Ejercicios Bioquimica

PRACTICAS DE BIOQUIMICA
Licenciatura en
Ciencias Ambientales
Dpto. de Ciencias de la Salud III

rea de Bioqumica y Biologa Molecular
Universidad Rey Juan Carlos
Prcticas de Bioqumica
Prcticas de Bioqumica: ndice.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO.
05
INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS
06
EVALUACIN DE LAS PRCTICAS
07
PRACTICA N 1: PRECIPITACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS. 08

1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS.
2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.
2.1.2 MTODO.
08
09
09
1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS.

2.2.2 MTODO.
11
12
12
1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 1.
14
1.4 EJERCICIO: DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LAS CADENAS LIGERA Y

18
PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
PRACTICA N 2: DETERMINACIN DE LA Km DE LA FOSFATASA CIDA

PARA EL p-NITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIN POR
FOSFATO MONOPOTSICO.
23
2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO
2.1.2 MTODO.
28
28
28
2.2 ENSAYOS ENZIMTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR

4.2.2 MTODO.
29
29
29
34
-2-
PRCTICA N 3: PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD

ENZIMATICA
39
3.1 PRESENTACIN DEL PROGRAMA INFORMTICO
3.1.1 DESCRIPCIN DEL PROGRAMA
3.1.2 MTODO.
39
39
42
42
PRCTICA N 4: TCNICAS CROMATOGRFICAS.
45
4.1. CROMATOGRAFA EN PAPEL.

4.1.2 MTODO.
46
47
47
4.2. DEMOSTRACIN: CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN.
49
52
-3-
LABORATORIO DE PRCTICAS: UBICACIN.

Laboratorio 006. Planta baja del Edificio Polivalente I.
Campus de Mstoles U.REY JUAN CARLOS.
C/ Tulipn s/n 28933 Mstoles Madrid.
NORMAS GENERALES DE LABORATORIO

Antes de la realizacin de las prcticas:
1. Estudiar cuidadosamente el guin que corresponda antes del comienzo de
cada prctica. Las posibles dudas se resolvern brevemente al inicio de la
prctica.
2. Se pasar lista para comprobar la asistencia a la prctica, por lo que se pide
puntualidad.
Durante la realizacin de las prcticas:
1. El uso de bata y guantes es obligatorio, as como cualquier otro material de
proteccin que indiquen los profesores.
2. Est absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio.
3. Est absolutamente prohibido pipetear con la boca.
4. Mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las prcticas, y
una vez acabadas limpiarlo completamente.
Despus de la realizacin de las prcticas en el laboratorio:
1. Completar el cuaderno de prcticas y entregarlo al final de las mismas
cuando el profesor lo indique.
-4-
INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS

Las clases prcticas del laboratorio de Bioqumica pretenden proporcionar
al estudiante una primera aproximacin experimental a las tcnicas bsicas
empleadas habitualmente en un laboratorio de Bioqumica, lo cual le permitir
aprender posteriormente tcnicas ms complejas con mayor facilidad.
Cada prctica presenta una breve introduccin terica que centra al

alumno sobre los objetivos de la misma. A continuacin, se detallan los reactivos,
materiales y mtodos que el alumno deber utilizar en el desarrollo de la misma.
Por ltimo, se plantean cuestiones relacionadas que el alumno deber responder
razonadamente. En el cuaderno de laboratorio deber anotar los resultados
experimentales obtenidos, realizar el trabajo indicado con esos resultados, anotar
las incidencias que hubieran podido ocurrir y responder a las preguntas
planteadas en el laboratorio, en ste guin de prcticas y en el propio
cuaderno.
El trabajo de laboratorio se concreta en cuatro prcticas, a realizar en

cuatro sesiones. Las primera prctica introduce al estudiante en las tcnicas ms
utilizadas en el estudio de protenas: precipitacin y cuantificacin. Tambin se
har un ejercicio de determinacin del peso molecular de una protena. En la
segunda prctica avanzamos en la actividad biolgica de las protenas,
caracterizando los parmetros cinticos de un enzima. En la tercera prctica se
utilizar un programa de ordenador que permite disear la mejor estrategia para
la purificacin de una protena con actividad enzimtica. En la cuarta prctica
se realizar una cromatografa en papel y adicionalmente se realizar una
demostracin de la tcnica de cromatografa de exclusin.
-5-
EVALUACIN DE LAS PRCTICAS DE BIOQUMICA

La asignatura de Bioqumica consta de dos partes, terica y prctica.
Ambas partes deben ser aprobadas de forma independiente para ser
considerado apto en la asignatura.
Las prcticas tendrn calificacin de apto o no apto, siendo requisito
indispensable superar las mismas para aprobar la asignatura. En la evaluacin
de la parte prctica se consideran requisitos indispensables:
A.- Asistencia: la realizacin de todas las prcticas es obligatoria. La no asistencia
implica declarar las prcticas suspensas, incluso en el caso de que se aprobara
el examen de prcticas.
B.- Cuaderno: Su entrega es obligatoria. Se entregar un solo cuaderno por cada
equipo de trabajo. En el cuaderno de laboratorio debe constar: 1) Objetivo de
cada prctica y desarrollo. 2) Incidencias durante la realizacin de la prctica.
3) Todos los resultados obtenidos. 4) Respuesta a las cuestiones planteadas en
cada prctica. 5.) Resolucin de los problemas planteados. Todas las grficas
deben presentarse hechas a mano en papel milimetrado original y pasadas a
tinta (no a lpiz).Es normativo que el cuaderno se entregue en la fecha indicada
por los profesores de prcticas y debidamente encuadernado en espiral. En caso
contrario, el cuaderno no ser admitido y se computar como suspenso. La
calificacin obtenida en l se tendr en cuenta en la nota final. Una vez
evaluados, los cuadernos se podrn recoger en la conserjera del edificio
polivalente o en la conserjera del aulario.
C.- Examen: En caso de suspender el cuaderno de laboratorio, se exigir un
examen prctico, que consta de dos partes:
C.1.-Test. Cada pregunta tendr cuatro opciones de respuesta, de las
cuales slo una es la correcta. Las preguntas se correspondern con los
aspectos tanto tericos como experimentales de las prcticas realizadas.
Las respuestas incorrectas no puntan negativamente.
C.2.-Problemas. Resolucin de 1 2 problemas que incluyan conceptos y
planteamientos experimentales tratados en una o varias prcticas.
El examen de prcticas se convoca conjuntamente con el examen de
teora, teniendo lugar en la misma fecha, hora y lugar que ste. El alumno que
slo quiera examinarse de prcticas debe indicarlo al principio del examen. De
lo contrario se considerar que se presenta a ambos y correr convocatoria.
Una vez aprobadas las prcticas, la calificacin de la parte prctica se
conservar hasta aprobar la parte terica. As pues, en caso de repetir la
asignatura NO se realizarn de nuevo las prcticas si stas fueron aprobadas
previamente.
-6-
PRACTICA N 1.
PRECIPITADO Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS.
El objetivo de esta prctica es el desarrollo de un protocolo para el

fraccionamiento de una protena, utilizando la tcnica del salting-out. En
concreto, se pretende enriquecer una muestra en anticuerpos, usando como
material de partida suero fetal bovino.
Los anticuerpos pertenecen a un grupo
de protenas llamadas -globulinas
inmunoglobulinas,
que
estn
compuestas por dos cadenas pesadas

(de peso molecular 55.000 Da cada
una) y dos cadenas ligeras (de peso
molecular 24.000 Da cada una) unidas
entre s por puentes disulfuro (Figura 1).
Estas protenas son muy abundantes en
la circulacin sangunea. Un cierto nmero de tcnicas ampliamente utilizadas
en los laboratorios de bioqumica y biologa molecular requieren la utilizacin de
inmunoglobulinas purificadas.
En la primera parte de esta prctica realizaremos la precipitacin fraccionada

de las protenas de suero de ternera con sulfato amnico, por lo tanto, no
estaremos
purificando
totalmente
las
inmunoglobulinas
sino
obteniendo
fracciones enriquecidas en estas. En la segunda parte se analizar el resultado

obtenido mediante valoracin cuantitativa.
-7-
1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS.

Cuando una sal se aade a una disolucin de protenas, se produce un
incremento de la solubilidad de las mismas (solubilizacin por salado o salting
in). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacin en solucin
de la protena por la disminucin de los coeficientes de actividad de los grupos
ionizables. A medida que la fuerza inica se eleva, por aumento en la
concentracin en la sal, se alcanza un mximo de solubilidad seguido de una
disminucin hasta que las protenas precipitan (precipitacin por salado o
salting out; Figura 2). Durante la precipitacin probablemente existe una
competencia por las molculas de agua de solvatacin entre la protena y la sal
por lo que las interacciones protena-protena se hacen ms importantes
producindose su precipitacin. El sulfato amnico, (NH4)2SO4, tiene una gran
solubilidad (por encima de 700 g/l) y es la sal ms utilizada para el
fraccionamiento de protenas.
-8-

- Suero de ternera (ST)
Disolucin saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturacin)
- Agua destilada.
- Tubos de plstico de centrfuga de 12 ml con tapn.
- Tubo graduado de vidrio Corex lamo.
- Pipetas de vidrio y propipetas de plstico.
- Centrfuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.
1.1.2 METODO.
1. Realizar una dilucin 1/5 del ST en H2O destilada. Preparar un volumen final de
6 ml. Aplicar la frmula:
Concentracininicial
Volumeninicial = Concentracinfinal
(Ci
Vi = Cf
Volumenfinal.
Vf.)
2. 5 ml de esta dilucin se llevan hasta un 30 % de saturacin con la disolucin

de (NH4)2SO4, saturada aplicando la siguente frmula:
Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]
Vsal= volumen que hay que aadir de la disolucin saturada de sal a la muestra.
V= volumen de muestra que se tiene.
S2= tanto por uno de la concentracin de sal a la que se quiere llevar la muestra.
S1= tanto por uno de la concentracin inicial de sal en la muestra
Se mezcla lentamente en fro, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a

4000 r.p.m. (revoluciones por minuto) durante 10 minutos a 4C.
3. Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide el volumen. El
precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fraccin 1).
4. El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 40% de saturacin
con el (NH4)2SO4 saturado. Se mezcla, se incuba 10 minutos en hielo y se
centrifuga a 4000 r.p.m. durante 10 minutos a 4C. Se pasa el sobrenadante a
-9-
un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de

H2O destilada (fraccin 2).
5. El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturacin con el (NH4)2SO4
saturado. Se procesa del mismo modo que en los pasos anteriores. El
precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fraccin 3).
6. Con las tres fracciones obtenidas y la ST(1/5) se realizarn las siguientes
diluciones (en volumen/volumen):
- ST (diluido 1/5):
dilucin 1/450 y dilucin 1/900.
- Fraccin 1
- Fraccin 2
- Fraccin 3
Para preparar cada dilucin, aplicar la frmula:

Concentracininicial x Volumeninicial = Concentracinfinal x Volumenfinal.
(Ci
Vi = Cf
Vf.)
considerando que el volumen final de las diluciones a preparar es de 900

microlitros (l), que la concentracin inicial es siempre de valor 1 en este tipo
de diluciones y que la concentracin final es el valor de la dilucin que se
desea obtener (1/12, 1/24, etc). Para diluir se utilizar agua destilada. Estas
diluciones sern necesarias para determinar la concentracin de protena de
cada fraccin obtenida.
- 10 -
1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS.

El objetivo de la prctica es calcular la cantidad total de protena
contenida en una disolucin. En un ensayo tpico de cuantificacin de protenas
la tcnica a utilizar ser la colorimetra. En sta tcnica se aade un agente
qumico colorante a una muestra de protena, provocando un cambio de color
en la muestra. El color obtenido ser ms intenso cuanto mayor sea la
concentracin de protenas en la muestra analizada. Este cambio de color es
cuantificable mediante el uso de un aparato denominado colormetro, que
analiza la intensidad del color y le asigna un valor correspondiente de
absorbancia (energa retenida por la muestra). El anlisis del colormetro consiste
en hacer pasas a travs de la muestra un haz de luz de longitud de onda
correspondiente al color adquirido por la muestra y determinar cunta energa
de ese haz de luz queda retenida por la muestra. Cuanto ms intenso sea el
color de la muestra, ms energa retiene (mayor absorbancia). Para determinar la
concentracin de protena presente en una muestra problema, se diluye la
muestra, se pone en presencia del agente colorante y se mide su absorbancia.
Este valor de absorbancia obtenido se compara con una recta patrn realizada
previamente en la que se hacen reaccionar concentraciones conocidas de una
protena control con el agente colorante. La cantidad de protena de la muestra
problema puede ser deducida entonces interpolando su absorbancia en la recta
patrn.
Colormetro y diagrama de funcionamiento.
- 11 -
El ensayo que vamos a realizar, denominado ensayo de Bradford, est

basado en el cambio de color que se produce en la muestra al poner en
presencia de protena al colorante llamado Coomassie brilliant blue G-250,
principio activo del reactivo de Bradford. El colorante se une a residuos
aminoacdicos bsicos (especialmente la arginina) y aromticos.

1.- Sero albmina bovina diluida a 1 mg/ml en agua destilada.
2.- Agua destilada.
3.- Tubos eppendorf de 1.5 ml (microtubos).
4.- Micropipetas y puntas de micropipetas.
5.- Diluciones de las fracciones obtenidas.
6.- Reactivo de Bradford.
7.- Colormetro y cubetas de plstico de colorimetra.
1.2.2 METODO.
1.- A partir de una disolucin de albmina a concentracin 1 mg/ml (1000 g/ml)
y usando agua destilada como diluyente, preparar 6 diluciones con volumen
final de 1 ml (1000 l), cada una con concentraciones finales de 5, 10, 25, 50,
75 y 100 g/ml. Realizar las diluciones en tubos eppendorf de 1.5 ml con tapa,
tambin denominados microtubos. Mezclar bien cada dilucin.
2.- Recoger una alcuota de 200 l de cada una de las diluciones preparadas
de BSA (includo el blanco) y depositarlos en una nueva batera de microtubos.
3.- Aadir 600 l del reactivo de Bradford a cada alcuota de 200 ml de cada
dilucin (includo el blanco) y mezclar manualmente por inversin. Aadir el
reactivo por orden desde la concentracin ms baja a la ms alta.
4.- Programar el colormetro a 595 nm de longitud de onda. Calibrar el
colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de
cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en cada caso. Por
- 12 -
ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin reajustar a cero)
para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir
ESTRICTAMENTE el mismo orden de concentracin ms baja a ms alta que se
sigui para aadir el reactivo de Bradford.
5.- Representar la recta patrn relacionando la absorbancia obtenida para cada
dilucin con la concentracin de esa dilucin de BSA. Ajustar la recta
grficamente.
6.- Recoger una alcuota de 200 l de cada una de las diluciones de las
fracciones obtenidas en la prctica anterior (includo el blanco) y depositarlos
en una nueva batera de microtubos.
7. Aadir 600 l del reactivo de Bradford a cada alcuota de 200 ml de cada
dilucin de las fracciones (inclur un nuevo blanco) y mezclar manualmente
por inversin. Aadir el reactivo por orden desde la concentracin ms baja a
la ms alta, desde Fraccin 1 hasta ST(1/5).
8. Calibrar el colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la
absorbancia de cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en
cada caso. Por ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin
reajustar a cero) para comprobar el error en la medida de las muestras.
9. Interpolar en la recta patrn los valores de absorbancia obtenidos para cada
dilucin de fraccin analizada, y deducir su concentracin.
Es muy importante seguir un orden a la hora de aadir el reactivo de Bradford
para la posterior medida de las muestras. Para que las medidas de absorbancia
sean fiables, todos las muestras deben estar, en la medida de lo posible, el
mismo tiempo en contacto con el reactivo de Bradford.
- 13 -

Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio
1.- Clculo de la dilucin 1/5 del Suero de Ternera (ST) en H2O destilada.
Ci
Vi = Cf
Vf.
Vi
Ci
Cf
Vf
ml
ml
.......... ml ST + .......... ml H2O = 6 ml ST 1/5.
2.- Clculo de los volmenes de solucin saturada de sal [(NH4)2SO4] necesarios

para obtener fracciones al 30%, 40% y 60% de sal.
Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]
% Sal
S2
S1
Volumen solucin saturada de sal
(peso/volumen)
(tanto por uno)
(tanto por uno)
(Vsal)
30 %
ml
40%
ml
60%
ml
Determinacin cuantitativa de protenas

1.- Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de BSA
Dilucin
Volumen inicial BSA 1mg/ml
Volumen de agua
100 g/ml
75 g/ml
50 g/ml
25 g/ml
10 g/ml
5 g/ml
Blanco
0 l
1000 l
- 14 -
2.- Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin de las fracciones.
Fraccin
Dilucin
ST (diluido 1/5)
dilucin 1/450
dilucin 1/900
dilucin 1/12
dilucin 1/24
dilucin 1/90
dilucin 1/180
dilucin 1/90
dilucin 1/180
0 l
900 l
Fraccin 1
Fraccin 2
Fraccin 3
Blanco
Volumen de fraccin
----------
Volumen de agua
3.- Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas.

Diluciones de BSA
Densidad ptica (u.a.)
100 g/ml
u.a.
75 g/ml
u.a.
50 g/ml
u.a.
25 g/ml
u.a.
10 g/ml
u.a.
5 g/ml
u.a.
Blanco (ltima)
u.a.
Diluciones de fracciones
Fr1. dilucin 1/24
u.a.
Fr1 dilucin 1/12
u.a.
Fr2 dilucin 1/180
u.a.
Fr2 dilucin 1/90
u.a.
Fr3 dilucin 1/180
u.a.
Fr3 dilucin 1/90
u.a.
St(1/5) dilucin 1/900
u.a.
u.a.
Blanco (ltima)
u.a.
- 15 -
4.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn

de sero albumina bovina poniendo en abscisas concentracin de protena y en
ordenadas el valor de absorbancia a 595 nm. Una vez obtenida la recta patrn
interpolar los resultados de absorbancia obtenidos para cada dilucin de las
fracciones. Reflejar en la grfica TODAS las interpolaciones realizadas. Calcular la
concentracin de protena que tiene cada dilucin.
Diluciones de fracciones
Concentracin de
la dilucin (g/ml)
Fr1 dilucin 1/24
u.a.
g/ml
Fr1 dilucin 1/12
u.a.
g/ml
Fr2 dilucin 1/180
u.a.
g/ml
Fr2 dilucin 1/90
u.a.
g/ml
Fr3 dilucin 1/180
u.a.
g/ml
Fr3 dilucin 1/90
u.a.
g/ml
u.a.
g/ml
u.a.
g/ml
BORRADOR PARA LA GRFICA DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS
- 16 -
5.- A partir de la concentracin de cada dilucin, calcular la concentracin real

de protenas del ST (1/5) y de todas las fracciones obtenidas multiplicando la
concentracin de cada dilucin por su valor de dilucin. Calcular el valor de
concentracin real de la fraccin como el valor medio de concentracin
obtenido a partir de cada dilucin. Calcula la cantidad (masa) de protena en
ST, ST(1/5) y en las tres fracciones, teniendo en cuenta la concentracin real y el
volumen de cada fraccin.
Factor de dilucin
Concentracin de
la fraccin (g/ml)
[Fr1. dilucin 1/24] x 24
g/ml
[Fr1 dilucin 1/12] x 12
g/ml
g/ml
g/ml
g/ml
g/ml
[St1/5 dilucin 1/900] x 900
g/ml
[St1/5 dilucin 1/450] x 450
g/ml
[St 1/5] media x 5
Concentracin
Masa de protena
media de la fraccin
de la fraccin
(g/ml)
(en g)
Fr1
g/ml
Fr2
g/ml
Fr3
g/ml
St1/5
g/ml
g/ml
St
6.- Ordenar entre s las fracciones obtenidas en funcin de su masa (de menor
cantidad a mayor cantidad), y justificar si el orden obtenido es lgico o no y
por qu.
- 17 -
1.4 EJERCICIO: DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LAS

CADENAS LIGERA Y PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partcula

cargada cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. La
partcula se desplazar hacia el electrodo de carga opuesta. As pues, una
partcula cargada positivamente (catin) se desplazar hacia el ctodo (polo
con carga negativa). Una partcula cargada negativamente (anin) se
desplazar hacia el nodo (polo con carga positiva). Como conclusin general,
en un medio determinado, las partculas se movern ms deprisa cuanto mayor
sea su carga, y ms despacio cuanto mayor sea su tamao. En este laboratorio,
las partculas sern molculas biolgicas macromolculas. En la separacin de
macromolculas, como las protenas, la carga qp es muy baja en relacin a su
masa. Para conseguir la migracion habra que aumentar mucho el campo
elctrico
se
producira
la
hidrlisis
del
agua.
Se
generaran
altas
concentraciones de OH- en el nodo y H+ en el ctodo, lo que provocara un

gradiente de pH que afectara a la carga de la partcula. Tambin habra
cambios en la viscosidad del medio debidos a la generacin de calor por una
diferencia de potencial muy elevada.
Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en un
gran volumen de medio tamponado. An as la relacin carga/masa sigue
siendo muy baja y la macromolcula migra muy lentamente con lo que el
problema de difusin se hace muy importante. Para aumentar la velocidad de la
macromolcula se aumenta la fuerza inica del medio y para evitar la difusin se
realiza la electroforesis en soportes slidos inertes denominados geles porosos.
La electroforesis es la tcnica ms utilizada en estudios analticos, sobre
todo de componentes moleculares, utilizndose frecuentemente en el laboratorio
para la separacin de protenas y de cidos nucleicos. La separacin de
protenas se realiza habitualmente mediante gel de poliacrilamida en presencia
de SDS. El gel se organiza en una red o malla a travs de cuyos poros circulan las
- 18 -
protenas a separar. Se obtiene mediante la formacin de polmeros de

acrilamida y el entrecruzamiento de stos mediado por la bis-acrilamida. El
tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin
de acrilamida y bis-acrilamida del gel. La polimerizacin es promovida por el
persulfato amnico y estabilizada por la N-N-NN-TEtraMetilEtilenDiamina (TEMED).
Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Ctodo (carga negativa). Polo inferior:
nodo (carga positiva).
Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo su

movilidad en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato
sdico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente)
que se une a una protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es
independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente 1.4 g de
detergente por gramo de protena. Existe una relacin lineal entre la distancia
que una protena recorre en un gel y el
logaritmo de su peso molecular. As pues, si
tenemos una serie de protenas de las que
conocemos
su
peso
molecular
podemos
utilizarlas como patrn y midiendo la distancia

que recorren en el gel, podemos construir una
recta que nos permita calcular el peso
molecular de nuestras protenas problema
interpolando la distancia que han recorrido.
Figura 2: Resultado de una electroforesis de protenas tipo SDS-PAGE. A la izquierda, las bandas
del marcador de peso molecular. Los carriles 1 a 8 se corresponden con distintas muestras de
protenas. Polo superior: Ctodo (carga negativa). Polo inferior: nodo (carga positiva).
- 19 -
En este tipo de electroforesis se suele usar un gel

discontinuo constituido por el gel de separacin o
resolucin (parte inferior) y el gel de concentracin o
empaquetamiento (parte superior, con pocillos). La
funcin del gel concentrador consiste en concentrar
la muestra hasta conseguir idealmente que forme
una lnea al inicio del gel resolutivo. Esto es posible
gracias a que el paso de malla de este gel es muy grande. El propsito es que
todas las muestras de protenas comiencen a resolverse por su tamao desde el
inicio del gel resolutivo, y no desde la entrada en el pocillo. Tras la electroforesis,
retiramos el gel concentrador y trabajamos slo con el resolutivo, el cual teimos
con solucin de Coomasie para revelar las bandas de protenas presentes.
En este ejercicio se van a analizar muestras provenientes de la precipitacin
fraccionada; 1.- Suero de Ternera diludo 1/5., 2.- Fraccin 1 (precipitado
obtenido con 30 % de sulfato amnico); 3.- Fraccin 2 (precipitado obtenido con
40% de sulfato amnico).; 4.- Fraccin 3 (precipitado obtenido con 60% de
sulfato amnico). Se incluir tambin un carril con marcadores de peso
molecular, que consisten en una mezcla de protenas de peso molecular
conocido que nos servirn de referencia:
Bandas del Marcador
Peso molecular
Miosina
207.000 Daltons
-galactosidasa
118.000 Daltons
Albmina de suero bovino
81.000 Daltons
Ovoalbmina
52.500 Daltons
Anhidrasa carbnica
36.200 Daltons
Inhibidor de tripsina de
29.900 Daltons
soja
Lisozima
Aprotinina
- 20 -
20.700 Daltons
7.100 Daltons
Resultado de la Electroforesis: Presentacin.
Se observan las bandas correspondientes a las cadenas pesadas en las tres fracciones. En la
ST1/5, debido a la gran cantidad de protena, aparece una mancha en la que no se puede
distinguir la banda correspondiente a la cadena pesada. Las cadenas ligeras en la fraccin I y II
no se detectan debido a la baja concentracin de protenas. En la fraccin II comienza a
detectarse una banda muy tenue, mientras que en la ST1/5 se observa ntidamente pero en forma
de mancha en lugar de en forma de banda.
Resultado de la Electroforesis: Ejercicio.
Se mide la distancia migrada en milmetros. Medir la distancia entre el inicio del gel resolutivo y el
centro de cada banda, tanto para las bandas del marcador de peso molecular de protenas
como para las bandas correspondientes a las cadenas pesadas y ligeras.
- 21 -
Ejercicio
1.- Inserta aqu las medidas de migracin de las bandas del marcador de peso
molecular y de las cadenas ligera (Cl) y pesada (Cp) de las inmunoglobulinas.
Bandas del Marcador
Peso molecular
Miosina
207.000 Daltons
mm
-galactosidasa
118.000 Daltons
mm
Albmina de suero bovino
81.000 Daltons
mm
Ovoalbmina
52.500 Daltons
mm
Anhidrasa carbnica
36.200 Daltons
mm
Inhibidor de tripsina de soja
29.900 Daltons
mm
Lisozima
20.700 Daltons
mm
Aprotinina
7.100 Daltons
mm
Fracciones
Distancia Migrada
Distancia migrada
Distancia Migrada
Cadena Pesada
Cadena Ligera
Fraccin 1
mm
mm
Fraccin 2
mm
mm
Fraccin 3
mm
mm
ST 1/5
mm
mm
Dilisis
mm
mm
Intercambio 1
mm
mm
Intercambio 2
mm
mm
Intercambio 3
mm
mm
Distancia Media Migrada
CP =
mm
CL =
mm
2.- Construir SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrn que relaciona el
logaritmo decimal de la distancia migrada (en mm) DE CADA BANDA DEL
MARCADOR con su peso molecular. Sobre esta recta INTERPOLAR la distancia
media de migracin de la cadena ligera y la cadena pesada de las
inmunoglobulinas para deducir su peso molecular. Representar sobre la
grfica ambas interpolaciones. Presentar los pesos moleculares de ambas
cadenas.
Peso molecular Cadena Pesada
Peso molecular Cadena Ligera
Daltons
- 22 -
Daltons
BORRADOR PARA LA GRFICA DE LOS PESOS MOLECULARES DE

PROTENAS
3.- Qu utilidad tiene la parte concentradora del gel de protenas?

4.- Qu ocurrira si no hubisemos aadido SDS (cargado negativamente) a la
muestra de protenas y las sometiramos a electroforesis?
PREGUNTA.- Explica razonadamente la siguiente cuestin. Las inmunoglobulinas
estn compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre
s por puentes disulfuro. Este dato nos indicara que la inmunoglobulina migrara
como una nica protena, detectando una sola banda. Sin embargo, en el gel
de electroforesis observamos que aparecen dos bandas diferenciadas (cadenas
pesada y ligera), y no una nica protena. A qu se debe este hecho?
- 23 -
PRACTICA N 2.
DETERMINACIN DE LA Km DE LA FOSFATASA CIDA PARA EL pNITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIN POR FOSFATO
La actividad enzimtica se ve afectada entre otros factores, por la
concentracin de sustrato inicial en la reaccin [S]inicial. La constante de
Michaelis-Menten (Km) se define como la concentracin de sustrato para la cual
la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima (Vmx). Permite
conocer la concentracin mnima de sustrato a la que hay que realizar los
ensayos de actividad enzimtica.
Fig. 1a: Grfica hiperblica Vo frente a [S]; Fig 2b: Grfica tipo Lineweaver-Burk (inversos).
La inhibicin enzimtica se define como la variacin de los parmetros Km

o Vmx del enzima provocada por la presencia de sustancias denominadas
inhibidores. Kap y Vmx-ap hacen referencia a la Km y Vmx del enzima
observados
en
presencia
del
inhibidor.
Los
enzimas
pueden
inhibirse
reversiblemente de manera competitiva y no competitiva. En la inhibicin

competitiva, la unin del sustrato y del inhibidor al enzima son mutuamente
excluyentes, mientras que en la no competitiva el inhibidor se une a un sitio
regulador distinto del centro activo. La inhibicin no competitiva implica la
- 24 -
disminucin de la velocidad de la reaccin catalizada por un enzima (Vmx-ap

es menor que Vmx), manteniendo Km constante. En la inhibicin competitiva
Kap es mayor que Km, mientras que Vmx se mantiene constante. En la inhibicin
competitiva se observa que al incrementar la concentracin de sustrato en la
reaccin, el porcentaje de inhibicin disminuye, mientras que en la no
competitiva el porcentaje de inhibicin permanece constante e independiente
del incremento en la concentracin de sustrato.
Fig. 2: Grficas hiperblica Vo frente a [S] y representacin de inversos para inhibicin reversible
competitiva (A) e inhibicin reversible no competitiva (B).
- 25 -
La constante de inhibicin (Ki) mide la afinidad del enzima E por el

inhibidor I. Se define como:
E+I
EI
Ki =
[E] [I]
[EI]
En el caso de una inhibicin no competitiva, Kap ser igual a Km, pero en

el caso de una inhibicin competitiva Ki debe deducirse a partir de la Kap la
cual se define como Km aparente del enzima en presencia del inhibidor.
Kap = Km {1+ ( [I]inicial / Ki )}
La fosfatasa cida de la levadura Saccharomyces cerevisiae cataliza la

siguiente reaccin: p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + fosfato
Esta enzima, como su nombre indica, tiene un pH ptimo de actividad a

pH 4. La determinacin de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la
cantidad de p-nitrofenol liberado por accin del enzima contenido en las clulas
de la levadura durante un perodo de tiempo determinado. La reaccin se
detiene aadiendo carbonato sdico (Na2CO3) que provoca un cambio brusco
de pH alcalinizando el medio. La actividad de la enzima se puede estudiar
gracias a que el producto de la reaccin (p-nitrofenol) en solucin alcalina
posee un color amarillo caracterstico que posee su mximo de absorbancia a
400 nm (mientras que el sustrato de la reaccin, p-nitrofenil-fosfato, no absorbe a
esta longitud de onda).
- 26 -
Propsito de la prctica: Determinacin de Km, Kap y Ki.

La determinacin de la Km de la fosfatasa cida para el p-nitrofenil-fosfato
se realiza incubando el enzima (fosfatasa contenida en las clulas de levadura)
con diferentes concentraciones de sutrato (p-nitrofenil-fosfato) y midiendo el pnitrofenol liberado en cada caso mediante colorimetra a 400 nm.
La determinacin de la Kap de la fosfatasa cida en presencia del fosfato
monopotsico (inhibidor) se realiza incubando la enzima en las condiciones
anteriores y en presencia de una concentracin constante del inhibidor.
Para los inhibidores de tipo competitivo, la determinacin de Ki se realiza a
partir de los datos de Km y Kap obtenidos. Para los inhibidores de tipo no
competitivo, no es posible hallar Ki a partir de Km y Kap, siendo Kap=Km.
- 27 -
2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO

2.1.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Dilucin 50 mM PNPP (sustrato).
2.- Tampn Citrato pH 4.0
3.- Pipetas de Vidrio.
4.- Micropipetas y puntas de micropipeta.
5.- Tubos de plstico de 2ml con tapn.
2.1.2 METODO.
Preparar en tubos de 2 ml un banco de diluciones seriadas a partir de una
dilucin inicial de PNPP 50 mM. Utilizar la frmula Ci
Vi = Cf
Vf. Utilizar como
diluyente TAMPN CITRATO pH 4.0.

Inserta aqu los resultados de los clculos de cada dilucin.
Dilucin de PNPP
Volumen inicial
Volumen de Tampn
Citrato pH 4.0
50 mM
2000 l
40 mM
l del 50 mM
30 mM
l del 40 mM
20 mM
l del 30 mM
10 mM
l del 20 mM
8 mM
l del 10 mM
4 mM
l del 8 mM
2 mM
l del 4 mM
- 28 -
2.2 ENSAYOS ENZIMTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR

2.2.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
1.- Banco de diluciones de PNPP (sustrato).
2.- Dilucin 15 mM Fosfato monopotsico (Inhibidor).
3.- Tampn Citrato pH 4.0
4.- Carbonto sdico 0.1 M.
5.- Pipetas de Vidrio.
6.- Micropipetas y puntas de micropipeta.
7.- Tubos de plstico de 2m y de 12 ml.
8.- Cultivo lquido de levadura.
9.- Colormetro y cubetas de colormetro.
10.- Estufa a 30 C.
11.- Centrfuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.
2.2.2 MTODO.
IMPORTANTE: Realizar primero las reacciones sin inhibidor y medir su absorbancia.
Una vez comprobado que los valores obtenidos son aceptables, realizar las
reacciones con inhibidor y medir su absorbancia.
1. Numerar los tubos de centrfuga, colocarlos en una gradilla y poner en cada
uno de ellos las cantidades de tampn, sustrato e inhibidor que se indica en la
tabla. Aadir a cada uno de los tubos (excepto el blanco) 0.2 ml de la
suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae (que contienen fosfatasa
cida). Agitar la suspensin de clulas antes de pipetearla.
2. Incubar las reacciones durante 15 minutos a 30C en una estufa o bao.
- 29 -
Preparacin de las reacciones sin inhibidor (slo sustrato).

Volumen de Tampn
Volumen de sustrato
Citrato pH 4.0
(p-Nitrofenilfosfato)
0.6 ml
0.2 ml del 2 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 4 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 8 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 10 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 20 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 30 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 40 mM
0.2 ml
0.6 ml
0.2 ml del 50 mM
0.2 ml
Blanco s
0.8 ml
0.2 ml del 2 mM
----------
nmero de reaccin
Levadura
Preparacin de las reacciones con inhibidor.

nmero de
reaccin
Volumen de
Tampn
Citrato pH 4.0
Volumen de sustrato
(p-Nitrofenilfosfato)
Inhibidor (fosfato
monopotsico
Levadura
15 mM)
0.4 ml
0.2 ml del 2 mM
0.2 ml
0.2 ml
10
0.4 ml
0.2 ml del 4 mM
0.2 ml
0.2 ml
11
0.4 ml
0.2 ml del 8 mM
0.2 ml
0.2 ml
12
0.4 ml
0.2 ml del 10 mM
0.2 ml
0.2 ml
13
0.4 ml
0.2 ml del 20 mM
0.2 ml
0.2 ml
14
0.4 ml
0.2 ml del 30 mM
0.2 ml
0.2 ml
15
0.4 ml
0.2 ml del 40 mM
0.2 ml
0.2 ml
16
0.4 ml
0.2 ml del 50 mM
0.2 ml
0.2 ml
Blanco i
0.6 ml
0.2 ml del 2 mM
0.2 ml
----------
3. Tras incubar las reacciones durante 15 minutos a 30C, detener la reaccin

con 3 ml de Carbonato sdico (Na2CO3 ) 0.1 M empezando en el mismo orden
en que se aadi la levadura. Aadir tambin 3 ml de carbonato sdico 0.1 M
al blanco.
- 30 -
4. Centrifugar para evitar la turbidez producida por las clulas y conservar los
sobrenadantes.
5. Programar el colormetro a 400 nm de longitud de onda. Calibrar el
colormetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de
cada una de las reacciones anotando el resultado obtenido en cada caso.
Por ltimo, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MS (sin reajustar a
cero) para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir
ESTRICTAMENTE el orden de concentracin ms baja a concentracin ms alta
de sustrato.
Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas.
Nmero de reaccin
u.a.
u.a.
u.a.
u.a.
u.a.
u.a.
u.a.
u.a.
Blanco s (ltima)
u.a.
u.a.
10
u.a.
11
u.a.
12
u.a.
13
u.a.
14
u.a.
15
u.a.
16
u.a.
Blanco i (ltima)
u.a.
- 31 -
Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato e inhibidor INICIALES en

cada reaccin (volumen final de la reaccin: 1 ml).
Nmero de
Volumen de sustrato
[S] inicial en la
Volumen de Inhibidor
[I] inicial en la
reaccin
usado en la reaccin
reaccin
usado en la reaccin
reaccin
0.2 ml del 2 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 4 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 8 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 10 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 20 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 30 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 40 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 50 mM
mM
----------
----------
0.2 ml del 2 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
10
0.2 ml del 4 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
11
0.2 ml del 8 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
12
0.2 ml del 10 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
13
0.2 ml del 20 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
14
0.2 ml del 30 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
15
0.2 ml del 40 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
16
0.2 ml del 50 mM
mM
0.2 ml del 15 mM
mM
- 32 -
Inserta aqu los valores de concentracin de sustrato INICIALES y absorbancia en

cada reaccin y sus correspondientes inversos.
Nmero de
reaccin
[S] inicial
1/[S] inicial
Vmax (Abs)
1/ Vmax (Abs)
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
10
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
11
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
12
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
13
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
14
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
15
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
16
mM
1/mM
u.a.
1/u.a.
- 33 -
1.- Representa grficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL las grficas

hiperblica y de inversos correspondientes a las reacciones en ausencia y en
presencia del inhibidor. La representacin se construye relacionando la
absorbancia obtenida para cada reaccin con la concentracin INICIAL de
sustrato en esa reaccin. (en abscisas, concentraciones INICIALES de pnitrofenilfosfato ensayadas; en ordenadas, absorbancias a 400 nm). Deducir
grficamente Km, Vmx, Kap y Vmx-ap tanto en la representacin
hiperblica como en la de inversos.
Inserta aqu los valores de Km, Vmx, Kap y Vmx-ap obtenidos.

Grfica
Vmax (Abs)
Km
Hiperblica
Grfica
mM
-1/Km
u.a.
1/Vmax (Abs)
(mM)-1
Inversos
Km
Kap
(u.a.)-1
Vmax (Abs)
mM
u.a.
- 34 -
Vmax-ap (Abs)
mM
-1/Kap
(mM)-1
Kap
u.a.
1/Vmax-ap
(Abs)
(u.a.)-1
Vmax-ap (Abs)
mM
u.a.
2.- Calcular el % de actividad e inhibicin producido por el fosfato monopotsico

para cada concentracin de sustrato INICIAL utilizada.
% actividad = (Abs con inhibidor/ Abs sin inhibidor) x 100.
% inhibicin = 1- % actividad.
Nmero de
reaccin
[S] inicial
% actividad
% inhibicin
mM
10
mM
11
mM
12
mM
13
mM
14
mM
15
mM
16
mM
3.- Determinar el tipo de inhibicin reversible (competitiva o no competitiva)

ejercida por el fosfato monopotsico sobre la fosfatasa cida, considerando:
1) los porcentajes de inhibicin obtenidos; 2) las variaciones entre Kap y Km y
entre Vmx ap y Vmx observados en la representacin de inversos. Razona tu
respuesta.
4.- En el caso de resultar que el fosfato monopotsico ejerce sobre la fosfatasa
cida una inhibicin reversible competitiva, calcular el valor de Ki de la
fosfatasa cida. Utilizar los valores de Km y Kap obtenidos mediante la
representacin de inversos.
Km
[I] inicial
Kap
mM
mM
- 35 -
mM
Ki
mM
BORRADOR PARA LA GRFICA HIPERBLICA DE ACTIVIDAD E INHIBICIN

DE LA FOSFATASA.
- 36 -
BORRADOR PARA LAS GRFICAS DE TIPO LINEWEAVER-BURK DE

ACTIVIDAD E INHIBICIN DE LA FOSFATASA.
- 37 -
BORRADOR PARA LA REPRESENTACIN GRFICA DEL PORCENTAJE DE

ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR RESPECTO A
LA CONCENTRACIN INICIAL DE SUSTRATO.
- 38 -
PRCTICA N 3
PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA
En esta sesin se utilizar un programa de ordenador, ProtNLab, que simula
el proceso de purificacin de un enzima. Este programa ha sido creado por el Dr.
A. G. Booth de la Facultad de Bioqumica y Biologa Molecular de la Universidad
de Leeds (Reino Unido). Las versiones del programa para distintas plataformas
(Windows,
Mac
Unix)
se
encuentra
disponible
en
la
pgina
web
http://home.btconnect.com/agbooth/archive/. La versin para entorno Windows

est depositada como material de prcticas en el Campus Virtual de la
asignatura y en las pginas web docentes de los profesores del rea de
Bioqumica y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias de la Salud III
Dres. Antonio Coloma (http://docentes.cs.urjc.es/~acoloma) y Oscar de Luis
(http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis).
3.1 PRESENTACIN DEL PROGRAMA INFORMTICO .

El programa permite simular la purificacin de 20 enzimas diferentes. Cada
enzima se identifica con un nmero del 1 al 20. Elegir el nmero deseado. A
continuacin nos indican una serie de caractersticas generales del enzima:
estabilidad trmica, estabilidad frente al pH, etc. Esta informacin no suele ser til
para disear las primeras etapas del proceso de purificacin. Es posible elegir
entre las siguientes tcnicas de separacin.
3.1.1 DESCRIPCIN DEL PROGRAMA

1.- Tratamiento con calor. En general es un paso de utilidad limitada debido a
que la gran mayora de las protenas son slo estables en un rango de
temperatura determinado, generalmente cercano al fisiolgico.
2.- Precipitacin con sulfato amnico. Define el porcentaje de saturacin inicial y
final. Prueba tres condiciones para intentar conseguir el mximo de la actividad
enzimtica en una de las fracciones (sobrenadante o sedimento) y el mximo
posible de protena total en la fraccin opuesta. Para definir nuevos porcentajes
de saturacin inicial y final usa la tecla Escape. Si no consigues una buena
separacin, utiliza otra tcnica.
- 39 -
3.- Cromatografa de intercambio de iones. El programa da a escoger entre los

siguientes tipos de intercambiadores de iones:
MATRIZ
DEAE-Celulosa
CARGA NETA
POSITIVA
CONTRAION
Anin
CM-Celulosa
NEGATIVA
Catin
Q-Sepharosa
POSITIVA
Anin
S-Sepharosa
NEGATIVA
Catin
La elucin de las protenas en la cromatografa de intercambio de iones se

realiza mediante un gradiente lineal de concentracin creciente de sal (ver
figura 1). En las fracciones obtenidas se determina la presencia de protenas
midiendo la absorbancia de las fracciones a 280 nm y la actividad enzimtica. A
continuacin, rene todas las fracciones en las que se detecta actividad
enzimtica (pool fractions) y contina con la siguiente etapa del proceso de
purificacin.
4.- Cromatografa de filtracin en gel. El programa ofrece la posibilidad de utilizar
distintas matrices para cromatografa de exclusin, en funcin del tamao
molecular de la protena que pretendemos purificar:
MATRIZ
RANGO DE FRACCIONAMIENTO ( kDa )
Sephadex G50
1.5 - 30
Sephadex G100
4 - 150
Sephacryl S-200
5 - 250
Ultrogel ACA 54
5 - 70
Ultrogel ACA 44
10 - 130
Ultrogel ACA 34
20 - 350
Biogel P 60
3 - 60
Biogel P 150
15 - 150
Biogel P 300
60 - 400
- 40 -
5.- Cromatoenfoque e Isolectroenfoque preparativo: Estas tcnicas permiten

separar las protenas por diferencias en su punto isoelctrico (pI).
El programa permite estimar el enriquecimiento y el rendimiento obtenido en
cada etapa de la purificacin (purification record). Se incluyen los siguientes
datos en forma de Tabla:
1.- Enzyme (units). Se refiere a la actividad enzimtica total.
2.- Proteina total (mg). Incluye el enzima que ests purificando y todos los
dems enzimas contaminantes.
3.- Rendimiento (yield): (enzyme units FINAL / enzyme units INICIAL ) X 100. El
rendimiento estima la prdida de actividad enzimtica a lo largo de la
purificacin. Debe ser lo ms prximo posible al 100%.
4.- Enriquecimiento (enrichment factor): actividad especfica FINAL / actividad
especfica INICIAL. Actividad especfica = enzyme units / protena total. El
enriquecimiento estima el grado de purificacin obtenido. Cuanto mayor
sea su valor numrico, mayor ser el grado de pureza.
El grado de pureza tambin se puede determinar mediante tcnicas de
electroforesis. El programa permite realizar electroforesis monodimensional en
condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE, ver fundamento en la
prctica 3) y bidimensional ( 2D SDS-PAGE ).
La electroforesis bidimensional consta de dos electroforesis consecutivas:
1.- Isoelectroenfoque. Destruye la estructura cuaternaria de las protenas
(incluyendo los puentes disulfuro), con lo que separa los distintos polipptidos,
monmeros o subunidades de un enzima multimrico. Separa los polipptidos
por sus puntos isoelctricos en un gel de poliacrilamida en el cual se establece
un gradiente de pH utilizando una mezcla de tampones. Los polipptidos se
mueven en funcin de su carga neta hasta la zona del gradiente donde el pH es
- 41 -
igual a su punto isoelctrico (pI), en la cual su carga neta ser cero y por lo tanto
su movilidad ser nula. El isoelectroenfoque es la primera dimensin (figura 2).
2.- Electroforesis SDS-PAGE. El gel de isoelectroenfoque se sita perpendicular a la
direccin de migracin de la segunda electroforesis en un gel de poliacrilamida
en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) (figura 2). Las protenas
migran en esta segunda dimensin en funcin de su peso molecular y se
detectan como manchas discretas en una posicin que se corresponde en la
dimensin horizontal con su peso molecular y en la vertical con su punto
isoelctrico ( pI ). La electroforesis bidimensional tiene una alta resolucin,
permitiendo separar incluso 2000 protenas diferentes en un solo gel.
3.1.2 MTODO.
Nuestro objetivo es purificar a homogeneidad (sin ningn otro enzima
contaminante) el enzima contenido en el material de partida. Para ello, a partir
de una muestra determinada se irn realizando secuencialmente las pruebas
indicadas en la descripcin del programa, variando las condiciones de cada
ensayo para optimizar la purificacin de la protena problema.

Purificacin virtual de dos muestras.
El profesor la profesora de prcticas asignarn a cada grupo de trabajo
el nmero de dos muestras que deben procesar. Se anotarn todos los pasos
dados durante la purificacin en su orden correspondiente y las condiciones de
cada uno de stos, as como su rendimiento. El resultado final de cada
purificacin virtual debe ser una sola mancha en un gel bidimensional
(homogeneidad), alcanzar un rendimiento lo ms prximo al 100 % (mnima
prdida de actividad enzimtica) y un enriquecimiento lo ms alto posible (alto
grado de pureza). Cada purificacin debe ser realizada con el mnimo nmero
de pasos posible.
- 42 -
Problema
Se dispone de una mezcla de tres protenas A, B y C que deseamos
purificar. La protena A es una enzima, por lo que utilizaremos la medida de su
actividad enzimtica para seguir su separacin. En primer lugar, realizamos
precipitacin con sulfato amnico hasta saturacin final del 45% y conservamos
la fraccin soluble. Teniendo en cuenta los resultados de valorar la mezcla inicial
y la fraccin soluble presentados en la tabla, calcular la actividad total y el
enriquecimiento de esta fraccin.
Como segundo paso del proceso de purificacin, realizamos cromatografa
de intercambio de iones en DEAE-Celulosa a pH 8,5 y elucin en un gradiente de
Cl Na. Los resultados de valorar la actividad enzimtica y la cantidad de protena
en cada una de las fracciones obtenidas se muestran en el siguiente grfico,
mientras que las mismas medidas realizadas en una mezcla de las fracciones 4 a
9 se presentan en la tabla. Calcular el rendimiento y el enriquecimiento para este
paso.
PROTEINA
ACTIV ENZ
RENDIMIENTO
ENRIQUECIMIENTO
MG
UI
INICIAL
511
6.000
100
Sulfato amnico
121
DEAE-CELULOSA
19
94
5.600
0.5
0
5
10
15
20
25
30
Nmero de fraccin
_________________Cantidad de protena
. . . . . . . . . . . . . . . . . . Actividad enzimtica de A
--------------------Concentracin molar
de Cl Na
- 43 -
35
40
45
50
Para purificar las protenas B y C, se juntan las fracciones 35 a 43 y el

pool resultante se analiza por electroforesis bidimensional. La separacin en la
dimensin horizontal es por isoelectroenfoque. La separacin en la dimensin
vertical es por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE). El resultado es:
5
pH
kDa
94
68
C
B
45
Si se sabe que la protena B es un homotrmero cuyas tres cadenas

polipeptdicas idnticas estn unidas por puentes disulfuro y la C es un
monmero, qu tcnica usaras para separar la protena B de la C? Por qu?
- 44 -
PRACTICA N 4.
TCNICAS CROMATOGRFICAS.
Muchas de las tcnicas que se utilizan en Bioqumica para la separacin de
los componentes de una mezcla de molculas biolgicas, se basan en las
diferencias que existen en las propiedades fsicas y/o qumicas de sus
componentes. Los componentes con propiedades fsico-qumicas muy diferentes
son fcilmente separables, sin embargo,si presentan propiedades muy similares,
los mtodos de separacin tendrn que ser ms complejos.
En todas las cromatografas existen una fase mvil y una fase estacionaria.
La velocidad a la que cada componente atraviesa la fase estacionaria depende
de la suma de la fuerza de transmisin que produce el movimiento de la fase
mvil y de la fuerza de interaccin del componente con la fase estacionaria que
tiende a frenar este desplazamiento.
La interaccin de los componentes con la fase estacionaria puede consistir
en un reparto entre la fase estacionaria y la fase mvil o en una adsorcin a la
fase estacionaria. Un tipo particular de cromatografa de reparto lo constituye la
cromatografa de filtracin en gel (o tambin denominada de exclusin). Otras
cromatografas se basan en la adsorcin, como la cromatografia de intercambio
de iones y la cromatografa de afinidad.
- 45 -
4.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

En esta prctica se utilizar la cromatografa en papel para separar por
polaridad verde luz, hemoglobina y azul dextrano. Sobre un soporte fsico (papel)
embebido en agua (fase estacionaria) depositaremos en la base una muestra de
la mezcla de pigmentos. A continuacin pondremos la base del papel en
contacto con un disolvente orgnico (fase mvil), permitiendo que ascienda a lo
largo del papel por capilaridad. La fase mvil ascender por el papel sin
mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irn separando en
funcin de su polaridad. Los pigmentos ms polares (hidroflicos) se retendrn
ms en la fase estacionaria, mientras que los ms apolares (hidrofbicos)
avanzarn ms rpido junto con la fase mvil. La movilidad de cada compuesto
respecto al frente del disolvente tiene un valor caracterstico, en unas
condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficiente o
factor de reparto (Rf). Aqul pigmento que resulte ms hidrofbico conseguir
avanzar ms lejos sobre el soporte slido, consiguiendo un valor de Rf ms alto.
Los tres componentes que queremos separar absorben en la regin visible del
espectro y ello nos permitir visualizar su separacin a lo largo del papel.
Figura 1: Resultado de una cromatografa en papel.
- 46 -

1.- Tira de papel Whatman.
2.- Placa de Petri.
3.- Fase mvil: disolvente apolar mezcla de ter de petrleo/acetona/benceno
en proporcin 85/10/5.
4.- Fase estacionaria: agua destilada.
5.- Mezcla de pigmentos.
6.- Tubo Falcon de 50 ml.
7.- Regla (con escala en milmetros) y lapicero.
4.1.2 MTODO.
1.- Recortar una tira de papel Whatman de 15 cm de largo por 2,5 cm de ancho.
Dibujar sobre el papel Whatman 2 lneas con lpiz. Una a 2 cm de uno de los
extremos y otra a 6 cm del otro extremo.
2.- Embeber el papel Whatman en fase estacionaria (agua) dentro de la placa
petri, procurando eliminar el exceso.
3.- En un tubo Falcon de 50 ml, aadir 3 ml de fase mvil (mezcla de disolvente).
Depositar el Falcon cerrado en una gradilla.
4.- Situar la tira de papel embebida en agua sobre la tapa seca de la placa de
petri. Sobre la lnea situada a 2 cm del papel de celulosa, depositar un par de
muestras de la mezcla de pigmentos. Cada muestra ser de 5 l y deben estar
suficientemente separadas entre s.
5.- Abrir el Falcon, tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos e
Introducirla en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente
moje el extremo inferior de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra. A
- 47 -
continuacin, doblar el extremo superior por fuera del Falcon (por encima de la
marca de 6 cm) y cerrarlo con la tapa.
6.- Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente
la marca superior del papel. Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de
cada mancha de pigmento que aparezca.
Figura 2: Medicin de la distancia migrada por cada pigmento
Rf = DA / DS
DA=
distancia
alcanzada
por
el
alcanzada
por
el
pigmento.
DS=
distancia
disolvente
- 48 -
4.2 DEMOSTRACIN: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIN.

La cromatografa de filtracin en gel separa molculas por tamao, que
es funcin de su peso molecular. La fase estacionaria la forma un gel, que se
introduce en una columna. El gel est constituido por esferas con poros de un
determinado dimetro (ver figura 1). La fase estacionaria es en realidad la parte
de la fase mvil que est en el interior de los poros. Las molculas grandes no
entran en los poros de las esferas del gel y por ello son arrastradas (eluyen) muy
rpidamente por la parte de la fase mvil exterior a las esferas, el volumen de
exclusin de la columna. Las molculas pequeas entran en los poros de las
esferas del gel y por ello eluyen ms lentamente. De esta forma, las molculas se
separan en funcin de su tamao, eluyendo fuera de la columna en orden
decreciente de peso molecular.
Figura 1. Principio de la cromatografa de exclusin
A)
B)
- 49 -
Considerando este modelo, se definen los siguientes parmetros :

VE= volumen de elucin de una molcula. Es el volumen de fase mvil que es
necesario hacer fluir por la fase estacionaria para que la molcula salga eluida
de la columna.
Vo = volumen de fase mvil fuera de las esferas del gel o volumen de exclusin
Vi = volumen de fase mvil en el interior de los poros del gel. Se determina como
diferencia entre el volumen mximo de elucin y el volumen mnimo de
elucin volumen de exclusin.
VG = volumen de las esferas del gel, menos el volumen de los poros
VS = Vi + Vg = volumen de sephadex hodratado.
Vt = Vo + Vi + Vg = volumen total de la columna.
El coeficiente de distribucin, KD, de una molcula entre la fase estacionaria y la
fase mvil representa la fraccin de la fase estacionaria (Vi) que es accesible
para la molcula y se define como: Kd = ( Ve Vo ) / Vi.
El volumen de exclusin Vo es el volumen de elucin de una molcula de muy
alto peso molecular que se excluye de los poros del gel (por ejemplo azul
dextrano de peso molecular mayor de 106 Da).. Para esta molcula Ve=Vo, lo
que implica que su Kd = 0 y el volumen de elucin es el mnimo posible. Para
molculas de peso molecular muy pequeo Ve = Vo + Vi, lo que implica Kd = 1,
siendo entonces el volumen de elucin el mximo posible. Por lo tanto, el
coeficiente de distribucin Kd est comprendido entre cero y uno.
Para protenas globulares existe una relacin lineal entre el logaritmo de sus
pesos moleculares y su volmenes de elucin de la forma.
log Pm = a b Ve
en la que a mayores valores de Pm (y log Pm) correspondern a menores valores
de Ve y viceversa. Los trminos a y b son constantes y sus valores dependen del
gel y de las dimensiones de la columna. Si separamos varias molculas patrones
de pesos moleculares conocidos, la determinacin de sus volumenes de elucin
permite establecer una recta patrn del logaritmo del peso molecular frente al
volumen de elucin Ve.
- 50 -
Si queremos determinar el peso molecular de una molcula, bastar con

separarla utilizando la misma columna en las mismas condiciones que con los
patrones, determinar su volumen de elucin e interpolar en la recta patrn.
En esta demostracin se utilizar la cromatografa de filtracin en gel
Sephadex G-100, para separar por peso molecular verde luz, hemoglobina y azul
dextrano. Los tres componentes que queremos separar absorben en la regin
visible del espectro y ello nos permitir visualizar su separacin a lo largo de la
columna y en las diferentes fracciones recogidas.
- 51 -

Cromatografa en papel.
1.- En la cromatografa en papel, identifica qu mancha se corresponde con
cada pigmento en el ensayo realizado. Completa el cuadro y calcula la Rf
media para cada pigmento. Ordena los pigmentos entre s de mayor a menor
hidrofobicidad.
Pigmento
Verde Luz
Azul dextrano
Hemoglobina
Muestra
aplicada
Valor DA
Valor Rf
Muestra 1
mm
mm
Muestra 2
mm
mm
Muestra 1
mm
mm
Muestra 2
mm
mm
Muestra 1
mm
mm
Muestra 2
mm
mm
Valor medio
Rf
mm
mm
mm
Valor Ds:______________mm
1er Pigmento ms hidroffico:
2do Pigmento ms hidroffico:
3er Pigmento ms hidroffico:
2.- Razona en funcin de la prctica realizada qu factores pueden afectar al Rf.

Justifica la incidencia de cada factor propuesto.
- 52 -
ANOTACIONES
- 53 -
ANOTACIONES
- 54 -
ANOTACIONES
- 55 -

Ejercicios Bioquimica

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PRACTICAS DE BIOQUIMICA

Dpto. de Ciencias de la Salud III

Universidad Rey Juan Carlos

Prcticas de Bioqumica: ndice.

INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS

EVALUACIN DE LAS PRCTICAS

PRACTICA N 1: PRECIPITACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTEINAS. 08

1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS.

1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 1.

1.4 EJERCICIO: DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LAS CADENAS LIGERA Y

PRACTICA N 2: DETERMINACIN DE LA Km DE LA FOSFATASA CIDA

2.2 ENSAYOS ENZIMTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR

2.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 2.

PRCTICA N 3: PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD

3.2 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 3.

PRCTICA N 4: TCNICAS CROMATOGRFICAS.

4.1. CROMATOGRAFA EN PAPEL.

4.2. DEMOSTRACIN: CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN.

4.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 4.

LABORATORIO DE PRCTICAS: UBICACIN.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO

INTRODUCCIN A LAS PRCTICAS

Cada prctica presenta una breve introduccin terica que centra al

El trabajo de laboratorio se concreta en cuatro prcticas, a realizar en

EVALUACIN DE LAS PRCTICAS DE BIOQUMICA

El objetivo de esta prctica es el desarrollo de un protocolo para el

compuestas por dos cadenas pesadas

En la primera parte de esta prctica realizaremos la precipitacin fraccionada

fracciones enriquecidas en estas. En la segunda parte se analizar el resultado

1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS.

1.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

2. 5 ml de esta dilucin se llevan hasta un 30 % de saturacin con la disolucin

Se mezcla lentamente en fro, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a

un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de

dilucin 1/450 y dilucin 1/900.

dilucin 1/12 y dilucin 1/24.

dilucin 1/90 y dilucin 1/180.

dilucin 1/90 y dilucin 1/180.

Para preparar cada dilucin, aplicar la frmula:

considerando que el volumen final de las diluciones a preparar es de 900

1.2 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS.

Colormetro y diagrama de funcionamiento.

El ensayo que vamos a realizar, denominado ensayo de Bradford, est

1.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

1.3 CLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRCTICA 1.

.......... ml ST + .......... ml H2O = 6 ml ST 1/5.

2.- Clculo de los volmenes de solucin saturada de sal [(NH4)2SO4] necesarios

Volumen solucin saturada de sal

(tanto por uno)

(tanto por uno)

Determinacin cuantitativa de protenas

Volumen inicial BSA 1mg/ml

3.- Inserta aqu las medidas colorimtricas obtenidas.

Densidad ptica (u.a.)

Densidad ptica (u.a.)

Fr1. dilucin 1/24

Fr1 dilucin 1/12

Fr2 dilucin 1/180

Fr2 dilucin 1/90

Fr3 dilucin 1/180

Fr3 dilucin 1/90

St(1/5) dilucin 1/900

St(1/5) dilucin 1/450