EXTRACCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS Y OTRAS

PROTEINAS A GRAN ESCALA

Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos.
ESTRUCTURA

LISIS CELULAR

Para obtener protenas intracelulares de los microorganismos existen tres mtodos

generales; enzimticos, qumicos o fsicos. No todas las metodologas pueden ser
utilizadas en procesos a gran escala. Quizs el ejemplo mas destacado es la
sonicacin, que es el mtodo ms empleado en la obtencin de protenas en el
laboratorio.
EXTRACCION POR METODOS QUIMICOS

lcali.
Este mtodo ha sido utilizado con considerable xito para la extraccin de protenas
bacterianas a pequea y gran escala. Por ejemplo la enzima teraputica Lasparaginasa.
Detergentes.
Los detergentes inicos son ms reactivos que los detergentes no-inicos y pueden
ocasionar la desnaturalizacin de muchas protenas.
La presencia de detergentes puede afectar tambin a las etapas posteriores de
purificacin, en particular a la precipitacin proteica por tratamiento con sales. Esto
puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografa de intercambio inico
o por ultrafiltracin
EXTRACCION POR METODOS FISICOS
Choque osmtico.
El choque
osmtico ha sido utilizado en la extraccin de enzimas hidroliticas y
protenas ligadas del espacio periplsmico de cierto nmero de bacterias Gramnegativas, incluyendo la E. coli. El empleo del choque osmtico se est viendo
favorecido con el incremento en el nmero de protenas recombinantes que se
secretan al periplasma.
Tamizacin slida
El mtodo implica la extrusin del material celular congelado a travs de un orificio de
pequeo dimetro y a una presin elevada, manteniendo la temperatura prxima a
-20C.
Tamizacin lquida
Este es ahora el mtodo de ruptura celular de eleccin utilizado en la lisis a gran
escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicacin tanto en procesos
industriales como de investigacin.
PURIFICACIN INICIAL
CROMATOGRAFIA
La purificacin de enzimas por cromatografa ha sido una prctica de laboratorio
durante muchos aos. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser
empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de
protenas
La cromatografa es la nica metodologa con la selectividad suficiente para purificar
una protena de una mezcla proteica compleja con un grado de purificacin final
superior al 99,8%.
Optimizacin del salto de escala y de la calidad del proceso

El salto de escala en la separacin cromatografica es, en principio, sencillo, ya que la

teora de esta metodologa seala que el dimetro de la columna no presenta un
efecto importante sobre la resolucin, de forma que bastara con incrementar el
dimetro de la columna para provocar el salto de escala.
En principio, estos procesos de salto de escala deben repetirse hasta alcanzar la
escala de operatividad deseada.
Seleccin de la metodologa
Para obtencin y separacin de protenas a gran escala se puede emplear cualquier
de las tcnicas cromatrograficas disponibles: filtracin a travs de geles, intercambio
inico, interaccin hidrofobica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.
Tabla 1 mtodos cromatografico para la purificacin de protenas a gran escala
Caracterstica
Tipo
de Caractersticas
Aplicacin
molecular
cromatografa
aprovechada
Tamao
Gel filtracin
Resolucin moderada para el El fraccionamiento es mejor
fraccionamiento y buena para en las ltimas etapas de la
tampones
intercambiadores. purificacin. En cualquier
Capacidad limitada por el momento puede ser utilizado
volumen de la muestra.
los
tampones
intercambiadores y podr
existir una limitacin respecto
al volumen de la muestra.
Carga
Intercambiador
La resolucin puede ser alta. Es ms efectiva en las
inico
Capacidad alta no limitada por primeras
fases
del
el volumen de la muestra. La fraccionamiento cuando se
velocidad puede ser muy van a manipular grandes
elevada dependiendo de la volmenes.
matriz.
Cromatoenfoque
La resolucin puede ser alta. Es mejor usarla en una
La capacidad puede ser alta. purificacin posterior, ya que
La velocidad puede ser alta.
las matrices son caras.
Polaridad
Interaccin
Resolucin buena. Capacidad Puede ser utilizado en
hidrofobica
muy alta y no limitada por el cualquier fase, pero es mejor
volumen de la muestra. aplicarla cuando la fuerza
Velocidad alta.
inica es alta tras la
precipitacin con sales o
despus de un intercambio
inico.
Afinidad
afinidad
La resolucin puede ser Puede
emplearse
en
biolgico
elevada. Capacidad puede ser cualquier
etapa,
aunque
alta o baja, dependiendo de normalmente
no
es
ligando y no limitada por el recomendable
en
las
volumen de la muestra. primeras fases.
Velocidad elevada.
Gel filtracin

ste tipo de separacin se basa en el tamao molecular. La fase estacionaria esta

formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente mvil. Cuando se aade la
muestra, las molculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.
Cromatografa de intercambio inico
Tradicionalmente para el fraccionamiento de protenas se han empleado los
intercambiadores inicos basados en compuestos de celulosa con diversos
sustituyentes;
Tabla 2. Sustituyentes en intercambiadores inicos
Intercambiador anionico
Amina cuaternaria (Q)
Amino etilo cuaternario (QAE)
Dietilaminoetilo (DEAE)

-CH2-N+-(CH3)3
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)3
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2

Los intercambiadores celulsicos inicos son ideales para diversas operaciones como
primera etapa en varios procesos.
No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de
celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren
cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza inica siendo muy
complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

La cromatografa de afinidad es quiz el mtodo de purificacin ms elegante para

obtener una protena a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en
el laboratorio, solo en los ltimos aos parece aceptable en purificaciones a escala
industrial.
Esta metodologa se basa en la interaccin de una protena con un ligando
inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una protena particular.
La cromatografa de afinidad con nucletidos inmovilizados es escasamente usada en
procesos de purificacin a gran escala quiz debido a su inestabilidad, corte, baja
capacidad y las dificultades de su incorporacin a una matriz solida.
Para la purificacin a gran escala de muchas enzimas, se ha empleado colorantes
inmovilizados, puesto que poseen ventajas tales como facilidad de unin a un soporte
matriz, estabilidad, alta capacidad y econmicos.
Tabla 3. Ejemplos de enzimas purificadas a gran escala por cromatografa de afinidad
con colorantes.
Enzima
Gliceroquinasa
Glucoquinasa
Glicerol deshidrogenasa
Metionil- tRNA sintetasa
Triptofanil tRNA sintetasa

Colorante
Procin azul-MX-3G
Procin marrn H-3R
Procin rojo HE-3B
Procin verde HE-4BD
Procin marrn MX-5BR

3-hidroxibutirato deshidrogenasa

Procin rojo H-3B

Malato deshidrogenasa
Carboxipeptidasa G2

Procin azul MX -4GD

Procin rojo H-3B
Procin azul MX-4GD

Eluyente
5 mM ATP
2 mM ATP
2 mM NAD
Gradiente de fosfato
50 mM triptfano
1 M KC1
1 M KC1 + 2 mM NADH
1 M KC1 + 2 mM NADH
Gradiente 0-0,7 mM KC1

Procin rojo H-8BN

Albumina de suero bovino

Albumina de suero bovino

Cibracron azul F3-GA

Cibracron azul F3-GA

Adsorbido en presencia
de 0,2 mM Zn2+ y tris
C1H 0,1 M, eluido con
10 mM EDTA pH 5,8y
despus, con tris-C1H
0,1 M pH 7.3

20 mM octanoato sdico
3 M NaCl, pH 8,6

ULTRAFILTRACION

La ultrafiltracin ha sido una tcnica de uso corriente en el laboratorio para la

concentracin de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. Tambin es una
alternativa para la dilisis y filtracin a travs de geles para la eliminacin de sales o
los cambios de tampones.

CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos
nucleicos y protenas.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro
tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de
acuerdo a su tamao o peso molecular.
Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern
posteriormente analizadas e interpretadas.
En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis;
sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa
ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas,
mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

 Etapas posteriores de procesamiento: extraccin y purificacin de

protenas M.D. SCAWEN, T. ATKINSON, P.M. HAMMOND, Y R.F.
SHERWOOD
K. Aunstrup, in `Applied Biochemestry and Bioengineering , ed. L. B. Wingard,
E. Katchalski-Katzir, and L. Goldstein, Academic Press, New York, 1979, p. 27.
P. M. Hammond, C. P. Price, and M. D. Scawen, Eur. J. BioChem., 1983,
132,651.
R. Kobayashi, T. Miwa, S. Yamamoto, and S: Nagasaki, Eur. J. Appl. Miccrobiol.
Technol., 1982, 15, 14.
https://prezi.com/7tupcmxyxa2r/extraccion-y-purificacion-de-enzimas/