ESTRATEGIAS GENERALES PARA LA PURIFICACION E

IDENTIFICACIN DE PROTEINAS EN FISIOLOGIA VEGETAL

Para qu purificar protenas?
- Para entender que est pasando en la clula y entre las clulas.
Reconstruccin de rutas metablicas. Son necesarios enzimas puros para
estudiar la cintica, regulacin de la reaccin etc.
- Para estudiar desviaciones del metabolismo normal.
- Purificacin de enzimas para su uso como biotacalizadores (lipasas,
proteasas, glucosa isomerasa), uso en terapeutica (insulina, interleukinas)
- Purificacin de proteina recombinante, ensayos de transformacin genetica.
- Y muchas otras razones
La purificacin de una protena que no ha sido previamente purificada es un
proceso casi emprico que ha de guiarse tanto por protocolos previamente establecidos
como por el sentido comn. El grado de pureza requerido depende de la finalidad de la
protena purificada. Los procesos de purificacin se caracterizan por comenzar con una
primera etapa de extraccin de proteinas, seguida de unas fases de purificacin y
comprobacin de la actividad enzimtica/protena buscada.
1.- EXTRACCIN DE PROTENAS
No debemos olvidar que el propsito final es purificar una protena u obtener
una actividad enzimtica especfica, por que en todo momento deberemos procurar
trabajar en condiciones que preserven las protenas. Durante todo el proceso deberemos
de trabajar con las muestras en hielo para conservarlas y a la vez inhibir proteasas.
El primer paso, obligado para cualquier purificacin, es la liberacin de
protenas. Para ello deberemos homogeneizar el tejido (mecnicamente,
enzimaticamente, choque osmtico, sonicacin, etc.) en un tampn de extraccin
adecuado. La funcin de este tampn es estabilizar las protenas y evitar la accin de
proteasas.
En un primer paso separaremos las protenas hidrosolubles de las liposolubles
mediante centrifugacin:
Protenas hidrosolubles: permanecen en solucin en solventes acuosos y
se pueden separar de la parte no soluble mediante centrifugacin.
Protenas liposolubles: en el extracto crudo suelen encontrarse asociadas
a restos de membranas de las que se pueden liberar mediante extraccin con
agua, con detergentes o mediante la rotura ultrasnica de la membrana.
Al tampn de extraccin con las protenas sin ningn paso de purificacin se le
denomina extracto crudo. Realizaremos un primer ensayo de actividad.

2.- METODOS GENERALES DE SEPARACIN

2.1.- Inmunoprecipitacin
Proceso rpido y especfico de separacin proteica mediante precipitacin.
Requiere la utilizacin de anticuerpos contra esa protena, por lo que no suele ser
aplicable en la purificacin de protenas nuevas. La unin Ag-Ac causa la precipitacin
del complejo, separndolo del extracto crudo.

Abbas, Litchman & Pober, Cellular and Molecular Inmunology, W.B. Saunders, 1999. Figure A-2

2.2.- Purificacin de protenas asociadas a membrana

Protenas adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que
desestabilizan las uniones no covalentes.
Protenas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de
fosfatasas, aunque muy probablemente perderemos la actividad en la purificacin. Para
evitar esto podemos emplear detergentes, siendo complicada la purificacin posterior.

3.- SEPARACIN POR TCNICAS CROMATOGRAFICAS

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los compuestos a
separar se distribuyen entre dos fases:
Fase estacionaria, de gran rea superficial, que puede ser slida o
lquida, estando en este caso dispuesta sobre un slido que le sirva de soporte.
Fase mvil, fluido que pasa a travs de la fase estacionaria. Puede ser
liquida o gaseosa.
Los compuestos eluidos (que han
atravesado la fase estacionaria) son transportados
por la fase mvil a un detector que los registra en
forma de curvas gausianas (forma de campana).
Se utiliza un detector UV seleccionado a 280 nm
ya que las protenas poseen un mximo de
absorcin aproximadamente a esta longitud de
onda debido a la presencia de aminocidos
aromticos (fundamentalmente Trp y Tyr). Dichas
seales se denominan picos y el conjunto de picos
y lnea base registrado se denomina
cromatograma. Las fracciones eluidas se van recogiendo independientemente, ya que las
protenas que contienen son distintas.
Los picos dan informacin cualitativa y cuantitativa de la mezcla en cuestin.
Cualitativa: el tiempo de retencin TR es siempre constante bajo condiciones
cromatogrficas idnticas. Por tanto un pico puede ser identificado por comparacin de
tiempos de retencin. Cuantitativa: el rea de un pico es proporcional a la cantidad de
muestra inyectada.
En funcin de las fases estacionaria y mvil empleadas existen numerosos tipos
de cromatografa. A modo de ejemplo citaremos algunas clases de cromatografa
lquida:
Tipos de cromatografa lquida
De Exclusin Molecular (tambin
denominada de Filtracin en Gel)
De Afinidad
De Intercambio inico

Separacin por
Tamao
Unin a grupos funcionales
Carga elctrica

4.- SEGUIMIENTO DEL PROCESO

No debemos olvidar que el fin ltimo es recuperar una protena o actividad
enzimtica especfica. A medida que vamos realizando la purificacin debemos ir
rellenando una tabla descriptiva del proceso (ver ejemplo)
Etapa
EC
SA
CII
FG

Volumen
(ml)
500
100
45
50

Actividad
Total (U)
3,000
2,400
1,440
1,000

Protena
Total (mg)
15,000
4,000
500
125

Act. Espec.
(U/mg)
0,2
0,6
2,9
8.0

Cantidad
(%)
100
80
48
33

Factor
de
Purificacin
3,0
14,5
40,0

EC: Extracto crudo. SA: Precipitacin con sulfato de amonio. CII: Cromatografa de intercambio inico. FG: Filtracin en gel.

Esta tabla nos permite realizar un seguimiento de la purificacin de nuestra

protena. En cada paso perdemos actividad enzimtica, las enzimas son frgiles y por
mucho cuidado que tengamos se degradan, adems que la purificacin no es 100%
sensible. Pese a las perdidas, en cada paso de purificacin la relacin entre la actividad
enzimtica y la cantidad de protena total (cociente denominado actividad especfica) es
mayor. La purificacin ideal es aquella en la que al final solo nos queda nuestra
protena. Esto lo comprobaremos mediante un SDS-PAGE.
Para identificar en que fraccin obtenida por cromatografa est la protena
problema deberemos realizar ensayos de actividad enzimtica o mediante la unin a
sustratos o marcadores especficos.
5.- IDENTIFICACIN DE LA PROTENA
Para identificar la protena es necesario conocer la secuencia de aminocidos,
para ello podemos emplear una serie de tcnicas:
Degradacin
de
Edman: Se basa en la escisin
y posterior identificacin del
aminocido del extremo amino
terminal. Este proceso se
realiza reiterativamente, por lo
que
puede
automatizarse.
Existen mquinas llamadas
secuenciadores de protenas. La
cantidad de protena necesaria
es mnima, pudiendo obtenerla
incluso a partir de una banda de
un gel. Es un mtodo lento que
no puede analizar fragmentos
mayores de 50 aminocidos.
Para evitar esto se suelen cortar
las protenas en fragmentos
pequeos y luego ordenarlos.
Analisis peptdico por MALDI-TOF: La protena purificada se degrada,
obteniendo peptidos cortos correspondientes a toda su secuencia. Posteriormente, se
analizan mediante espectrometria de masas, pudiendo reconstruirse as parte de la
secuencia. Con esta secuencia uno recurre a las bases de datos para poder identificarla.
Mtodo no til en el descubrimiento de nuevas protenas.
Anlisis del mRNA: Conociendo el mensajero podremos saber la secuencia de
aminocidos de la protena. Muy til para simplificar su purificacin, en caso de
proteina recombinante siempre sabemos la secuencia.