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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA
METODOS EN BIOTECNOLOGIA
CROMATOGRAFA DE GASES
8 de Junio de 2004
2
CONTENIDO
Antecedentes/Historia
Mecanismos de la cromatografa
Fundamentos tericos
Nomenclatura
Fase mvil
Puerto de inyeccin
Horno de la columna
Fase estacionaria
Soporte
Columna cromatogrfica
Detectores
1
2
2
5
6
6
7
8
9
10
15
Mtodos
Anlisis cualitativo
Mtodos de coincidencia
20
20
21
Aplicaciones
Comida, saborizantes y fragancias
Qumicos y petrleo
Ambientales
Mdicas y biolgicas
Industria
Otras aplicaciones
Aplicaciones prcticas
Cromatografa de gases como mtodo principal
31
31
34
35
35
37
38
38
40
Innovaciones
41
Pginas web
45
Bibliografa
45
Antecedentes/Historia
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a ser
separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra
se mueve en una direccin definida. Los componentes son separados por sus diferentes
tazas de migracin (IUPAC). La cromatografa puede ser clasificada por su utilidad y en
base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos. De acuerdo a su
utilidad la cromatografa se clasifica en: analtica, utilizada para determinar los qumicos
presentes en una mezcla y en que concentracin; y preparativa, utilizada para purificar
grandes cantidades de qumicos.
La primera tcnica cromatogrfica fue ideada por el botnico ruso Mikhail Tswett en 1906,
quien utiliz almina para separar los pigmentos coloreados de las hojas de las plantas.
Tswett en su experimento original, meti dentro de un tubo de vidrio un fino polvo
(sacarosa) para producir una columna de una altura deseada. Posteriormente, extrajo los
pigmentos de hojas y los coloc en un solvente (ter de petrleo) y agreg un poco de la
solucin dentro de la columna. Cuando toda la solucin haba pasado a travs de la
columna se form una estrecha zona inicial bajo la capa inicial del adsorbente. Despus
agreg ms solvente y aplic presin en la parte de arriba de la columna. Mientras el
solvente iba pasando a travs de la columna, los pigmentos se iban separando
individualmente (Fig. 1). La clave del xito de la columna de Tswett, fue la aplicacin de la
mezcla dentro de la columna en una zona inicial estrecha y la posterior aplicacin del
solvente fresco.
2
En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el anlisis de polienos. Los
primeros en utilizar un gas como fase mvil fueron A. T. James y A. J. Martin en 1952,
para separar cidos grasos cortos. Posteriormente Dabrio, en 1971, la utiliz para separar
metilaminas, aminas alifticas y homlogos de piridina.
Mecanismos de la cromatografa
El movimiento de las substancias durante la cromatografa es el resultado de dos fuerzas
oponibles, la fuerza de manejo de la fase mvil y la fuerza resistente o accin de retardo del
sorbente. La fuerza de manejo mueve las substancias del origen de la columna en direccin
del flujo de la fase mvil. La accin de retardo impide el movimiento de las substancias
arrastrndolas del flujo y adhirindolas al adsorbente. Las molculas se encuentran
alternando entre estar pegadas al adsorbente o despegadas en el flujo, esto da como
consecuencia que pese a que el flujo es constante, solo una fraccin de las molculas se
estn moviendo. Las substancias que se mueven ms lentamente es porque estn siendo
unidas ms fuertemente a la fase estacionaria, mientras que aquellas que se mueven ms
rpidamente es por que son menos solubles o de poca afinidad.
La habilidad de tener una migracin diferencial entre los componentes de la mezcla es el
resultado de la selectividad del sistema cromatogrfico. El flujo de la fase mvil no es
selectivo en el sentido de que no afecta el movimiento de los solutos. Como parte del
sistema cromatogrfico, sin embargo, la fase mvil debe ser un poco selectiva para ayudar a
la absorcin de los solutos con la fase estacionaria. La fase estacionaria tambin juega un
papel importante dentro del cromatograma debido a su accin resistiva como una fuerza
selectiva de la velocidad de flujo de los solutos.
Fundamentos tericos
Se han propuesto muchas teoras con complejos modelos matemticos para explicar el
comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas. Las ms estudiadas son:
La principal es la teora de las placas tericas (theoretical plates theory), la cual plantea
que una columna cromatogrfica est constituda por una serie de placas contenidas en la
fase estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa;
que el volumen de fase mvil entre placas es constante; que las dos fases estn en equilibrio
en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribucin es constante e independiente de
la concentracin del soluto. Desventaja: adems de que se basa en muchas suposiciones, la
principal desventaja es la falta de conexin entre la eficiencia de la columna y las
propiedades fisicoqumicas de la partcula.
En la teora para las columnas capilares se considera que la difusin aparente no contribuye
de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El
coeficiente relacionado con la difusin molecular tiene un valor de uno debido a que la
distancia que recorre la partcula es igual a la longitud de la columna. El trmino
relacionado con la transferencia de masas viene dado en funcin del dimetro de la
columna, pues en este tipo de columna es ms importante que el tamao de partcula de
relleno.
La ecuacin de esta teora es un caso particular de la ecuacin de la teora cintica, en este
caso se omite el trmino A pues su valor es despreciable; se relacionan las magnitudes que
caracterizan la geometra del soporte y el trmino C se presenta de manera distinta pues en
este tipo de columna es ms importante la fase mvil que el tamao de partcula.
Las respectivas integraciones de la ecuacin permiten obtener una que relaciona el valor de
la presin con la posicin de la columna, otra que indica la velocidad media, la
compresibilidad o factor de obstruccin
Coeficiente de reparto (K)
Propiedad termodinmica del sistema soluto-fase estacionaria-fase mvil independiente del
proceso cromatogrfico. Concentracin de soluto en la fase estacionaria frente a
concentracin de soluto en fase mvil a temperatura constante.
Factor de capacidad (k)
Depende de las propiedades termodinmicas del sistema (K) y adems es funcin de las
caractersticas de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una molcula
determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase mvil
Relacin frontal (Rf)
La relacin frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo fenmeno.
Representa la relacin entre las velocidades medias del soluto y la fase mvil en su
recorrido por la columna.
Tiempo muerto ( tm)
Es el tiempo de retencin de una sustancia insoluble en la fase estacionaria (K=0).
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Volumen de retencin (VR)
Es el volumen de fase mvil necesario para transportar el soluto de un extremo a otro de la
columna. Se denomina volumen de retencin neto al volumen verdadero y corregido, el
cual se obtiene a partir de la ecuacin que involucra adems la compresibilidad del gas
portador. El volumen de retencin especfico est delimitado por la temperatura.
Retencin relativa (rx:p)
Conservan las propiedades del coeficiente de reparto y son fciles de calcular, su manejo se
dificulta al momento de elegir un patrn adecuado. Se utiliza para disminuir el efecto de
errores, sobre todo, en el conocimiento del peso de la fase estacionaria en la columna.
Resolucin
Cada sustancia se desplaza a una velocidad caracterstica dada por el valor de su relacin
frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa terica. Por tratarse de un
mtodo donde se separa por elucin es mejor referirse a tiempo de elucin ms que a
distancias recorridas.
Eficacia
Una columna ser ms eficaz mientras mayor sea el nmero de placas tericas que tenga.
Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer condiciones
similares de trabajo.
Nomenclatura
Desde el primer cromatgrafo de Tswett hasta los cromatgrafos de ahora siguen utilizando
la misma nomenclatura para sus componentes:
Un tubo de metal o vidrio se llena con un slido activo (adsorbente) para formar una
columna cromatogrfica. La mezcla a separar es aplicada en una zona inicial y es lavada
con un solvente, lquido de lavado o revelador. La serie de resultados se denomina
cromatograma, y el lavado de la zona inicial para formar el cromatograma es la formacin
o desarrollo del mismo.
Cuando el agente a detectar se trata con un agente qumico para formar un color, se dice
que la cromatografa est siendo revelada. La combinacin del solvente, la mezcla y el
adsorbente son llamados sistema cromatogrfico. Cada sistema cromatogrfico est
compuesto por una fase mvil (solvente) y una fase estacionaria (la columna).
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Si los componentes de la mezcla son analizados cuantitativamente, recibe el nombre de
evaluacin o cuantificacin. Si el soluto es separado del adsorbente por lavado antes del
anlisis, entonces se le llama elucin y al agente a ser analizado se le llama eluyente, al
lquido que sale de la columna se le nombra efluente. Cuando la fase mvil es lquida, la
tcnica suele recibir un nombre relacionado con la forma en que se dispone la fase
estacionaria (columna, capa fina, papel, etc.). Existen tres formas de desarrollar este
proceso: elucin, anlisis frontal y desplazamiento. Cuando la fase mvil es un gas,
solamente se utilizan columnas y el proceso siempre se realiza por elucin.
La forma ms usual de hacer cromatografa de gases es utilizando un lquido como fase
estacionaria; recibe entonces el nombre de cromatografa gas-lquido (CGL). Tambin se
utilizan absorbentes, dando lugar a la cromatografa gas-slido (CGS), pero en mucho
menor proporcin.
La cromatografa de gases es una tcnica analtica que puede ser utilizada para separar
compuestos orgnicos basada en sus volatilidades. Tambin provee informacin cualitativa
y cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son
separados por sus diferencias de particin entre la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria
en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio.
Un cromatgrafo de gases consiste de:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Fase mvil.
Puerto de inyeccin.
Horno de la columna.
Columnas
Fase estacionaria.
Detector.
Sistema de registro de datos.
7
(mediante jeringas especiales). El inyector se trata de una cmara situada a la entrada de la
columna y calentada independientemente de sta (a temperatura superior del punto de
ebullicin del componente ms voltil de la muestra, generalmente), que suele tener una
membrana de caucho a travs de la cual se introduce la muestra con la ayuda de una
microjeringa hipodrmica.
Inyeccin de la muestra evaporada e introducirla a la columna a travs de un septo de
plstico (estable a la temperatura de inyeccin, debe ser reemplazado peridicamente).
Temperatura de inyeccin debe ser de 10 a 50 mayor a la temperatura de la columna.
Jeringas: varios estilos disponibles. Aguja fija, removible. Varios tamaos y ngulos.
Volmenes de la muestra desde 1 l, lquidos de 0.1-10 l y gases 0.5-5 ml. Inyeccin
rpida para introducirla en una sola descarga y no debe haber aire al momento del llenado.
Precisin de la inyeccin +/-1%. Incremento de la precisin al utilizar circuitos (gas
sampling loops) y vlvulas para introducir cantidades constantes. Equipo no caro y requiere
temperatura constante.
La tcnica de inyeccin de muestra recomendada para lquidos en cromatografa de gases
es el mtodo de flujo del solvente. El solvente puro es introducido a la jeringa seguido de
una bolsa de aire, despus se coloca la solucin muestra, y finalmente otra bolsa de aire. Se
lee el volumen de la muestra y posteriormente se inyecta al cromatgrafo.
Horno de la columna
En el interior se sita la columna, donde se debe tener una buena regulacin de la
temperatura. Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto de inyeccin,
y en el otro al detector. La columna debe estar en el centro del horno sin tener contacto con
las paredes (Fig. 2).
Percha de
la columna
Columna de
capilaridad
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tipo de material es la temperatura mxima a la que se puede trabajar. Las fases se pueden
clasificar en:
No polares: para separar sustancias poco o nada polares. El ms utilizado son las
gomas de silicona OV-1, OV-101 o SE-30, para trabajar hasta ms de 300C donde
se consiguen eficacias de columna extraordinarias.
Columnas con fase mixta: para resolucin de separaciones parciales con dos o ms lquidos.
Posibilidad de separar hasta 50 sustancias mezclando dos, tres y cuatro lquidos para formar
la columna final. Aunque es ms laboriosa y poco prctica la representacin grfica esto ha
sido simplificado al utilizar programas computacionales.
Soporte (Support)
La funcin bsica del soporte slido es sostener la fase estacionaria. El soporte debe de
tener elevada superficie por unidad de volumen, estabilidad trmica, dureza mecnica,
inactividad qumica y baja resistencia al paso de un gas.
La mayora est hecho de tierra de diatomeas (diatomita o Kieselguhr), principalmente se
trata de slice hidratada microamorfa, la calcinacin de esta tierra dar lugar a diversos
productos segn la forma y temperatura de tratamiento.
Fundente carbonato sdico, productos blancos utilizados para filtracin. Celita, Celatom.
Tiene menor actividad superficial residual. El cromosorbo G es utilizado en columnas con
poca fase estacionaria y se obtienen mejores eficacias. El cromosorbo A es utilizado en
escala preparativa.
Sin fundente y a mayor temperatura, productos rosados utilizado para ladrillos refractarios.
Sil-O-Cel, Sterchamol, C-22. Son de mayor superficie y mejor resistencia mecnica, pero
son los que presentan mayor actividad superficial residual.
Todos los soportes porosos tiene cierta actividad residual debida a la presencia de iones
metlicos o defectos de superficie, y a los grupos OH de las molculas. Esta actividad
modifica el desarrollo normal del cromatograma, por lo tanto este efecto debe ser
disminiudo desactivando el soporte.
Una manera es cubrirlos con la misma fase estacionaria, la cua se adsorbe fuertemente en
estos puntos y el efecto sobre el soluto es menor. Tambin se puede hacer por lavado cido
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o bsico, aunque el sistema ms utilizado es hacer reaccionar los grupos hidroxilo de la
superficie del soporte con reactivos adecuados.
El ms comn es la silanizacin, en el que se hace reaccionar con dimetil diclorosilano, y
pueden encontrarse comercialmente con el mismo nombre que el material original
(Cromosorbo) o nombres especializados. Aunque para casos extremos pueden presentarse
an fenmenos de adsorcin que se eliminan aadiendo una pequea cantidad de fase
estacionaria muy polar (Carbowax).
Columna cromatogrfica
Las columnas estn hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o
enrrolladas. Excepto para las de vidrio, las columnas son empacadas mientras se estn
doblando. Las columnas analticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm.
de dimetro. Segn se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que
alcance la relacin de fases se originan los diferentes tipos de columnas. La separacin de
la mezcla se realiza dentro de la columna, por lo tanto, es la parte ms importante del
cromatgrafo.
La primera columna utilizada fue una de relleno (James & Martin, 1952), posteriormente
fue introducida la columna capilar, siendo as los dos extremos en la gama de columnas
utilizadas en la cromatografa de gases. El criterio para la diferenciacin de columnas es
con base en dos propiedades de stas:
Con base en estas dos caractersticas se encuentran los siguientes tipos de columnas, en las
que Vm/Vs y k aumetan en orden progresivo1:
1.
2.
3.
4.
Clsicas de relleno
Capilares rellenas
Capilares de capa porosa
Capilares abiertas
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Las columnas empaquetadas contienen un soporte slido inerte con una cubierta delgada de
la fase lquida. El soporte slido es frecuentemente tierra de diatomeas. La fase lquida
puede tener una viscosidad baja y una alta solubilidad para la mezcla de componentes.
Las columnas de capilaridad originalmente contenan una pelcula del lquido cubriendo la
pared interna de la columna de vidrio o metal. Las columnas de capilaridad ahora contienen
una capa de revestimiento slido dentro de ella con poro en el centro. Estas columnas son
mejores porque se les puede aplicar una velocidad ptima de flujo ms rpida (aprox. de 25 ml por min en lugar de 1 ml por min). Debido a este tipo de columnas, los anlisis han
podido ser ms sensibles.
La cantidad de muestra que admite una columna capilar sin que sufra sobrecarga es mucho
menor que en una columna clsica. La sobrecarga se alcanza cuando la concentracin de
soluto en la fase estacionaria es tan grande que la isoterma de distribucin deja de ser
lineal.
1.- Columnas clsicas de relleno
Constitudas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con la superficie
recubierta por una pelcula de la fase estacionaria.
Longitud 1-10 m
Dimetro interno 2-4 mm hasta 5 cm en escala preparativa
Tamao de la partcula de relleno diez veces menor que el dimetro del tubo
Capacidad de carga grande
Relacin de fases pequea
Permeablilidad baja
A mayor tamao de partcula del relleno mayor ser su permeabilidad, cuanto ms rugosa
sea su superficie mayor capacidad de carga se obtendr. Por esta razn es el nico tipo de
columna que se usa a escala preparativa.
La suspensin del soporte en la disolucin de la fase estacionaria debe agitarse
mecnicamente y, si es necesario, calentar ligeramente para evaporar la mayor parte del
solvente. El tubo de la columna debe estar perfectamente limpio, para rellenarlo se debe
introducir un extremo de sta en el relleno preparado con la ayuda de un embudo, mientras
que por el otro extremo se hace vaco con una bomba. Como tapones es conveniente utilizar
lana de vidrio o cuarzo y una malla metlica fina (Fig. 3).
2.- Columnas capilares rellenas
Se distinguen de las columnas clsicas de relleno por le dimetro interno del tubo, no
excede un milmetro. Adems, la relacin entre los dimetros del tubo y de la partcula de
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relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea un relleno ms irregular y una
permeabilidad del orden de diez veces superior.
Longitud de 10-50 m.
Dimetro interno de 1 mm.
Tamao de la partcula de relleno de 3 a 5 veces
Capacidad de carga pequea
Relacin de fases grande
Permeablilidad mayor que las clsicas
Al ser mayor la permeabilidad pueden construirse columnas ms largas (10-50 m). Guichon
(1966) y Halasz (1967) han hecho estudios muy detallados de este tipo de columna.
Este tipo de columnas no est comercializado, debido a lo difcil de introducir un soporte en
un tubo capilar metlico de esa longitud. Por el contrario, es ms sencillo cuando se trata de
tubos de vidrio. Se rellena un tubo Pyrex con el soporte elegido antes de estirarlo, entonces
al capilar resultante contiene ya el soporte en su interior. La fase estacionaria se introduce
de manera similar a las columnas capilares abiertas (Fig. 3).
3.- Columnas capilares de capa porosa
En este caso el soporte es depositado en la pared interior del tubo, despus es recubierto por
la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vaca.
Longitud de 25-200 m
Dimetro interno de 0.1-0.5 mm
Tamao de la partcula de relleno vara entre el de un soporte clsico y las partculas de
carbono producidas por la pirlisis de una sustancia orgnica.
Permeablilidad valores mximos (al igual que las capilares abiertas)
El procedimiento depender de la naturaleza de la columna y del soporte.
Columna metlica: se prepara una suspensin del soporte, se llena la columna con la
suspensin, se cierra un extremo y se evapora el agente dispersante quedando as adheridos
a la pared del capilar.
Columna de vidrio: similar al de columnas capilares rellenas. La diferencia consiste en
introducir una varilla de acero inoxidable un el tubo de vidrio y situar el soporte entre
ambos. Despus se procede al estirado manteniendo fija la varilla (Fig. 3).
4.- Columnas capilares abiertas
Tambin conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla (Golay, 1958).
La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que acta como soporte.
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Entre los factores que disminuyen la eficacia de una columna se encuentran:
Clsica
de
relleno
Capilar de
capa porosa
Capilar
abierta
Tubo
o
Fase estacionaria
Grano de soporte
Fig. 3. Tipos de columnas cromatogrficas.
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Detectores
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas
acarreador, convirtiendo una seal no medible directamente en una seal elaborable de
una propiedad fsica. Esta seal es elaborada por una comparacin entre el gas acarreador
puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente
separados en la columna, esto es traducido en una seal elctrica que es amplificada y
registrada al momento de salir de la columna.
Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad), tiene una respuesta lineal
(linearidad) sobre un amplio rango de concentracin y es relativamente insensible a
variaciones de flujo y temperatura (rango dinmico lineal).
Pueden ser clasificados por:
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conductividad trmica (la mayora de los gases orgnicos tienen calores de conductividad
bajos).
Este es un mtodo no destructivo dependiente de concentracin, con selectividad universal,
con un lmite de deteccin de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de deteccin es debido
al cambio de resistencia del cable basado en la termoconductividad del gas cuando fluye a
travs de la columna (Fig. 4).
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Este es un mtodo destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para
compuestos orgnicos, con un lmite de deteccin de ~ 100pg/seg. Su modo de deteccin
es debido a la produccin de iones en una flama resultando en una corriente que puede ser
medida (Fig. 5).
18
selectividad de FPD clsicos (como una porcin por peso del carbono) es 105 para
sulfurados y 106 para fosforados.
La cromatografa de gases con FPD puede ser usada para detectar componentes sulfurados
en extractos crudos de aceite y en contaminantes de gas natural. Tambin puede ser
utilizado para detectar pesticidas y herbicidas organofosforados, as como de componentes
sulfurados voltiles en el anlisis de alimentos.
Este es un mtodo destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para S, P, Sn,
B, As, Ge,Se, Cr; con un lmite de deteccin de ~ 100pg/seg. Su modo de deteccin es
debido a la produccin longitudes de onda particulares resultando en una corriente que
puede ser medida.
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Detector de captura de electrones (ECD electron capture detector)
Es altamente sensible a compuestos halogenados y por lo tanto muy til en la deteccin de
pesticidas. Da un poco de respuesta a hidrocarburos y otros carbonilos conjugados. Para
este tipo de cromatografa la muestra debe contener una fase gaseosa electrfora. Este es
un sistema donde se detectan partculas por absorcin de especies que contienen
halgenos, nitrilos, nitratos, organometales y dobles enlaces conjugados. Las partculas
son emitidas por una fuente de 63Ni, los electrforos las absorben reduciendo la corriente,
siendo esta la base de la respuesta(Fig. 7).
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Mtodos
Anlisis cualitativo
La cromatografa de gases es uno de los mtodos fsicos de separacin ms eficaces que se
conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de informacin:
posicin, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posicin, un solo parmetro
expresado cuantitativamente expresado como dato de retencin, suministra la informacin
cualitativa y los otros proporcionan la informacin cuantitativa.
Para simplificar el problema del anlisis cualitativo se supone que el cromatograma se ha
registrado en las condiciones ptimas, los picos estn totalmente separados con resolucin
superior a la unidad y que cada uno de ellos corresponde a un solo compuesto. En los casos
favorables es posible identificar los componentes por la posicin de los picos, pero por lo
general la ambigedad es tan grande que el analista ha de completar la informacin con la
obtenida por otros mtodos analticos, siendo preferibles las tcnicas multiparamtricas,
como la espectrometra de masas o la espectroscopa de infrarrojo.
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En la siguiente tabla se resumen los procedimientos utilizados para identificar los picos
cromatogrficos. No existe un mtodo general aplicable a todos los problemas prcticos, la
informacin cromatogrfica cualitativa depende del conocimiento previo de la composicin
de las muestras y casi siempre se han de combinar varias de las operaciones incluidas en la
tabla para seguir identificaciones fiables. A pesar de los inconvenientes del mtodo, la
cromatografa de gases en combinacin con otras tcnicas es el instrumento ms eficaz
conocido hasta la fecha para determinar la composicin cualitativa de mezclas complejas de
compuestos orgnicos.
Tabla. 1 Identificacin cualitativa por cromatografa de gases2.
Mtodos de coincidencia
El mtodo ms simple de identificacin cromatogrfica consiste en comparar el volumen de
retencin de un compuesto problema con el de un patrn, determinado en las mismas
condiciones operativas y en la misma columna. Como estas condiciones son difciles de
mantener constantes en cromatogramas registrados sucesivamente y todava ms difciles
en das diferentes, es mejor aadir el patrn como un marcador a la muestra problema y
comprobar si no coincide con alguno de los picos originales. Si por el contrario, aumenta la
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altura de alguno de ellos, es una evidencia de la coincidencia de los volmenes de
retencin. La respuesta negativa no es ambigua; se puede afirmar que ninguno de los
componentes de la muestra es el patrn. Pero en caso contrario la ambigedad es muy
grande, sobre todo si se analizan compuestos que no han sido previamente estudiados por
cromatografa de gases.
Al estudiar la probabilidad de que el pico que coincide con el patrn sea el patrn, la
certeza es la identificacin de que un pico depende de sustancias eluidas cerca del mismo
con las que puede confundirse. Expresando cuantitativamente esta observacin intuitiva se
tiene2:
= h/(V1r-V2r)/Vr
= nmero total de picos/nmero total de divisiones
Si se sabe de antemano que la mezcla solamente contiene carbono e hidrgeno, dato
suministrado por el anlisis elemental orgnico, h sera el nmero posible de hidrocarburos
eluidos entre los volmenes de retencin V1r y V2r.
La menor diferencia de volmenes de retencin detectable, Vr al nivel de confianza de 95
% vale 4Vr (Vr es el error tpico de las medidas duplicadas del volumen de retencin).
En otras palabras si en un cromatograma fuera posible incluir todos los eluyentes posibles
entre V1r y V2r el nmero de sustancias que dentro del error experimental seran
simultneamente eluidas sera , o en densidad de los picos. En la prctica la distribucin
de picos sigue la distribucin de Poisson2.
pn = e-pn/n!
en la que pn es la probabilidad de encontrar n solutos en el intervalo unitario Vr
Para reducir las identificaciones errneas a 1 en 1000, solamente sern permisibles 4
eluyentes. Esto significa que en la mayora de los casos prcticos es imposible la
identificacin en ste nivel con una sola columna a partir de los datos de retencin. La
nica manera de eliminar esta dificultad es reducir , y por tanto, pes. Esto es equivalente a
reducir Vr o h. La primera alternativa implica mejorar la precisin de las determinaciones
de rutina de las medidas de retencin a un nivel superior al 1%, muy difcil de conseguir en
la practica. Por otra parte, es posible reducir fcilmente por medio de otro tipo de
informacin, anlisis elemental, tcnicas instrumentales o separacin en otras columnas
cromatogrficas. Son evidentes las razones de la separacin en varias columnas, pero una
discusin semicuantitativa aclara las limitaciones del tratamiento estadstico.
23
La probabilidad que se eluyan simultneamente picos conteniendo ms de un componente
en dos columnas diferentes A y B est dada por2:
pesA+B = pesA*pesB
como pesB <1 se deduce que pesA+B < pesA; y por ello la separacin en dos columnas ha
reducido la probabilidad de identificacin errnea debida a la elucin simultnea.
Siguiendo este procedimiento y separando en suficiente nmero de columnas es posible
reducir pes a un valor muy pequeo. Sin embargo, para que se cumpla el procedimiento
estadstico la distribucin de los eluyentes ha de ser aleatoria, no ser vlido el
razonamiento si el volumen de retencin en la columna A est relacionado con el de la
columna B. Por lo tanto, el empleo de varias columnas reduce la probabilidad de
identificacin errnea, ms marcadamente cuando las columnas tienen comportamiento
muy diferente.
Retencin relativa
Los volmenes de retencin dependen de un gran nmero de variables operativas, debido a
esto es difcil conseguir respuesta idntica an en columnas preparadas en las mismas
condiciones; por lo tanto, para identificar sustancias a partir de datos bibliogrficos se han
de expresar las retenciones como variables reproducibles por diferentes equipos e
investigadores.
Se han utilizado dos procedimientos generales:
a) Clculo de los volmenes de retencin especficos
b) Determinacin de retenciones relativas a patrones
Es difcil determinar rutinariamente el volumen de retencin especfico porque se necesita
conocer con exactitud el peso de la fase estacionaria de la columna. En la prctica del
anlisis cualitativo se emplea corrientemente la retencin relativa. Los componentes y el
patrn han de registrarse en el mismo cromatograma. El clculo es muy sencillo, se limita a
la realizacin de dos medidas de distancia, una desde el mximo del pico del problema al
pico del aire, y otra entre los mximos del patrn y el aire. La retencin relativa de un
compuesto es independiente de la longitud de la columna, del flujo del gas portador y de la
cantidad de fase estacionaria; dependiendo solamente de la temperatura de separacin y de
la naturaleza de la fase estacionaria.
Un inconveniente de la identificacin por retenciones relativas es el gran nmero de
sustancias empleadas como referencia, que hace difcil determinar la coincidencia de los
datos publicados por diferentes autores. Es casi imposible en la prctica fijar un solo patrn
24
de referencia y su seleccin queda a disposicin del especialista, por lo que existe gran
nmero de datos de poca aplicacin a problemas particulares.
25
columnas de capilaridad puede ser ilustrado ms claramente sustituyendo la altura
equivalente a una placa terica (H) por nmero efectivo de placas tericas (N). En este
modelo, (N) est relacionado a la longitud de la columna (L) de acuerdo a H (HETP) =
L/N. La figura 9 muestra (H) como una funcin de la velocidad promedio (u) donde Hmin
y umin estn bajo condiciones de flujo optimizados.
26
.
Fig.10 Efectos de usar diferentes gases acarreadores en el punto Van Deemeter4.
Antes de marcar el uso de flujo de acarreadores, se ajusta la fuente del acarreador que es
por lo menos 20 psi ms grande que la presin de la cabeza de la columna. Esto es para
minimizar la resistencia del flujo de la columna para suplementar lneas y garantizar una
velocidad de flujo volumtrico constante entre el inyector, la columna y el detector. Para
medir la velocidad lineal, se inyecta una sustancia no retenible a la temperatura donde hay
mayor elucin. Si a esto se le optimiza la temperatura, estar arriba del 50 % de la
eficiencia que puede ser perdida cuando se hacen rangos de 50 hasta 200 C. La velocidad
lineal es calculada usando la siguiente ecuacin y entonces un valor promedio se obtiene de
un mnimo de tres mediciones4. Cuando la velocidad lineal se optimiza para el helio ser
aproximadamente 21-40 cm/seg y para el hidrgeno de 50-80 cm/seg.
U (cm/seg) = longitud de la columna/RT del pico de lo no retenido
Es importante considerar el disfraz de la velocidad del flujo de gas cuando se optimiza la
velocidad lineal del acarreador, especialmente desde que el disfraz afecta la forma del pico,
linearidad y reproducibilidad. Esto podra ser porque la velocidad es optimizada pero no
parece ser porque el disfraz del flujo no lo est. Las velocidades de flujo varan de acuerdo
al disfraz del gas y el tipo de detector.
Por ejemplo, con ECD el detector de gas necesita mantener un equilibrio de concentracin
de electrones trmicos y un barrido efectivo de gas acarreador-soluto. La sensibilidad ECD
es inversamente proporcional al flujo, aunque un flujo fuerte se requiera para el barrido de
27
sustancias altamente retenidas para producir picos agudos. Para mantener una sensibilidad
satisfactoria en las velocidades de flujo en el ECD se utiliza 95 % de argn y 5 % de
metano como fuente de gas.
La resolucin, la simetra de los picos y la sensibilidad podran ser monitoreadas para
confirmar que la cromatografa de gases est calibrada correctamente y la velocidad lineal
est optimizada. La cantidad requerida de resolucin y la simetra del pico es especfica al
mtodo de anlisis. Normalmente, una buena resolucin se encuentra entre 0.5-1.0 y un
rango aceptable PGF est entre 0.8 a 1.2 cuando estn determinados por 1 y 2 (ver abajo).
1) Resolucin= rt2-rt1/ Avg (w2+w1)
rt2 rt1 es la diferencia en los tiempos de retencin entre los dos picos, w2 es el ancho del
pico 2 y w1 es el ancho del pico 1.
2) PGF = 1.83 * el pico a 1/2 de altura / pico a 1/10 de altura
3) La sensibilidad est relacionada con la altura del pico a la base del mismo. Una porcin
de 3:1 indica una sensibilidad adecuada.
28
estn entre los solutos que eluyen al principio o tratar varias tcnicas de inyeccin que sean
compatibles con el muestreo tipo splitless.
Una cabeza del alineador desactivada, sin lana de slica es preferida para una mezcla ligera
de la muestra con el solvente. Ocasionalmente, la lana puede ser usada para ayudar a la
volatilizacin de los componentes de alto peso molecular. Un alineador de cuello de ganso
es una alternativa viable para un alineador delgado, diseado especficamente para mejorar
la eficiencia del splitless y disminuir la degradacin de la muestra. Una columna
moderadamente polar desactivada, puesta 1 o 2 cm abajo del punto de inyeccin, podra ser
utilizada siempre con splitless para minimizar el pegado de los picos y para tener una
migracin uniforme del solvente.
Para tener un tiempo de purga ptimo, se comienza con un rango de purga de 0.2 a 1.5 min.
Si el tiempo es muy corto, menos de 0.1 min. los componentes ms pesados no se
volatilizarn lo suficiente o no se creara la concentracin del solvente. Si hay una gran
diferencia entre el punto de ebullicin del solvente y el del soluto, el tiempo de purga
necesitar estar cercano a 0.2 min. Ajustar el tiempo de purga en incrementos de 0.1 min.
hasta alcanzar el mximo de sensibilidad del soluto sin que haya trazas del solvente.
El muestreo tipo split es el mtodo ms popular porque inyectar muestras de 0.1 a 2 l no
impide que haya una buena altura y sensibilidad en el pico. Si se obtiene la cantidad
mxima de eficiencia de la columna, las reas del pico ms pequeas asociadas con el
muestreo tipo split reflejan una reduccin en lo ancho lugar de lo alto del pico. Mejorar la
simetra del pico permite una mejor reproducibilidad y por lo cual da una mejor
cuantificacin del rea de los picos. Otra ventaja del split, es que se pueden usar columnas
ms estrechas para tener una mejor resolucin sin tener que volver a muestrear la columna.
Quiz el nico inconveniente del split es que la cantidad inyectada a la columna podra no
ser representativa si la muestra no es completamente vaporizada. Esto es porque la muestra
entra en el alineador con el respirador split abierto y el extracto de la muestra y el
acarreador son purgados antes de que entren a la columna. Por esta razn, el mtodo de
inyeccin split puede ser monitoreado siempre corriendo soluciones estndares de
concentraciones conocidas y analizar su reproducibilidad. La cantidad purgada en el
respirador del split est determinado por la velocidad del split4:
Velocidad del split (ml/min)=
Promedio del flujo del split+ promedio de flujo de columna/promedio de flujo de columna
29
residuos no analizables y garantizar el calentamiento adecuado, mezclado y expansin del
vapor. Esto es particularmente importante cuando se inyectan componentes de alto punto de
ebullicin.
Para mejorar la velocidad del split, colocar la temperatura del horno a la temperatura inicial
y ajustar flujo del respirador del split hasta que est en 10 a 15 ml/min. El flujo a travs del
respirador de purga pude estar entre 0.5 a 6 ml/min. y el flujo del acarreador en 2 a 5
ml/min. al final del detector.
Combinacin de temperatura y programacin de temperatura para completar la
optimizacin
La adicin de control electrnico de presin a la programacin de la temperatura mejora
dramticamente la separacin, reduce el tiempo de corrida y se obtiene una velocidad
ptima lineal para el soluto. Esto es porque la presin puede ser regulada precisamente y el
flujo programado continuamente durante la columna. El EPC puede ser corrido a presin
constante con un solo punto de entrada en toda la columna. Esto es similar a lo que el
gauger mecnico hace, excepto que los flujos son ms estacionarios, permitiendo una
restauracin ms rpida del equilibrio del flujo despus de un periodo de apagado. El EPC
puede ser tambin programado para tener una corrida de flujo constante, donde la presin
es ajustada automticamente a los cambios de temperatura para corregir el volumen del gas
dentro de la columna dado a que el calor se expande al incrementar la temperatura.
En general, el flujo y presin constantes, promueven una elucin ms rpida de
componentes de alto peso molecular en temperaturas ms bajas con mejor resolucin. La
habilidad para correrlo a temperaturas bajas reduce significantemente la degradacin termal
y mejora la longevidad de la columna.
Para optimizar el flujo constante, la presin de la cabeza de la columna debe incrementar
3.5 veces a la cantidad original en la columna por cada 200C para compensar un
incremento en la viscosidad. Esto garantiza una alta eficiencia y un flujo constante, la cual,
bajo presin constante, puede gotear ms del 50 %. Hay varios factores a considerar cuando
se programa un EPC, particularmente la longitud de la columna, dimetro interno,
velocidad de split y el goteo de la presin desde la cabeza hasta la cola de la columna. El
siguiente es un clculo para mejorar el EPC y establecer una presin en la cabeza necesaria
para mantener un flujo constante mientras la temperatura se incrementa de T1 a T24:
Pi2 = [(T2/T1)1.7(pi2-po2)1+po2]1/2
Donde Pi es la presin gauge inicial + 1 atm y po es la presin de salida a 1 atm.
30
La programacin de la presin envuelve simples y mltiples campos los cuales entran en el
panel de control en la misma manera como un programa de temperatura. Los cambios en la
presin pueden ocurrir en temperatura y tiempos especficos durante una corrida,
permitiendo una mejor optimizacin. Algunos puntos que garantizan una programacin
exitosa son:
1. Seleccionar columnas que tengan mayor eficiencia que la requerida para la
separacin.
2. La temperatura del horno inicial podra ser lo suficientemente baja como para
permitir separar componentes de bajo punto de ebullicin pero ms alta que la
temperatura mnima para la fase estacionaria de la columna.
3. Correr mezclas complejas en temperaturas iniciales bajas para dispersar os picos.
4. Siempre introducir un tiempo de sostenido inicial para soluto de rpida elucin.
5. Incrementar las rampas de presin y temperatura para reducir los espacios en blanco
entre grupos. Comenzar con rampas de temperatura. Si los ltimos picos de elucin
son resueltos pobremente, reducir la temperatura e incrementar la presin.
Al incrementar la presin durante la inyeccin, el volumen de expansin de vapor puede ser
controlado para prevenir el regreso el cual podra ocurrir si la cantidad inyectada excede la
capacidad del buffer en la cabeza del alineador. En el pulso de presin, la cabeza de presin
es aumentada un poco despus de la inyeccin, y se programa una inclinacin para el
remanente de la corrida. Esto actualmente mejora el muestreo splitless porque expansin de
volmenes ms pequeos son producidos dado al menor tiempo gastado en la cabeza. No
hay suficiente tiempo para que el vapor se expanda hasta el inicio del alineador y salga por
el respirador del purgador. Puesto que el tiempo que la muestra permanece en el alineador
es reducido, hay menos contacto con sitios activos de superficies catalticas del alineador.
Hay menos adsorcin del alineador y descomposicin de la muestra y por lo tanto la
resolucin del pico es mejorada. Ocasionalmente, la delimitacin de los picos puede ocurrir
con pulsos de presin, especialmente si usas concentracin de solventes debido a que la
velocidad del flujo tiende a interferir con la concentracin de la muestra en la columna.
Esto puede ser solucionado variando el tiempo de purga, los pulsos de presin y la
temperatura del horno.
Cuando se usa EPC con inyeccin tipo split, la velocidad del split puede ser programada
para cambiar durante la corrida o entre los mtodos en una secuencia. Tambin, puede ser
programado para apagarlo entre corridas para conservar la cantidad de gas acarreador. Si se
aplican pulsos de presin a la inyeccin tipo split, incrementa el flujo el cual podra reducir
la velocidad de split.
Con la programacin de la temperatura y presin se han optimizado y mejorado los
procedimientos de corrida. Los programas computarizados como el ezGC ™ proveen
aproximaciones ms cercanas para condiciones ya optimizadas. Esto no remplaza los
mtodos ya desarrollados pero puede eliminar los tiempos de corrida sesgados.
31
El software requiere que dos programas extremos sean usados como un rango 1) Una
presin o temperatura alta con un rampeo rpido y 2) una presin y temperatura inicial con
un rampeo bajo. Los resultados entran al programa, con la longitud de la columna, la
presin sobre el dimetro de la columna, la velocidad lineal, de tiempo muerto y otros
parmetros. Una serie de algormetros determinan los mejores programas basados en la
termodinmica de retencin para ndices y clculos.
Aplicaciones
Un intento para crear una compilacin de aplicaciones deseadas para generar un manual
debe ser selectivo, en consecuencia la compilacin casi siempre puede estar incompleta por
cromatgrafos individuales debido a la omisin de ejemplos que se consideran crticos para
algunos campos especficos. Por otra parte, algunos de los ejemplos incluidos pueden ser
criticados porque los eventos de separacin en la cromatografa de gases pueden ser muy
rpidos y en muchos casos es posible generar resultados que son superiores a los mostrados
en las ilustraciones. Los avances que han permitido mejorar los mtodos incluye a)
mejores mtodos de preparacin y almacenamiento de las muestras, b) mejoras en la
instrumentacin comercial, incluyendo entradas superiores que llevan a cabo un mejor
proceso de inyeccin de la muestra y c) la disponibilidad de mejores columnas desactivadas
en un rango ms amplio de dimetros y cubiertas de una gran variedad de fases
estacionarias. Las guas de aplicaciones para fases estacionarias en los anlisis de las
diferentes reas se muestran en catlogos tales como Supelco, Applied Science, Analabs,
etc.
Otra forma de clasificar las aplicaciones en la cromatografa de gases es dividir los datos de
la literatura en reas de inters, pese a que la sobrelapacin de algunos sea inevitable, una
serie de grados de redundancia puede ser evitada por la asignacin de cuatro grandes
categoras:
a) Comida, sabores y fragancias. Productos naturales y las feromonas, anlisis de
pesticidas; separacin de enantimeros.
b) Petrleo y qumicos. cidos grasos; combustibles sintticos, carbn y aceites;
separacin de enantimeros.
c) Ambientales. Contaminantes de agua, aire y tierra; halometanos en el agua hasta las
dioxinas en la tierra; anlisis de pesticidas; separacin de enantimeros.
d) Mdicas y biolgicas. cidos grasos; niveles de alcohol y drogas en la sangre;
anlisis de pesticidas; separacin de enantimeros.
Aplicaciones en comida, saborizantes y fragancias
En la mayora de las investigaciones hechas sobre saborizantes se realizan por
cromatografa de gases, y las correlaciones sensoriales que se requieren para que haya
significancia en la determinacin de sabores deben ser medidas por patrones de
32
cromatografa de gases. El anlisis puede ser complicado debido a que los compuestos de
inters volatilizan usualmente en muy bajas concentraciones, y son frecuentemente
dispersados dentro de una matriz que contiene materiales los cuales podran, si se quedan
dentro de la columna, acortar la vida de la muestra en un grado considerable. La
cromatografa puede ser extremadamente compleja y frecuentemente influenciada por los
mtodos de preparacin de la muestra.
La cromatografa de gases es ampliamente utilizada en el anlisis de aceites esenciales,
donde la complejidad de la muestra puede ser en verdad un gran reto. Muchos de estos
productos son frgiles e importantes comercialmente y se utiliza la cromatografa de gases
para cuantificar componentes especficos que podran ser indicativos de calidad del aceite y
para detectar adicin de compuestos clandestinos como antioxidantes as como
componentes utilizados como diluyentes.
Un ejemplo de esto puede ser el aceite de limn al cual se adulteraba por la adicin de
turpentina. De aqu que la cromatografa de gases es usada no solo para establecer cuales
son los materiales normales que contiene cada muestra, sino tambin aquellos componentes
cuya concentracin aumenta el abuso del aceite (ejemplo: el p-cymeno). La complejidad el
aceite es tan alta que no se podra analizar su composicin por una simple columna
cromatogrfica, por lo que se usan columnas especializadas de polimetilsiloxano con
diferentes fases estacionarias, para producir una mejor separacin de los compuestos as
como un tiempo de vida ms largo.
Otro uso importante de la cromatografa de gases ha sido en el anlisis de vinos
adulterados. Por ejemplo, en los vinos europeos fue de gran importancia en la deteccin de
dietilenglicol. El dietilenglicol es un material txico y se ha encontrado en niveles de 60
g/L en los vinos. Tambin se pueden detectar contaminantes dentro de la comida
empaquetada por cromatografa de gases. Estos contaminantes estn relacionados con
trazas de solventes residuales usados en las pelculas plastificadas del empaquetamiento
(por ejemplo, el 2-etilhexanol).
El dibromo de etileno (EDB) ha sido utilizado ampliamente para inhibir la infestacin de
insectos en comida empaquetada, pero se demostr que este compuesto es carcinognico en
altos niveles. Debido a la gran complejidad de las muestras de comida, la deteccin de estos
EDBs puede ser un problema, por lo que se han optimizado fases estacionarias que
permiten un aumento en la retencin relativa y velocidad parcial de la volatilidad de los
compuestos, dando prioridad a la salida de los contaminantes.
Tabla 2. Columnas recomendadas para cromatografa de comida, sabores y fragancias4
Solutos
Fase estacionaria
Tipo de columna
cidos grasos voltiles en 10% SP-1000/1%H3PO4
PEGa
agua (C2 a C5)
cidos grasos bacterianos 3% SP-2100, Silar 5CP
1, 5, 225.
Aminocidos
OV-17, OV-210
17
Carbohidratos
2330, 2340
225, 275
33
Aplicaciones relacionadas a qumicos y petrleo
Los anlisis de productos del petrleo incluyen la separacin de mezclas de gases ligeros
hasta la caracterizacin de aceites crudos y materiales producidos en la licuacin del
carbn. La diferenciacin de hidrocarburos parafnicos, olefnicos y aromticos son metas
normales, y algunas veces se requiere la deteccin de componentes nitrogenados y
sulfurados. Las preparaciones de hidrocarburos derivados de aceites o carbn licuado
pueden ser extremadamente complejas y tambin pueden incluir una variedad de otros
grupos funcionales. La cromatografa multidimensional puede ser requerida para el anlisis
de estas mezclas complejas, la cual da una gran estimacin de ciertos aditivos de octanos.
Las columnas empaquetadas todava son utilizadas para algunas separaciones de
hidrocarburos ligeros, mezclas de gases, componentes sulfurados y nitrogenados de bajo
peso molecular; alcoholes y halocarbonos de bajo peso molecular. Estas columnas
normalmente se empaquetan con almina o algunos polmeros porosos como los
cromosorbos.
Las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos hidrocarbonados estn limitados
generalmente a fuerzas de dispersin; por ejemplo, la fase estacionaria de
metilpolisiloxano, cuya interaccin con los solutos est limitada a las fuerzas de dispersin,
funciona bien para la separacin de estos componentes. Mooney, et al. (1982) 4 demostaron
la separacin de hidrocarbonos de bajo peso molecular en un sistema de vlvula de entrada,
usando una columna de pelcula apretada en condiciones subambientales. Estas columnas
son especialmente tiles para mezclas de baja ebullicin. Tambin se han diseado
separaciones interesantes utilizando columnas tubulares de capa porosa (PLOT) cubiertas
con almina.
Estas columnas incrementan la retencin de los hidrocarburos de bajo peso molecular en
altas temperaturas. Se disearon sistemas de multicolumnas de vlvula de entrada, con
potencial de reflujo y/o redireccin de fracciones individuales a tubos abiertos,
microempaquetados y columnas PLOT, para llevar a cabo separaciones que son difciles de
duplicar con equipos convencionales o columnas tubulares abiertas.
La cromatografa multidimensional se utiliza para la separacin de algunos componentes
menores como los aditivos antiknock en gasolinas. Levy y Yancey (1986) 4, describieron
un sistema para cuantificar aditivos oxigenados con las bases de caractersticas de retencin
cuando las inyecciones de gasolina eran simultneamente agregadas a dos columnas
diferentes.
Las pruebas de solventes han sido todo un reto, debido a la cantidad masiva del
constituyente principal que debe ser inyectado a la columna si la deteccin es para los
constituyentes menores; por ejemplo, el rango dinmico del sistema debe ser
suficientemente amplio para acomodar estas diferencias cuantitativas en los componentes.
34
Aplicaciones ambientales
Los anlisis ambientales se enfocan a la deteccin y/o cuantificacin de muchas substancias
diferentes en una diversidad de matrices. Estos anlisis pueden ir desde qumicos de
pesticidas y herbicidas hasta hidrocarburos aromticos polinucleares (PAHs), compuestos
clorados mezclados en el aire, agua y tierra. En muchos casos el problema inicial es la
obtencin y preparacin de la muestra. Las muestras de agua son muy variables, desde agua
potable hasta aguas industriales.
En muchos casos las agencias de regulacin de calidad tienen procedimientos estndar
especficos para el anlisis de materiales dados en una matriz dada. Con algunas
excepciones los mtodos de anlisis oficiales son menos sensitivos y consumen mayor
tiempo que los mtodos que se desarrollaron en los comienzos de la cromatografa. En
Estados Unidos, la agencia de proteccin ambiental (EPA) especific procedimientos para
el monitoreo de efluentes industriales en 1977. Los mtodos 603 hasta el 613 separan en 13
clases los 113 contaminantes orgnicos que son monitoreados por cromatografa de gases.
Los anlisis cromatogrficos se llevan a cabo por columnas tubulares abiertas, las cuales
dan una excelente precisin y tiempos de anlisis muy cortos pese a la complejidad que
podra presentar la muestra. En estos anlisis cromatogrficos se usan fases estacionarias de
compuestos aromticos para mejorar la separacin de los solutos. Las mismas columnas se
usan para la separacin de pesticidas y compuestos aromticos clorados.
35
Tabla 3. Fases estacionarias recomendables para las aplicaciones biolgicas y qumicas4
Solutos
Columnas empaquetadas
Columnas tubulares
Clinicas/Biomdicas
Cetosteroides
Silar 5CP
225
Colesterol, esteroides,
estrgenos
OV-17
17
Alcoholes en sangre
Carbopak/SP-1000
PEG
Drogas
Anfetaminas
Apiezon/KOH
Antidepresivos
SP-2250
Alcaloides
SP-2250, OV-17/H3PO4
Barbitricos
SP-2250
1,5,17
Diurticos
OV-17/H3PO4
36
diferentes, una empleando FID y la otra con deteccin de nitrgeno/fsforo (NPD), para
generar los datos de la Fig. 12.
Fig. 11. Anlisis de una droga ilegal en un analizador de detector y columna doble4.
Aplicaciones en la industria
La cromatografa de gases es muy til cuando pretendemos identificar los compuestos que
determinan una caracterstica aromtica conocida. Por lo tanto, es necesario conocer los
umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirta nuestro producto, ya sea mediante
estudio bibliogrfico o por deteccin olfatomtrica. Esta informacin es un instrumento til
para el seguimiento del producto en el proceso productivo, as como el control de otros
materiales enolgicos, como son los tapones y las barricas. Algunos controles importantes a
efectuar durante la fase de crianza en vinos y cavas son mtodos especficos para la
determinacin de fenoles voltiles y compuestos azufrados. Concretamente en la cava, a
partir de la evolucin de ciertos compuestos voltiles, entre ellos los vitispiranos, se calcula
el momento en el que tienen lugar las fases de autlisis y postautlisis durante la crianza.
Controlar el momento en que se desarrollan estas fases es importante debido a las
alteraciones organolpticas que conllevan.
La informacin que nos puede suministrar la GC en el control de calidad ser ms grande
cuanto mejor conozcamos el perfil cromatogrfico de la fraccin aromtica de nuestro
producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de datos del mismo en las
diferentes etapas de elaboracin y en diferentes adiciones, y correlacionar estadsticamente
determinados compuestos con ciertas anomalas, o tipificar variedades que no contengan
algn compuesto especfico que las identifique (como sucede en la mayora de casos). No
37
obstante, se trata de anlisis todava demasiado laboriosos para constituir aplicaciones
rutinarias de control.
En todo caso, el anlisis por cromatografa de gases no nos permite definir el perfil
aromtico del vino analizado. El problema se agrava en aquellos compuestos para los que
no disponemos de patrones sintticos y, por tanto, no es posible conocer sus propiedades
aromticas.
Otras aplicaciones
Tambin se hacen anlisis cromatogrficos para la determinacin de metanos
trihalogenados, los cuales daan la salud por la desinfeccin del agua de piscinas con cloro.
Se hacen anlisis de componentes de la acrilamida. Se determinan los residuos de
ditiocarbamato en los alimentos dietticos. La determinacin de aceites minerales en el
agua. Anlisis de herbicidas en campos de golf. Para determinar los grados de alcohol en
bebidas como la cerveza. Para la determinacin de componentes aromticos en alimentos y
bebidas.
Aplicaciones prcticas
Dentro de la investigacin que se realiza en el Instituto de Biotecnologa, en el
departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis, se realiza investigacin sobre la
degradacin enzimtica de compuestos azufrados, como el dibenzotiofeno, presentes en
petrleo crudo y sus derivados. El azufre al ser oxidado durante el proceso de combustin,
se convierte en un contaminante atmosfrico al formar cido sulfhdrico, el cual forma parte
de la lluvia cida. La deteccin de los productos de degradacin se realiza por
cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas. La cromatografa de gases nos
permite cuantificar la concentracin de compuestos azufrados; y la espectrometra, el
anlisis
de
los
productos
(fig.12).
38
Abundance
TIC: DBT.D
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
Time
4.00
6.00
8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
Time-->
A) cromatografa de gases.
Abundance
184
600000
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
139
100000
50000
92
63
m/z
32
50
100
150
215
246281 327
377
429
479
530562 605
200
250
300
350
400
450
500
550
600
659693
650
700
m/z-->
B) espectrometra de masas
Fig. 12 grfica de deteccin de dibenzotiofeno.
Entre las aplicaciones de ms importancia est la del mbito de alimentos, debido a que es
de suma importancia tener conocimiento de los componentes cuya presencia cae dentro de
los parmetros permitidos en ciertos productos, an a pesar de que no formen parte del
contenido original. Para ejemplificar este punto hacemos referencia al siguiente artculo de
divulgacin. Se anexa publicacin al finaldel trabajo.
39
Lpez, M.G. 2001. Una sinfona de aromas. Avance y perspectiva, Unidad Irapuato,
CINVESTAV. vol. 20. p. 421-424
40
**Dr. Charles Rice
Agron 645-Microbiologa del suelo
Depto de Agronoma./KSU. Kansas State, USA
Biomasa microbiana. Carbono y Nitrogeno mineralizable. Liberacin de gases bajo
condiciones de fumigacin.
http://www.oznet.ksu.edu/ed_agron645/lab/645GCinfo.htm
** Qumica atmosfrica
Programa de Ingeniera Qumica Ambiental y de Qumica Ambiental (PIQAyQA)
Facultad de Qumica/UNAM. Distrito Federal
Cromatgrafo de gases Perkin Elmer
http://www.cneq.unam.mx/paidoteca/quimicaambiental/instalaciones.htm
** Centro de Investigaciones Qumicas/UAEM. Cuernavaca, Morelos
Cromatgrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas (HP5973).
http://www.ciq.uaem.mx/ciq/servicios1.htm
**Laboratorio de Biogeoqumica UBIPRO/UNAM Iztacala, Distrito Federal
Cromatgrafo de Gases con detector de Espectrometra de Masas (Finnigan Mat).
http://www.iztacala.unam.mx/dip/ubiprolab_biogeoquimica.html
**Alcoholera de Zapopan. Jalisco
Comercializacin de alcohol etlico.
http://www.alcoholera-zapopan.com/laboratorio.html
**Anlisis en el rea de Alimentos y Frmacos
Laboratorio de instrumentacin/CETI. Guadalajara, Jalisco.
http://www.ceti.mx/es/servicio_ext/tec_quimicas/lab_instrumentacion.phtml
Innovaciones
Se han hecho innovaciones aumentando los volmenes de inyeccin al cromatgrafo
(LVI). En anlisis de cromatografas de gases tpicas normalmente solo una fraccin del
volumen inyectado es de inters analtico, el resto solo interfiere o no es importante. Para
mejorar el anlisis, aumentando la integridad analtica, disminuyendo la frecuencia de
retencin etc. Se ha diseado un sistema llamado ProSep.
41
El sistema ProSep consiste de 4 componentes, el mdulo de precolumna, el cual es el
puerto de entrada, dos mdulos control y una precolumna de vidrio o slica la cual est
unida dentro de la precolumna de manera similar al alineador de vidrio split/splitless
(partido / sin partir) (paso 1). El flujo de la funcin ProSep se muestra en la siguiente
figura.
La inyeccin con el ProSep en el cromatgrafo de gases de manera split.
Debido a que ProSep provee alguna separacin, los componentes inyectados son
organizados en la precolumna de acuerdo a su punto de ebullicin, aqu el solvente, el
analito y la matriz son ordenados en el puerto y los solventes de bajo punto de ebullicin
son rpidamente eluidos (paso 2).
Despus de la eliminacin del solvente, la columna de preseparacin modula la
temperatura, cerrando el respirador split transfiriendo los solutos dentro de la columna
analtica (paso3).
Cuando ya se han transferido todos los solutos de inters, se abre de nuevo el respirador
split se abre de nuevo y la columna de preseparacin aumenta la temperatura para hervir a
los componentes no deseados de la matriz (paso 4). Todos estos pasos son monitoreados
bajo softwares de la marca ProSepTM.
42
43
individuales de una mezcla con un alto grado de poder resolutivo, no puede dar, en sentido
riguroso ms que informacin preliminar sobre su estructura. Hay que sealar como
esencial que cualquier columna cromatogrfica no es un instrumento analtico, sino tan solo
un medio de separacin fsica.
Asimismo, desconectando ciertos detectores especficos (por ejemplo captura de electrones,
fsforo, etc.), los detectores cromatogrficos solamente responden en general a la cantidad
de la muestra eluda de la columna. Por ello la utilizacin de los datos basados en el tiempo
de retencin absoluto o relativo puede resultar un mtodo adecuado para la identificacin
tentativa de ciertos compuestos o mezclas relativamente simples o para las cuales se
dispone de los correspondientes patrones. Sin embargo, cuando esta metodologa se intenta
llevar a extremos, como el anlisis de mezclas de productos naturales de extrema
complejidad, los resultados as obtenidos carecen de la precisin cualitativa, sobre todo en
los casos que se requiere una programacin de la temperatura del cromatgrafo de gases y
se carece de compuestos patrn. A este respecto, una de las reas ms activas de la
combinacin cromatografa de gases-espectrometra de masas es en conclusin la
identificacin de compuestos nuevos o no sospechados previamente.
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Pginas web
http://home.nas.net/~dbc/cic_hamilton/gas.html
links a diferentes mtodos.
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