Fundamentos y Tipos de ELISA

Autor: Cultek, S.L.U

El ELISA es una tcnica que se basa en el uso de un antgeno o un anticuerpo
marcado con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fijado a un soporte,
se interrumpe la reaccin antgeno-anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato
especifico sobre la enzima que producir un color determinado observable a simple
vista o cuantificable por un espectrofotmetro o analizar la reaccin antgeno
anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo: directo,
indirecto, sndwich: Doble, Heterlogo.
En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antgeno o
anticuerpo, luego se agrega

la muestra problema con la mezcla de antgenos o

anticuerpos, se une el antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno ya

tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Adicin del anticuerpo secundario
marcado con la enzima , unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
,lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no adherida , adicin del
substrato, unin del substrato a la enzima, para luego obtener la coloracin color
ELISA directo: En este se fija el antgeno al soporte, se lava para eliminar los no
fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reaccin
con el antgeno y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no
reaccionaron y se agrega un sustrato especfico para la enzima, al final se observa la
coloracin. ELISA indirecto: En este la diferencia viene dad que a nivel que el elemento
marcado por la enzima es un anti-anticuerpo que va a reaccionar con el anticuerpo, que
reacciono junto al antgeno previamente fijado;

finalmente agrega un sustrato

especfico para la enzima, se lava y se observa la coloracin.

ELISA sndwich doble: Se fija al soporte el anticuerpo especficos del antgeno
en el suero problema, posteriormente se aade el suero problema y los antgenos de
fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente
se aaden anticuerpos conjugados con una enzima(de diferente eptopo a los
previamente fijados) estos reaccionan con los antgenos de la muestra problema que se
encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se aade un sustrato a la
enzima marcadora y se observa el color visual o por colorimetra, en cuanto al ELISA

sndwich triple la diferencia viene dada por que los segundos anticuerpos que se
colocan no son marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos
conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se colocaron luego,
posteriormente se lava y se coloca el sustrato especifico para la enzima.
ELISA Competitivo: Fijacin de anticuerpos especficos al soporte anticuerpos,
adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado
en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos (objeto de
estudio).Al mismo tiempo, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso
anterior, marcados con una enzima, lavar. Agregar un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o
colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.
Si las lecturas de ambas pruebas son iguales, el antgeno a estudio no tiene nada que ver
con los anticuerpos empleados en el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos
pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado con el anticuerpo empleado para
tapizar el soporte y la diferencia de absorbancia o densidad ptica, es proporcional a la
concentracin del antgeno problema.
Mtodos especficos
Para lograr el tapizado de antgenos y anticuerpos de diluye el antgeno o
anticuerpo en tampn carbonato (pH 9,6) y se incuba luego durante 3h a 37C o 16h a
4C, tambin de puede incubar a 40-50C en tampn fosfato (PBS) o en agua fisiolgica
tamponada pH 7,2-7,4. En cuanto a la solucin de lavado se elaborara una solucin
salina con Tween 20 como agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma se debe conjugar la
enzima, esta debe de poder unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, un substrato
cromognico o fluorognico conveniente. Las enzimas ms utilizadas son las fosfatas
alcalina, peroxidasa de rbano y -galactosidasa.

Mtodos de lectura de resultados

Colorimetra: En estos ensayos se obtiene un producto de reaccin coloreado que
absorbe luz, siendo la densidad ptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de
producto medido. Para todos los ensayos enzimticos, la etapa final es la adicin del
substrato enzimtico, este es escogido por su rendimiento en la reaccin enzimtica.
Para ensayos colorimtricos, la tasa de desarrollo de color es proporcional, dentro de un
cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimtico presente.
Fluorescencia: La fluorescencia es una variacin de la colorimetra en este un
producto de reaccin emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada
longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz
emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado. En comparacin con los
mtodos colorimtricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente ms sensibles y,
sufren a cambios de pH, temperatura, restos de detergente en el lavado y concentracin
inica. Lo que lo hace mas funcional es que amplia el rango de medida en cuanto al
obtenido en los ensayos colorimtricos.
Luminiscencia: En este proceso la enzima acta sobre un sustrato generando un
producto capaz de emitir fotones en lugar de generar un color visible, este proceso se
define como la capacidad de emitir luz por parte una sustancia esta puede ser mediante
una reaccin qumica (quimioluminiscencia), mediante una longitud de onda
(fotoluminiscencia= florescencia) o mediante un producto al ser degradado
(bioluminiscencia).
Para poder interpretar los resultados, se puede observar el color a simple vista,
pero el ojo humano no es capaz de notar la variacin de 0,1 de densidad ptica, por eso
se usa el espectrofotmetro para poder as cuantificar los resultados. Es importante
resaltar que las soluciones ELISA es un mtodo de inmunodeteccin que se utiliza para
detectar diversas patologas animales y vegetales.