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Contenido:
Introduccin y normas de trabajo.
Cultivo de clulas de mamferos: aspectos bsicos
Funcionamiento y uso de aparatos generales de laboratorio de cultivos
Lavado de material, esterilizacin y preparacin de medios de cultivos celulares
Microbiologa:
Medios de cultivo, siembra y observacin de microorganismos
Virologa:
Titulacin de virus y transduccin
Clulas de insectos:
Generacin de protenas recombinantes mediante el uso de baculovirus
Clulas de mamferos:
Descongelacin de lneas establecidas
Cultivos primarios de linfocitos de ratn
Clulas ES
Cultivos primarios neuronas de cerebro de ratn
Clulas de plantas
Seguridad Biolgica
Pocillos Dimetro
Area /placa
1
35 mm
10 cm2
1
60 mm
28 cm2
1
100 mm
78 cm2
Botellas (flasks)
Nombre comn
T-25
T-75
Pocillos Dimetro
1
---1
----
Area/botella
25 cm2
75 cm2
millones de clulas
placas tipo Petri-dish
Nombre comn
P35
P60
P100 *
Siembra
0.3
0.8
2.2
Confluencia
1.2
3.2
8.8
millones de clulas
Botellas (flasks)
Nombre comn
T-25
T-75
Siembra
0.7
2.2
Confluencia
2.8
8.8
Medio
2
3
10
Lavados Trip/EDTA
2
1
3
2
10
3
volumen (ml)
Cuando se disminuye un 90% la densidad de clulas, se dice que las clulas se pasan 1/10
(la densidad de reduce a 1/10 de la inicial). Si es un 80%, el pase es de 1/5.
Como ejemplo, si queremos pasar unas clulas 1/5 manteniendo el cultivo en una placa de las
mismas dimensiones, simplemente hay que descartar el 80% de las clulas. Si se quiere
conservar todas las clulas, para expandirlas, las clulas se habrn de distribuir en 5 placas de
la misma superficie que la original. En cualquiera de los dos casos, la densidad se reduce a
1/5, las clulas sufren un pase 1/5, etc.
Si las clulas se dividen cada 24h, se puede predecir que (tras 12-24 h de parada del
crecimiento tras su siembra), al da 2 habr el doble de clulas que las sembradas, al da 3,
cuatro veces, y as sucesivamente.
Como ejemplo, tras un pase 1/10, y asumiendo que las clulas no se dividen durante las
primeras 24h,
da 0 densidad= 100%, por lo que las clulas se pasan dejando densidad 10%.
da 1 densidad= 10%
da 2 densidad= 20%
da 3 densidad= 40% (cambio de medio)
da 4 densidad= 80%
da 5, las clulas necesitarn ser pasadas de nuevo
TRIPSINIZACIN (y otros mtodos de pasar clulas).
Para la mayora de lneas celulares que crecen adheridas a un substrato, la forma ms
conveniente de levantarlas en una suspensin celular (para poder manejarlas fcilmente en
suspensin), es mediante el uso de tripsina (proteasa), que digiere aqullas protenas celulares
implicadas en la adhesin celular al soporte.
[En caso que sea importante preservar protenas de membrana, se suele desaconsejar este procedimiento, habiendo
de recurrirse a procedimientos mecnicos, como el pipeteo repetido, o el barrido/araado de la superficie de
cultivo.]
Para que la tripsinizacin sea efectiva, y para contribuir a debilitar la adherencia de las clulas
al soporte, aparte de tripsina, hay que asegurarse de eliminar el suero del medio (que contiene
inhibidor de tripsina), as como cationes divalentes presentes en el medio y que median la
interaccin clula-sustrato (mediante el uso de EDTA).
Para ello, el procedimiento estndar de tripsinizacin es el siguiente (p. ej. para una placa
P100) (para otros tamaos de placa ver la tabla anterior):
Materiales: * PBS conteniendo 0.004% EDTA (PBS/EDTA)
(Mezclar botella 80ml EDTA al 0.02% con 320ml PBS)
* Tripsina 0.05% en EDTA (Trip/EDTA)
(Mezclar botella 20ml tripsina 0.25% con 80ml EDTA 0.02%)
Procedimiento:
- retirar el medio de cultivo
- lavar 1x (una vez) con PBS/EDTA.
- incubar con 1-2 ml solucin de Trip / EDTA, 5 min, RT 37oC (si es posible), hasta que
las clulas se vean redondas bajo el microscopio, seal de que su adherencia est
muy desminuida.
- diluir la tripsina / EDTA en la placa con 8-9 ml de medio completo (con suero); esto
detiene la tripsinacin (por el aporte de protenas del suero, el inhibidor de tripsina
presente en el suero, y el aporte de Calcio y Magnesio con el medio y el suero). Adems., en
el volumen final de 10 ml es fcil pipetear la suspensin para acabar de levantar la clulas
(pipetear arriba y abajo, esparciendo la suspensin por toda la superficie de la placa, unas 510 veces, con la energa suficiente (y no ms) como para despegar la clulas). Evitar hacer
vaco al pipetear, as como hacer demasiadas burbujas, ya que ambas cosas matan muchas
clulas).
- si la tripsinazcin ha sido efectiva, todas las clulas de la placa se encontrarn en los
10ml de suspensin, como clulas aisladas, no como agregados. Transferir este
Equipos de filtracin.
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coste por unidad hace que en muchos casos an se empleen unidades reutilizables
como pueden ser las unidades Swimmex de Millipore.
Estos equipos de filtracin constan o bien de una fuente de vacio conectada a un
kitasato dotado de una unidad de filtracin esterilizada por autoclavado, o bien de una
bomba peristltica que fuerza el flujo de solucin a travs de una unidad de filtracin
hermtica (por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa Millipore). En ambos
casos la esterilizacin se produce al atravesar la solucin un filtro de poro 0.22 um.
Autoclave.
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Contamos tambin con una gran variedad de tubos de ensayo para el desarrollo de
una forma efectiva de diferentes tcnicas y rutinas dentro del laboratorio.
Cada tipo de material se utiliza para diferentes funciones, as como todos los
materiales de cristal se utilizaran para la preparacin y almacenamiento de medios y
reactivos, todo el plstico nos servir para la preparacin de alcuotas de los
diferentes reactivos y con esto conseguiremos realizar diferentes stocks para una
rpida preparacin de medios y reactivos utilizados en las rutinas de un Laboratorio.
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Cabinas de Flujo
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peligrosos.
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Incubadores de CO2.
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Microscopios.
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17
18
19
20
Juan Rebelles
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22
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24
25
26
27
28
Flameado
Calor seco
Horno Pasteur
Calor Hmedo
Autoclave tyndalizador
Medios de cultivos, Apsitos
Hervidor
29
Bujas filtrantes
filtros de membrana Lquidos
filtros Seitz de placa
Filtracin
76
1 litro
77
HEPES 1M (comercial)
5 ml
78
6 gs
79
Albumax al 0.5 %
5 gs
100 ml
77
HEPES 1M (comercial)
500 l
78
0.6 gr
79
Albumax al 5 %
5 gr
Tripsina 0,25 %
81
Tripsina
2,5 gr
30
PBS 10 X
100 ml
glucosa
1,1 gr
Rojo fenol 1 %
1,5 ml
H2O hasta
1 litro
31
PBS BSA 1 %
PBS 10 X
100 ml
Glucosa
1.19 gr
80
BSA 1 %
10 gr
H2O hasta
1 litro
Cloruro sodico Na CL
9 gr
Cloruro potasico K CL
0.32 gr
10
0.30 gr
0.29 gr
Glucosa
1.11 gr
47
Hepes
2.38 gr
H2O hasta
1 litro
McCoYs
PH= 7,2
82
McCoYs
11.9 gr
10
2.2 gr
H2O hasta
1 litro
32
GLUTAMINA 200 mM
21
L - glutamina
29,23
dH2 O hasta
1 litro
L -alanina
3,92 gr
18
L asparagina dH2 O
6 gr
14
L cido aspartico
5,32 gr
15
L cido glutamico
5,88 gr
29
L - prolina
4,6 gr
dH2 O hasta
1 litro
Se reparte en alicuotas de 10 ml
ROJO FENOL 1 %
33
37
Rojo fenol
2,5 gr
13
NaOH 1N
8,12 ml
dH2 O hasta
250 ml
BSS
2
Ca CL2 2H2 O
1,5 gr
Na CL
80 gr
K CL
4 gr
42
Mg SO4 7H2 O
2 gr
44
CL2 Mg 6H2 O
2 gr
11
KH2 PO4
0,6 gr
12
Na2 H PO4
5 gr
Rojo fenol 1%
10 ml
dH2 O
10 litros
pH 7,2..7,4
EDTA 0,02%
hasta
34
45
37
EDTA
0,2 gr
PBS 10 X
100 ML
Rojo fenol 1%
1,5 ml
dH2 O
1 litro
hasta
Se reparte en alicuotas de 80 ml
Se esteriliza en autoclave 15 min. a 120 C
Se almacena a 20 C
PBS 10 X
3
Na CL
800 gr
K CL
20 gr
12
289,6 gr
11
PO4 H2K
20 gr
dH2O
10 litros
hasta
35
PBS 1X
3
Na CL
8 gr
K CL
0,2 gr
12
2,9 gr
11
PO4 H2K
0,2 gr
dH2O
1 litro
hasta
Cloruro potsico
50 gr
Se guarda a 4C
dH2O
hasta
250 ml
Antimicotico
0,2 gr
dH2O
1 litro
hasta
Se guarda a 4C
Se disuelve calentando a 60 C
MEDIO M 3
42
4,40 gr
1 gr
59
Glutamato potasico
7,88 gr
36
63
Glutamato sdico
6,53 gr
39
0.8 gr
Glucosa
10 gr
61
Acido Oxalactico
0,25 gr
62
Bis-tris
1,05 gr
66
TC- yeastolate
1 gr
14
cido aspartico
0,30 gr
31
Threonina
0,50 gr
30
Serina
0,35 gr
18
Asparagina
0,30 gr
21
Glutamina
0,60 gr
29
Prolina
0 40 gr
20
Glicina
0,50 gr
16
Alanina
1,50 gr
34
Valina
0,40 gr
27
methionina
0,25 gr
24
Isoleucina
0,25 gr
25
Leucina
0,40 gr
32
tirosina
0,25 gr
28
Phenylalanina
0,25 gr
64
B- alanina
0,25 gr
22
Histidina HCl
0,55 gr
33
Trytophano
0,10 gr
17
Arginina
0,50 gr
26
Lisina HCl
0,85 gr
69
cisteina HCl
0,20 gr
65
Colina HCl
0,05 gr
Hidrogeno carbonato K
dH2O
hasta
(ojo)
0,50 gr
1 litro
37
TC- 100
49
TC-100
20 gr
Bicarbonato Na
0,35 gr
(HCO3 Na)
hasta
1 litro
28 gr
dH2O
50 ml
hasta
Se almacena a 4C
100 ml
PBS 10 X
100 ml
dH2O
1 litro
hasta
38
PBS 1X completo
PBS 10 X
1 litro
1,32 gr
44
1 gr
dH2O
10 litros
hasta
RPMI
38
RPMI
104,2 gr
10
20 gr
dH2O
10 litros
hasta
Estreptomicina sulfato
10 gr
35
Penicilina G 1580 u / mg
6,32 gr
dH2O
100 ml
hasta
Estreptomicina sulfato
(100 mg / ml)
Penicilina G 1580 u / mg (105 u / ml)
Se utiliza a 1 / 1000
Se esteriliza por filtracin a presin con membranas de 0,2 , 0,45 , y prefiltro
Se almacena a 20C
39
CARMEN PUNZON
Clulas linfocitarias, y cultivos en suspensin.
40
Obtencin de esplenocitos
1. Depositar el bazo en una placa Petri (p100) que contenga de 8-10ml de medio RPMI
completo sin suero.
2. Se coge por la parte inferior una jeringa de 20ml estril de tal forma que lo que
tenemos en el extremo superior es el mbolo. Con el embolo, se aplastan los bazos
depositados en un filtro de nylon situado en un tubo falcon de 50ml, asi hasta que
queden completamente disgregados., aadiendo medio RPMI.
3. La suspensin de clulas obtenidas de los bazos que hay en el tubo, se centrifugan a
1500 rpm, temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
4. Lisis de eritrocitos: resuspender el pellet celular en 1-3 ml de tampn de lisis a 4C y
dejar en esta solucin 1-2 minutos sobre hielo.
5. Aadir 20ml de RPMI sin suero y centrifugar de nuevo.
6. Resuspender el pellet de las clulas en RPMI con 5% de suero, contar las clulas y
plaquear .
7. Dejar las clulas 48-72 horas para ver proliferacin.
41
Clonaje de hibridomas
1. Contar clulas viables usando un hemocitometro y azul tripan. Las clulas
resuspendidas en RPMI con 10% de suero.
2. Preparar una placa de 96 pocillos.
3. Cacular las clulas para poner una clula por pocillo y 10 clulas por pocillo.
4. Esperar que las clulas formen clones.
5. Una vez formado los clones expandir a una placa de 48 pocillos y asi sucesivamente .
Es conveniente congelar en cada paso por posibles contaminaciones.
6. Recoger sobrenadante para testar el anticuerpo monoclonal.
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Mitomycin C (Roche)
Use 10 g/ml (stock 1mg/ml), medium (PA6 or MEF). Remove the old
medium and add
new medium with Mitomycin for 2-4 hours (at 37oC). After that, wash the cells
with PBS,
trypsinize, count the cells, and plate them again in plates of your election.
Mitomycin C can be used also at 1 g/ml for overnight treatment of the cells.
Basically the protocol is based on plating mES cells in low density on stromalfeeders (we use PA6
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cell line, from Riken Cell Bank, Japan), and posterior factor and media
addition as follows:
Day: 0 5 8 11 14
Material requerido:
Medios y Tampones:
Protocolo a seguir:
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MICROBIOLOGIA
Miguel Remacha
MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos.
Composicin de un medio de cultivo:
- componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono,
aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos (P, N, Mg, S, etc.)
- componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agaragar), tampones, indicadores de pH, etc.
Tipos de medios de cultivo:
a) En funcin de su consistencia:
- medios lquidos
- medios slidos (en tubo, en placa)
- medios semislidos
b) En funcin de su composicin:
- medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura)
- medios sintticos
c) Existen medios de cultivo cuya composicin permite el crecimiento de una
gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en
cambio, se utilizan para la seleccin de determinados grupos de organismos, o
se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test
bioqumicos.
- medios selectivos
- medios diferenciales
- enriquecimientos
- medios para test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de
azcares, etc.).
49
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OBSERVACION MACROSCOPICA
El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista, para
observarlas se necesita un microscopio ptico. Sin embargo, las colonias
que forman sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a su identificacin. A
nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao,
aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de
brillo, color, etc. Incluso sobre medio lquido las bacterias producen
modificaciones de inters para su clasificacin y que tienen que ver
esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa
si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona
superficial, si producen pigmentos, etc.
En medios diferenciales/selectivas se pueden observar caractersticas
adicionales que reflejan el metabolismo de las bacterias sembradas.
OBSERVACION MICROSCOPICA
Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la
nica forma de observarlas bien en el microscopio ptico consiste en
incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue
mediante su teido con colorantes o mediante la disposicin de una
ptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.
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VIROLOGIA
TITULACION DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCION
Base terica:
Titular una suspensin de virus consiste en determinar el nmero de unidades
infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos lticos,
la titulacin se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir
una placa de lisis sobre un csped bacteriano, lo que es cierto para bajas
multiplicidades de infeccin. As, determinando el nmero de placas de lisis
producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensin de virus, podremos
calcular el nmero de unidades infectivas presentes en la muestra original.
Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresin de un
bacterifago lambda utilizado en ingeniera gentica (derivado de RS45) que
porta el gen de la -galactosidasa bajo el control de un potente promotor de
transcripcin constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de forma que
podremos seleccionar y detectar la integracin en la prctica simultnea de
transduccin. Como medios para el cultivo e infeccin se puede utilizar
directamente caldo y agar comn a los que se aade siempre Cl2Mg a una
concentracin final de 10mM, al objeto de evitar la disgregacin de los
componentes de la cpsida del virus. Tambin se utilizar agar blando, que se
obtiene aadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo comn (con el Cl2Mg presente), y
que tiene como funcin el permitir una difusin limitada de la progenie vrica tras
la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transduccin emplearemos placas de agar
de McConkey con el antibitico kanamicina
Procedimiento:
1) Se prepara un inculo de la cepa de E. coli a infectar en un medio que contiene
10 mM de Cl2Mg y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37C y con agitacin
durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo).
2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl2Mg) y se
mantienen en estado lquido en los baos a 50C (Los monitores hacen esto).
3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la
suspensin de virus utilizando el caldo comn con el magnesio.
4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estriles, y
aadir a cada uno 0.1 ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las
indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37C
durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorcin del virus a la superficie de
las bacterias.
54
5) Aadir tambin 0,1 ml de la dilucin 10-1a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria
para la prctica de transduccin. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un
control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.9 ml CC+Mg
MUESTRA
10
-1
10
-2
10
-3
-4
10
10
+2
-5
6) Aadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50C) sobre los tres tubos ms diludos,
homogeneizar y extender sobre placas de agar comn procurando que no queden
burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la mesa
durante 5-10 minutos.
7) Extender directamente los tubos para la transduccin sobre placas de seleccin
de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estriles.
8) Incubar a 37C en posicin invertida durante toda la noche.
9) Al da siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con
el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de infeccin
por un virus nico, multiplicando por los factores de dilucin correspondientes en
cada caso se podr determinar el TITULO del fago, esto es, el nmero de unidades
infectivas por ml.
10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color
de stas. La aparicin de colonias rojas indicar que el fago se ha integrado en el
cromosoma confiriendo a esta bacteria resistencia al antibitico de seleccin y
capacidad de utilizacin de lactosa mediante la introduccin de genes procedentes
de otras bacterias (Transduccin).
Repartir:
- Una gradilla para tubos eppendorf
- Tres tubos de plstico de 5 ml
- Caldo con Magnesio para diluciones
- P1000, P200 y puntas estriles
- Que est el bao a 50 C con el agar blando
- Tres placas de agar comn
- Dos placas de agar de Mc con kanamicina (AMcK)
- Que haya bolitas estriles.
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CLULAS DE INSECTOS
GENERACIN DE UNA PROTENA RECOMBINANTE EN CLULAS DE INSECTO
MEDIANTE EL USO DE BACULOVIRUS.
1.- Introduccin.
Los baculovirus son una familia de virus infectivos para invertebrados. Poseen un genoma de
DNA de doble cadena circular con un tamao de 80-180 Kb. Se caracterizan por albergar dicha
informacin gentica en una cpside recubierta de envoltura viral. Durante la infeccin se generan dos
formas de progenie viral: partculas extracelulares (ECV) y partculas de virus en cuerpos de oclusin,
que estn formados por la protena viral poliedrina y que protegen al virus de la inactivacin por el
entorno. El virus entra en la clula por endocitosis o fusin, la replicacin del DNA tiene lugar 6 horas
despus y, a partir de las 10 horas, el virus empieza a liberarse al medio extracelular, alcanzndose los
niveles mximos 36-48 horas. El gen de la poliedrina se ha clonado y secuenciado y se ha visto que no
es esencial para el ciclo de infeccin o replicacin del virus en cultivo de tejidos. La sustitucin del gen
de poliedrina por un gen de inters, que lleva a la generacin de ECV nicamente, ha sido utilizado
para el control de plagas y la produccin de protenas recombinantes,
La utilizacin del sistema de baculovirus ha surgido como un sistema popular de produccin de
protena recombinante en clulas eucariotas. Distintos factores han contribuido a su popularidad:
Debido a que el genoma viral es grande, es posible la inclusin segmentos de DNA extrao
grandes.
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En esta prctica vamos a infectar clulas Sf9 con el baculovirus recombinate de GRK2
(quinasa de receptores acoplados a protenas G) y vamos a analizar la expresin de la
protena mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS.
2.- Materiales y mtodos.
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Clulas Sf9.
Aminocidos no esenciales.
Gentamicina.
Mezcla de antibiticos.
Tampn fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2mM, pH 7.4).
Inhibidores de proteasas: Benzamidina (10 g/ml), Inhibidor de Tripsina (10 g/ml), aprotinina
1x y PMSF (200 M).
Albmina 1 mg/ml.
Reactivo de Bradford.
58
Plantilla:
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1.- Introduccin.
El principio bsico de la electroforesis es el movimiento que experimenta una partcula cargada en un
determinado medio cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. Dada una partcula de
carga neta Q sometida a un campo elctrico de intensidad E, se mover por la accin de una fuerza
igual a:
F = Q E = Q V/d
siendo V la diferencia de potencial y d la distancia entre los electrodos.
Esta tcnica es utilizada frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y cidos
nucleicos.
Uno de los medios de soporte ms empleado en la electroforesis, es el gel de poliacrilamida. Este gel
o red tridimensional se consigue mediante la polimerizacin lineal de la acrilamida, y el entrecruzamiento
de cadenas provocado por la bisacrilamida. El gel se organiza en una serie de fibras que al
entrecruzarse, y segn el grado de entrecruzamiento, deja poros a travs de los cuales circulan las
protenas a separar. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin de
acrilamida y bisacrilamida del gel. La polimerizacin de la acrilamida y bisacrilamida es promovida por
radicales libres generados por el persulfato amnico y que son estabilizados por el TEMED. La
poliacrilamida presenta la ventaja de ser a la vez criba y soporte, no presenta fenmenos de adsorcin
de tipo inico ni flujo electro-osmtico, y ofrece la posibilidad de utilizar un amplio rango de pH.
Los pesos moleculares de las protenas pueden ser determinados midiendo la movilidad en geles de
poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sdico (SDS). Esto es debido a que la cantidad
de SDS, detergente aninico, que se une a una protena es proporcional al peso molecular del
polipptido y es independiente de su secuencia; a saturacin, se unen aproximadamente 1,4 g. de
detergente por gramo de protena. As, si una serie de protenas de peso molecular conocido son
sometidas a electroforesis y se separan en una serie de bandas, la representacin grfica de la distancia
recorrida en funcin del logaritmo del peso molecular, da una lnea recta. Este sistema de electroforesis
en poliacrilamida-SDS se conoce como mtodo de Laemmli.
2.- Materiales y reactivos.
- Acrilamida/bisacrilamida al 30/0.8% (p/v).
- Tris-HCl 1M, pH 6,8.
- Tris-HCl 1M, pH 8,8.
- SDS 10% (p/v).
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Gel Separador
(7.5%) Vt = 10ml
Gel Empaquetamiento
(3%) Vf = 5 ml
2,50 ml
0,84 ml
2,50 ml
---------------
----------------
1,25 ml
SDS 10%
100 l
100 l
TEMED
5 l
5 l
APS 10%
100 l
50 l
Agua destilada
4,85 ml
2,80 ml
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Cuando el gel concentrador haya polimerizado, retirar el peine e instalar el gel en el aparato de
electroforesis siguiendo las instrucciones del Profesor. Rellenar las cmaras de los electrodos con el
tampn de electroforesis.
Marcadores coloreados:
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Retirar sobrenadante
Resuspender en 1ml de NB+B27+ Gln 500M+ Antibiticos 1x
Contar
Sembrar 200.000 cels/pocillo de P24 en 0.4ml medio (sobre los 0.3ml de
laminina)
Hacer un cambio total de medio a las 3h (NB+B27+ Gln 500M+ Antibiticos
1x)
SEGURIDAD BIOLGICA
- OBJETIVOS
Conocimiento en la manipulacin, gestin de residuos y diseo de instalaciones
especificas de bioseguridad para prevenir los riesgos de exposicin a agentes
biolgicos en laboratorios de cultivos celulares
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- PROGRAMA:
Teora: (10 horas)
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muy variado pero bsicamente estn constituidas por tejidos procedentes de biopsias y
necropsias y por fluidos corporales como: sangre, orina, etc. Adems, tambin se realizan
cultivos de clulas animales, de bacterias y de hongos con objeto de caracterizar el o los
microorganismos causantes de la infeccin en el paciente o en el animal infectado.
Las vas de transmisin de estos agentes biolgicos son: la va respiratoria, la va drmica, la
va y la digestiva, y la va parenteral. Debido a esto es necesario establecer un plan especfico
de prevencin de riesgos biolgicos.
Estn descritos diferentes niveles de bioseguridad de acuerdo con la probabilidad del riesgo
de infeccin y las medidas disponibles que van del nivel 1 hasta el 4, que estn descritos en la
legislacin vigente, tanto para los laboratorios cmo para animalarios.
El objetivo de un plan de prevencin de riesgos biolgicos es
reducir o eliminar la
67
571:
Exposicin
agentes
biolgicos.
Equipos
de
proteccin
68
69