Introduccion

En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policacas o de

mdicos donde se hacen anlisis a pequeas muestras para
averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la vctima o con
el malo, o si cierta sustancia puede afectar a la salud, etc..,
entonces uno ve que los investigadores hacen una serie de
estudios con las muestras, que en ocasiones son muy pequeas, y
dan resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se tiene
en el laboratorio, en una solucin, presencia de color, o cuando se
sabe que hay ciertas cantidades de algn elemento pero no se
sabe cuanto, se genera la inquietud de saber que elemento es, en
que cantidad est y es entonces que se producen una serie de
preguntas, tales como: COMO LO MIDO? y otras ms, entre
ellas pueden estar: Qu es la luz?, qu es longitud de onda,
cmo se mide?, que relacin hay entre luz y color?; para que
sirve esto?, de qu manera se mide una solucin coloreada?.
En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla, sobre
este tema tratando de dar una idea fundamental de las preguntas
anteriores y otras ms que se hacen en torno al tema que se est
presentando; espero este trabajo sea til tanto a profesores como
alumnos para orientarse y poder entender ms acerca de la
espectrofotometra a nivel laboratorio de ciencias biolgicas.

Espectroscopia
Caractersticas de la Luz
Colores
Qu es longitud de Onda?

Relacin entre frecuencia, velocidad y longitud de onda

Absorcin / Absorbitividad
Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometra

Colorimetra y Espectrofotometra como procedimientos

analticos
Fotocolormetro
ESPECROFOTMETRO
Curva Patrn
Referencias e Imgenes

La espectroscopia es el estudio del espectro de la

luz que emiten los cuerpos, sustancias y
elementos.
De este estudio se puede conocer la composicin,
temperatura, densidad, velocidad de
desplazamiento y otros factores que les son
propios y componen a estos cuerpos, sustancias
o elementos

La luz tiene una naturaleza dual:

Como onda
Como una corriente de partculas o paquetes de
energa (fotones)

Albert Einstein desarroll en 1905 la teora de

que la luz estaba compuesta de unas partculas
denominadas fotones, cuya energa era
inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz.

3
1
Foton

La teora electromagntica de la luz propuesta por

Maxwell: La perturbacin que se propaga como ondas de luz
est formada por fuerzas elctricas y magnticas, y la
perturbacin se produce en cargas elctricas en
movimiento.

Efecto de la emisin electromagntica

El efecto fotoelctrico demuestra el comportamiento de la

luz como partcula (grnulos o corpsculos)

La naturaleza corpuscular de la luz se observa

en fotos de objetos iluminados muy dbilmente.

La imagen se forma punto a punto, y muestra

que la luz llega a la pelcula fotogrfica por
unidades separadas que los producen.

Estos descubrimientos dieron origen a toda la

tecnologa moderna de telecomunicaciones como la
televisin

En estas imgenes
se puede apreciar,
debido a la toma
fotogrfica los
elementos
puntuales que
apoyan a esta
teora

Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una

amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la
mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se
conoce como color puro al color de la luz con una nica
longitud de onda o una banda estrecha de ellas.

Cuanto ms larga la longitud de onda de la luz visible

tanto ms rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta estn en la zona
violeta del espectro.

As todos los elementos existentes poseen un

espectro
***

Hay varios tipos de espectros, los ms comunes son

los espectros continuos, espectros de emisin y los
espectros de absorcin.
Si es colocado frente al espectroscopio se podr ver, un
elemento:
En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y
presiones y no se presentan lneas obscuras se trata de un
espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas lneas de
colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro de
emisin.
Y por ltimo si sucede la primer situacin y entre el
elemento afectado y el espectroscopio se coloca un
elemento a menor temperatura que el primero, se obtiene el
espectro de absorcin

La luz blanca produce al descomponerla lo que

se llama un espectro continuo, que contiene el
conjunto de colores que corresponde a la gama
de longitudes de onda que la integran.

Todos los elementos poseen un espectro propio,

que se puede medir al someterse a temperaturas
elevadas ya que producen espectros discontinuos .

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se

llama longitud de onda ( = lambda).

CARACTERSTICAS DE LAS ONDAS

nodo

La longitud y la frecuencia de onda son

inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente ecuacin

U.V.

L
u
z
v
i
s
i
b
l
e

X
GAMMA

350 nm

750 nm
Infrarrojo
Microondas
Radio

La luz visible es
slo una pequea
parte del espectro
electromagntico
con longitudes de
onda que van
aproximadamente
de 350 nanmetros
hasta unos 750
nanmetros
<nanmetro, nm =
milmillonsimas de metro>.

La luz blanca est compuesta de ondas de diversas

frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un
prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda

As la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de

onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de
onda se manifiestan como diferencias de color.

La distribucin de los colores se determina por la

longitud de onda de cada uno de ellos.

Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les
conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta,
ultravioletas.

Ultravioleta

Luz visible

Infrarrojo

102 -104

~ 104

104-107

UV Violeta Azul
4000 A

Verde Amarillo Naranja Rojo

Espectro Visible

IR
7500 A

Relacin entre frecuencia,

velocidad y longitud de onda*

Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene una
'frecuencia natural', (vibracin en
ausencia de perturbacin).

frecuencia es el Nmero de vibraciones por segundo

As Frecuencia, es nmero de veces que la

onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

Quin es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemn que

construy un dispositivo para generar y detectar en un
laboratorio ondas electromagnticas, demostrando su
existencia as como, se reflejan estas ondas, se refractan y
se comportan como las ondas de luz

Estim que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3

x 107 Hz. Y determin que su longitud l era de 10 m. Con
estos valores estableci que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

o sea, la velocidad de la luz.

1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u

oscilacin por segundo. (1 Hertz = 1
ciclo/seg)
Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por
segundo
Un megahercio (MHz) = un millon de
ciclos por segundo
Un gigahercio (GHz) = mil millones de
ciclos por segundo

Un pndulo de 1 m de longitud presenta

una frecuencia de 0,5 Hz, es decir que el
pndulo va y vuelve una vez cada 2
segundos.

Longitud de onda = velocidad de propagacin / frecuencia

l= c / u
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = l . u (m-1s-1)
u=c/l

Frec = Vel / l
Como la luz viaja a una velocidad de
3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz
Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo

Relacin entre Medidas en valores Hertz y Metros

Las ondas electromagnticas de

frecuencias extremadamente elevadas,
como la luz o los rayos X, suelen
describirse mediante sus longitudes de
onda, que frecuentemente se expresan en
nanmetros.
Un ejemplo es: Una onda
electromagntica con una longitud de onda
de 1 nm tiene, aproximadamente una
frecuencia de 300 millones de GHz.

l= vel / u
El sonido se propaga a una velocidad de 340 m cada
segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz

l = 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m

4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)

7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)

Algunas equivalencias
1m

0.001 mm

10-6 m

nm = mm

0.001m

10-9 m

0.0001m = 0.1 nm

10-10 m

Comparacin de las mediciones de las

longitudes de onda con la luz visible.

El color de un cuerpo depende de la luz que

recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el
color rojo se d cuando absorbe en casi su
totalidad, todas las radiaciones menos las
rojas, las cuales refleja o deja pasar
dependiendo su estructura (slida o
transparente).

La energa UV es mayor que,

cualquier color del espectro
visible. Sin embargo los
rayos X son ms energticos
que la luz UV, como se puede
apreciar por su longitud de
onda.

Con base a lo anterior se

puede
entender
que
existe
una
relacin
inversa entre la longitud
de onda y la energa del
fotn correspondiente.

Entonces, las energas en el rango ultravioleta-visible excitan

los electrones a niveles de energa superiores dentro de las
molculas y las energas infrarrojas provocan solo vibraciones
moleculares

El color percibido de una solucin depende de la

combinacin de colores complementarios que la
atraviesan

Proceso de Absorcin
La energa de excitacin a una molcula
proveniente de un fotn durante el proceso de
absorcin se representa as:
A + hn A* A + calor

donde:
A es el absorbente en su estado de energa bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de
excitacin energtica
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente

La energa del fotn incidente posee una

longitud de onda (l)

A* es inestable y rpidamente revierte a su

estado energtico ms bajo, perdiendo as la
energa trmica correspondiente.

La absorcin de determinadas longitudes de

onda depende de la estructura de la
molcula absorbente (absortividad, a)

Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0

pasa a travs de una solucin, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0
Luz incidente (I0)

Luz absorbida

Luz emergente (I)

a = absortividad

I0

I
c = concentracin.
b

(nmero de partculas por

cm3)

Longitud del medio

absorbente o ancho de la
celda

Absortividad (a)
a es una constante de proporcionalidad
que comprende las caractersticas
qumicas de cada compuesto, o molcula
y su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentracin en moles

por litro y la trayectoria a travs de la celda
en centmetros, la absortividad se denomina
absortividad molar y se representa con el
smbolo e .
En consecuencia cuando b se expresa en
centmetros y c en moles por litro.
A = e bc
Donde A representa la absorbancia del
compuesto

Las leyes de Lambert y Beer *

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz

monocromtica (I0) pasa a travs de un medio
absorbente,
su
intensidad
disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta

I = I0e-ab

I0

1 cm.

I0

2 cm.

Ancho de la celda

I0

3 cm.

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a

travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentracin del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0

I0

I0

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley

de Beer-Lambert donde la fraccin de luz incidente que es
absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar
una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida
por la muestra.

Ley de lambert Beer:

I = I0
Si despejamos:

-abc
e

I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denomina

Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc
Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc

Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relacin entre la

intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0
Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la

longitud del recorrido b a travs de la solucin
y la concentracin c del color absorbente.
Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces la

absortividad tiene unidades de lg1cm1.

Qu relacin guardan la transmitancia y la

absorbancia?
De acuerdo a las caractersticas de la sustancia
analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solucin

I0

LUZ
A
B
S
O
R
B
I
D
A

Luz transmitida

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de

la transmitancia
Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal)
Absorbancia

Concentracin

% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)
% Transmitancia

Concentracin

Absorbancia

De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz

que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recproco de la transmitancia (T) o bien al log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o
(blanco) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 log10 T = log10 T

La representacin grfica correspondiente a

absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:

Concen
tracin

Obtencin de TRANSMITANCIA utilizando valores de

Absorbancia

Con base en la relacin:

T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)

%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresin anterior

log10 %T = -abc log

10

10 + log10 100

Invirtiendo trminos
log %T = log10 100 -abc log

10

10 = 2 abc * 1

log10 %T = 2 abc
Como abc = Absorbancia = A

log10 %T = 2 A.

log10 %T = 2 A.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 a que equivale en % T?

Log10 % T = 2 0.6 = 1.4

Log10

% T = 1.4

%T = 1 /

Log10101.4

Aplicando antilog. a
1.4 = 15 % de transmitancia

Obtencin de absorbancia a partir de un valor de

% de transmitancia
RECORDANDO:

A = log10 1/T
Ejemplo de clculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia

Se le llama espectrofotometra a la medicin

de la cantidad de energa radiante que absorbe
un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro, en funcin de la longitud de onda
de la radiacin lumnica y a las mediciones a
una determinada longitud de onda.

* Arco iris en Marte

Cmo se puede medir la radiacin que emiten o

absorben los cuerpos?.

Un aparato capaz de obtener el espectro de una

radiacin, es decir, de separar la radiacin en
sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama
un espectrgrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de
un espectrmetro.
Cuando es capaz de medir tambin la intensidad
de la radiacin, se llama espectrofotmetro.

Espectroscopio

Espectgrafo

1817

Espectmetro

De fluorescencia

De Emisin
ptica
Para metales

Imagen de Marte vista con

ayuda de espectmetro de
rayos Gamma

Colorimetra y
Espectrofotometra
como procedimientos
analticos *

Las
tcnicas
colorimtricas
se
fundamentan con la medicin de la
absorcin de radiacin
visible por
sustancias coloreadas.
Sin

cuando una muestra a

no posee coloracin, es

embargo,

determinar

necesario llevar a cabo un tratamiento de

color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el
compuesto de inters

Las diferentes sustancias se analizan mediante

reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentracin
de la sustancia a analizar mayor es el color de la
reaccin.

Tambin es posible que la muestra pueda ser

leda cuando su espectro de absorcin se
encuentra en las regiones no visibles del
espectro, como las referentes a las regiones de
UV o infrarroja

Visn de las abejas

Orbitas de TITAN

Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo

La
diferencia
entre
colorimetra
espectrofotometra consiste en el tipo

y
de

instrumental empleado:

El colormetro es un aparato en los que la longitud de onda

se selecciona por medio de filtros pticos que son
insertados en este.

En el espectrofotmetro la longitud de onda es

seleccionada mediante dispositivos monocromadores los
cuales estn integrados a la mquina.

Algunos de los procedimientos colorimtricos o

espectrofotomtricos con los que se cuenta
para precisar la concentracin de una sustancia
en solucin son los siguientes:

Referencia de color
Colormetro Klett
Espectrofotmetro

M.C.I/2005

FOTOCOLORMETRO KLETT / SUMMERSON

Fundamento de colormetro Klett

Una solucin que absorbe el rojo pero no el amarillo y

el azul con la combinacin de estos dar un color
verde.

Luz incidente

Luz absorbida

Luz emergente

Rojo
Amarillo

Amarillo

Azul

Azul

Verde

Por lo anterior podemos aplicar un sencillo

mtodo para precisar con cual filtro podramos
leer una solucin dependiendo el color de esta
Cuando la solucin sea roja no se deber utilizar
un filtro de color rojo porque justamente ese es el
color que no absorbe.
En relacin a esto,
en el manual del
fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que
se puede utilizar para determinar que filtro se debe
emplear de acuerdo al color de la solucin a
estudiar:

Color del
filtro

Rango
espectral

Soluciones
coloreadas

Azul

400-465

Roja, Naranja,
Amarilla, Verde,
Turbias

Verde

500-570

Roja, Amarilla,
Violeta, Naranja,
Azul

Rojo

640-700

Azul, Verde,
Amarilla

A menudo se hace referencia a la estrella de colores para

facilitar el recordar la eleccin del color de filtro para lectura
colorimtrica. Para soluciones de color azul verde y amarilla
correspondera un filtro rojo. Para soluciones de color rojo,
naranja o amarrillo seleccionaramos un filtro color azul.
Finalmente para soluciones con color verde, azul o amarilla
elegiramos un filtro rojo.

Manejo del
Fotocolormetro

1.
2.

Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre dentro del

portafiltros (B) y este en su lugar (C)
Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el centro, en
cero; si no es as ajuste a cero con la perilla (E) que se
localiza en la parte superior; siempre y cuando la lmpara se
encuentre apagada

M.C.I/2005

3.
4.

5.

La lmpara (F) se enciende con el apagador (G), deje

calentar entre 5 y 10 minutos.
Ajuste la escala del potencimetro (H) con la perilla
correspondiente (I) a cero
Coloque la cubeta (limpia) (J) con el blanco, en su sitio (K) y
encienda con el interruptor (L)
F

I
L
J
M.C.I/2005

6.

7.

Mediante la perilla (M) del galvanmetro , se acopla la lectura

a cero , lo que implica que la aguja (D) y la escala (H) deben
estar en cero.
Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la
cubeta el blanco y colocar la solucin problema, la aguja (D)
se desviar de su posicin , es necesario nuevamente ajustar
(con I) a cero, la lectura que proporcione la escala (H) es la
correspondiente al problema

M
D

H
I

M.C.I/2005

Las lecturas se
realizan en U.K.
(unidades Klett)
Las lecturas que se
mayores a 500 U.K
y las menores a 25
U.K., no se usaran
para calcular
concentraciones

U.K

/ 500 =
Absorbancia

U.K.

X 500 =
Transmitancia

CUIDADO
S

Las muestras no deben

tener burbujas,
encontrarse turbias o
con precipitados.
El volumen de la
muestra no debe ser
excesivo para evitar
que se desborde, en
caso de que sucediera,
se debe limpiar con un
pao limpio o papel
absorbente suave, para
evitar rayarla.
La cantidad a adicionar
es, mximo, hasta
partes de la cubeta

No se deben derramar
lquidos, sobre todo
solventes, cidos o
lcalis; dentro del
contenedor de la
cubeta, se puede daar
parte del mecanismo
El fotocolormetro
nunca se debe
encender sin filtro.
No deje que se
sobrecaliente,
mantenga apagado si
no lo utiliza.

Un espectrofotmetro es un instrumento
que descompone un haz de luz (haz de
radiacin electromagntico), separndolo
en bandas de longitudes de onda
especficas, formando un espectro
atravesado por numerosas lneas oscuras
y claras, semejante a un cdigo de barras
del objeto, con el propsito de identificar,
calificar y cuantificar su energa

Distribucin de la luz en el
espectrofotmetro

Espectrofotmetro Mecanismo Interno

Met.Cient. I
COLOR

LONGITUD DE ONDA (l)

Rojo (R)

700 nm

Verde (G)

546.1 nm
435.8 nm

Azul (B)

Es usual que al seguir una receta para la

determinacin de la concentracin de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (l)
especfica a la que hay que leer con el colormetro o
espectrofotmetro.
Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)
compuestos parecidos pero diferentes?

La explicacin radica en el hecho de que cada

producto qumico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorcin de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de

absorcin caracterstico
Absorbancia

l
Las longitudes de onda con mayor absorcin (picos) correspondern
de forma general a aquellas con las que se leer la muestra para
determinar su concentracin
Absorbancia

La relacin entre la absorbancia por una sustancia a una l

determinada y su concentracin es directamente proporcional es decir:
a mayor concentracin mayor proporcin de luz absorbida.
Absorbancia

Conc.

As, el espectro de absorcin de la clorofila es:

Colorante comn, la Rodamina 6G

en Metanol..

Espectro de Absorcin (lnea contnua) y Espectro de

Transmisin (lnea discontnua).

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismtica

Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual

se vierte la solucin a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un

comportamiento constante ante la variacin de la longitud de
onda es comn que las celdas del espectrofotmetro o
colormetro sean de este material .

Curva Patrn
El razonamiento para el
determinacin
de
una
desconocida es:

proceso de
concentracin

A partir de concentraciones conocidas de las

cuales tambin se sabe su absorbancia (curva
patrn), es posible interpolar (intercalar) la
concentracin del problema sabiendo su
absorbancia (lnea roja en figura siguiente)

CURVA PATRN
0.6

0.5

A
B

Absorbancia del problema

0.4

S
0
R

0.3

B
A
N

0.2

Interpolacin

C
I
A

0.1

0
0

Concentracin mg/lt

10

12

Con base en que la Absorbancia guarda una relacin lineal con

la concentracin, se comprende la existencia de una relacin de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentracin:

A1 / A2 = C1 / C2

Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida.
C1 = Concentracin del problema.
C2 = Concentracin del estndar.
Si despejamos C1 = Conc del problema
A1 (problema) * Conc estndar
Conc. (problema) =
A2 (estndar)

Ejemplo de curva patrn para la determinacin de safranina;

donde se solubiliza este colorante nicamente en agua siendo
por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la
calibracin del equipo (colormetro o espectrofotmetro)

TUBO

Stock de Safranina
(3 x10 -4 g/ml) ml

Agua Destilada ml

10

0.05

9.95

0.10

9.9

0.20

9.8

0.40

9.6

0.80

9.2

En este ejemplo de determinacin de Glucosa, en la

preparacin de los tubos para la lectura de la curva patrn, se
incluyen ms elementos y por lo cual el tubo blanco (0)
contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin
de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

Glucosa 0,1 mg/ml

(mL)

0.0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Agua destilada
(mL)

1.0

0.4

0.9

0.8

0.2

0.6

0.0

Fenol al 5% (mL)

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Acido sulfrico
(mL)

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

Compuesto

(blanco)

RESULTADO de la curva patrn anterior

Absorbancia en el Espectrofotmetro a 490 nm
Curva de calibracin de glucosa
1
Absorbancia

Tubos Absorbancia
1
0
2
0.135
3
0.253
4
0.417
0.658
5
0.574
6
7
0.768

0.8
0.6
0.4
0.2
0
1

4
Tubos

Un
aspecto
importante
de
la
evaluacin
espectrofotomtrica, es que muchas molculas orgnicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo
Por lo que es comn, actualmente, que la mayora de los
espectrofotmetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos
As, los grupos carbonilo presentes en los aldehdos
(RCHO), cetonas (RCOR), cidos carboxlicos (RCOOH),
l steres (RCOOR) y amidas (RCONHR) dan lugar a
absorciones intensas en la regin del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones mximas (picos de absorcin) de algunos

compuestos que absorben en la regin ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorcin se localizan en la regin

del infrarojo

Tipos de Espectrofotmetro
Existen en la actualidad
diversos tipos de aparatos con
los mismos principios los hay
mecnicos y digitales; unos
miden solo la luz visible, otros
son ms precisos y miden
tambin luz U.V. , Infrarroja, de
absorcin atmica (AA),
flurescencia de rayos-X de
emisin de plasma (ICP),,
multipropsitos (para medir
directamente la solucin con
suspensin, muestras slidas y
biolgicas), acoplado a
masas,etc..

MCI
Para medir Luz Visible

MCI
Para medir Luz Visible y U.V.

MCI
Para medir Luz Visible y U.V.
Diferentes tipos de espectrofotmetros

Spectronic 20 D

Spectrnic 20

Partes del Spectronic 20 D

Manejo de
espectrofotmetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el manejo el

espectrofotmetro Modelo Spectronic 20.

Manejo de espectrofotmetro

Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se

activar la luz roja de encendido (b).
Seleccionar la longitud de onda con el botn (c).
Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y
sin muestra.
Insertar la cubeta con el blanco en su seccin (d).
b
d
c
a

Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)

Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra
problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.
La aguja (d) del lector se deslizar sobre la escala (f) , se
lee en % de transmitancia en unidades de absorbancia
f
d

CUIDADOS

Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse

turbias o con precipitados.
El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de que
sucediera, se debe limpiar con un pao limpio o papel
absorbente suave, para evitar rayarla.
La cubeta se sujeta por los lados opacos.
La cantidad a adicionar es, mximo, hasta partes
de la cubeta
No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes,
cidos o lcalis; dentro del contenedor de la cubeta,
se puede daar parte del mecanismo
Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y libre
de humedad

GRACIAS