados Unidos, la agencia de proteccin ambiental (EPA) especific procedimientos para el monitoreo de efluentes industriales en 1977. Los mtodos 603 hasta el 613 separan en 13 clases los 113 contaminantes orgnicos que son monitoreados por cromatografa de gases. Los anlisis cromatogrficos se llevan a cabo por columnas tubulares abiertas, las cuales dan una excelente precisin y tiempos de anlisis muy cortos pese a la complejidad que podra presentar la muestra. En estos anlisis cromatogrficos se usan fases estacionarias de compuestos aromticos para mejorar la separacin de los solutos. Las mismas columnas se usan para la separacin de pesticidas y compuestos aromticos clorados.

Aplicaciones mdicas y biolgicas La deteccin en bajos niveles de componentes significativos en este campo tiene requerimientos estrictos para los sistemas analticos; esto es tambin cierto para otros solutos activos como los pesticidas. Los altos niveles de solutos activos podran necesitar no solo la seleccin de columnas bien desactivadas, sino tambin de los sistemas analticos particulares, como desactivar el puerto de inyeccin del cromatograma. Cuando la cuantificacin es importante, las tcnicas utilizadas por Schomburg (1979) 4 y Dandeneau (1979) 4, podran ser empleadas para establecer que la precisin del sistema se extiende a los niveles medidos para el soluto en cuestin. Para solutos termolbiles se requieren columnas fras de inyeccin (tabla 3).

35 Tabla 3. Fases estacionarias recomendables para las aplicaciones biolgicas y qumicas4 Solutos Columnas empaquetadas Columnas tubulares Clinicas/Biomdicas Cetosteroides Silar 5CP 225 Colesterol, esteroides, estrgenos OV-17 17 Alcoholes en sangre Carbopak/SP-1000 PEG Drogas Anfetaminas Apiezon/KOH Antidepresivos SP-2250 Alcaloides SP-2250, OV-17/H3PO4 Barbitricos SP-2250 1,5,17 Diurticos OV-17/H3PO4

Frecuentemente es deseable el anlisis de un anestsico presente en el aire suministrado a un paciente del que se encuentra en la atmsfera del cuarto, para lo cual se requiere un sistema de deteccin rpido y normalmente se utiliza uno de conductividad trmica. Para esto se utilizan columnas tubulares abiertas de dimetro largo muy apretadas para llevar a cabo la separacin de varios anestsicos en menos de 7 minutos; las columnas empacadas llevan a cabo la separacin en 28 minutos. Algunas veces el envenenamiento de pacientes por solventes orgnicos voltiles son evidentes por el hedor del paciente al respirar, pero en otros casos el diagnstico es facilitado por anlisis de sangre. Los agentes ms comunes en estos casos son los solventes (aerosol, repelentes o anestsicos) los cuales incluyen bromocloro -difluorometano, nbutano, tetracloro de carbono, clorobutanol, etc. Ramsey y Flanagan (1982) 4, usaron inyecciones de espacio principal o headspace en dos columnas empaquetadas diferente y con una deteccin simultnea por captura de electrones-ionizacin de flama (FID-ECD) para facilitar la deteccin e identificacin rpida de estos solutos en las muestras de sangre de pacientes envenenados. Es probable que con la columna DB-624 se pueda tener un anlisis ms rpido y mejor. La drogas son frecuentemente solutos ms activos, y su derivatizacin es normalmente requerida para su anlisis en columnas empaquetadas. Se puede incrementar la forma inerte de las columnas de slica para permitir un anlisis directo de estas drogas sin derivatizar. En algunos casos, la derivatizacin es empleada para aportar estabilidad trmica y se puede utilizar en ambas columnas, las empaquetadas y las tubulares abiertas. En estudios de derivatizacin de aminas disfuncionales. Jacob, et al (1985) 4, establecieron que con excepcin de la efedrina, todas las drogas examinadas producan dos derivados estereismeros que eran resueltos en picos bien formados bajo las condiciones que ellos usaron. Alm, et al. (1983) 4, inyectaron muestras simultneas de drogas en dos columnas

36 diferentes, una empleando FID y la otra con deteccin de nitrgeno/fsforo (NPD), para generar los datos de la Fig. 12.

Fig. 11. Anlisis de una droga ilegal en un analizador de detector y columna doble4. Aplicaciones en la industria La cromatografa de gases es muy til cuando pretendemos identificar los compuestos que determinan una caracterstica aromtica conocida. Por lo tanto, es necesario conocer los umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirta nuestro producto, ya sea mediante estudio bibliogrfico o por deteccin olfatomtrica. Esta informacin es un instrumento til para el seguimiento del producto en el proceso productivo, as como el control de otros materiales enolgicos, como son los tapones y las barricas. Algunos controles importantes a efectuar durante la fase de crianza en vinos y cavas son mtodos especficos para la determinacin de fenoles voltiles y compuestos azufrados. Concretamente en la cava, a partir de la evolucin de ciertos compuestos voltiles, entre ellos los vitispiranos, se calcula el momento en el que tienen lugar las fases de autlisis y postautlisis durante la crianza. Controlar el momento en que se desarrollan estas fases es importante debido a las alteraciones organolpticas que conllevan. La informacin que nos puede suministrar la GC en el control de calidad ser ms grande cuanto mejor conozcamos el perfil cromatogrfico de la fraccin aromtica de nuestro producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de datos del mismo en las diferentes etapas de elaboracin y en diferentes adiciones, y correlacionar estadsticamente determinados compuestos con ciertas anomalas, o tipificar variedades que no contengan algn compuesto especfico que las identifique (como sucede en la mayora de casos). No

37 obstante, se trata de anlisis todava demasiado laboriosos para constituir aplicaciones rutinarias de control.

En todo caso, el anlisis por cromatografa de gases no nos permite definir el perfil aromtico del vino analizado. El problema se agrava en aquellos compuestos para los que no disponemos de patrones sintticos y, por tanto, no es posible conocer sus propiedades aromticas.

Otras aplicaciones Tambin se hacen anlisis cromatogrficos para la determinacin de metanos trihalogenados, los cuales daan la salud por la desinfeccin del agua de piscinas con cloro. Se hacen anlisis de componentes de la acrilamida. Se determinan los residuos de ditiocarbamato en los alimentos dietticos. La determinacin de aceites minerales en el agua. Anlisis de herbicidas en campos de golf. Para determinar los grados de alcohol en bebidas como la cerveza. Para la determinacin de componentes aromticos en alimentos y bebidas. Aplicaciones prcticas Dentro de la investigacin que se realiza en el Instituto de Biotecnologa, en el departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis, se realiza investigacin sobre la degradacin enzimtica de compuestos azufrados, como el dibenzotiofeno, presentes en petrleo crudo y sus derivados. El azufre al ser oxidado durante el proceso de combustin, se convierte en un contaminante atmosfrico al formar cido sulfhdrico, el cual forma parte de la lluvia cida. La deteccin de los productos de degradacin se realiza por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas. La cromatografa de gases nos permite cuantificar la concentracin de compuestos azufrados; y la espectrometra, el anlisis de los productos (fig.12).

38

Abundance TIC: DBT.D

5500000 5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000

Time-->

Time

4.00

6.00

8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

A) cromatografa de gases.

Abundance Scan 550 (11.368 min): DBT.D

184 600000

550000

500000

450000

400000

350000

300000

250000

200000

150000 139 100000

50000 63 32 50

92 215 246281 327 377 429 479 530 562 605 200 250 300 350 400 450 500 550 600 659693 650 700

m/z-->

m/z

100

150

B) espectrometra de masas Fig. 12 grfica de deteccin de dibenzotiofeno. Entre las aplicaciones de ms importancia est la del mbito de alimentos, debido a que es de suma importancia tener conocimiento de los componentes cuya presencia cae dentro de los parmetros permitidos en ciertos productos, an a pesar de que no formen parte del contenido original. Para ejemplificar este punto hacemos referencia al siguiente artculo de divulgacin. Se anexa publicacin al finaldel trabajo.

39 Lpez, M.G. 2001. Una sinfona de aromas. Avance y perspectiva, Unidad Irapuato, CINVESTAV. vol. 20. p. 421-424

Cromatografa de gases como mtodo principal **DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AMBIENTALES CENTRO DE CIENCIAS DE LA ATMSFERA/UNAM. Distrito Federal Investigacin: Estudio de la composicin orgnica semivoltil presente en las partculas menores o iguales a 10 y 2.5 m suspendidas en el aire por cromatografa de gases espectrometra de masas. **LABORATORIO DE CALIDAD DEL AIRE/ITESM. Monterrey, Nuevo Len Cromatografa de gases acoplado a espectrometra de masas y detector infrarrojo con transformada de Fourier. Cromatgrafo de gases con detector de captura de electrones. Detector de ionizacin de flama. Monitoreos de emisiones en fuentes fijas, perimetrales y proyectos especiales en empresas. http://uninet.mty.itesm.mx/ctl/labaire.html **LABORATORIO DE NUTRICION Y ALIMENTOS Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro. Coahuila Responsable: Lic. Laura Olivia Fuentes Lara. Investigacin: Bromatolgicos en forrajes y concentrados para consumo animal; en alimentos de consumo humano (frutas, hortalizas, cereales, carnes rojas y pollo). Determinacin de cidos grasos. www.uaaan.mx/DirInv/texthtml/servicio.htm ** LABORATORIOS DE INVESTIGACIN QUMICA Y BIOQUMICA (LIQB)/TESE. Ecatepec, Edo. Mx. Cromatgrafo de gases Hewlett Packard con detector selectivo de masas y detector de conductividad trmica. Cromatgrafo de gases Varian. Investigacin: Tratamiento de efluentes gaseosos por medio de catlisis qumica y biofiltracin. Restauracin de suelos contaminados con hidrocarburos y plaguicidas. Produccin de pigmentos y enzimas de inters agroalimentario. Anlisis externos (anlisis de compuestos orgnicos voltiles y semivoltiles). http://tese.dns2go.com/index.asp?opcion=laboratorios

40 **Dr. Charles Rice Agron 645-Microbiologa del suelo Depto de Agronoma./KSU. Kansas State, USA Biomasa microbiana. Carbono y Nitrogeno mineralizable. Liberacin de gases bajo condiciones de fumigacin. http://www.oznet.ksu.edu/ed_agron645/lab/645GCinfo.htm ** Qumica atmosfrica Programa de Ingeniera Qumica Ambiental y de Qumica Ambiental (PIQAyQA) Facultad de Qumica/UNAM. Distrito Federal Cromatgrafo de gases Perkin Elmer http://www.cneq.unam.mx/paidoteca/quimicaambiental/instalaciones.htm ** Centro de Investigaciones Qumicas/UAEM. Cuernavaca, Morelos Cromatgrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas (HP5973). http://www.ciq.uaem.mx/ciq/servicios1.htm **Laboratorio de Biogeoqumica UBIPRO/UNAM Iztacala, Distrito Federal Cromatgrafo de Gases con detector de Espectrometra de Masas (Finnigan Mat). http://www.iztacala.unam.mx/dip/ubiprolab_biogeoquimica.html **Alcoholera de Zapopan. Jalisco Comercializacin de alcohol etlico. http://www.alcoholera-zapopan.com/laboratorio.html **Anlisis en el rea de Alimentos y Frmacos Laboratorio de instrumentacin/CETI. Guadalajara, Jalisco. http://www.ceti.mx/es/servicio_ext/tec_quimicas/lab_instrumentacion.phtml

Innovaciones
Se han hecho innovaciones aumentando los volmenes de inyeccin al cromatgrafo (LVI). En anlisis de cromatografas de gases tpicas normalmente solo una fraccin del volumen inyectado es de inters analtico, el resto solo interfiere o no es importante. Para mejorar el anlisis, aumentando la integridad analtica, disminuyendo la frecuencia de retencin etc. Se ha diseado un sistema llamado ProSep.

41 El sistema ProSep consiste de 4 componentes, el mdulo de precolumna, el cual es el puerto de entrada, dos mdulos control y una precolumna de vidrio o slica la cual est unida dentro de la precolumna de manera similar al alineador de vidrio split/splitless (partido / sin partir) (paso 1). El flujo de la funcin ProSep se muestra en la siguiente figura. La inyeccin con el ProSep en el cromatgrafo de gases de manera split. Debido a que ProSep provee alguna separacin, los componentes inyectados son organizados en la precolumna de acuerdo a su punto de ebullicin, aqu el solvente, el analito y la matriz son ordenados en el puerto y los solventes de bajo punto de ebullicin son rpidamente eluidos (paso 2). Despus de la eliminacin del solvente, la columna de preseparacin modula la temperatura, cerrando el respirador split transfiriendo los solutos dentro de la columna analtica (paso3). Cuando ya se han transferido todos los solutos de inters, se abre de nuevo el respirador split se abre de nuevo y la columna de preseparacin aumenta la temperatura para hervir a los componentes no deseados de la matriz (paso 4). Todos estos pasos son monitoreados bajo softwares de la marca ProSepTM.

Fig. 13 Columnas de separacin tipo ProSepTM 7.

42

Fig. 14 Cromatgrafo de gases con columnas y detectores ProSep7. Cromatografa de gases y espectrometra de masas Durante los ltimos veinte aos la espectrometra de masas (EM) y la cromatografa de gases (GC) han demostrado repetidamente, en gran nmero de laboratorios en todo el mundo, su versatilidad como mtodos analticos para la determinacin estructural y separacin de compuestos orgnicos. Ambas tcnicas han alcanzado ltimamente un alto grado de desarrollo en sus diversas facetas prcticas, habindose convertido respectivamente e independientemente en dos mtodos analticos en los que se conjuntan una gran rapidez, sensibilidad y poder resolutivo. Aunque en la prctica hasta 1957 la cromatografa de gases y la espectrometra de masas avanzaron por caminos diferentes pero paralelos en el campo del anlisis orgnico, gracias al gran potencial demostrado por los primeros intentos de combinacin y a su rpido desarrollo, en la actualidad la combinacin directa cromatogrfica de gases-espectrometra de masas se reconoce como uno de los sistemas ms eficaces a disposicin del qumico analista para el estudio e identificacin de mezclas complejas de productos orgnicos. Conectando la salida de un cromatgrafo de gases a la cmara de ionizacin de un espectrmetro de masas de puede obtener informacin estructural (espectro de masas) para cada uno de los componentes de la mezcla original, previamente inyectada en el cromatgrafo, a medida que estos son eluidos en serie de la columna cromatogrfica. De esta forma las limitaciones inherentes de la cromatografa de gases quedan considerablemente reducidas en el anlisis cualitativo. Dichas limitaciones surgen del hecho de que mientras la cromatografa de gases pueda separar los componentes

43 individuales de una mezcla con un alto grado de poder resolutivo, no puede dar, en sentido riguroso ms que informacin preliminar sobre su estructura. Hay que sealar como esencial que cualquier columna cromatogrfica no es un instrumento analtico, sino tan solo un medio de separacin fsica. Asimismo, desconectando ciertos detectores especficos (por ejemplo captura de electrones, fsforo, etc.), los detectores cromatogrficos solamente responden en general a la cantidad de la muestra eluda de la columna. Por ello la utilizacin de los datos basados en el tiempo de retencin absoluto o relativo puede resultar un mtodo adecuado para la identificacin tentativa de ciertos compuestos o mezclas relativamente simples o para las cuales se dispone de los correspondientes patrones. Sin embargo, cuando esta metodologa se intenta llevar a extremos, como el anlisis de mezclas de productos naturales de extrema complejidad, los resultados as obtenidos carecen de la precisin cualitativa, sobre todo en los casos que se requiere una programacin de la temperatura del cromatgrafo de gases y se carece de compuestos patrn. A este respecto, una de las reas ms activas de la combinacin cromatografa de gases-espectrometra de masas es en conclusin la identificacin de compuestos nuevos o no sospechados previamente.

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Pginas web
http://home.nas.net/~dbc/cic_hamilton/gas.html links a diferentes mtodos. http://tese.dns2go.com/index.asp?opcion=laboratorios http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/GC/ imgenes http://www.alcoholera-zapopan.com/laboratorio.html http://www.cee.vt.edu/program_areas/environmental/teach/smprimer/gc/gc.html#intro animaciones http://www.ciq.uaem.mx/ciq/servicios1.htm GC centro de Investigaciones Qumicas/UAEM http://www.chem.vt.edu/chem-ed/sep/gc/gcpics.html cromatgrafos http://www.dreamingearth.com/gas_chromatographs.html GC y aromaterapia http://www.essencefleur.com/Empresa2.htm GC en produccin de perfumes http://www.orbigen.com/protocols/Gas_Chromatography.html ligas a diferentes campos (historia, tcnicas, etc.) http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/gaschrm.htm explicacin general http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Datanodes.html?prod_line_id=97503 3 reactivos, aparatos http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/ma in.htm conceptos generales con links a detectores

Bibliografa
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