1.

EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS

MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

-2007

MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un gran
potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de alimentos,
desde sustancias inorgnicas hasta materias orgnicas sumamente
complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia
diversidad de nichos ecolgicos con temperatura, acidez o tensiones de
oxgeno extremas.
Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo ms
prctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr estas
poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que brinde a
los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para
desarrollarse. Este ambiente artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.
* MEDIO DE CULTIVO es toda preparacin artificial, slida, semislida o
lquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias
fundamentales, una fuente de energa y condiciones ambientales
adecuadas para la sntesis y mantenimiento de su protoplasma.

CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se

obtienen en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a)
puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida por
una nica clase de microorganismos.
b)
mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de una
clase de microorganismos.
En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se pueden
cultivar fuera de su hbitat natural. Ciertos parsitos obligados como
las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales;
requieren clulas vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.
CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGN LA FUENTE DE
ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN
Al disear un medio de cultivo es importante conocer los
requerimientos de energa y carbono de las especies a cultivar.
- Fuente de energia, puede ser:

- luz: energa luminosa que se

convierte en energa qumica. Los microorganismos que utilizan esta
fuente de energa se denominan fototrofos.
- reacciones de oxido-reduccin a partir de
compuestos qumicos inorgnicos u orgnicos. Los microorganismos
que utilizan esta fuente de energa se denominan quimiotrofos.
Todos los organismos requieren una fuente de energa para obtener ATP
y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes
metabolismos:
- respiracin aerobia: aceptor final de electrones O2
- respiracin anaerobia: aceptores finales de electrones: NO 3-,
SO4=, CO2, fumarato
- fermentacin: conjunto de reacciones donde compuestos
orgnicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se
produce ATP por fosforilacin a nivel de sustrato.
- Fotosntesis
- Fuente de carbono, puede ser:
- CO2: los microorganismos que
utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.
compuestos orgnicos carbonados
(azcares, aminocidos, cidos grasos, etc). Los microorganismos que
utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.
De la combinacin de estas categoras surge la sig. clasificacin de
microorganismos:
Fuente de energa
Ejemplos

Luz

Fuente de carbono

CO2
acetato

Categora

Fotoautotrofos

Algas,
cianobacterias

Fotoheterotrofos

Alg. bacterias

Reacciones
CO2
Bacterias oxidantes de

Quimiolitotrofos

de xido-reduccin
del azufre, de Fe2+
compuestos orgnicos
Hongos, bacterias
Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

H2,
Quimioorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario conocer
en qu categora est incluido el microorganismo a cultivar para elegir
acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos
inorgnicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y
orgnicos para quimioorganotrofos.
Un medio de cultivo est integrado por:
1. Elementos energticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):
Fuente de carbono: puede ser CO2 compuestos carbonados
orgnicos. Se utilizan en la construccin de innumerables
molculas necesarias para la clula. Los hidratos de carbono
se consideran fuente de carbono y energa por excelencia
en los quimioorganotrofos. Los ms comunes son:
hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
trisacridos como rafinosa;
polisacridos como almidn, glucgeno;
alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
glucsidos como salicina, y esculina.
Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos
respecto de la fuente de nitrgeno y pueden crecer utilizando
molculas sencillas como NO3-, NH3 N2. El nitrgeno es
metabolizado para proveer protenas, cidos nucleicos y
polmeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar
nitrgeno en forma de aminocidos, bases pricas o
pirimdicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el
aporte de nitrgeno es realizado por las peptonas, que son
los productos de la hidrlisis cida o enzimtica de protenas
de origen animal o vegetal (carne, soja, casena, gelatina,

harina de maz y girasol). Esos productos de hidrlisis pueden

tener longitud variable, desde aminocidos, hasta dipptidos,
tripptidos, polipptidos, albumosas, proteosas.
La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H 2SO4 y
presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipptidos
Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes
proteasas actuando a pH especficos, ej. papana a pH 6.5,
tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de
hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo,
cumplen la funcin de fuente de carbono y energa. Aportan
vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan
carcter buffer al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos
fermentables.
Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o
potasio que tambin confieren poder buffer al medio de cultivo
(pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de
cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolpidos
de la yema. El fsforo se incorpora a cidos nucleicos,
fosfolpidos, polmeros de membrana, ATP, y sustancias de
reserva (grnulos de volutina)
Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina.
En la clula se incorpora a aminocidos y diferentes
coenzimas.
Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y
magnesio se adicionan como sales inorgnicas. Son cationes
que estabilizan macromolculas aninicas. K + acta como
coenzima y estabilizador de RNA. Mg 2+ se integra a colorofila
en organismos fotosintticos. Ca2+ abunda en esporas como
dipicolinato de calcio.
Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin
osmtica del medio extracelular. Es un catin requerido por
bacterias haloflicas. Se suele suministrar como NaCl.
b) Microelementos o trazas (mg ug/ml): suelen estar
naturalmente
presentes
como
contaminantes
de
los
macroelementos.
* Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulacin.

Fe: cofactor de enzimas para la funcin respiratoria en

citocromos, catalasa y flavoprotenas. En adecuada concentracin
favorece la sntesis de toxina diftrica.
Co: interviene en la sntesis de vitamina B 12.
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.
Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be,
F, etc.
Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier
microelemento a concentracin mayor que 10-4 M puede
resultar txico para el desarrollo de los microorganismos.
2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy
bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la
clula que los necesita. Por esta razn, deben ser agregados al
medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B,
algunos aminocidos, purinas, pirimidinas, cidos grasos. Hay
ejemplos clsicos como los factores X y V (porfirinas) de la
sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para
crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de
crecimiento, es imprescindible para el cultivo de clulas
animales.
Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La
capacidad de sintetizar un compuesto esencial est relacionada
con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se
completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genticas,
alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie
de reacciones se bloquea en algn paso y no finaliza con xito. El
compuesto que por esta razn dej de sintetizarse, se convierte
en un factor de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los
factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos
extractos:
-Extracto de carne: su funcin es ser complemento vitamnico de
las peptonas. Pero tambin aporta sustancias nitrogenadas
como:
aminocidos, bases pricas y pirimdicas, cidos
orgnicos, creatina, xantina, hipoxantina, cido rico, urea, y
sustancias no nitrogenadas como glucgeno, fosfatos de
hexosas, cido lctico, sales inorgnicas.
La calidad de este tipo de extracto vara con la carne empleada,
el tiempo y la temperatura de extraccin.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de
las clulas de levadura. Su funcin es ser suplemento vitamnico

de las peptonas, pero tambin aporta mezclas de aminocidos y

pptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de
levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas,
carbohidratos y aminocidos. Es el extracto soluble en agua de la
malta de cebada.

3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El ms usado:
el agar, es un polisacrido cido derivado de algas marinas,
formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada
10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeas
concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de
composicin qumica estrictamente definida destinados a
autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos
para quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia slida normal, al
0.2-0.3% en medios semislidos o blandos, al 5% en medios de
consistencia muy firme para detener el crecimiento de grmenes
muy mviles, y al 0% cuando se preparan medios lquidos
(caldos).
Sus caractersticas:
Funde a 80-100C y permanece lquido hasta 50-55C.
A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin afectar
la viabilidad (supervivencia) de las mismas.
Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la
mayora de las bacterias patgenas del hombre.
No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas.
Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias
(poblaciones de microorganismos derivadas de una nica clula),
lo que resulta imposible en medios lquidos!
Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las colonias.
Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para
permitir la difusin de los nutrientes del medio de cultivo en
todas direcciones, y suficientemente cerrada segn la
concentracin empleada- para impedir la movilidad de los
microorganismos.

Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa
intensamente para fines especficos en Inmunologa y Biologa
Molecular.

- Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de

cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgnica
del medio de cultivo.
- Gelatina: es una protena obtenida por hidrlisis del colgeno.
Fue el primer solidificante usado en Microbiologa, pero es
degradado por la mayora de las bacterias (lo comen, por lo que
el medio inicialmente slido termina convertido en medio lquido)
y la temperatura de incubacin no puede ser mayor a 22C (es el
punto de fusin) con lo que cultivos slidos a temperaturas ms
altas resultan inviables.
- Albmina de huevo, suero: a 80C estas protenas coagulan y
solidifican el medio de cultivo.
4. Agua
El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del peso
total de una clula y es fundamental para la realizacin de todos
los procesos metablicos, funciones enzimticas, solvatacin de
materiales orgnicos e inorgnicos, donacin de electrones para
organismos fotosintticos. Los medios de cultivo se preparan en
el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su
composicin y asegura la ausencia de iones como Ca 2+ y Mg2+
que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones
indeseables.
CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO
An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn
cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendr
lugar si se desconocen las siguientes condiciones fsicas:
- temperatura:
crecimiento.

cada

especie

tiene

su

temperatura

ptima

de

* mesfilos: 35-37C
* psicrfilos: 15-20C
* termfilos: 50-60C
-presin osmtica: la mayora de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl.
Las halfilas requieren concentraciones superiores.
-presencia de oxgeno: segn sus requerimientos de O 2 las bacterias se
clasifican en:
* aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer.
Metabolismo respiratorio.
* microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O 2 y una
atm enriquecida en CO2. Pueden

realizar respiracin aerobia.

*anaerobios obligados: el O2 les resulta txico. Crecen en
medios muy reducidos (sin O2).
Metabolismo fermentativo.
* anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O 2
(metabolismo fermentativo) y
cuando son expuestos al O2 no mueren.
*anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones
aerobias (metabolismo respiratorio)
como
anaerobias
(metabolismo
fermentativo).
-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo
para su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales
adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la
desecacin llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo
prolongado hasta que el ambiente sea propicio para la germinacin.
Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum),
Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintticos.
-pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente
alcalino (7 7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidfilos),
Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
a) Por su consistencia (esto depende de la inclusin o no de un
agente solidificante)
-lquidos (no permiten el aislamiento de colonias)
-slidos (permiten el aislamiento y observacin de
colonias)
b) Por su origen (esto depende de que la frmula se pueda describir
qumicamente con precisin)
-sintticos: estrictamente definidos desde el punto
de vista qumico, generalmente
se usan para cultivar fototrofos y
quimiolitotrofos.
-naturales o complejos: se preparan a partir de
sustancias naturales de origen ani-

mal

vegetal

de

composicin

qumica no rigurosamente
constante: leche, suero, macerado de
maz, peptonas, ex
tractos de carne, levadura. Son aptos
para el cultivo de
quimioorganotrofos. Son los que
prepararemos y usaremos en el
Laboratorio de Microbiologa.
c) Por su composicin:
- comunes: incluyen una frmula nutritiva bsica que permite
el crecimiento de microorganismos poco exigentes.
- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de
componentes muy ricos
como
leche, sangre, huevo, lquido asctico, extracto proteico de
cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes.
d) Por su funcin:
- Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que sembrados
con
poblaciones
mixtas
de
microorganismos,
favorecen
la
multiplicacin de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies
restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos
qumicos especficos o requieren condiciones fsicas especiales
(temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae
tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la
misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece
la proliferacin de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe
otras enterobacterias; caldo EC
a 44.5C, una temperatura que
favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios slidos que de manera parecida a
los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e
impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las
condiciones fsicas del medio de cultivo o agregando compuestos
qumicos inhibidores. Ej:
- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un
gnero implicado en la produccin de yogur, se puede agregar cido
actico a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4,
totalmente inadecuado para muchas bacterias acompaantes.
- altas concentraciones osmticas: en agar manitol salado con una
concentracin de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer,
salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como
Staphylococcus aureus

- agregando antispticos: colorantes como verde brillante, cristal

violeta y eosina, se utilizan para inhibir grmenes Gram positivos
mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares
se usan con el mismo propsito.
- agregando antibiticos: en Ingeniera Gentica es prctica rutinaria
la inclusin de antibiticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de
cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias
genticamente manipuladas. Estas clulas son resistentes a uno o ms
antibiticos y pueden desarrollar en un medio que los incluye, mientras
las clulas acompaantes, sensibles a los antibiticos, no pueden
crecer. En Microbiologa Clnica, se usan antibiticos de espectro de
accin reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio
no interesa, a la vez que no afectan los grmenes que se estn
investigando.
-Medios
diferenciales:
permiten
demostrar
caractersticas
metablicas de un determinado grupo de microorganismos. Por ej.:
puede el germen A utilizar glucosa por una va fermentativa? Si
agregamos glucosa a un medio de cultivo slido y un indicador de pH
que indique por cambio de color si el azcar ha sido fermentado o no,
estaremos analizando una caracterstica metablica de A. Existen
medios diferenciales donde se pueden detectar varias caractersticas
metablicas distintas. La clave es incluir en la frmula del medio de
cultivo a usar: , el sustrato adecuado para la caracterstica metablica
que se desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variacin
de color u otro fenmeno perceptible, los cambios que hayan tenido
lugar. Las pruebas bioqumicas que veremos en los Trabajos Prcticos
son claros ejemplos de medios de cultivo diferenciales.
-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo
entre la toma de una muestra y su procesamiento. Incluye compuestos
que aseguran la supervivencia de las clulas hasta que sean sembradas
en un medio de cultivo adecuado.
IMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen funciones
mixtas. Ej.: puede ser enriquecido porque lleva sangre y selectivo
porque incluye algn antibitico. Puede ser selectivo porque incluye
inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades
metablicas.
EJERCICIOS DE APLICACIN

1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qu componentes

tendra en cuenta para disear un medio de cultivo qumicamente
definido o sinttico que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energa:
- fuente de nitrgeno:
2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qu componentes
tendra en cuenta para disear un medio de cultivo complejo o
qumicamente indefinido que incluye:
fuente de carbono:
fuente de nitrgeno:
fuente de energa:
3. En el Trabajo Prctico tendremos ocasin de preparar algunos de los
siguientes medios de cultivo:
a)
Caldo nutritivo
Extracto de carne. 0.3 g
a.1. Qu aporte realiza cada
componente?
Peptona de carne . 0.5 g
a.2. Si no hay hidratos de
carbono, qu componente aporta C?
NaCl . 0.5 g
a.3 Cul es la fuente de
energa en el medio de cultivo?
Agua destilada. 100 ml
a.4. Clasifique este medio
por su consistencia, origen y composipH: 7- 7.2
cin. Qu clase de microorganismos
segn fuente de C y
energa- creceran en l?
b) Agar nutritivo
Extracto de carne. 0.3 g
b.1. Qu aporte realiza cada
componente?
Peptona de carne . 0.5 g
b.2.
Qu
componente
aporta los factores de crecimiento?
NaCl . 0.5 g
b.3 Cul es la fuente de
energa en el medio de cultivo?
Agar . 1.5 g
b.4. Clasifique este medio
por su consistencia, origen y composiAgua destilada. 100 ml
cin. Qu clase de
microorganismos segn fuente de C y
pH: 7 -7.2
energa- creceran en l?

c) Medio BW3

K2HPO4 ... 0.25 g

c.1. Mencione fuente
carbono y fuente de nitrgeno
CO2 burbujeo constantec.2 Cul sera la fuente
energa?
MgSO4 ... 0.0375 g
c.3. Por su consistencia y
origen, cmo clasificara este medio?
Na2MoO4... 2.5 x 10-3 g
c.4. Para qu clase
grmenes segn fuente de C y de energaNaVO3 .. 1.24 x 10-4 g
sera adecuado?
KNO3 . 1 g
Agua destilada 1000 ml

de
de
su
de

d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo

comn para convertirlo en un medio enriquecido?
- agua destilada
-penicilina
-suero
fetal
bovino
-colorantes
- sangre de oveja
-leche
-extracto proteico de
cianobacterias
-sales biliares
-antispticos
-yema de huevo
-agar
e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos
quimioorganotrofos, acidfilos y resistentes a penicilina, incluidos en
una poblacin mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C
pertenecen a flora acompaante.
e.1.
Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese
propsito? (marque la/s respuesta/s correcta/s)
- un medio de transporte
- un medio enriquecido
-un medio de enriquecimiento
- un medio selectivo
-un medio slo diferencial
e.2. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya una
fuente de C, una fuente de energa, una fuente de N y factores fsicos
y/o qumicos que favorezcan slo el desarrollo del grupo A.