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RESUMEN
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos
animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo
representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente.
El glucgeno posee una estructura ramificada con cadenas lineales de
restos consecutivos de glucosa, unidos por enlaces (1-4), y por enlaces (1-6)
en los puntos de ramificacin. La hidrlisis de estos enlaces glucosdicos
puede ser catalizada por cidos minerales. stos rompen enlaces al azar, con
formacin intermediaria de todos los posibles oligosacridos y la conversin
final de stos en glucosa.
La naturaleza polisacrida del glucgeno se pone de manifiesto
demostrando el aumento de grupos reductores durante la hidrlisis, que se
detectan mediante el reactivo 3-5-dinitrosaliclico (3-5-DNS). Este reactivo en
presencia de azcares reductores se reduce a cido 3-amino-5-dinitrosaliclico
(producto coloreado que absorbe a 540 nm).
1
3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Hidrlisis cida del glucgeno
3.1.1. Se preparan 8 tubos de ensayo de vidrio y se marcan del 1 al 8. Se
aaden a cada uno de ellos el glucgeno (excepto al primero que lleva
agua) y la solucin de HCl segn se detalla en la Tabla 1:
HCl
(2 M)
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
Tiempo de
incubacin a100C
0 min
0 min
2 min
4 min
6 min
8 min
10 min
12 min
NaOH
(1,2 M)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
35DNS
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
-amilasa
(mL)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Tiempo de
incubacin
0 min
0 min
1 min
2 min
3 min
4 min
5 min
6 min
35 DNS
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
3. RESULTADOS ESPERADOS
Los resultados de absorbancia a 540 nm van incrementndose desde el tubo
1 al 8, tanto en la hidrlisis cida (Tabla 3; Figura 1) como enzimtica (Tabla 4;
Figura 2) pues a mayor tiempo transcurrido habr mayor hidrlisis de
glucgeno y por tanto mayor nmero de grupos reductores que reaccionan con
el DNS y se convierten en 3-amino-5-dinitrosaliclico, compuesto anaranjado
que tiene su mximo de absorbancia a 540 nm.
En ambos casos, se muestran tanto los valores de absorbancia obtenidos
como los porcentajes de hidrlisis respecto al tiempo, considerando el 100 %
de hidrlisis la del tubo 8. La representacin se hace con los porcentajes de
hidrlisis de glucgeno y el tiempo transcurrido.
3.1. Hidrlisis cida
Tabla 3. Resultados de hidrlisis cida
Tubo
1
2
3
(n)
Tiempo
0
0
2
(min)
A540
0
0,01
0,260
(nm)
0
0,77
10
12
0,520
0,780
1,01
1,150
1,30
40
60
77,7
88,5
100
20
120
100
80
60
40
20
0
0
6
8
Tiempo (min)
10
12
14
1,67
22
40
0,35
0,46
0,54
0,60
58
77
90
100
120
100
80
60
40
20
0
0
3
4
5
6
7
Tiempo (min)
Figura 2. Representacin grfica de los resultados obtenidos y detallados en la Tabla 4
5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
Los resultados obtenidos tanto en la hidrlisis cida como enzimtica deben
corresponderse con un aumento de dicha hidrlisis a lo largo del tiempo. Este
aumento debe ser proporcional, aunque sta puede perderse en los ltimos
minutos si ya se ha conseguido hidrolizar prcticamente todo el glucgeno de
la muestra. Tambin se puede perder la proporcionalidad si no se aade el
NaOH, en el caso de la hidrlisis cida, o el DNS, en el de la hidrlisis
enzimtica, en los tiempos indicados pues no se parara la hidrlisis de
glucgeno de forma adecuada.
Existe una diferencia clara entre los valores de absorbancia a 540 nm
obtenidos para la hidrlisis cida y enzimtica, siendo mucho mayores los
primeros. Esto, lgicamente, es debido a que con la hidrlisis cida se
consiguen hidrolizar todos los enlaces del glucgeno mientras que con la amilasa slo los (1-4).
A los alumnos al finalizar la parte prctica, se les entregar un folio donde
tendrn que mostrar los resultados obtenidos en ambas hidrlisis y representar
los porcentajes. Adems, tendrn que contestar varias preguntas para evaluar
su aprovechamiento y comprensin de la prctica.
5
6. BIBLIOGRAFA
Clark JM (1966): Bioqumica Experimental, 1 ed. Editorial Acribia (Zaragoza,
Espaa), pp 42-45.
Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega
(Barcelona, Espaa), pp 304-305.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert
(Barcelona, Espaa), pp 577-580.
167,02 mL
Hasta 1 litro
pureza
del
35%
una
48 g
Hasta 1 litro
80 mg
Hasta 10 mL
80 g
Hasta 1 litro
Solucin de 3-5-DNS
Tabla 10. Solucin de 3-5-DNS
cido dinitrosaliclico
10 g
NaOH 2,0 M
Hasta 200 mL
Calentar hasta la disolucin total.
Reactivo 3-5-DNS
Tabla 12. Reactivo DNS
Solucin de 3-5-DNS
Solucin tartrato NaK-4H2O
Agua destilada
200 mL g
500 mL
Hasta 1 litro
Solucin de -amilasa
Tabla 13. Solucin de -amilasa
Saliva humana
Solucin de fosfato sdico pH 7,0
0,25 mL
Hasta 20 mL