SEP.

SEIT.

Direccin General de Educacin Tecnolgica Industrial

Manual de Prcticas

I N M U N O L O G A

Q.B.P. Marcelino J. Campos Tejeda

C.B.T.i s 194

Cd. Ayala Mor

Introduccin 1 2 3 Diluciones Sangrado de animales Inmunizacin de animales 4 8 11

Reacciones de Precipitacin 4 5 6 Precipitacin capilar Imnunodifucin doble Inmunudifucin radial 20 24 27

Reacciones de Aglutinacin

Aglutinacin activa 7 8 9 10 Tipificacin de grupos sanguneos Prueba de coombs Pruebas cruzadas Reacciones febriles 29 35 39 46

Aglutinacin Pasiva 11 12 13 14 15 Inhibicin de la hemaglutinacin Inhibicin dela aglutinacin Factor Reumatoide Protena c reactiva Antiestreptolisinas 49 51 52 55 57

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

Los laboratorios se destinan fundamentalmente a la experimentacin y la investigacin cientfica, las actividades que se realizan en los laboratorios son de tipo practico.

Finalidades: Lograr al mximo el aprovechamiento de los recursos humanos y materiales con los que se cuentan dentro del laboratorio, para obtener mejores resultados tanto individuales como en conjunto, fomentando en el educando los hbitos de observacin, responsabilidad e investigacin.

Seguridad: Todos los educandos deben de poner en prctica las reglas de higiene y seguridad dentro del laboratorio, debiendo dar aviso inmediatamente al maestro de cualquier desperfecto o accidente que pudiese ocurrir (en fusibles e interruptores elctricos, conexiones de gas, llaves de agua), por higiene no debe tirar papeles, dejar muestras en las coladeras de las mesas de trabajo, no tirar sustancias en el piso.

Disciplina: 1.2.La hora de entrada ser la que indique su horario, dando una tolerancia de 10 minutos. El alumno debe recibir y entregar el equipo y material en buen estado al finalizar la prctica (si nota algn desperfecto en los materiales debe de reportarlo inmediatamente). Durante su estancia en el laboratorio, el alumno deber usar la bata de trabajo, (blanca). El alumno para poder realizar su objetivo de la prctica debe traer el material o muestras en ellas se le pidan.

3.-

4.-

Prctica N 1
Nombre de la practica......Diluciones Objetivo Al termino de la practica el alumno adquirir los conocimientos necesario para poder realizar concentracin o dilucin de soluciones que son de gran utilidad en el laboratorio clnico. Introduccin: Una de las ramas importantes que apoyan a la inmunologa son las matemticas ya que es necesario realizar clculos que son vitales para poder realizar una metodologa lo que nos indica que cualquier error en los clculos traer como consecuencia un mal diagnostico del proceso patolgico. Como algunas metodologias requieren de preparar soluciones es necesario saber que es una solucin esta se puede definir como un sistema homogneo y estable donde participan molculas, tomos o sustancias. Los componentes que participan en una solucin son el soluto y el disolvente el primero siempre se encuentra en menor proporcin y el segundo se encuentra en mayor proporcin . Las soluciones para su estudio se pueden clasificar en: 1.- Empricas .-Estas soluciones se caracterizan por que para su preparacin no se requiere de clculos matemticos dentro de este grupo se pueden encontrar: a.- Insaturadas b.- Saturadas c.- Sobresaturadas 2.- Valoradas.- Son soluciones que para poderla preparar se requiere realizar clculos matemticos tomando en cuenta la composicin qumica del soluto aforando a un litro dentro de stas se tiene: a.- Sol. Molares( soluto en gramos o moles a un Litro) b.- Sol. mlales ( soluto en gramos o moles en un litro ) c.- Sol Normales( soluto en equivalentes qumicos a un litro) 3.- Porcentuales.- Soluciones donde el soluto se expresa en gramos o mililitro aforando a cien mililitros dentro de stas se encuentran: a.- Peso b.- Volumen En el laboratorio por cuestin de economa en la mayora de las ocasiones es necesario preparar pequeas cantidades de una solucin apartar de una mas concentrada (realizar una dilucin )dependiendo del caso se puede realizar los siguiente. A.- Disminuir la concentracin adicionando disolvente en cantidades conocidas.- En este caso la dilucin se puede expresar en forma de proporciones, donde el primer dgito nos
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Prctica N 1
indica el volumen de la solucin original el cual se puede expresar en mililitros, microlitros etc. y el segundo no indica el volumen final de la nueva solucin. V.g. 1 : 2 1:3 1:4 1:5 Etc. (1+1=2) (1+2=3) (1+3=4) (1+4=5)

B.- Cuando se realizan diluciones seriadas.- En este caso se acostumbra referirse a un factor de dilucin que es el que multiplica a la dilucin anterior. Vg. Realizar una serie de diluciones con factor de dilucin de dos y tres 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 :16, 1 : 32 1 : 3, 1 : 9, 1 : 27, 1 :71, 1 : 213 C.- Cuando se tiene una solucin a una concentracin determinada y se requiere diluirla.para esto se divide la dilucin final que se requiere entre la dilucin con que se cuenta . Vg. se tiene una solucin 1: 6 y se necesita una que tenga una proporcin 1: 54 para esto se procede a dividir 54 entre 6 y el resultado es 9 lo cual no quiere decir que se tomara un volumen de la dilucin 1:6 y se le agregara ocho del diluyente lo cual no da una solucin 1:54 con respecto a la original. D.- Cuando se requiere un volumen final determinado y preciso diferente al calculado tericamente ya que por lo general el volumen que se necesita es menor al terico para esto se toma en cuenta el volumen que se requiera y la dilucin que se desea. V.g. se necesita 25 mililitro de una solucin 1:250 en teora se tendra que preparar 1 volumen del soluto mas doscientos cuarenta y nueve del solvente apartar de esta solucin se tomara veinticinco y se desechara doscientos veinticinco lo que se puede observar de lo anterior que se desechara la gran mayora de la solucin para evitar esto se realiza lo siguiente: En primer lugar se hara la relacin entre el volumen deseado y el terico 25/250 lo cual dara 0.1 este resultado se multiplica por la expresin 1 + 249 donde el siguiente resultado 0.1 + 24.9 = 25 que es el volumen deseado sin alterar la relacin 1:250 que es la que se desea.

Material: Safranina Azul de Metileno

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Prctica N 1
Tubos de ensaye Pipetas Balanza Espectrofotometro Agua Metodologa: 1.- Pesar 0.1 gramo de safranina y disolverlo en 4.5 militros de agua 2.- Colocar en nueve tubos de ensaye 4.5 ml de agua y marcarlos del uno al nueve. 3.- Tomar 0.5 mililitros con una pipeta del tubo que contiene la safranina/agua y colocarlo en el tubo uno y homogeneizar 4.- Del tubo uno tomar con una pipeta y depositarlo en el tubo numero dos homogeneizar 5.- Repetir el procedimiento anterior hasta el tubo nueve de este descartar 0.5 mililitros despus de homogeneizar. 6.- Valorar la disminucin de color en forma visual . 7.- Con ayuda de un espectrofotometro realiza una curva ( selecciona longitud de onda de acuerdo a l espectro de emisin) Nota. Realiza el mismo procedimiento para el colorante azul de metileno y registra tus resultados

Cuestionario: 1.- Prepara una solucin 0.2 Molal de cido sulfrico a un volumen final de 250 ml. 2.- Prepara una solucin 0.2 Molar de cido sulfrico a un volumen final de 300 ml 3.- Prepara una solucin 0.2 Normal de cido sulfrico a un volumen final de 300 ml 4.- Realiza una serie de diez diluciones de una solucin con un factor de dilucin de 6 5.- Se tiene una dilucin 1:6 y se requiere para realizar una metodologa una dilucin 1:70 realiza los clculos necesarios para obtener esta dilucin. 6.- Reporta los resultados de tus dos procedimientos incluyendo. 7.- Reporta la conclusin a la que llegas en la practica

Prctica N 2
Nombre de la practica...... Sangrado de animales

Objetivo

Al termino de la practica el alumno adquirir la habilidad de manipular y sangrar animales de experimentacin lo cual gran utilidad para la obtencin de productos biolgicos en el laboratorio

Introduccin:

El sangrado de animales se realiza antes y despus de un protocolo de inmunizacin que sucede despus de 4-7 dais despus de la ultimas inoculacin pero es importante realizar un sangrado previa al esquema de inmunizacin lo cual nos sirve como testigo negativo del protocolo de inmunizacin. el suero obtenido despus del protocolo de inmunizacin se le determina el titulo de anticuerpo presentes lo cual valora la potencia del producto biolgico.

Material Jeringas con agujas del 25 Jeringas con agujas del 22 Jeringas con agujas del 20 Cepo ( caja para sujetar conejos ) Trampa para ratn Torundas impregnadas de alcohol Crema depiladora

Metodologa: Sangrado de conejo

Oreja

1.- Introducir el conejo en el cepo

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Prctica N 2

2.- Localizar la arteria central 3.- Limpiar con una torunda impregnada de alcohol 4.- Sangrar el conejo con una jeringa con aguja del 20 5.- Obtener la cantidad necesaria de sangre 6.- Retirar la aguja y presionar el sitio de la puncin con una torunda impregnada del alcohol

Corazn

1.- Sujetar el conejo d las cuatro patas colocndolo con el

trax hacia arriba el corazn por medio del

2.- con el dedo ndice y medio localizar en la zona del trax latido cardiaco 3.- Limpiar con una torunda impregnada de alcohol el trax 4.- Realizar la puncin con una aguja del 20

5.- Si la aguja no se encuentra en cavilad cardiaca sacarla y volver a introducirla 6.- Seccionar la sangra hasta obtener el volumen de sangre 7.- Retirar la aguja y colocar una torunda de algodn Nota.- cuando se introduce la aguja en cavidad cardiaca se siente por que la jeringa registra las pulsaciones del corazn si esto no sucede no se esta en regin cardiaca. si la aguja se mueve en el interior del trax puede haber riesgo de desgarra tejido cardiaco y pulmonar ocasionando la muerte del animal Sangrado de cobayo Se realiza en forma similar al sangrado de conejo por va cardiaca deseado

Sangrado de ratones

1.- Sujetar el conejo colocndolo dentro de una trampa para ratones o sobre la jaula jalar ligeramente la cola
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Prctica N 2

2.- Introducir una pipeta Pasteur o un capilar sin heparina en la regin interna del ojo hasta encontrar el seno venoso, esto sucede cuando la sangre fluye por capilaridad hasta la luz de objeto de puncin

cuestionario:

1.- Cual es la razn por la cual se debe de sangrar un animal de laboratorio

2.- Que animal sangraste y a que problemas te enfrentaste

3.- Que es un producto biolgico

4.- Que entiendes por esquema de inmunizacin

Prctica N 3
Nombre de la practica...Inmunizacin de animales

Objetivo

Al trmino de practica el alumno tendr la habilidad de realizar un esquema de inmunizacin en animales para la obtencin de productos biolgicos con gran cantidad de anticuerpos inducidos

Introduccin: Se entiende por inmunizacin al proceso mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmunologa al entrar en contacto con un antgeno especifico esta respuesta puede ser natural o artificial La obtencin de anticuerpos por medio de una va de inmunizacin es de gran ayuda en la teraputica humana y animal en diferentes procesos infecciosos o txicos adamas de que estos antisueros son de gran ayuda para la identificacin de bacterias Cuando un inmunogeno penetra al organismo, se activan una serie de mecanismos inespecificos y especficos (donde interactuan clulas portadoras del antgeno < CPA >, linfocitos t y b. como resultado de esta interaccin se induce una respuesta inmune primaria con la formacin de anticuerpos loa cuales pueden detectarse en el suero despus de cuatro das de inmunizacin <fase lag>, aumentando lentamente <fase Log> hasta llegar a un mximo <meseta> para despus decaer rpidamente en este tipo de respuesta es Producido principalmente por IgM seguida por IgG . si hay un segundo contacto con el inmunogeno la fase la disminuye considerablemente y alcanza un mximo de diez veces mas la concentracin del anticuerpo que en la respuesta inicial esta respuesta es mediada por IgG . El antgeno producido por efecto de una respuesta inmunologica va a estar en funcin de :

1.- Ruta de inmunizacin 2.- Naturaleza del inmunogeno 3.- Va de procesamiento del inmunogeno 4.- Presentacin del inmunogeno a linfocitos La dosis del inmunogeno es importante ya que si se inocula una dosis no adecuada se puede presentar el fenmeno de tolerancia que es un estado de no respuesta a un antgeno particular. Para que se puede producir una respuesta inmunologica es necesario tomar en cuenta los siguientes factores

1.- Antgeno ya que su inmunogenicidad va a estar en funcin de, complejidad estructural, peso molecular, conformacin y naturaleza qumica <se ha visto que las protenas son mas inmunogenicas que los carbohidratos y lpidos> es importante recordar que un antgeno se comporta de manera diferente en diferentes especies animales adamas que es importante la edad, el sexo y la gentica.
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Prctica N 3

2.- Estado fsico del antgeno <soluble o particulado> esto es importante ya que de aqu va a depender la va de inmunizacin que se eligiera : Antgenos particulados <bacterias, glbulos rojos clulas y partculas inertes> de preferencia son introducidos por va intravenosa Antgenos solubles pueden ser introducidos por diferentes vas <intramuscular (IM),intraperitoneal (IP) subcutnea (SC) intradermica (ID) cuando se utiliza la va SC e ID se recomienda que se acompae de un inmunopotenciador o adyuvante Un adyuvante es un estimulador de la respuesta inmunologica para que esto suceda debe de reunir los siguientes requisitos: a.- Ser capaz de formar un deposito para proteger al antgeno del catabolismo rpido dentro del organismo b.- ser capaz de estimular la respuesta inmune no especifica para lograr incrementar las linfocinas favoreciendo la induccin de linfocitos B, proliferacin de timocitos, interaccin de clulas T y B, estimularon de fagocitosis, procesamiento del antgeno, causa una reaccin inflamatoria local en el sitio de la inoculacin .

Adyuvantes antignicos Endotoxinas de bacterias Gram neg.(Micobacterias, Bordetella pertusis )

Adyuvantes no antignicos Tartrato aluminico de potasio o alumbre fosfato de calcio aceite mineral lanolina polinucleotidos algunos agentes tensodepresores

Dentro del las practicas inmunologicas el adyuvente que mas se trabaja es el Freund del cual se conocen dos tipos: Incompleto.- es una mezcla de aceite mineral con un detergente Aceite ( drakeol, bayol, nujol ) Detergente ( falfa, arlacel, aquafor ) vg. arlacel-drakerol ( 1:9 ) arlacel-bayol ( 3:17)
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Prctica N 3
Completo.- contiene adems una micobacteria

vg. M. tuberculosis M. bovis M. phlei Estas micobacterias se utilizan a razn de 1-5 mg. de peso seco por cada ml de adyuvante incompleto En humanos no se recomienda utilizar ningn adyuvante de Freund debido a que frecuentemente su utilizacin conduce al desarrollo de granulomas severos Un adyuvante puede funcionar

1.- Aumentando directamente el numero de clulas involucradas en la formacin de anticuerpos 2.- Favoreciendo el mejor procesamiento del antgeno por la clula fagociticas 3.- Prolongando la duracin del antgeno en el animal inmunizado Cuando se va a realizar una ruta de inmunizacin es necesario tomar en cuenta las siguientes consideraciones a.- El volumen administrado b.- El regulador y los componentes que deben de ser administrados junto con el inmunogeno c.- La rapidez con la que el inmunogeno es liberado dentro de la circulacin linftica y sangunea

vg. Para un conejo se recomienda de 2-5 ml por va subcutnea para un ratn 0.3-1ml intraperitoneal Cuando un inmunogeno se administra por va intramuscular o intradermica su liberacin es lenta, pero si el intravenosa su liberacin es rpida. nunca se debe de aplicar un inmunogeno junto con un adyuvente por va intravenosa Material Jeringa con aguja del 25 Jeringa con aguja del 22 Jeringa con aguja del 20 Cepo Trampa para ratn Crema depiladora Torundas impregnadas del alcohol Inmunogenos
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Prctica N 3
Metodologa

Inmunizacin de conejos

Va intravenosa 1.- Colocar el conejo en el cepo 2.- Localizar las venas marginales 3.- Sujetar bien la vena con el dedo anular y medio 4.- Limpiar la zona de inmunizacin con una torunda impregnada de alcohol al 70 % 5.- Proceder a inocular el inmunogeno para esto se recomienda que se inicie la inmunizacin en el entramo mas distante a la cabeza procediendo a inyecta hacia abajo.

Va subcutnea 1.- Elegir la zona de inoculacin 2.- Cortar el pelo con ayuda de tijeras 3.- Limpiar con una torunda impregnada de alcohol 4.- Levantar ligeramente la piel del conejo 5.- Introducir la aguja lentamente, aproximadamente una tercera parte del aguja . 6.- Depositar el antgeno sin que se forme papula en el sitio de la inoculacin

Va intradermica 1.- Rasurar el lomo del animal 2.- En este sitio aplicar crema depiladora y dejar actuar durante 5-8 min. 3.- Limpiar en su totalidad la crema con ayuda de un trapo hmedo
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Prctica N 3
4.- Introducir la aguja en la dermis del animal con el bisel hacia arriba una vez dentro de la piel, girar 120 y depositar el inoculo 5.- En el sitio dela inoculacin se debe de observar la formacin de una papula

Inoculacin de cobayos Va intradermica 1.- Rasurar el lomo del animal 2.- Aplicar crema depiladora y dejar actuar durante 5-8 min. 3.- Limpiar con un trapo hmedo la crema depiladora en su totalidad 4.- Introducir la aguja en la dermis con el bisel hacia arriba y una vez dentro girar 120 y depositar el inoculo 5.- En el sitio del inoculacin se debe de formar una papula Intraperitoneal 1.- Sujetar el cobayo de las cuatro patas con el trax hacia arriba 2.- Colocar el cobayo en forma inclinada con la cabeza hacia abajo 3.- Limpiar la regin abdominal con una torunda impregnada de alcohol 4.- Introducir la aguja en posicin lateral y proceder a inocular el inmunogeno

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Prctica N 3
Inmunizacin de ratones

Va intraperitoneal 1.- Colocar el animal en la jaula para ratones 2.- Sujetar la cola del animal y cabeza con una mano 3.- Exponer la regin abdominal 4.- Colocar el animal con la cabeza hacia abajo 5.- Limpiar la regin donde se puncionara 6.- Introducir la aguja en posicin lateral e inocular el antgeno

Va intravenosa 1.- Colocar el animal en la jaula para ratones y sujetar la cola en forma horizontal procurando que la vena caudal quede expuesta 2.- Limpiar la cola con una torunda impregnada de alcohol 3.- Introducir el antgeno usando una aguja de calibre 25 esto sucede cuando se desliza suavemente el antgeno DEPENDIENDO DEL INMUNOGENO Y DEL ANIMAL A INOCULAR SE PUEDE SEGUIR EL SIGUIENTE ESQUEMA DE INMUNIZACIN. Antgenos particulados Inoculacin 1 2 3 4 Sangrado Da 0 4 8 12 18 Fecha Dosis 0.5 ml 1.0 ml 2.0 ml 3.0 ml Va IV IV IV IV

Los antgenos bacterianos que se pueden utilizar son cepas Salmonella choleraesuis H y O ajustados a una concentracin aproximada 900 millones de bacterias por ml de suspensin cuando ya se completo el esquema de inmunizacin se debe de titular obteniendo un titulo de 1:640 para el antgeno somtico O y para el antgeno flagelar H 1:5000 si esto no

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Prctica N 3
sucede se recomienda realizar una quinta inoculacin con 3 ml del antgeno despus del cuarto o sexto da del sangrado y volver a sangrar seis das despus de la inoculacin.

Inmunizacin con Eritrocitos

Inoculacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sangrar

Da 0 2 4 6 8 10 12 14 16 21

Fecha

Dosis 1 1 1 1 1 2 2 2 2

Va IV IV IV IV IV IV IV IV IV

Los eritrocitos se deben de preparar al 10% en solucin salina isotnica

Antgenos solubles Inoculacin 1 Da 0 Fecha Dosis 5 mg de Ag disuelto en 1 ml solucin salina emulsificado en 1 de adyuvante completo de Freund. 5 mg de Ag disuelto en 1 ml solucin salina emulsificados en 1 de Ayuvante incompleto de Freund 0.25 mg de Ag en solucin salina 0.5 mg de Ag en solucin salina 1.0 mg de Ag en solucin salina Va de ml de ml ID o SC

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ID o SC IV IV IV

3 4 5 Sangrar

30 31 32 39

Los antgenos solubles que se que se pueden utilizar son fracciones sricas como la Albmina, Gama globulina, Albmina de Huevo.

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Prctica N 3
Suero Total

Inoculacin 1

Da 0

Fecha

15

3 4 5 Sangrar Cuestionario

30 31 32 39

Dosis 1 ml de Ag diluido 1:10 en sol. sal. emulsificada en 1 ml de adyuvante completo de Freund 1 ml de Ag diluido 1:10 en solucin salina emulsificada en 1 ml de adyuvante incompleto de Freund 1 ml de Ag diluido 1:50 en solucin salina. 1 ml de Ag diluido 1:25 en solucin salina. 1 ml de Ag diluido 1:10 en solucin salina.

Va ID o SC

ID o SC

IV IV IV

1.- Que va de inmunizacin utilizaste y por que

2.- Que es un antgeno

3.- Que antgeno utilizaste

4.- Cual es la funcin de un adyuvante

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Prctica N 3
Introduccin Las reacciones de precipitacin ( inmunoprecipitacin ) se presentan cuando antgenos solubles y polivalentes se combinan con su anticuerpo especifico ( antisuero homologo ) dando lugar a complejos insolubles que pueden aparecer al cabo de unos minutos, los cuales son visibles y cuantificables para que la reaccin Ag-Ab se lleve acabo va a depender de varios factores: Ph Fuerza ionica Temperatura Tiempo Concentracin de antgeno Concentracin de anticuerpo Las reacciones de precipitacin pueden ser cuantificadas adems que pueden realizarse en medios lquidos, slidos, o semisolidos Medio liquido Medio solid Medio semisolido Inmunodifucin radial o simple Inmunodifucin doble Inmunoelectroforesis Contrainumoelectroforesis Electroinmunoelectroforesis unidimensional Inmunoelectroferesis cruzada Las reacciones de precipitacin en medios semisolidos permiten identificar individualmente cada constituyente de una mezcla de antgenos y anticuerpos, as como su cuntificacin por comparacin con otros ya conocidos los cual es mas fidedigno si se combina con electroforesis. cuando se trabaja con inmunodifucin es importante valorar la velocidad de difusin de los reactivos ya que esta va a estar en funcin de fsicas e inmunoquimicas del sistema las cuales son: ..concentracin de las molculas ( la velocidad de definicin es proporcional a la concentracin ) ..tamao de las molculas ( la vel. de difusin es inversamente proporcional al tamao de las molculas ) ..forma de las molculas ..viscosidad del medio ..temperatura La interpretacin de prueba va a estar en funcin del numero de bandas que resulten las cuales van a estar formadas por un complejo antigeno-anticuerpo

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Prctica N 4
Nombre de la practica.... Precipitacin en medio liquido Objetivo Al termino de la practica el alumno adquirir la habilidad de cuantificar la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra determinada con ayuda de un mtodo capilar liquido

Introduccin Cuando se realiza una precipitacin en medio liquido es necesario mezclar cantidades crecientes de antgeno y concentracin constante de anticuerpo o viceversa la cantidad de precipitado varia segn la proporcin de los reaccionantes a pequeas concentraciones de antgeno no se observa formacin de precipitado , pero conforme va aumentando la concentracin de antgeno este precipitado va a aumentar en forma proporcional hasta alcanzar un mximo y empezar a disminuir si se analizaran los tubos capilares despus de la formacin del precipitado es posible observar antgeno libre en la en zona ascendente de la curva ( zona de exceso de anticuerpo ) o antgeno libre en la regin descendente de la curva ( zona de exceso de anticuerpo ) pero en la regin central de la curva no hay Ag. ni ab libre lo cual se le nombre zona de equivalencia . Si se realiza una grfica donde se graficara cantidad de precipitado formado contra cantidad de antgeno agregado el resultado seria tres zonas y stas quedaran de la siguiente manera. 1.- Exceso de anticuerpo 2.- Equivalencia 3.- Exceso de antgeno Material Tubos capilares Tubos de ensaye Pipetas Gradilla de plastilina Solucin salina Solucin de albmina de huevo Suero anti albmina de huevo Metodologa 1.- Dividir en tres partes iguales 11 tubos capilares 2.- En ocho tubos de ensayo realizar Diluciones al doble de la albmina con solucin salina usando como volumen final un mililitro. 3.- Se llena un tubo capilar por capilaridad con antisuero hasta la primer marca se limpia la parte externa del tubo
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Prctica N 4

4.- Se gira 180 el capilar y se hace descender hasta la marca el antisuero 5.- En forma similar se absorbe antgeno sin diluir que llegue hasta la segunda marca limpiar la parte externa del tubo con papel absorbente 6.- Mezclar por inversin repetida 7.- Tapar uno de los extremos con el dedo y dejar que el contenido quede centrado en el tubo 8.- Repetir los pasos 3 hasta el 7 pero utilizando las Diluciones de la albmina 9.- Se usan testigos utilizando solucin salina mas antisuero sin diluir y solucin salina mas antgeno 10.- Colocar los tubos en una gradilla de plastilina y dejarlos unos minutos a temperatura ambiente y guardarlos en refrigeracin durante 24-48 hrs. 11.- Medir la precipitacin en milmetros 12.- Anotar los resultado

Cuestionario:

1.- Anota las Diluciones que realizaste en cada tubo capilar

2.- Que precipitado resulto en cada capilar

3.- Que concentracin de antgeno hay en cada capilar antes de reaccionar

4.- Que concentracin de anticuerpo hay en cada capilar antes de reaccionar

5.- Que cantidad de antgeno hay libre en cada capilar despus de reaccionar

6.- Que cantidad de anticuerpo hay libre en cada capilar despus de reaccionar
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Prctica N 5
Nombre de la practica ... Inmunodifucin doble mtodo de Ouchterlony

Objetivo: Al termino de practica el alumno adquirir la habilidad de cuantificar la cantidad de anticuerpo presente en un producto biolgico problema con ayuda de un mtodo de inmunodifucin doble

Introduccin

El mtodo de Ouchterlony se basa en que el antgeno y el anticuerpo difunden atrevas de un medio semisolido y formen complejos inmunes estables los cuales pueden ser analizados visualmente para valorar la reaccin antigeno-anticuerpo que nos puede dar idea de la pureza del antgeno o del anticuerpo en forma muy gruesa, esta metodologa tambin nos puede ayudar para cuantificar la concentracin de antgeno o titular antisueros la desventaja de este mtodo es que tiene una baja sensibilidad

Material Porta objetos limpios y desengrasados Cajas de petri Aplicadores de madera Pipetas Matraz erlenmeyer Pipetas Pasteur Papel absorbente Solucin salina isotnica Timerosal al 1% Antgeno especifico Anticuerpo especifico Metodologa 1.- Preparar una solucin de agarosa al 0.1% en solucin salina isotnica disolverla por calentamiento reponer el volumen perdido con agua destilada caliente 2.- Sumergir los porta objetos en la solucin de agarosa caliente, escurrir y dejar secar ( barnizado de portaojbetos )

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Prctica N 5
3.- Preparar solucin de agarosa al 0.1 % en solucin salina isotnica y disolverla por calentamiento reponiendo el volumen perdido con agua destilada caliente ; adicionar timerosal hasta obtener una concentracin final de 0.1 %

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Prctica N 5
4.- Colocar los portaobjetos barnizados secos en un puente de tincin y con ayuda de una pipeta inundarlos con agarosa al 1% caliente 5.- Dejar gelificar los potaobjetos a temperatura ambiente hmedo hasta su uso y guardarlos en ambiente

6.- realizar perforaciones en el gel con ayuda de un capilar de acuerdo al siguiente esquema

O O O

Nota El agar residual de la perforaciones se elimina con ayuda de aplicadores 7.- Los posos realizados se llenan con un antgeno al centro y los anticuerpos a los lados 8.- En ambiente hmedo se colocan los portaobjetos sobre aplicadores de madera 9.- Incubar a temperatura ambiente de 24 - 48 horas y buscar bandas de precipitacin (observar las placas identificando las bandas de precipitacin de identidad total, identidad parcial o no identidad ) 10.- Anota tus resultados

Cuestionario: 1.- Que antgeno utilizaste 2.- Que anticuerpos utilizaste 3.- En que posos hubo identificacin de Ag-Ab 4.- Para que se utiliza el ambiente hmedo 5.- Por el antgeno debe de estar en el centro

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Prctica N 6
Nombre de la practica ........ Inmunodifucin radial

Objetivo Al termino de la practica el alumno cuantificara la cantidad de antgeno o que tenga en un producto biolgico con ayuda de la inmunodifucin radial

Introduccin Este mtodo es de gran ayuda para la cuantificacin de antgenos los cuales conforme van difundiendo va diluyndose hasta que adquiere una concentracin proporcional al anticuerpo generando un halo de precipitacin cuyo dimetro es directamente proporcional ala concentracin de antgeno. El anticuerpo cuando se encuentra en su concentracin inicial es muy alta lo cual favorece la formacin de complejos solubles. para que esta determinacin sea confiable se necesita tener muestras estandarizadas de antgeno lo cual funciona como patrn de referencia . Este mtodo se basa en la difusin del antgeno y el anticuerpo a a travs de un medio semisolido generando complejos inmunes estables los cules pueden ser valorados visualmente identificando el sistema Ag-Ab as como la posible relacin inmunologica entre dos antgenos as como para realizar estimaciones a grandes rasgos de la pureza de un anticuerpo o un antgeno aunque tambin es de gran ayuda la determinacin para semicuantificar la cantidad de anticuerpo presente de un producto biolgico o el titulo precipitante de un antisuero la desventaja de este mtodo radica en su baja sensibilidad. Material Portaobjetos Cajas de petri Pipeta serolgica Pipeta Pasteur Matraz erlenmeyer Papel absorbente Regla graduada en milmetros Agarosa Solucin salina isotnica Timerozal al 1% Antisueros Solucin de antgenos a diferentes concentraciones Metodologa 1.- Barnizar portaobjetos 2.- Preparar solucin de agarosa al 1% con solucin salina y disolver la agarosa por calentamiento reemplazando el volumen con agua destilada caliente . dejar enfriar la
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Prctica N 6
agarosa hasta una temperatura de 45c y adicionar 1-5% ( v/v ) del antisuero, mezclar perfectamente y adicionarle timerosal hasta una concentracin final de 0.1%. 3.- colocar los portaobjetos barnizados sobre un puente de tincin y con ayuda de un pipeta inundarlos con la mezcla antisuero-agarosa dejar gelificar a temperatura ambiente y guardarlos en ambiente hmedo hasta su uso. 4.- sobre una lnea horizontal realizar perforaciones de 3 mm de dimetro separadas 0.5 cm

5.- Llenar cuatro posos con un volumen determinado de las soluciones de antgeno y un poso con la solucin problema del antgeno 6.- Incubar las placas en cmara hmeda a temperatura ambiente durante 24-48 hrs.

Anotar los resultados midiendo los dimetros de inhibicin y realizar una grfica donde se colocara concentracin de antgeno contra el cuadrado del dimetro de inhibicin. interpolar el valor de la solucin problema para conocer su concentracin. Cuestionario 1.- Que Diluciones realizaste del antgeno

2.- Que dimetro de inhibicin obtuviste

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Prctica N 7
Nombre de la practica Determinacin de Grupos sanguneos

Objetivo:

Al termino de la practica el alumno ser capaz de identificar las determinantes antigenicas mas frecuentes en la superficie de los eritrocitos.

Introduccin

En la membrana de los eritrocitos se encuentran estructuras qumicas con propiedades especificas las cuales se pueden detectar con un anticuerpo homlogo donde se implica la aglutinacin del eritrocito de ah que al anticuerpo se le denomina Hemaglutinina y al antgeno Hemaglutnogeno. Se dice que son isoaglutingenos ( Ag) e isoaglutininas (Ag ) que diferencian los glbulos rojos de individuos de los de otros de la misma especie . Tomando como base las caractersticas genticas, morfolgicas y qumicas de los glbulos rojos se observa un polimorfismo que depende de las caractersticas inmunohematolgicas adems de que presentan caractersticas importantes como ser detectados por su actividad especifica con el Ab correspondiente que producen aglutininas o lisis, se transmiten por herencia segn las leyes de Mendel aparecen en ciertas etapas de la vida fetal y estn plenamente formados al nacer persistiendo durante toda la vida de ah que se puedan clasificar en un gran numero de grupos o sistemas sanguneos bien definidos dentro de los cuales se pueden mencionar los siguientes sistemas.

1.- ABO 2.- Rh 3.- MNS 4.- Lewis 5.- Luteran 6.- Duffy 7.- Kidd 8.- Diego 9.- Y 10.- Xg Etc. Los que se determinan en forma rutinaria en la mayora de los laboratorios son el ABO y el Rh.

Sistema ABO

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Prctica N 7
Es el que se descubri en primer lugar por Landstainer y se caracteriza por que es el nico que en el plasma y en el suero contiene siempre aglutininas que reaccionan con factores sanguneos presentes en glbulos rojos de otras personas. Las isoaglutinas que contiene se dice que son del tipo completo (IgM) de ah sean altamente aglutinantes y buenos fijadores del complemento razn por la cual la determinacin de los grupos sanguneo sea de gran importancia en las transfusiones sanguneas . En la superficie de los glbulos rojos es posible encontrar uno dos o ningn de los dos antgeno ( A y B ) tomando como base lo anterior se puede decir el sistema ABO se pueden clasificar de la siguiente manera: G. Sanguneo O A B AB Isoaglutinogeno Ninguno A B AyB Isoaglutininas en suero Anti-A Anti-B Anti-B Anti-A Ninguno

Sistema Rh Se descubri como resultado del experimento con animales ( Landsteiner) tomando como base a levine y Stetson que reportaron el caso de una mujer con severa reaccin hemoltica despus de una transfusin con sangre de su esposo. Tomando en cuenta la suposicin de que en los eritrocitos de monos Macacus rhesus podan existir antgenos similares a los de los humanos se inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de Macacus rhesus y el que se obtena aglutinaba los eritrocitos del mono y del 85% de la poblacin blanca aunque otras investigaciones demostraron que estos antgenos eran diferentes pero se determino que la mayora de los eritrocitos humanos tienen el antgeno del mono rhesus y otro diferente pero que se relaciona de ah que se conserv la denominacin del Rh para el antgeno humano y asign el nombre de LW al antgeno comn del hombre y del mono esta denominacin esta echa por Levine. Una vez que se descubri el sistema Rh se sigui realizando investigaciones resultando dos clasificaciones para este sistema una la propone Weiner y la otra Fhiser-Race . Weiner Rho rh rh hr hr Fisher-Race D C E c e Rh positivo Siempre Con frecuencia con frecuencia con frecuencia con frecuencia Rh negativo Nunca rara vez rara vez casi siempre casi siempre

Segn Fisher-Race se haban identificado cinco como pertenecientes al sistema Rh estos son C, c, D, E ,e . Estos se combinan entre si para dar lugar a diferentes patrones antignicos donde el D tiene dominancia antignica de ah que los individuos que presenta
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Prctica N 7
el antgeno D se dice que son Rh positivo mientras que los que no lo tiene se les denomina Rh negativo tomando como base lo anterior se pueden clasificar de la siguiente manera. Factores Rh Rho ( D ) rh ( C ) rh ( E ) ----+ ---+ -+ + + --+ + -+ -+ + + + -- Ausente + Presente Material Centrifuga Torundas Pipetas Pasteur Portaobjetos Jeringa Tubos de ensaye Aplicadores Suero anti-A Suero anti- B Suero anti- AB Suero anti-D Suero de Coombs Albmina bovina al 22% Glbulos rojos Humanos A. B y O al 5% Solucin salina isotnica Tipo Rh W F-R rh cde rh Cde rh cdE rh,rho rhy CdE Rho cDe Rh1 CDe Rh2 cDE Rh1,Rh2 CDE Rhz

Designacin Rh neg. Rh neg. Rh neg Rh neg. Rh pos. Rh pos. Rh pos Rh pos.

Metodologa

1.- Tomar una muestra de sangre aproximadamente tres mililitros y dejar coagular a temperatura ambiente. 2.- Centrifugar para separar el suero del paquete 3.- Rotular una placa de la siguiente manera

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Prctica N 7
Anti-A Anti-B Anti-AB Autotestigo

4.- Con ayuda de una pipeta Pasteur Tomar eritricitos del fondo del tubo y colocarlos en cada una de las marcas . 5.- A un lado de cada gota de eritrocitos colocar una gota de antgeno comercial segn corresponda a la marca y en la marca de autotestigo colocar una gota de albmina al 22%. 6.- Mezcla las gotas con ayuda de un aplicador para cada marca y posteriormente con movimientos circulares. 7.- Buscar la presencia de aglutinacin en 25 segundos e interpretar el resultado Nota.- La presencia de aglutinacin en la marca como autotestigo nos ndica la presencia de autoanticuerpos anti-eritrocito y se debe de reporta Bsqueda de Isoaglutininas 1.- Rotular una placa de la siguiente manera

2.- Agregar una gota de eritricitos previamente identificados como A, B y O en la marca correspondiente 3.- Adicionar una gota de suero problema 4.- Mezclar ambas gotas con ayuda de un aplicados y posteriormente con movimientos circulares.

5.- Buscar la presencia de aglutinacin e interpretar el resultado de acuerdo al siguiente esquema.

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Prctica N 7
Reaccin de eritrocitos con suero comercial Anti-A Anti-B Anti-AB + -+ -+ + + + + ---Sistema Rh Metodologa 1.- Colocar una gota de glbulos rojos en dos tubos de ensaye 2.- A un tubo adicionarle una gota de suero anti-D y agitar suavemente 3.- A otro tubo adicionarle una gota de albmina bovina al 22% y agitar suavemente 4.- Centrifugar ambos tubos 60 seg. a 1000 r.p.m. 5.- Buscar la presencia de aglutinacin en primer lugar en el tubo que contiene albmina al 22% y los glbulos rojos posteriormente en el tubo que contiene el suero comercia anti-D si solamente se presenta aglutinacin en este tubo se reporta con Rh positivo. 6.- Si no hay aglutinacin en ningn tubo se incuban los tubos a 37 C durante 30 min. y posteriormente lavar los eriotrocitos con solucin salina ( hasta que el sobrenadante quede transparente no mas de tres lavados) 3400 r.p.m. durante 2 min. 7.-Desechar el sobrenadante y agregarle una gota de suero de Coombs 8.- Resuspender el paquete suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 60 seg. ambos tubos 9.- Buscar la presencia de aglutinacin si el tubo problema presenta aglutinacin se dice que el individuo es de grupo Du Rh Positivo Si no hay aglutinacin se dice que el individuo es Rh negativo. Pero si hay aglutinacin en el tubo autotestigo se dice que puede ser debido a una respuesta autoinmune y para fines de transfusin el individuo se clasifica como Du y se considera Donador Rh positivo y receptor Rh negativo. Cuestionario 1.- Define lo que es una hemaglutinina 2.- Define lo que es un hemaglutingeno 3.- Que es una isoaglutinina 4.- Que es un isoaglutingeno 5.- Que son las heteroaglutininas 6.- Plasma tu conclusin de la practica. Reaccin del suero con antgenos conocidos A B O -+ + ----+ + -Grupo sanguneo A B AB O

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Prctica N 8
Nombre de la practica Prueba de Coombs Objetivo Al termino de la practica el alumno ser capas de realizar reacciones de antiglobulinas que son de gran importancia en inmunologa. Introduccin En algunas ocasiones, los anticuerpos se encuentran unidos a los antgenos correspondientes presentes en la membrana de los eritrocitos los cuales no reaccionan con una aglutinacin visible para coombs diseo un mtodo el cual donde reaccionan las antiglobulinas tomando en cuenta dos aplicaciones para detectarlas. 1.- Los isohematoanticuerpos humanos son globulina del tipo gama 2.- Cuando se adiciona un anticuerpo antiglobulnico a eritrocitos revestidos de un isoanticuerpo resulta en la aglutinacin de los Gr. revestidos.

La determinacin de las globulinas ocurre en dos fases.

1.- Los anticuerpos IgG se unen o revisten a los eritrocitos 2.- Se adiciona un reactivo antiglobulnico se manifiesta por la aglutinacin de los eritrocitos revestidos con globulina. El suero de Coombs se obtiene inmunizando conejos con globulina humana y es de gran ayuda en casos de histocompatiblidad en el sistema Rh entre la madre y su producto , puede haber isonmunzacin con la produccin de anti-D de la clase IgG estos anticuerpos pueden atravesar placenta y unirse a los eritrocitos del producto ocasionando enfermedad la cual se denomina eritriblastosis fetal, <enfermedad hemoltica del recin nacido y kerniteros aunque tambin se pueden utilizar en casos de anemia hemoltica autoimune o incompatibilidad por otros sistemas de grupos sanguneos. Cuando los anticuerpos anti-D no reaccionan se recurre a la prueba de coombs que puede ser de dos manera directa o indirecta.

Prueba de coombs directa Sirva para demostrar el revestimiento in vivo de los eritrocitos se aplica cuando los eritrocitario estn recubiertos con anticuerpos no aglutinantes en la enfermedad hemoltica del recin nacido, en la anemia hemoltica autoinmune o en la investigacin de reacciones de reacciones consecutivas a transfusiones de sangres incompatibles.

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Prctica N 8
Prueba de coombs indirecta Sirva para que los anticuerpos IgG reaccionen in vitro con eritrocitos que contengan el aglutinogeno correspondiente que despus de el tratamiento adecuado se le adiciona suero antiglobulnico y espera la respuesta. La determinacin de la prueba de coombs indirecta es de gran ayuda para. 1.- Identificar la presencia de Ab no aglutinantes en suero de personas sensibilizados a uno mas antgenos sanguneos. 2.- Estudiar el suero de mujeres con isoinmunizacion materno-fetal 3.-Pruebas de compatibilidad sangunea.

Material Centrifuga Bao Mara Glbulos rojos problema al 2% Glbulos rojos normales al 2% Glbulos rojos al 5% Solucin salina isotnica Suero de coombs Suero problema Suero anti-D diluido a titulo sub aglutinante Tubos de ensaye

Metodologa Prueba directa 1.- En un tubo de ensaye adicionar dos gotas de suspensin al 2% de eritrocitos problema 2.- Aadir dos gotas de suero coombs 3.- a otro tubo adicionarle dos gotas de globulos rojos normales y dos gotas de suero de coombs ( testigo negativo) 4.- Centrifugar los tubos a 1000 r.p.m. durante 60 seg. 5.- Desprender el botn y buscar la presencia de aglutinacin en el problema y no aglutinacin en testigo.

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Prctica N 8
Prueba indirecta 1.- Etiquetar tres tubos problema, testigo negativo, testigo positivo . 2.- Al tubo problema adicionarle dos gotas de suero problema y dos gotas de eritrocitos al 5% ORh positivo. 3.- Al tubo T.negativo adicionarle dos gotas de solucin salina y dos gotas de eritrocitos ORh positivo al 5% 4.- Al tubo T.positivo adicinarle dos gotas de suero anti-D eritrocitos ORh positivo al 5% 5.- Centrifugar los tubos a 1000 r.p.m./60 seg. 6.- Desprender los eritrocitos y buscar la presencia de aglutinacin en el problema si esta es negativa resuspender e incubar en bao a 37 durante 20 minutos 7.- Lavar los eritrocitos con solucin salina y resuspender en sol salina remanente. 8.- Agregar dos gotas de suero d coombs. 9.- Mezclar y centrifugar 1000 r.p.m./60 seg. 10.- Desprender el botn suavemente y buscar la presencia de aglutinacin . Cuando los Glbulos rojos con suero problema aglutinan en la primer ocasin indican la presencia de anticuerpos aglutinantes. Cuando aglutinan los Gr. con suero problema y suero de coombs nos indica la presencia de anticuerpos no aglutinantes en el suero problema. El testigo negativo no debe de aglutina. La aglutinacin del testigo positivo no indica que el suero de coombs esta funcionado. diluido y dos gotas de

Cuestionario:

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Prctica N 10
Nombre de la practica Pruebas de compatibilidad

Objetivo Al termino de la practica el alumno sabr determinar los anticuerpos incompletos que se encuentren dirigidos contra antgenos de sistemas menores Introduccin

Antes de realizar una transfusin sangunea entre individuos compatibles en el sistema ABO y Rh es necesario realizar pruebas de compatibilidad sangunea ( prueba cruzada) la cual se lleva acabo con eritrocitos del donador y suero del receptor ( prueba mayor ) y con eritrocitos del receptor y suero del donador ( prueba menor ) . esta determinacin tiene como fin poner de manifiesto la existencia de anticuerpos dirigidos contra antgenos de sistemas menores o secundarios las cuales deben de realizarse en condiciones diferentes las cuales favorezcan la reaccin Ag-Ab y la formacin de aglutinacin celular. En forma rutinaria las reacciones se realizan en solucin salina al 0.85 % donde solo aglutinan principalmente los anticuerpos de la clase IgM Cuando se utiliza albmina bovina facilita la deteccin de anticuerpos[pos de la clase IgG ya que este anticuerpo se ve impedidos frecuentemente por el potencial z ( fuerza repulsiva entre eritrocitos por cargas elctricas negativas sobre la membrana ) . Cuando se utiliza la anti-inmunoglobulina de coombs sirve para poner de manifiesto anticuerpos que no tienen actividad aglutinante, unidos a la membrana del eritrocito. Cuando se utiliza enzimas como papaina, ficina, o la bromelina nos ayudan a potenciar la actividad de algunos anticuerpos, como los dirigidos contra el sistema Rh, Lewis, kidd, vel e i . tambin modifica y destruye los antgeno tales como : Mns, Duffy, por, Xga, Yta, Csa, Cha, esta propiedad se utiliza para identificar los correspondientes anticuerpos. Antes de realizar una prueba cruzada es necesario conocer los datos clnicos del donador y receptor para poder elegir los anlisis adecuados pero si no se conocen estos datos es necesario realizar los siguientes estudios. --Paciente que nunca ha sido transfundido o que no haya tenido embarazos. esto es con el fin de que pueden existir anticuerpos contra antgenos de los sistemas menores adquiridos en forma natural Prueba salina rpida Albmina rpida Ficina o papaina rpida

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Prctica N 10
--Paciente politransfundido, que haya tenido varios embarazos o que no se desconozcan sus antecedentes . adems de los anticuerpos contra antgenos menores y los adquiridos en forma natural pueden existir otros inducidos por transfusiones previas por el producto hacia la madre por medio de eritrocitos. Salina rpida Albmina rpida Ficina o papaina rpida Salina a 37 / coombs Albmina a 37/ coombs Ficina o papaina a 37/ coombs

Material Centrifuga Jeringas Tubos de ensayo Pipeta Pasteur Albmina bovina al 25 % Solucin salina al 0.85% Ficina ( 1mg/ml) o papaina ( 10 mg/ml)

Metodologa

1.- Tomar una muestra sangunea de 5 ml y colocar 0.2 ml en un tubo de ensayo que contenga 5 ml de solucin salina (gr. al 5%) el resto de sangre depositarla en un tubo de ensayo sin anticoagulante para obtener suero 2.- Realizar el mismo proceso con el receptor

Prueba salina rpida a.- marcar un tubo de ensayo como PM (prueba mayor ) y adiciona dos gotas de gr. del donador y dos gotas de suero del receptor.

b.- A otro tubo de ensayo marcarlo como PM (prueba menor ) y colocarle dos gotas de gr. del receptor y dos gotas de suero del donador c.- Centrifugar los dos tubos a 1000 r.p.m. durante 60 seg.
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Prctica N 10

d.- Observar el sobrenadante de ambos tubos para la bsqueda de hemolisis. resuspender suavemente el botn eritrocitario en busca de aglutinacin Albmina

E.- En caso de no observar aglutinacin en los dos tubos de la solucin salina rpida agregar a ambos tubos solucin de albmina al 25% F.- Incubar a 37 durante 15 min. G.- Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 60 seg. H.- Resuspender el paquete eritrocitario para la bsqueda de aglutinacin.

Prueba indirecta de coombs

I.- Si no ha observado aglutinacin en los tubos lavar los eritrocitos con solucin salina a 3400 r.p.m. durante 2 min. cuantas veces sea necesario J.- Despus del ultimo lavado eliminar el sobrenadante y adicionar al paquete dos gotas de suero de coombs y mezclar K.- Centrifugar los tubos a 1000 r.p.m. durante 60 seg. L.- Buscar la presencia de aglutinacin Prueba con ficina, papaina o bromelina Esta determinacin es de gran utilidad para potenciar la actividad de algunos anticuerpos como los dirigidos contra el sistema Rh, Lewis, i, kidd, vel pero tambin modifican o destruyen antgenos tales como Mns, Duffy, Xga, lo cual es de gran utilidad para la identificacin de los anticuerpos correspondientes. el inconveniente de esta determinacin es que las enzimas pueden actuar contra los anticuerpos y otras enzimas del suero. Preparar ficina Disolver 1 g. de ficina y disolverla en 100 ml de solucin salina de fosfatos a Ph 7.3 ( guardarla en refrigeracin a menos 20 c y para su uso diluirla 1:10 con regulador de fosfatos 0.1 m Ph 7.3 Preparacin de papaina Disolver 0.5 g. de papaina en 190 ml de amortiguador de fosfatos Ph 5.5 y agregar 10 ml de L-cisteina al 0.6 % en agua destilada incubar a 37 c durante una hora y centrifugar recuperar el sobrenadante y almacenar a -20c
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Prctica N 10

Preparacin de Gr. Lavar Gr. en solucin salina y el paquete celular con un volumen igual de papaina o ficina mezclar e incubar a 37c durante 15 min. .lavar los gr. con solucin salina y ajustar a una concentracin al 2%

Metodologa 1.- En un tubo de ensayo colocar dos gotas de suero 2.- Agregar dos gotas de gr. al 2% de gr. tratados 3.- Incubar a 37c durante 30 min. 4.- Centrifugar a 100 r.p.m. durante 60 seg. y resuspender suavemente par la bsqueda de aglutinacin Otra forma de determinar las pruebas cruzadas 1.- Tomar una muestra de 5 ml de sangre sin anticoagulante del donador y colocar 0.1 ml de esta sangre en un tubo que contenga 5 ml de solucin salina el resto de la sangre se deposita en un tubo de ensayo para que se coagule 2.- repetir lo mismo con el receptor 3.- en una serie de 12 tubos se etiquetan como se indica en el cuadro A 1 --1 --1 --1 -B -1 --1 --1 --1 -C -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 D 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 E ---2 2 2 ------F ------1 1 1 ---G ---------1 1 1

PM pm Auto PM pm Auto PM pm Auto PM pm Auto

A.- Gr. al 2% de donador B.- Suero del donador D.- Suero del receptor E.- Albmina al 25% Nota.- los nmeros de los cuadros indican gotas

C.- Gr. al 2% del receptor F.- Papaina G.- Ficina

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Prctica N 10

4.- Mezclar todos los tubos y centrifugar 60 seg. a 2500 r.p.m. 5.- Buscar la presencia de aglutinacin en los tubos 6.- Si no se presenta aglutinacin en ningn tubo incubar a 37c durante 30 min. 7.- Centrifugar los tubos a 2500 r.p.m. durante 5 min. y descartar el sobrenadante 8.- Lavar el paquete celular de cada tubo con solucin salina ( 2500 R.P.M. durante 5 min. ) dos veces 9.- Agregar una gota de suero de coombs al paquete celular de cada tubo 10.- Homogeneizar y buscar la presencia de aglutinacin

Para saber si la determinacin esta bien realizada es necesario introducir un testigo positivo y un negativo Testigo positivo 1.- Adicionarle dos gotas de anti-D diluido 1:32 y dos gotas de gr. al 2% de un individuo o Rh positivo 2.- Incubar a 37c durante 30 min. 3.- Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 min. 4.- Lavar los gr. con solucin salina 5.- Adicionar una gota de suero de coombs y buscar la presencia de aglutinacin Testigo negativo 1.- A un tubo adicionarle dos gotas de anti-D diluido 1:32 y dos gotas de gr. al 2% de un individuo o Rh negativo 2.- Incubar a 37c durante 30 min. 3.- Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 min. 4.- Lavar los gr. con solucin salina 5.- Adicionar una gota de suero de coombs y buscar la presencia de aglutinacin Nota Cualquier indicio de aglutinacin en un tubo es incompatibilidad entre el posible donador y el receptor
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indicativo de que hay

Prctica N 10

Nombre de la practica.. Reacciones Febriles Objetivo Al termino de la practica el alumno adquirir la habilidad para determinar los anticuerpos presentes en un individuo que ha padecido un infeccin bacteriana por microorganismos pirogenicos Introduccin Cuando un paciente presenta un cuadro febril en primer termino se sospecha de un agente pirogenico dentro de los cuales se pueden encontrar las Salmonellas , Brucellas , Rickettsias y otros agentes pirogenicos los de importancia clnica son los menciondos estos microorgansmos cuando penetran al arganismo desencadenan una respuesta inmunologica la cual es mediada por anticuerpos los cuales se pueden cuantificar dependiendo de fecha en la cual se haya estado en contacto con el agente etiologico. Pero tomando como base lo anterior tambien es importante que el mdico mande el estudio en el momento en el cual se puede detectar ls niveles mas altos de anticuerpos . Cuando se quiere detectar anticuerpos por salmonellas s decie que se practica la reaccin de Widal para demostrar la presencia de agltininas esta reacin inicialmente se diseo para detectar Salmonella typhi pero posteriormente se pudo demostrar que otras especies de salmonela producian fiebre tifoidea de ahi que para poder identifcar las aglutininas del flagelo (H) o del soma (O) se requiere de tomar en cuenta las Salmonellas las cuales se clasifican en cinco grupos A, B, C, D, y E. Donde en cada grupo se puede encontrar: A S. paratyphi A S. typhimurium S.paratyphi B S. derby S. san diego S. paratyphi C S. cholerasuis S. newport S. montevideo S. typhi S. enteritidis S. dublin S. gallinarum S. pullorum S. anatum S. meleagridis S. give S. newington S. illinois S. senftenberg

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Prctica N 10

Cuando se requiere diagnosticar los titulos de salmonella se debe de tomar en cuenta que estos se elevan al final de la cuarta semana de la infeccin. Otro microorganismo que puede producir elevacin de temperatura son la Brucella las especies que los hacen son B abortus , B. suis . B. mellitensis las cules responden de la misma manera cuando se requiere demostrar las aglutininas su diagnostico es relativamente sencillo cuando se encuentra en la fase aguda ( apartir de la segunda semana de la enfermedad alcanzando su maximo en la tercer y sexta semana si reporta un titulo 1:320 es indicativo) de la enfermedad pero cuando se hace cronica se dificulta su diagnostico. La fiebre producida por Rickettsias se diagnostica por la reaccin de Weil-Felix quienes aislaron una cepa de Proteus de una muestra de orina en un paciente con tifus ademas de que en el paciente tambioen se encontraron aglutininas contra este mismo Proteus al cual se le denomino OX-19 posteriormente se aislaron otras cepas de proteus las cuales se les denomino OX-2 y OX-K que son los mas utilizados para el diagnostico de enfermedades producidas por Rickettsias esto se hace debido a que es muy dificil y peligrosos el cultivo de Rickettsias para el personal de laboratorio tomando como base lo anterior se puede clasificar las reacciones serolgicas de las enfermedades producidas por rickettsias:

Especie R.prowasekii R. mooseri R. reckettsi R. conori R.siberica R. austarlis R. akari R. tsutsugamushi R. quintana R. burnet

Reaccin deWeil-Felix Enfermedad OX-19 OX-2 OX-K Tifus epidmico +++ + 0 Tifus murino +++ + 0 Fiebre maculatosa de +++ + 0 la montaa Fiebre mediterranea + +++ 0 Tifus siberiano + +++ 0 Tifus de Queensland + +++ 0 Viruela rickettsial 0 0 0 Fiebre fluvial 0 0 +++ Japonesa Fiebre de Tricheras 0 0 0 Fiebre Q 0 0 0

Material

Placas de vidrio para reacciones febriles Aplicadores Pipetas de 0.1 ml Antgenos de Salmonella typhi O Salmonella typhi H
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Prctica N 10
Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Brucella abortus Proteus ox-19 Metodologa Cualitativo 1.- Tomar tres ml de sangre sin anticoagulante 2.- Dejar que se coagule y extraer el suero 3.- Marcar la placa de vidrio de la siguiente manera

S.typhi O

S. typhi H

S.paratyphi A

S.paratyphi B

B.abortus

Proteus OX-19

4.- En cada marca colocar 0.4 ml de suero 5.- Al lado del suero colocar una gota de cada uno de los antgenos 1.- Salmonella typhi O 2.- Salmonella typhi H 3.- Salmonella paratyphi a 4.- Salmonella paratyphi b 5.- Brucella abortus 6.- Proteus ox-19 6.- Mezclar las dos gotas con ayuda de un aplicador 7.- Oscilar la placa durante dos minutos 8.- Buscar la presencia de aglutinacin en la placa 9.- Si hay aglutinacin en alguna de las marcas realizar una determinacin cuantitativa por cada marca que resulte positiva

Mtodo cuantitativo

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Prctica N 10

1.- Marcar una placa de la siguiente manera 1 2 3

2.- A cada marca agregar el siguiente volumen 1.- 0.08 ml(dil 1:20) 2.- 0.04 ml(dil 1:40) 3.- 0.02 ml(dil 1:80) 4.- 0.01 ml (dil 1:160) 5.- 0.005 ml (dil 1:320) 6.- 0.0025 ml (dil 1:640)

3.- A cada marca agregar una gota de antgeno que corresponda este va a ser el que resulto positivo 4.- Mezclar el antgeno y el suero con ayuda de un aplicador 5.- Con movimientos circulares homogeneizar la mezcla Ag-Ab 6.- Al cabo de dos minutos observar la presencia de aglutinacin 7.- el titulo se reporta como la reciproca de la dilucin mas alta donde todava se observa aglutinacin

Cuestionario 1.- De que depende la determinacin de una enfermedad febril 2.- Cuantas salmonellas puedes identificar serologicamente 3.- Cuantas Brucellas puedes identificar serologicamente 4.- Como identificas las enfermedades producida por rickettsias

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Prctica N 11
Nombre de la practica...... .Inhibicin de la Hemaglutinacin

Objetivo Al termino de la practica el alumno adquirir la habilidad para determinar la presencia de gonadotropina corinica humana con ayuda de diferentes metodologias

Material Orina o suero con GCH en altas concentraciones Centrifuga Tubos de ensayo Anti GCH Glbulos rojos recubiertos con GCH Ltex recubierto con anti-GCH

Metodologa Inhibicin de la hemaglutinacin Fundamento La reaccin se basa en la inhibicin de la hemaglutinacin basndose en que los gr. se ha revestido con GCH y al adicionar anticuerpos contra GCH se lleva acabo un reaccin de aglutinacin formando un anillo difuso pero si a esta reaccin se le adiciona una GCH libre (orina) bloquea los anticuerpos y evita la reaccin con los gr. lo cual trae como consecuencia sedimentaron de gr. y formacin de un anillo caracterstico 1.- Centrifugar 5 ml de muestra (orina) 2.- Abrir un tubo que contenga Gr. recubiertos de GCH y anti GCH 3.- Por cada problema adicionar 400 microlitros agua destilada 4.- Adicionar 100 microlitros de muestra 5.- Agitar suavemente el tubo para mezclar el contenido del tubo 6.- Depositar el tubo el lugar donde se encuentre libre de vibraciones y del calor de tal forma que se puede observar de abajo hacia arriba 7.- Dejar reposar durante dos horas y observar la reaccin

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Prctica N 12
Nombre de la practica Fundamento La reaccin se basa en una aglutinacin directa con partculas de ltex las cuales estn recubiertas de anti-GCH para cuando se pone en contacto con la muestra problema y esta presente la GCH en cantidades detectables reaccionan para formar un agregado Ag-Ab lo cual se demuestra por medio de una aglutinacin visible Aglutinacin en partculas de ltex

Metodologa 1.- Coloca un portaobjetos limpio y desengrasado sobre una superficie horizontal 2.-Homogenizar el reactivo que contenga las partculas de ltex y transferir al portaobjetos 25 microlitros de este 3.-Adicionar 50 microlitos de la muestra problema a un lado de el reactivo de ltex 4.-Con ayuda de un aplicador homogeneizar ambas soluciones 5.-Con movimientos circulares mezclar ambas soluciones 6.-Al cabo de dos minutos observar la reaccin

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Prctica N 13
Nombre de la practica.... Factor Reumatoide Objetivo Al termino de la practica el alumno tendr la habilidad de identificar la presencia de anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulina en procesos inflamatorios

Introduccin En el suero de personas con ciertos padecimientos inflamatorios como puede ser artritis y fiebre reumtica aparecen anticuerpos dirigidos contra las inmunoglobulinas del individuo a estos anticuerpos se les denomina Factor Reumatoide. la especificidad de esta reaccin es variable y se puede ver tres formas caractersticas a.- Reaccin de inmunoglubulinas extraas de conejo o de caballo b.- Reaccin de inmunoglubulinas humanas desnaturalizada c.- Inmunoglobulinas autologas El factor reumatiode por lo general es un anticuerpo de la clase IgM que puede reaccionar con uno o mas antgenos especficos La produccin del factor Reumatoide es resultado de respuesta del individuo hacia uno o mas determinantes antignicos especficos presentes en sus propias gamaglobulinas. el factor Reumatoide reacciona con complejos Ag-Ab, en casi todos los casos el factor Reumatoide forma complejos solubles con IgG in vivo los cuales pueden ser eliminados de la circulacin sin causar ninguna alteracin por el sistema retculo endotelial. en raros casos el complejo factor reumatoide-inmunoglobulinas son solubles a temperatura corporal, pero en fro se pueden precipitar en el suero por el fro ( crioglobulinas ) los individuos que presentan crioglubulinas son mas predispuestos a sufrir lesiones secundarias . los niveles sericos de FR guardan relacin con la aparicin de ndulos subcutneos. por lo general el factor Reumatoide esta constituido por inmunoglobulinas con especificidad par los fragmentos FC de la IgG la mayora de los mtodos de laboratorio detectan el Factor Reumatoide IgM 19s pero tambin hay reaccin en las inmunoglobulinas de la clase IgM , IgG 7s y de la IgA . el Factor Reumatoide esta presente en los siguientes padecimientos artritis, Lupus eritematoso, esclerosis, Mononuclosis infecciosa y algunos casos de poliomielitis la determinacin del factor Reumatoide no es muy especifica pero si es muy sensible lo cual puede dar positiva en los siguientes padecimientos hipergamaglubulinemia, hepatopatias, sfilis padecimientos infecciosos crnicos como son lepra y tuberculosis pero se hacen negativas cuando el individuo mejora. En investigaciones se a visto que un reducido numero de personas sanas dan positiva la prueba y personas enfermas con artritis dan negativa la prueba . el principio de la prueba se basa en la reaccin del ltex sensibilizado con gama globulina humana y el factor Reumatoide.

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Prctica N 13
La granulocidad del ltex puede confundir con una prueba positiva, sueros lipmicos pueden dar resultados falsos positivos. Material Ltex sensibilizado Solucin amortiguadora Aplicadores Placa de aglutinacin Tubos de ensayo Metodologa Cualitativa 1.- Tomar una muestra sangunea y dejar que se retraiga el coagulo separa el suero 2.- Preparar una dilucin 1:20 del suero problema con la solucin amortiguadora 3.- Marcar una placa de la siguiente manera

Testigo Positivo

Problema

Testigo Negativo

3.- Colocar 0.05 ml del dilucin del suero en la marca Prob. 4.- Colocar 0.05 ml de testigo positivo en la primer marca 5.- Colocar 0.5 ml de testigo negativo en la tercer marca 6.- Adicionar 1 gota de reactivo de ltex a cada uno de los controles y del problema 7.- Con ayuda de un aplicador mezclar las gotas y con homogeneizar movimientos circulares

8.- Al cabo de dos minutos ver la reaccin de los testigos y el problema (buscar presencia de aglutinacin )

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Prctica N 13
Cuantitativa

1.- Prepara una serie de Diluciones con factor de 2 partiendo del suero diluido hasta una dilucin final de 1:640 2.- Colocar 0.05 ml de cada dilucin en un laminilla 3.- Adicionar a cada dilucin 1 gota de partculas de ltex 4.- Con ayuda de un aplicador mezclar y homogeneizar con movimientos circulares 5.- Al cabo de dos minutos buscar la presencia de aglutinacin 6.- El titulo de factor Reumatoide se expresa como la reciproca de la dilucin mas alta donde se presente aglutinacin

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Prctica N 14
Nombre de la practica.... Protena C reactiva Objetivo Al termino de la practica el alumno adquirir la habilidad para identificar por medio de una reaccin la presencia de la protena c reactiva en el suero de un paciente con una infeccin bacterina de tipo agudo

Introduccin El nombre de protena C reactiva deriva de que en personas que padecan neumona lobular se extraa suero y el extracto era un carbohidrato que se le denomino c y al protena humana capas de precipitarlo se le denomino PC reactiva La protena c reactiva aparece en el plasma en individuas que padecen procesos patolgicos donde hay inflamacin o necrosis como sucede en la fase aguda de infecciones bacterianas de ah que la protena c reactiva se puede detectar de 18 a 24 hrs. despus del inicio de la enfermedad alcanzando un mximo durante la fase aguda disminuyendo cuando el paciente sana. Un elevado titula de protena c reactiva no es especifica de inflamacin ,ya que resulta positiva en todas la infecciones bacterianas y en algunos procesos neoplasicos as como en destruccin de tejidos como es el caso de infarto al mioacardio. esta determinacin es de gran ayuda con fines epidemiologicos ya que se puede monitorear la actividad con pacientes con fiebre reumtica y artritis Reumatoide. La velocidad de eritrosedimentacin se eleva con prueba positiva de PC aumentando primero la PC despus la VSE pero la PC retorna antes a la normalidad despus de la VSE. La PC es un glicoprotena que aparece en el suero con padecimientos antes mencionados. Esta determinacin se basa en el principio de que la PC presente en el suero del paciente sirve como anticuerpo y el ltex sensibilizados contra la glicoprotena que se encuentra en el suero producindose un aglutinacin si esta presente Material Ltex sensibilizado anti PC Amortiguador salino de glicina Suero control negativo Suero control positivo Aplicadores Placa de aglutinacin Centrifuga Tubos de ensayo

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Prctica N 14
Metodologa 1.- Tomar una muestra sangunea sin anticoagulante y esperar que se retraiga el coagulo 2.- Separar el suero 3.- Con el suero realizar una dilucin 1:20 con la solucin amortiguadora 4.- Poner 0.05 ml de la dilucin en la laminilla 5.- Colocar 0.05 ml de suero control positivo 6.- Colocar 0.05 ml de suero control negativo 7.- Agregar una gota de partculas de ltex sensibilizado a cada gota adicionada ( problema, positivo, negativo ) 8.- Con ayuda de un aplicador mezclar las gotas (utilizar aplicador diferente para cada mezcla) 9.- Con movimientos circulares homogeneizar la laminilla 10.-Esperar dos minutos y verificar los controles por medio de aglutinacin en el control positivo y no aglutinacin en el control negativo reportar el suero problema de acuerdo a su comportamiento con los controles

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Prctica N 15
Nombre de la practica.... Antiestreptolisinas Objetivo Al termino de la practica el alumno ser capas de demostrar en un suero problema la presencia de estreptolisinas Introduccin Las infecciones estreptococicas son frecuentes en nios en edad escolar de ah que sea posible detectar los anticuerpos en respectivos tal es el caso de la antiestrptolisina-O (ASO) esta es una hemolisina labil al oxgeno, pero es activa a eritrocitos humanos y a los de conejo. La estreptolisina es producida por la mayora de las cepas Lancefield de estreptococos del grupo A aunque algunas cepas del grupo C y G tambin la producen . La determinacin de los ttulos de antiestroptolisina se basa en hacer reaccionar el antgeno del estreptococo del grupo A con Diluciones del suero del paciente y glbulos rojos del tipo ORh positivo al 5% para valor la no hemilisis( que es donde se inactiva toda la estreptolisina). Los ttulos estreptolisina se elevan en pacientes que presentan infecciones estreptococicas no supurativa tal es el caso de Fiebre Reumtica y Glomerulonefritis aguda. Los estreptococos no solamente producen reaccin Ag-Ab por antiestreptolisinas sino que tambin producen otro tipo de enzimas tal es el caso de: 1.- Hialuronidas ( AH) 2.- Antiestreptocinasa 3.- Antidesoxirribonucleasa B (anti-DNAasa) 4.- Antidifosfopiridinanucleotidasa ( anti-DPNasa ) En los pacientes que se sospecha de una infeccin no supurante por estreptococo la determinacin de eleccin para detectarla es la ASO pero para descartar cualquier error se recomienda realizar dos o mas determinaciones de las enzimas que producen reaccin AgAb. Material Suero problema Tubos de ensaye Glbulos rojos o Rh positivo Solucin salina amortiguada cloruro de sodio fosfato cido de potasio fosfato cido disodico agua destilada Estreptolisina

7.40 g 3.70 g. 1.81 g. 1000.00 ml

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Prctica N 15
Metodologa 1.- Adicionar 10 ml de agua destilada al vial que contenga la estreptolicina liofilizada 2.- Por cada 5 ml de agua se utiliza un tubo capilar que contenga hidrosulfito de sodio 3.- Mezclar por inversin la estreptolisina reconstituida la cual al adicionarle el hidrosulfito se activa y se encuentra lista para su utilizacin 4.- Prepara una solucin al 5 % de glbulos rojos con solucin salina amortiguada ( antes de preparar la suspencin de Gr. se lavan con solucin salina) 5.- Prepara las siguientes Diluciones del suero problema con solucin salina amortiguada dilucin 1: 10 dilucin 1:100 dilucin 1:500 ...La dilucin 1:10 se puede preparar agregando una parte de suero y nueve partes de solucin salina amortiguada ...La dilucin 1:100 se prepara agregando una parte de la dilucin 1:10 mas nueve partes de la solucin salina amortiguada ...La dilucin 1:500 se prepara agrando dos partes de la dilucin 1:10 mas ocho partes de solucin salina amortiguada 6.- Rotular 14 tubos de ensayo de la siguiente manera Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 dilucin 1: 12 dilucin 1: 50 dilucin 1:100 dilucin 1:125 dilucin 1:166 dilucin 1:250 dilucin 1:333 Tubo 8 dilucin 1: 500 Tubo 9 dilucin 1: 625 Tubo 10 dilucin 1: 833 Tubo 11 dilucin 1:1250 Tubo 12 dilucin 1:2500 Tubo 13 testigo neg. Tubo 14 testigo pos.

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Prctica N 15
7.- seguir el siguiente protocolo

1:10 1:100 1:500 Testigos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A 0.8 0.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.3 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 B 0.2 0.8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.7 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1.0 Agitar los tubos C 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5 Agitar los tubos e incubar a 37 C durante quince minutos D 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
A.- Dilucin en mililitros B.- Solucin salina Amortiguada en mililitros C.- Volumen de estreptolisina en mililitros D.- Suspensin de globulos rojos en mililitros

8.- El titulo se reporta en unidades TODD que es la reciproca de la dilucin mas alta donde se neutraliza completamente la estreptolisina De ah que se toma como neutralizacin cuando no se presenta hemolisis en el tubo se comprueba con el tubo numero 13 del protocolo La hemolisis se comprueba con el tubo numero 14 del protocolo

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Prctica N 15
Bibliografia

1.- Manual de laboratorio de la Escuela Nacional de Ciencia Biolgicas ( I. P. N. ) Autores varios 1992 2.- Diagnostico Clnico por el Laboratorio Todd-Sanford Editorial Salvat Sexta edicin 1980 3.- Inmunologa Bsica y Clnica Daniel P. Stites Abba I.Terr Editorial el Manual Moderno Sptima edicin 1991 4.- Microbiologa e Inmunologa Warren E. Levinson Ernest Jawetz Editorial el Manual Moderno primera edicin 1992 5.-Manual de diagnostico Clnico y de Laboratorio Krupp, Tierney, Jawetz, Roe, Camargo Editorial el mnual Moderno Tercera edicin 1991

6.- Hematologa Clnica Byrd S. Leavell, Oscar A Thorup Editorial Interamericana Cuarta edicin 7.- Histologa Roland Leeson Thomas Editorial Interamericana Tercera edicin

8.- Hematologa Bsica A.V. Hoffbrand ,J.E. Pettit Editorial Limusa 9.- Fisiologa Medica William F. Ganong Editorial Manual Moderno 10.- Mtodos de laboratorio Lynch, Stanley, Lesli, Spore Editorial Inteamericana 11.- Inmunologa Rojas W. Editorial Manual Moderno

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