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08 2001

Bacteriolgico Analtico Manual Captulo 23 Mtodos microbiolgicos para cosmticos

Autores: Anthony D. Hitchins Tony T. Tran, y James E. McCarron Para obtener informacin adicional, pngase en contacto con Rebecca Campana Historial de revisiones: Agosto de 2001: Seccin: Identificacin de los microbios. Revisado de la Parte D y ha aadido 2b referencia. Agosto de 2001: formulacin M79 corregido. La capacidad de los microorganismos para crecer y reproducirse en los productos cosmticos ha sido conocido durante muchos aos. Los microorganismos pueden causar deterioro o cambios qumicos en los productos cosmticos y los daos para el usuario (4,5,10,14-16,20,21). Mtodos para el aislamiento de microorganismos a partir de los productos cosmticos son los recuentos de colonias directos y cultivo de enriquecimiento. Los productos que no son solubles en agua se tratan inicialmente de que sean miscibles antes de que se llevaron a cabo los procedimientos de aislamiento. Medios de dilucin y de las planchas que se utilizan sistemas conservantes parcialmente inactivate se encuentran comnmente en los productos cosmticos. Los microorganismos aislados se identifican por mtodos microbiolgicos de rutina o mediante kits comerciales de identificacin. El esquema para estos anlisis se resume en la figura. 1. A. Equipos y materiales 1. Pipetas, estril, 1, 5 y 10 ml, se graduaron 2. Gasas, estril, 4 x 4 pulgadas 3. Los instrumentos estriles: pinzas, tijeras, bistur y cuchillas, esptulas y microspatulas 4. Tubos de ensayo, con tapn de rosca, 13 x 100, 16 x 125 y 20 x 150 mm 5. Botellas de dilucin, con tapn de rosca 6. Equilibrio, sensibilidad de 0,01 g 7. Placas de Petri, estriles, de plstico, 15 x 100 mm 8. Varillas de vidrio doblado, estril 9. Incubadoras, 30 2 C y 35 2 C 10. Sobres generadores de atmsfera anaerobia, tiras indicadoras, y tarros (BBL o Oxoid), o incubador anaerobio, 35 2 C, o en la guantera anaerbica, 35 2 C. 11. Tarros de la vela o de CO 2 incubadora, 35 2 C. 12. Campana de flujo laminar con filtro HEPA, si est disponible 13. Vitek o sistema de identificacin automatizado computarizado equivalente B. Medios1 de enumeracin e identificacin de las bacterias Gram-positivas y hongos 1. Agar anaerobios ( M112 ) 2. Agar bilis esculina ( M183 ) 3. Infusin de cerebro y corazn (BHI) agar y caldo de ( M244 ) 4. Agar extracto de malta (MEA) ( M935 ) 5. Agar de dextrosa de patata (PDA) ( M1276 ) 6. Agar sal manitol ( M977 )
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7. Agar leten Modificado (MLA) ( M788 ) y el caldo (MLB) ( M799 ) 8. (DE) medio de ensayo-oxidativo fermentativa ( M11710 ) 9. Caldo de dextrosa de Sabouraud ( M13311 ) 10. Base de agar sangre ( M20A12 ) 11. Agar de almidn ( M14313 ) 12. Tripticasa (trptico) agar de soja (TSA) ( M15214 ) y el caldo (TSB) ( M15415 ) 13. Baird-Parker (BP) agar ( M1716 ) 14. Prueba de la catalasa ( R1217 ) 15. Vogel-Johnson (VJ) agar (opcional) ( M17618 ) 16. Kit de identificacin bacteriana Comercial (API o equivalente) La figura. 1: Esquema de la enumeracin, el aislamiento e identificacin de los microbios cosmticos Preparacin de la muestra. Diluir las muestras preparadas en las Grandes Ligas. Extender las muestras duplicadas en 0, l ml (A) MLA 48h, 30 C (B) PDA (o MEA) con clortetraciclina 7 das, 30 C (C) BP (o VJ) de agar 48h, 35 C (opcional) (D) Agar anaerbico MLA das 2-4, 35 C

Enriquecer diluciones MLB durante 7 das, a 30 C. Se purifica el crecimiento slo si no hay colonias en MLA. Recuento de las colonias y la subcultura diferentes tipos de colonias en agar MacConkey y MLA (y BP o VJ agares si se utiliza en c, arriba). Para aislados fngicos, ver texto. Determine la reaccin de Gram, forma de la clula, y la produccin de catalasa de los aislamientos purificados. Proceder a la identificacin de las cepas bacterianas que se describen en el texto o utilizar juegos de identificacin. La figura. l. Abreviaturas: MLB, caldo leten modificado; MLA, agar leten modificado; PDA, agar papa dextrosa; MEA, agar extracto de malta; BP, Baird-Parker, VJ, Vogel-Johnson. C. Medios19 para la identificacin de Enterobacteriaceae 1. Caldo de hidratos de carbono de Andrade y el indicador ( M1320 ) para las pruebas de metabolismo de ramnosa, manitol, sorbitol, arabinosa 2. Agar hierro lisina ( M8921 ) 3. Caldo de malonato de dietilo ( M9222 ) o fenilalanina caldo de malonato de dietilo (Difco) 4. Medio de ornitina-Motilidad indol ( M9923 ) 5. Caldo MR-VP ( M10424 ) 6. Agar citrato de Simmons ( M13825 ) 7. Hierro triple azcar (TSI) agar ( M14926 ) 8. Agar urea de Christensen ( M4027 ) 9. Agar MacConkey ( M9128 ) 10. Medio lisina descarboxilasa para las bacterias Gram-negativos no fermentadores ( M8829 ) 11. Agar desaminasa Fenilalanina ( M12330 ) ( vase tambin el C-3, ms arriba) 12. API 20E, Roche Enterotube u otros kits de identificacin equivalentes
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Incubar todas las pruebas bioqumicas utilizando medios de comunicacin en B y C, por encima, a 35-37 C durante 18-24 h, excepto el caldo malonato (48 h) y el caldo MR-VP (48 horas o ms). D. Medios31 y reactivos32 para la identificacin de bacterias Gram-negativos no fermentadores (NF) bacilos 1. La acetamida medio ( M233 ) 2. Flagelar mancha de Clark ( R1434 ) 3. Agar esculina, modificado (CDC) ( M5335 ) 4. Gelatina de nutrientes (CDC) ( M11536 ) 5. Medio Indol ( M6437 ) y medio indol (CDC) ( M6538 ) 6. Medio de King B ( M6939 ) 7. De la lisina descarboxilasa (PMA) medio para las bacterias Gram-negativas NF ( M8840 ) 8. Medio de nitrato Motilidad ( M10141 ) 9. Caldo de nitrato, enriquecido (CDC) ( M10942 ) 10. Rey de DE medio basal ( M7043 ) para las pruebas de metabolismo de la sacarosa, lactosa, fructosa, esculina, xilosa, glucosa (dextrosa), manitol, salicina, sorbitol, y maltosa 11. Tiras de prueba de oxidasa 12. Agar urea de Christensen ( M4044 ) 13. Medio basal descarboxilasa (por arginina descarboxilasa) ( M4445 ) 14. El extracto de levadura (YE) agar ( M18146 ) 15. Pseudomonas agar F ( M12847 y P ( M12948 ) (Difco) 16. Agar cetrimida (Pseudosel TM , BBL, Difco), o equivalente ( M3749 ) 17. Glicerol, estril (Difco), o equivalente 18. API, NFT, u otro sistema de identificacin comercial equivalente 19. Caldo citrato de Koser ( M7250 ) E. Otros medios de comunicacin51 y los reactivos52 1. Solucin acuosa de etanol al 70% y 1% de HCl (v / v) o 4% de yodo en solucin de etanol al 70% o solucin de glutaraldehdo al 2% 2. De Tween 80 (Polysorb 80) 3. Etanol, 95% (v / v) 4. Coagulasa plasma de conejo liofilizado con EDTA 5. 3% (v / v) Solucin acuosa de perxido de hidrgeno 6. La tincin de Gram ( R3253 ) y la mancha endospore ( R32A54 ) 7. Medio de carne cocida ( M4255 ) F. Manipulacin de las muestras de cosmticos para el anlisis microbiolgico Analizar las muestras tan pronto como sea posible despus de su llegada. Si es necesario, guarde las muestras a temperatura ambiente. No incubar, refrigerar o congelar las muestras antes o despus de su anlisis. Inspeccione las muestras cuidadosamente antes de abrir y tomar nota de las irregularidades del recipiente de la muestra. Desinfectar la superficie de recipiente de la muestra con la mezcla acuosa de etanol al 70% (v / v) y 1% de HCl (v / v) u otro desinfectante ( ver El) antes de abrir y retirar contenidos. Utilice campana de flujo laminar, si es posible. Superficie seca con una gasa estril antes de abrirlo. Utilice porcin representativa de contenido para el anlisis microbiano, por ejemplo, 1 g (ml) porcin de muestra. Para los productos que pesen menos de 1 g (ml), analizar el contenido completo. Si slo hay una unidad de muestra est disponible y mltiples anlisis que se desean (es decir, microbianos, toxicolgicos y qumica), tomar la submuestra para anlisis microbiolgico antes de los de otros anlisis. En esta situacin, la cantidad de submuestra utilizada para el anlisis microbiano depender de otros anlisis a ser realizados. Por ejemplo, si el contenido total de la muestra es de 5 ml, utilizar 1
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o 2 porcin ml para anlisis microbiano. G. Preparacin preliminar muestra Las cantidades de muestra y diluyente que aqu se pueden ajustar de acuerdo a la cantidad de muestra disponible. Si la muestra tiene muchas submuestras, cantidad de material de prueba puede ser aumentado y la carga de trabajo racionalizado por composicin. Los analistas deben utilizar su mejor juicio para decidir cundo y cunto material compuesto. 1. Lquidos . Decimalmente diluir 1 ml de lquido directamente en 9 ml de caldo modificados leten (MLB) en 20 x 150 mm tubo de ensayo con tapn de rosca para el 10 -1 dilucin. 2. Los slidos y polvos . Aspticamente separacin y pesado de 1 g de muestra en tubo de ensayo con tapn de rosca de 20 x 150 mm que contiene 1 ml de Tween 80 estril. Dispersar producto en Tween 80 con esptula estril. Aadir 8 ml estril MLB y mezclar bien. Este ser el 10 -1 dilucin. 3. Crema y productos a base de aceite . Aspticamente separacin y pesado de 1 g de muestra en un tubo con tapn de rosca de 20 x 150 mm que contiene 1 ml de Tween estril 80 ms seis y cincuenta y cinco cuentas de vidrio de 5 mm (o de diez a quince cuentas de vidrio de 3 mm). Mezcle los contenidos totales con mezclador Vortex. Ajustar volumen total a 10 ml con estril MLB (8 ml) para el 10 -1 dilucin. 4. Los aerosoles de polvos, jabones, lquidos y otros materiales . Descontaminar la boquilla de aerosol lo ms posible en muestras de secreciones con una gasa humedecida con 70% (v / v) de etanol acuoso. Expulsar parte del producto para enjuagar la boquilla; luego rociar cantidad apropiada en la botella de dilucin tarado, por ejemplo, 1 g de producto en 9 ml estril MLB. Mezcle bien el producto y el caldo, y pesar de nuevo. Este ser un 10 -1 dilucin si se obtuvo exactamente 1 g de muestra. 5. Materiales anhidros . Tratar como en el G-2 o G-3, segn corresponda. H. Evaluaciones microbiolgicas No todos los anlisis descritos a continuacin sern necesariamente realizarse, sin embargo, el recuento de aerobios, enriquecimiento de la cultura y el recuento de hongos se deben realizar de forma rutinaria. 1. Recuento de placa aerobia (APC) . Utilice una tcnica de extensin en placa para facilitar el reconocimiento de los diferentes tipos de colonias y, en caso necesario, para el recuento diferencial. Utilice tambin Baird-Parker (BP) o Vogel-Johnson (VJ) agar si Staphylococcus spp. son sospechosos. Preparar y etiquetar conjuntos de duplicados de placas de Petri que contenan agar modificado leten (MLA) y agar BP para muestras de 10 -1 a 10 -6 diluciones. Aadir ya sea 5 o 10 ml de la preparacin cosmtica preparada ( ver G, ms arriba) a 45 o 90 ml, respectivamente, de la MLB, para 10 -2 dilucin. Diluir las muestras decimalmente en MLB ( NOTA : salvar diluciones para el paso de enriquecimiento) para obtener series de dilucin total de 10 -1 a 10 -6 . (Comienza con 10 -2 si todo el 10 -1 dilucin se ha agotado.) Mezclar bien las diluciones y pipeta de 0,1 ml de cada dilucin en superficies de medios slidos en platos petri premarcan. Spread inculo sobre toda la superficie con varilla de vidrio doblado que se esteriliza primero por inmersin en etanol al 95% y rpidamente flameado para eliminar el etanol. Deje medio absorber inculo antes de invertir e incubando las placas durante 48 horas a 30 2 C (35 C para las placas de BP). Utilice el nuevo difusor para cada dilucin (en diluciones bajas), ya que algunos restos del producto, podr arrastrar y afectar negativamente el procedimiento de llama-esterilizacin. Para la absorcin de inculo efectivo, asegrese superficie del agar se sec (30 min a 35 C) cuando agar est recin hecho. Contar todas las colonias en placas que contienen 25 a 250 colonias, y registrar los resultados por dilucin contados. La media de los recuentos de colonias obtenidas, y multiplicar el promedio por 10 y luego por el factor apropiado de dilucin (10 -1 - 10 -6 ). Los resultados como APC / g (ml) de la muestra. Si las placas no contienen 25-250 colonias, dilucin registro cont y nmero de nota de las colonias encontrado. Para placas de BP, contar las colonias bien distribuidas que son convexos, de color negro brillante, con o sin una zona clara que rodea la colonia. ( NOTA :.. colonias coagulasa positivos
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producir claro, pero las colonias coagulasa negativo puede o no producir despejar Si colonias coagulasa negativo claro, su irregularidad informa, que los distingue de las colonias coagulasapositivo) Seleccin de placas que tienen ms de 250 colonias, cuando los a una dilucin mayor no contienen tipos coloniales descritos anteriormente. Las placas de diluciones mnimas que tienen menos de 25 colonias tambin se pueden utilizar si es necesario. De cada placa que demuestra el crecimiento de BP, elegir una o ms colonias tpicas para confirmar su reaccin coagulasa. Colonias de transferencia a tubos inclinados de agar de cualquier medio de mantenimiento adecuado, por ejemplo, tripticasa (trptico) de agar de soja (TSA), la infusin de cerebro y corazn (BHI) agar. Incubar tubos inclinados hasta que el crecimiento es evidente. Calcular el nmero de Staphylococcus aureus organismos presentes mediante la determinacin de la fraccin primera de las colonias probadas que son coagulasa positiva. Multiplique esta fraccin por el nmero promedio de Staphylococcus colonias contadas en las placas de BP. Multiplique el nmero obtenido por el factor de dilucin apropiado y reportar el nmero de S . aureus / g (ml) de la muestra. Si no hay colonias se obtienen en los medios de MLA o BP, observar diluciones MLB ya preparados mientras enriquecindolas a 30 2 C durante 7 das. Examine enriquecimientos diaria para el crecimiento. Despus de 7 das de incubacin, o cuando se sospecha de crecimiento, subcultivar todos los enriquecimientos en tanto MLA y placas de agar MacConkey. Incubar las placas 48 horas a 30 2 C. 2. Los hongos, levaduras y mohos recuento en placa . Transferir 0,1 ml cada vez de series de dilucin (Hl, arriba) para etiquetado adecuadamente placas duplicadas de uno u otro agar extracto de malta (MEA) o agar papa dextrosa (PDA), ambos con 40 ppm de clortetraciclina. Corre el inculo sobre la superficie del medio con varilla esparcidor de vidrio estril. Despus de inculo es absorbida por medio, placas invertidas, incubar a 30 2 C, y observar al da durante 7 das. La media de los recuentos obtenidos en placas duplicadas, multiplicar por 10 para permitir el volumen chapada (0,1 ml), multiplicar por el factor de dilucin, y reportar como levadura o moho recuento / g (ml) de la muestra. Para enriquecimientos fngicas (opcional), diluir la muestra preparada decimalmente en caldo de dextrosa de Sabouraud y se incuba como se describe anteriormente para las diluciones de MLB. Si se produce el crecimiento, la racha en el agar de Sabouraud dextrosa, MEA o PDA. Los ltimos dos agares deben contener tanto 40 ppm clortetraciclina. 3. Concentracin de grmenes anaerobios (usar slo para talcos y polvos) . El propsito principal de este procedimiento es para detectar el bacilo del ttanos ( Clostridium tetani ), que puede ocurrir en estos productos. Realizar como se describi anteriormente para APC, utilizando agar MLA, pre-reducida de agar anaerobio, y 5% de sangre de oveja desfibrinada de agar para el chapado. Incubar las placas de agar sangre en el 5-10% atmsfera de dixido de carbono (frasco con vela o CO 2 incubadora), y las placas de agar anaerbico en la marmita de anaerobios. Incubar tanto para 48 h antes del cmputo. Reincubate durante 2 das ms si no hay colonias aparecen a las 48 h. Pre-reducir placas de agar anaerbico antes de la inoculacin mediante la colocacin de ellos en una atmsfera anaerobia durante la noche (12-16 h). Incubar las placas de agar anaerbico en atmsfera anaerobia (recipiente de anaerobios, incubadora, o en la guantera) durante 2 das a 35 2 C; incubar las placas aerbicamente MLA durante 2 das a 35 2 C como control aerbico. Los anaerobios estrictos crecern solamente en los frascos anaerbicos. Se recomienda que una pequea cantidad (0,1 ml) de inculo puede utilizar para disminuir la expansin del crecimiento causada por la humedad, y que las placas inoculadas se colocan en una atmsfera anaerobia en cuestin de minutos despus de la inoculacin para minimizar la exposicin al oxgeno. Anaerbico Sospecha organismsmust subcultivarse aerbicamente (bajo CO 2 ) y anaerbicas para establecer su relacin verdadera oxgeno. Compruebe situados terminalmente esporas en caldo de carne cocida se incuba a 35 C durante 2 das. El uso de una espora tincin diferencial para detectar esporas es obligatorio. Otros mtodos pueden detectar artefactos nonspore, lo que podra conducir a la identificacin de los esfuerzos desperdiciados. Si se asla un formador de esporas anaerobias obligadas, consulte AD Hitchins, FDA, Washington, DC 20204, para obtener informacin sobre cmo proceder. 4. Prueba de deteccin para el nmero total de microorganismos presentes en los cosmticos usados y no usados . Los medios slidos, temperaturas de incubacin y tiempos descritos en H 1-3 se pueden aplicar, en su caso, a las muestras preparadas como se muestra en el G 1-5 para seleccionar los cosmticos para los recuentos totales antes de realizar las evaluaciones microbiolgicas completas como se describe en H 1-3 arriba. Si la muestra contiene <10 ufc por ml de producto o g, una prueba de deteccin utilizando 1 ml de la 10 -1 dilucin en la tcnica de verter la placa deben arrojar resultados de crecimiento negativas. Si la muestra
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contiene <100 ufc por ml de producto o G, una prueba de deteccin utilizando 0,1 ml de la 10 -1 dilucin en la tcnica de extensin en placa debera producir un resultado de crecimiento negativo.

La identificacin de microbios Los mohos y levaduras deben ser purificados y levaduras identificadas como medida de lo posible el uso de kits, por ejemplo, tarjeta de levadura y Vitek API tira de la asimilacin de levadura. Si es necesario, enve aislados fngicos a Valerie H. Tournas, FDA, Washington, DC 20204, para la especiacin. Para las bacterias, examine todas las placas y la racha morfolgicamente tipos coloniales dismiles sobre soporte MacConkey y MLA. Preparar la tincin de Gram de todo tipo colonial morfolgicamente diferentes obtenidos en cultivo puro. Con los mtodos dan aqu, los aislados pueden ser identificados a nivel de gnero, en general, se enumeran las pruebas para la especiacin, cuando sea necesario. Resultados de la prueba deben ser evaluados utilizando el Manual de Bergey (12) o los mtodos de Madden (14). Kits comerciales de identificacin, por ejemplo, API, Roche, Vitek, Hewlett-Packard ( ver Apndice 1), se recomienda encarecidamente. A. Los mtodos de identificacin 1. Bacilos Gram-positivos . Informe bacilos Gram-positivos aerbicos, ya sea como formadores de esporas o nonsporeforming. Para mejorar la esporulacin, inocular placa de agar de almidn con el aislamiento e incubar 48 horas a temperatura ambiente. Prepare bien la tincin de Gram o la mancha endospore de colonia aislada y nota la posicin de endospore dentro clula vegetativa (central, terminal, o subterminal), forma de endospora (redonda o elipsoidal), y la morfologa de esporulacin esporangio de clulas (hincha o no hinchada). Pruebe todas las barras de formadores de esporas aerbicas para la motilidad por cualquiera de estos dos mtodos: a. Mtodo de cultivo . Tubo Pualada inocular de prueba de movilidad o medio-motilidad indol ornitina. Incubar aerbicamente 18-24 h a temperatura ambiente. El crecimiento de la lnea de la pualada (indicado por la turbiedad del medio alrededor de arma blanca) constituye una prueba positiva. b. El examen microscpico . Inocular aislado colonia en caldo adecuado. Incubar aerbicamente 18-24 h a temperatura ambiente. Coloque una gota de caldo de cultivo en portaobjetos limpio y cubrir con cubreobjetos. Motilidad se indica por las clulas bacterianas individuales que se mueven en direcciones aleatorias. Observe en cada 400X o con aceite de inmersin. Adems de la caracterizacin de bacilos Gram-positivos generalmente no es necesario. Consulte refs. 7 y 12 si se requiere una mayor caracterizacin de estos organismos. 2. Cocos Gram-positivos . Racha MLA placa de los medios de comunicacin de APC (MLA o BP), incubar 18-24 horas a 35 2 C, y el crecimiento resultante de ensayo para la actividad de la catalasa y la produccin de coagulasa (si catalasa-positivas). a. Prueba de la catalasa . Aadir una gota de 3% de H 2 O 2 , ya sea a colonia aislada o para limpiar portaobjetos de microscopio y lugar asa de platino llevando algn aislar dentro de la gota. La reaccin es positiva si el gas oxgeno se desarrolla rpidamente (formacin de burbujas). (Bucles de alambre de nicrom pueden dar reacciones positivas falsas.) Cuando H O 2 se coloca directamente en una colonia de las bacterias morirn. Control positivo ( Staphylococcus o una bacteria entrica) y control negativo ( Streptococcus ) se deben ejecutar al mismo tiempo para asegurar la calidad de la H 2 O 2 solucin. b. Prueba de la coagulasa . Inocular pequea cantidad de crecimiento a partir de la inclinacin de mantenimiento en el tubo de 13 x 100 mm que contiene 0,2 ml de caldo BHI. Incubar 18-24 horas a 35 2 C, y luego aadir 0,5 ml de plasma de conejo liofilizado reconstituido coagulasa (con EDTA) y mezclar bien. Incubar a 35 2 C durante 6 horas y examinar para la coagulacin. Dbilmente cepas coagulasa productoras puede requerir incubacin durante la noche para la formacin de cogulos de ser evidente. Incluya conocido coagulasa positivo y conocido organismo coagulasa negativos con cada serie de muestras. Considere todas las cepas que producen la reaccin de coagulasa positivos como S . aureus . Si no se produce catalasa , inocular la bilis esculina inclinado de agar, un tubo de TSB que contena 6,5% de NaCl, y una placa de agar sangre de oveja al 5%. Incubar 18-24 horas a 35
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2 C. Si organismo ennegrece medio bilis esculina y crecer en presencia de 6,5% de NaCl, reportarlo como "Grupo D enterococo" ( Enterococcus spp.). Si se ennegrece medio bilis esculina, pero no va a crecer en presencia de 6,5% de NaCl, reportarlo como "Grupo D Streptococcus , no enterococo. " Si no se oscurecer medio bilis esculina, reportarlo, ya sea como alfa, beta, gamma hemoltico o Streptococcus . Si agar 5% sangre de cordero no est disponible, reportarlo como " Streptococcus , no el Grupo D. " Realice especiacin adicional de estreptococos, si es necesario, utilizando los procedimientos descritos en la ref. 7 o kits de serolgicos disponibles comercialmente para este propsito, por ejemplo, Phadebact (Pharmacia Diagnostics, Piscataway, NJ). Si se produce catalasa , inocular los siguientes medios de comunicacin con el recin aisladas colonia: agar sal manitol, tubos duplicados de-oxidativo fermentativa (DE) medio con dextrosa (overlay 1 tubo con vaspar estril o aceite mineral, dejar 1 tubo flojamente tapado sin superposicin) , y enriquecido inclinado de agar para su uso en la prueba de la coagulasa. Informe organismo como S . aureus si es coagulasa positivo y / o fermentar manitol; S . epidermidis si es fermentativo y oxidativo en DE dextrosa, es coagulasa-negativos, y no fermentar el manitol, o Micrococcus especie si es oxidativo slo en DE dextrosa. 3. Bacilos Gram-negativos . Inocular TSI inclinado de agar, placa de agar MacConkey, agar cetrimida, y la placa de MLA con todos los bacilos Gram-negativos. Incubar 18-24 horas a 35 2 C. Reacciones ETI inclinacin / a tope de A / A o K / A (A = cido; K = alcalina) + H 2 S indican un Enterobacteriaceae aislar. K / K, K / NC (NC = sin cambio) o NC / NC reacciones indican no fermentadores (NF) bacilos Gram-negativos. Si las reacciones de la ETI estn enmascarados por la produccin de sulfuro de hidrgeno, inocular lactosa y glucosa caldos de carbohidratos e incubar 18-24 horas a 35 2 C. Para un Enterobacteriaceae aislar, perf las siguientes pruebas y uso de rbitros. 3, 6, 11 a 13 para interpretar los resultados. El API 20E o kit comercial equivalente pueden utilizarse para identificar a nivel de especie. Medios necesarios para las pruebas se enumeran en C, anteriormente. Si un organismo crece en agar cetrimida o se identifica como un bacilo NF Gram-negativo, determinar fluorescente y la produccin de pigmento no fluorescente, la produccin aerbica de cido de cualquiera de glucosa, sacarosa, xilosa, manitol o, y la produccin de gas de nitrgeno a partir de un nitrgeno inorgnico fuente; efectuar otros ensayos necesarios utilizando los medios que figuran en el D, arriba. La acetamida utilizacin, el crecimiento a 42 C, y la licuefaccin de gelatina son pruebas importantes para distinguir las tres Pseudomonas especies, P . aeruginosa , P . fluorescens , y P . putida . Para interpretar los resultados de estas pruebas, utilice refs. 4, 11, 12, 19 o el kit y los datos no fermentadores API Base. Confirmar putativo P . aeruginosa cepas mediante el mtodo descrito a continuacin. 4. Mtodo para la identificacin de Pseudomonas aeruginosa Identificacin de P . aeruginosa es especialmente preocupante porque este organismo sobrevive en los cosmticos del rea del ojo (21) y se ha implicado en las infecciones de los ojos (20). Es oportunista patgena para los seres humanos (10) y altamente resistente a los agentes antibacterianos tales como compuestos de amonio cuaternario, penicilina y muchos antibiticos de amplio espectro. a. La identificacin presuntiva Inclinados de agar TSI . Traslado colonias tpicas bien aisladas a partir de placas de agar cetrimida para tubos inclinados de agar TSI. Superficie racha y culata de arma blanca. Incubar a 35 C durante 24 2 h. Todos los cultivos inclinados que tienen crecimiento y un alcalino (rojo) de inclinacin y alcalina (rojo) trasero deben ser considerados como presunto positivo para Pseudomonas spp. y la prueba de oxidasa y otras reacciones bioqumicas. Algunas pseudomonas pueden producir sulfuro de hidrgeno ligero en TSI, pero esto se puede confundir con pigmentos solubles producidos por algunas especies. Prueba de oxidasa Tiras de prueba de oxidasa (por Pseudomonas spp.) Tetrametil- p -fenilendiamina-dihidrocloruro 1,0 g El cido ascrbico 0,1 g Agua destilada 100 ml Cortar el papel de filtro (Whatman N 40) en pequeas tiras de unos 10 x 40 mm. Sombra en el reactivo. Escurrir. Corre tiras sobre toallitas de papel en una bandeja. Shade con toallas de papel, porque la luz degrada el reactivo; seca en 35 C incubadora. (Reactivo
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tambin degrada a temperatura ms alta.) Cuando se haya secado, almacenar en botellas de color marrn a temperatura ambiente. Las tiras se deben proteger de la luz y la humedad, sino que debe ser de color blanco. Las tiras son estables indefinidamente. Utilice asa de platino para desprestigiar a la masa de las clulas en la porcin de la banda. (Nicrom da reacciones positivas falsas.) Leer a los 10 s, no hay ms tiempo . Positiva se indica por un color morado oscuro; negativa se indica por la ausencia de color o cuando aparece un color prpura despus de 10 s. Pseudomonas spp. son oxidasa-positivo. b. Las pruebas bioqumicas De cada uno de agar presuntiva inclinacin ETI positivo inocular tubos inclinados de agar YE duplicados, el caldo de Koser citrato, malonato de caldo, medio que contiene arginina descarboxilasa, agar de nitrato de la motilidad, gelatina nutriente basal (CDC), agar de Pseudomonas F, y Pseudomonas agar P. YE agar inclinados . Inocular por duplicado agar inclinado YE. Incubar una inclinacin a 35 C durante 24 2 h y una inclinacin a 42 C durante 24 2 h. ( NOTA : Eq de agar inclinados a 42 C antes de la inoculacin, ya que otras especies de Pseudomonas . pueden crecer ligeramente a 42 C en medios nonpreincubated, pero no van a crecer en cultivos inclinados precalentadas) Pocos Pseudomonas spp. que no sea P . aeruginosa crecer a 42 C. P . aeruginosa produce un olor a pescado de trimetilamina en agar YE. Aproximadamente el 4% de todas las culturas encontradas rutinariamente dejan de producir pigmento. Debido a que a menudo se confunden con Alcaligenes spp., Achromobacter spp., u otras especies, las cepas no pigmentadas deben realizar ms pruebas antes de que se descartan. Caldo citrato de Koser . Inocular el caldo y se incuba a 35 C durante 24 y 48 h. Utilizacin de citrato se indica mediante turbidez marcada. Caldo malonato . Inocular el caldo malonato. Incubar a 35 C durante 24 2 h. Una prueba positiva para la utilizacin de malonato como nica fuente de carbono se indica mediante un indicador de cambio de verde a azul (alcalina). Agar motilidad nitrato . Para inocular agar motilidad nitrato, superficie racha y el culo de arma blanca. Incubar a 35 C durante 24 2 h. Aadir unas gotas de cada uno de cido sulfanlico y naftilamina. Un de color rosa oscuro resultante o el color rojo indica la reduccin de nitrato a nitrito. Un negativo en color, junto con la presencia de burbujas de gas o grietas en el medio se consider una reaccin positiva e indica la reduccin de nitrato a nitrito a nitrgeno libre. NOTA : Siempre pruebe un tubo de control se incubaron en las mismas condiciones. Caldo de arginina descarboxilasa . Inocular la descarboxilasa de medio basal que contiene arginina. Atornillar las tapas firmemente para evitar la aireacin. Incubar a 35 C durante 24 2 h. Examine para el crecimiento. Una reaccin positiva para la descarboxilacin arginina se indica por ningn cambio en el color del medio de prpura. Una reaccin negativa se indica mediante un indicador de cambio a amarillo (cido). Licuefaccin de gelatina . Inocular los tubos de gelatina de nutrientes y las nalgas de arma blanca. Incubar a 25 C (temperatura ambiente) durante al menos 72 h. Enfre antes de examinar para la licuefaccin. Incubar los tubos negativos 1 semana. Tubos negativos se mantienen normalmente hasta 6 semanas antes de desechar, pero claramente esto no es prctico. Sin embargo, P . aeruginosa normalmente se licua rpidamente de gelatina. Agar de Pseudomonas F y Pseudomonas agar P . Inocular verti placas de agar F y P de agar por rayas. Incubar a 25 C durante al menos 3 das. Examine agar F con luz negro (onda larga UV). Pigmentos solubles en agua fluorescentes (pyoverdines) se difundir en agar adyacente a rayas que contienen Pseudomonas spp. Romper agar P con varilla de vidrio en aproximadamente la misma cantidad de agua destilada y agitar vigorosamente hasta que el agua se ha retirado la mayor cantidad de pigmento de lo posible. Decantar en el separador. En una campana qumica, aadir 5-10 ml de cloroformo al agua en el separador y agitar (ventilacin de vez en cuando para evitar que la presin interna). El piocianina azul migrar a cloroformo. Trasvasar capa de cloroformo a tubo de ensayo. Aadir alrededor de 3 ml de agua destilada. Aadir 1 gota 1 NH 2 SO 4 . Piocianina se enrojece y se migra al agua. Deseche solvente en la botella de cloroformo-residuos especiales. Mancha flagelos . Si la cultura se rene todos los otros requisitos para P . aeruginosa , incluyendo pigmentos, no es necesaria la mancha flagelos. Utilizar mtodos de Clark o seguir cualquier otro mtodo adecuado (7), por ejemplo, Leifson o mtodos Bailey. Un mtodo
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rpido en fresco, con la tincin Ryu (8) ha sido reportado. P . aeruginosa tiene un solo flagelo polar. Las otras pseudomonas fluorescentes tienen varios flagelos. B. Resultados bioqumicos. Examinar datos con el fin, como se muestra. No se salte . TSI Culo cido, cua alcalina, + gas No Culo cido, inclinacin cido, gas + No Cua alcalina y las nalgas, + H 2 S Posiblemente Agar YE No hay crecimiento a 42 C No Crecimiento a 42 C Probablemente Arginina descarboxilasa Negativo - Probablemente no Positivo Probablemente Citrato de Koser No hay crecimiento - Probablemente no Crecimiento Posiblemente Utilizacin Malonato Negativo - Probablemente no Positivo Posiblemente Reduccin de nitrato Negativo, no hay gas - Probablemente no Positivo Posiblemente Motilidad Negativo - Probablemente no Positivo Posiblemente Flagelacin Flagelos polares Posiblemente Cualquier otro flagelacin No Agar Pseudomonas F Sin pigmento fluorescente No Pigmento soluble en agua Fluorescente (pyoverdine) Agar Pseudomonas P Sin pigmento No Si el pigmento est presente, confirmarlo como procyanineP . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa P . aeruginosa

C. Interpretacin Los productos cosmticos no se espera que sea asptica, sin embargo, deben estar completamente libre de alta virulencia de patgenos microbianos, y el nmero total de microorganismos aerobios por gramo deben ser bajos. Dado que no existen estndares ampliamente aceptables para los nmeros, las pautas temporales se utilizan en su lugar. Para los productos del rea del ojo, el recuento no debe ser mayor de 500 unidades formadoras de colonias (UFC) / g de conformacin; para los productos no rea de los ojos, el recuento no debe ser superior a 1000 UFC / g. La presencia de patgenos sera particularmente importante en la evaluacin como inaceptable un cosmtico con un recuento marginalmente aceptable, por ejemplo, de 400 UFC / g para un producto para los ojos-rea. Los patgenos o patgenos oportunistas, cuya incidencia sera de especial preocupacin, especialmente en rea de los ojos, los productos cosmticos incluyen S . aureus , Streptococcus pyogenes , P . aeruginosa y otras especies, y Klebsiella pneumoniae . Algunos microbios normalmente considerados como no patgeno oportunista patgena pueden ser, por ejemplo, en las heridas. D. Eficacia conservante cosmtico . Las directrices anteriores para la interpretacin de los resultados se aplican a los productos cosmticos antes de la hora de uso. Cosmticos contienen conservantes antimicrobianos y por lo tanto se espera que soportar una cierta cantidad de abuso por parte de los usuarios. Anteriormente, no haba pruebas validadas para la eficacia de conservacin de cosmticos (9), aunque la prueba de la eficacia farmacutica conservante en la Farmacopea de EE.UU. (2) o la prueba de cosmticos en las directrices tcnicas de la Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA) ( 1) se utilizaron. Recientemente, la prueba de la CTFA se ha validado la AOAC (2b) para su uso con cosmticos lquidos. Se ha propuesto una prueba de la eficacia conservante cosmtica slida (18). Cosmticos en kits de prueba reutilizables, tales como aquellos en tiendas al por menor, pueden ser microbiolgicamente evaluaron semicuantitativamente por una prueba de hisopo estril (17).
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