Inmunologa Farmacia UMH ______________________________________

El Sistema Inmune. Propiedades.

1) Definicin del Sistema Inmune 2) Inmunidad innata y adaptativa. 3) Propiedades de la respuesta inmune. 4) Defectos en la respuesta inmunolgica y en la enfermedad.

Clulas del Sistema Inmune. Marcadores de diferenciacin leucocitarios.

1) Lneas de diferenciacin celular en la hematopoyesis. 2) La nomenclatura "CD". 3) Clulas linfoides: Linfocitos T y B y clulas plasmticas, Clulas "Natural Killer". Marcadores moleculares citoplasmticos y de membrana de diferenciacin y activacin. 4) Clulas presentadoras de antgeno: Fagocitos monomorfonucleares, Clulas de Langerhans, Clulas interdigitantes, Clulas foliculares dendrticas. Marcadores moleculares. 5) Otras clulas que participan en la Respuesta Inmune: Fagocitos polimorfonucleares, Basfilos, Mastocitos, Eosinfilos.

El tejido linfoide: rganos primarios. rganos secundarios.

1) Tejidos linfoides: a) Primarios. b) Secundarios. 2) El sistema linftico. 3) Mdula sea. 4) Timo. 5) Bazo. a) Areas T dependientes. b) Areas B dependientes. 6) Ganglios linfticos: a) Areas T dependientes. b) Areas B dependientes. 7) Organizacin del tejido linfoide asociado a las mucosas (MALT). 8) Trfico linfocitario. "Homing".

Inmunoglobulinas.
1) Definicin de anticuerpo. 2) Estructura de las inmunoglobulinas y caractersticas fisicoqumicas. Estructura en dominios. 3) Regiones constantes y variables. Relacin entre estructura y funcin. 4) Isotipos de cadenas pesadas y ligeras. 5) Alotipos e idiotipos. 6) Cadena J y componente secretor. 7) Funciones de los anticuerpos.

Gentica de las inmunoglobulinas I. Generacin del repertorio de BCR.

1) Genes de las Inmunoglobulinas. 2) Mecanismo de reordenamiento gnico. 3) Generacin de la diversidad. 4) Eliminacin de clones autorreactivos.

Gentica de las inmunoglobulinas II.

1) Cambio de isotipo. 2) Inmunoglobulinas secretadas Vs inmunoglobulinas de membrana. 3) Maduracin de la afinidad: Hipermutacin somtica en centros germinales. 4) Fisiologa de la produccin de anticuerpos.

La estructura antignica. Interaccin antgeno-anticuerpo.

1) Nomenclatura: Antgeno, Eptopo, Inmunogenicidad, Antisuero. 2) La unin antgeno-anticuerpo. Complementariedad espacial. Fuerzas de intervienen en la unin. 3) Parmetros que expresan la fuerza de unin entre un antgeno y un anticuerpo. 4) Inmunogenicidad. Qu hace que una molcula sea antignica? 5) Antgenos T dependientes y T independientes.

Linfocitos B. Receptor antignico.

1) El complejo BCR. 2) BCR y subpoblaciones B. 3) Ontogenia de los linfocitos B. 4) Seleccin de linfocitos B en mdula sea. 5) Reconocimiento de antgeno soluble e internalizacin. 6) Diferenciacin de linfocitos B. Clulas plasmticas.

El Complejo Mayor de Histocompatibilidad. Estructura molecular y funcin.

1) Importancia de las molculas MHC. Sistema HLA. 2) Estructura de las molculas MHC de clase I. 3) Funcin de las molculas MHC de clase I. 4) Estructura de las molculas MHC de clase II. 5) Funcin de las molculas MHC de clase II. 6) Patrones generales de unin de pptidos a molculas HLA-I y HLA-II. Diferencias. Residuos de anclaje primarios y secundarios.

Gentica del Complejo Mayor de Histocompatibilidad

1) Organizacin cromosmica de los genes del complejo HLA. 2) Polimorfismo allico. 3) Patrn de herencia de los genes MHC. Desequilibrio de ligamiento. 4) Aplicaciones del tipaje HLA: trasplante de tejidos, asociacin HLA-enfermedad, paternidad, distribucin tnica de haplotipos.

Procesamiento y presentacin de antgeno.

1) El procesamiento antignico. 2) Presentacin antignica asociada a molculas MHC de clase I. 3) Presentacin antignica asociada a molculas MHC de clase II. 4) Naturaleza del pptido procesado. Pptidos intracelulares Vs extracelulares. 5) Las clulas T y B reconocen formas distintas del antgeno. 6) Superantgenos.

Linfocitos T. Receptor antignico: TCR.

1) Estructura del receptor antignico de los linfocitos T. El complejo CD3/TCR. 2) Tipos de receptor: TCR alfa/beta y TCR gamma/delta. 3) Topologa del complejo MHC-PEPTIDO ANTIGENICO-TCR. 4) Funcin de las cadenas de CD3 en la transduccin de seales. 5) Papel de las molculas coestimuladoras en la activacin de linfocitos T.

Gentica del receptor antignico del linfocito T. Generacin y seleccin del repertorio de especificidades.
1) Estructura y organizacin gnica de las cadenas del TCR. 2) Reordenamiento gnico intratmico. 3) Seleccin positiva y negativa de timocitos CD4+CD8+. 4) Papel de las clulas del estroma en la seleccin. 5) Desarrollo de las poblaciones de clulas T con TCR de tipo gamma/delta. 6) Apoptosis como mecanismo de homeostasia.

Activacin linfocitaria.
1) La activacin celular en la respuesta inmune. 2) Secuencias intracelulares inductoras de activacin e inhibicin. 3) Cascada bioqumica de la activacin linfocitaria. Segundos mensajeros. Fosforilacin de protenas. Factores de transcripcin.

Citocinas.
1) Estructura y funcin de las citocinas 2) Sistemas celulares productores de citocinas. 3) Receptores de citocinas. Familias. 4) Mecanismos de accin de las citocinas. 5) Clasificacin de las citocinas. Citocinas que regulan la respuesta inespecfica. 6) Citocinas que regulan la respuesta adaptativa. 7) Quimiocinas y sus receptores. 8) Citocinas hematopoyticas. 9) Subpoblaciones de linfocitos T segn su patrn de secrecin de citocinas (Th1, Th2, Th0).

Molculas de adhesin en la respuesta inmune.

1) Molculas de adhesin clula-clula y clula-matriz extracelular. 2) Clasificacin de las molculas de adhesin: Selectinas, Familia supergnica de las inmunoglobulinas, Integrinas, Adresinas (diriginas) vasculares. 3) Control de la expresin de las molculas de adhesin en las clulas y tejidos.

Respuestas citolticas: Mecanismos efectores.

1) Citotoxicidad mediada por clulas de estirpe linfoide: Clulas T citotxicas. Clulas "Natural Killer". 2) Reconocimiento de la clula diana. Receptores para HLA-I de funcin inhibidores. 4) Mecanismos moleculares de citotoxicidad. 5) Autoproteccin citoltica.

El Sistema del Complemento.

1) Definicin. Nomenclatura de los factores. 2) Activacin del Complemento: Va alternativa. Va de las lectinas. Va clsica. 3) Complejo de ataque a la membrana. 4) Factores reguladores solubles y de membrana. 5) Receptores celulares para el Complemento. 6) Funciones biolgicas del Complemento.

Generacin, dinmica y regulacin de la respuesta inmune.

1) Focalizacin de la respuesta. 2) Mediadores inflamatorios. Mediadores de los mastocitos y macrfagos. 3) Interacciones leucocito-endotelio. 4) Regulacin de la infiltracin leucocitaria. 5) Interaccin APC/Ag con linfocitos T. 6) Interaccin linfocito T activado-linfocito B en tejido linfoide. 7) Generacin de linfocitos efectores y de memoria. 8) Papel regulador del antgeno. 9) Papel regulador de los inmunocomplejos. 10) Interacciones idiotpicas. 11) Regulacin neuroendocrina de la respuesta inmune

Tolerancia inmunolgica.
1) Qu se entiende por tolerancia inmunolgica?. 2) Mecanismos de tolerancia: Delecin clonal, Anergia 3) Supresin, Desviacin inmune, Ignorancia inmunolgica.

Reacciones de hipersensibilidad.
1) Concepto de hipersensibilidad. 2) Hipersensibilidad de tipo I. 3) Hipersensibilidad de tipo II. 4) Hipersensibilidad de tipo III. 5) Hipersensibilidad de tipo IV.

Autoinmunidad.
1) El fenmeno de autoinmunidad. 2) Mecanismos de dao tisular en enfermedades autoinmunes. 3) Enfermedades autoinmunes no organoespecficas. 4) Enfermedades autoinmunes organoespecficas.

Inmunodeficiencias.
1) Inmunodeficiencias primarias. 2) Inmunodeficiencias secundarias. 3) Infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana.

Tcnicas Inmunolgicas.
1) Reacciones de precipitacin en geles. Imunodifusin radial simple, inmunodifusin doble, inmunoelectroforesis, inmunofijacin y contrainmunoelectroforesis 2) Enzimoinmunoensayo y Radioinmunoensayo. 3) Nefelometra. 4) Electroinmunotransferencia. 6) Inmunoprecipitacin. 8) Produccin de antisueros. 9) Produccin de anticuerpos monoclonales. Utilidad.

10) Inmunofluorescencia directa/indirecta. 11) Tcnicas de histocompatibilidad.

Tema 01. Introduccin a la Inmunologa

Todos los individuos tienen la necesidad de defender constantemente su integridad biolgica frente a agresiones externas, causadas por bacterias, virus, hongos y parsitos, para poder sobrevivir.

Para que este fenmeno defensivo se lleve a cabo, los organismos disponen de una serie de barreras naturales de aislamiento, como son la piel y las mucosas, y de un sistema especializado de defensa conocido como sistema inmune (Figura sistema inmune), que tiene la capacidad de identificar y destruir todo lo extrao que invada nuestro organismo.La inmunologa es precisamente la

ciencia que estudia los procesos moleculares y celulares implicados en la defensa de la integridad biolgica del organismo a travs de la identificacin de las sustancias propias y la deteccin de las sustancias extraas, al objeto de tratar de destruir y as evitar infecciones por microorganismos patgenos (Figura Respuesta Inmune) En su conjunto en la respuesta inmune participan (Figura Principales componentes del sistema inmune): Molculas, entre las que destacan las inmunoglobulinas (anticuerpos), las citocinas y sus receptores, el sistema de complemento, entre otras;

Clulas inmunocompetentes, entre las que destacan linfocitos, monocitos, clulas dendrticas y otras; rganos linfoides (Figura Principales rganos y tejidos linfoideos), que es el sitio donde se
agrupan las clulas inmunocompetentes y entre los que destacan los primarios, como timo y mdula sea y los secundarios como ganglios linfticos, bazo y tejidos linfoides asociados a mucosas y epitelios. En cada organismo, los mecanismos de defensa son de tipo innato y de tipo adaptativo, que en general son muy diversos y heterogneos (Figura Tipos de respuesta inmune), aunque siempre existe una actuacin integrada de todos los componentes de ambos mecanismos. Los mecanismos que conforman la inmunidad de tipo innato estn cons- tituidos por las barreras naturales, que las componen junto con la piel que asla lo interior de lo exterior otra gran cantidad de elementos naturales, dentro de los cuales estn las mucosas que actan como un puesto fronterizo entre dos compartimientos y otros factores particulares como la lisozima de la saliva y las secreciones lagrimales y nasales que tienen la capacidad de romper la unin de los azcares presentes en las paredes bacterianas, favoreciendo su destruccin, y la respuesta inmune innata propiamente dicha, en la que intervienen diversas molculas como el complemento y ciertas citocinas; as como un conjunto de clulas, que en general se caracterizan por su capacidad para actuar de manera inmediata sin requerir de un aprendizaje previo Adicional a los mecanismos de defensa innatos, existe la respuesta inmune adaptativa, que corresponde con la segunda lnea de defensa del individuo y se caracteriza por desarrollarse solo y especficamente frente a cada una de las sustancias extraas que han conseguido penetrar en el organismo y que no han sido previamente eliminadas por los mecanismos de la respuesta innata. En esta respuesta participan prioritariamente linfocitos T, linfocitos B y las molculas liberadas por estas clulas producto de su activacin, como son los anticuerpos y las citocinas. A diferencia de la respuesta innata, cuyas clulas siempre poseen un nmero limitado de receptores preformados con una amplia capacidad de reconocimiento que permite que con pocos receptores se reconozcan prcticamente la mayora de las bacterias, en la respuesta adaptativa los linfocitos T y los linfocitos B en su conjunto s poseen receptores para la mayora de patgenos existentes en la naturaleza.

Por otra parte, el sistema inmune adaptativo genera memoria de un estmulo antignico a otro de la misma ndole, debido a la permanencia por tiempos indefinidos de poblaciones linfoides sensibilizadas luego de un estmulo antignico y a diversos mecanismos internos de control que permite que la intensidad de la respuesta inmune se automodule y regule. Basado en todas estas propiedades descritas, la respuesta adaptativa a diferencia de la respuesta innata posee las caractersticas de especificidad, clonalidad, memoria y autorregulacin.Hemos dicho que el

sistema inmune defiende y preserva lo propio de lo extrao, pero comencemos por reflexionar y analizar sobre lo propio y lo extrao para el sistema inmune de cada individuo. Concepto de lo propio y extrao para el sistema inmune El primer gran objetivo del sistema inmune es el reconocimiento de s mismo y la identificacin selectiva de lo extrao al objeto de neutralizarlo. Sin embargo, la estrategia de defensa utilizada por el sistema inmune no parece ser rgida; sino adaptable y flexible, ya que en unas circunstancias ciertas bacterias son identificadas como extraas y destruidas, y en otras circunstancias el organismo decide que puede convivir con ellas e incluso utilizar las vitaminas que producen en beneficio propio. Componentes extraos para el sistema inmune Se entiende por extrao todo aquello que no haya sido reconocido adecuadamente por el sistema en su entorno durante el desarrollo fetal o en las primeras semanas de vida. Estos componentes biolgicos o sustancias extraas se denominan antgenos y pueden formar parte de los miles de microorganismos como bacterias, virus, parsitos y hongos que tanto abundan en la naturaleza o incluso de un tejido u rgano proveniente de otros individuos.En este sentido, todas las sustancias que tienen la capacidad de estimular al sistema inmune y generar una respuesta inmune, se conocen como antgenos, mientras que las zonas o partes del mismo que tienen capacidad inmungena, se conocen como determinantes antignicos o eptopos. Sabemos que prcticamente cualquier tipo de molcula biolgica, incluyendo azcares, lpidos, hormonas, metabolitos intermediarios, carbohidratos complejos, fosfolpidos, cidos nucleicos y protenas pueden ser antgenos.En general los antgenos son de mayor tamao que la zona que participa en la unin con el anticuerpo denominado determinante antignico o eptopo de modo que un anticuerpo solo se une a una zona muy restringida del antgeno. La mayora de los antgenos poseen mltiples eptopos, con lo que pueden unir mltiples anticuerpos a la vez siempre que los eptopos estn suficientemente alejados entre ellos para que no existan interferencias estricas que lo impidan. Clsicamente se llamaba antgeno a toda molcula capaz de generar un anticuerpo, pero en la actualidad se considera antgeno a cualquier molcula capaz de unirse a un anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola generarlo. Aquellas molculas que adems sean capaces de generar un anticuerpo se les denomina inmungenas. En este sentido existen molculas muy pequeas que llamamos haptenos, que para generar anticuerpos necesitan ir unidas a molculas ms grandes llamadas transportadoras. Una vez que se han generado de este modo, anticuerpos contra el hapteno, ste puede unirse a los anticuerpos. El hapteno es por lo tanto, una molcula antignica pero no inmungena.La capacidad de unin antgeno-anticuerpo (AgAc), es la caracterstica ms importante y comn de todas las inmunoglobulinas. Esta unin es no covalente y dbil, de tal forma que la reaccin es reversible, encontrndose los antgenos y los anticuerpos libres en equilibrio dinmico con los unidos. Tras la unin Ag-Ac, as sustancias extraas o antgenos son neutralizadas y posteriormente destruidas por las inmunoglobulinas a travs de mecanismos, que pueden ser diferentes segn el tipo de inmunoglobulina que participa. Por ultimo, debemos considerar que el sistema inmune se constituye en el elemento de control de todo el universo bioqumico interno, tomando en cuenta el hecho de que la piel nos sirve de primera barrera para aislar lo interior de lo exterior y las mucosas actan como puestos fronterizos a fin de permitir la necesaria interaccin entre lo interno y lo externo. Pero decamos antes que a veces toleramos incluso bacterias que nos son tiles a pesar de que no son propias, lo cual se explica porque el organismo es mucho ms receptivo a lo extrao cuando no hay una seal de alarma. En definitiva, parece que no estamos ante un sistema exclusivamente centrado en la autodefensa frente a la

amenaza de contrarios, sino que ms bien se trata de un sistema dedicado a la proteccin de la integridad biolgica vital de cada individuo, para que ste pueda sobrevivir de manera independiente en un universo altamente biodiversificado, Qu es lo propio para el individuo? Los conocimientos actuales indican que cada individuo entiende por propio todos aquellos componentes naturales presentes en s mismo y que ya desde el seno materno, el sistema inmune del feto, aun inmaduro comienza a identificar con precisin. Sin embargo no resulta tan sencillo entender cmo el sistema inmune ya desde el seno materno comienza a diferenciar en todo momento los componentes propios de los que no lo son a pesar de la compleja estructura individual compuesta de miles de millones de molculas y de clulas. Un sistema que adems no nace con el nuevo individuo, sino que una vez formado en el feto y en el recin nacido va progresivamente madurando a travs de nuevas experiencias. Esta es la razn por la que se habla de aprendizaje, ya que se entiende que el sistema inmune del nuevo individuo identifica como propio todas aquellas molculas generadas por el feto durante su periodo de desarrollo en el seno materno y que han sido reconocidas como algo natural de su entorno.La inmunologa actual nos habla tambin de que ese aprendizaje va unido a un sistema ms complejo de etiquetaje interno. As de la misma manera en que todos los miembros de una especie cuentan con componentes idnticos como son las hormonas, tambin cuentan con unos componentes muy variables denominados molculas de histocompatibilidad que son diferentes de unos individuos a otros incluso dentro de la misma especie y en consecuencia son los verdaderos marcadores de lo propio de cada individuo (Figura: Individualidad) Estas molculas actan a modo de cdigo de barras biolgico que si bien, se transmiten de padres a hijos, son nicos e irrepetibles, debido a la diversidad que se genera tanto por recombinacin gentica como por mutaciones espontneas. As pues, podemos decir que la especie humana es biolgicamente diversa al estar formada por individuos que a su vez son biolgicamente nicos. En este contexto, tambin cabe preguntarse Cules son las consecuencias de los errores de la interpretacin entre lo propio y lo extrao?, por lo que no se escapa que un serio dilema para el sistema inmune es la necesidad de compatibilizar por una parte la defensa de cada persona, manteniendo su individualidad, y la defensa de la especie, propiciando su diversidad. Debido a la complejidad de esta funcin, existen mecanismos muy precisos de control que evitan que sea el sistema inmune el que destruya los componentes propios del organismo donde asienta. Sin embargo, la biologa humana no est exenta de fallos, apareciendo as en ciertos casos enfermedades, conocidas como de autoinmunidad, en las que el sistema inmune falla en estos sistemas de reconocimiento y pierde la tolerancia que debe mantener frente a los componentes propios. Defensa del individuo y tolerancia a la especie Los procesos moleculares y celulares implicados en cada mecanismo de defensa desarrollado por el sistema inmune, son fundamentales para la salud y por ende para la supervivencia del individuo. En ausencia de un sistema inmune eficaz y competente, muchos microorganismos pueden producir diversas infecciones que en la mayora de los casos pueden resultar mortales. Cuando el individuo, a pesar de poseer un sistema inmune eficiente, desarrolla cuadros clnicos asociados a infecciones, generalmente es debido a que necesita tiempo para construir una respuesta fuerte contra los microorganismos invasores, lo que favorece, que estos patgenos tomen ventaja sobre todo durante la infancia o la vejez, pocas en las que el individuo es ms vulnerable inmunolgicamente. Un serio dilema para el sistema inmune es la necesidad de compatibilizar por una parte la defensa del individuo manteniendo su individualidad, y por otra la defensa de la especie propiciando su diversidad. Hoy se sabe, que el desarrollo del sistema inmune es un evento bien estudiado que parte de

su caracterstica inmadurez en la poca fetal del individuo. Los linfocitos, que son los principales protagonista de la respuesta inmune, aparecen ya en la semana 13 de gestacin y no es hasta la semana 25 cuando adquieren capacidad funcional. El feto posee pues una capacidad de respuesta muy primitiva, y slo al final del embarazo comienza a producir algunos tipos de anticuerpos, que son otra de las grandes herramientas del sistema inmune, para defender al individuo despus de nacer. Sin embargo, la mayora de los anticuerpos que posee el recin nacido son propios de la madre, quien se los pasa a travs de la placenta. En general, la accin del sistema inmune en el periodo de vida fetal es muy compleja, ya que por una parte tiene que madurar en el sentido de reconocerse a s mismo y por otra tiene que tolerar los componentes maternos desarrollando mecanismos para no entrar en conflicto con ellos. Finalmente y en consecuencia de todo lo anterior, hemos de decir que la Inmunologa es una ciencia de gran amplitud que comprende diversas reas en continua expansin, dentro de las que destacan: Inmunogentica, Inmunobiologa, Inmunopatologa o Inmunologa clnica, Inmunofarmacologa, Inmunologa veterinaria, etc. Alteraciones del sistema inmune Cuando los mecanismos inmunes se alteran dan lugar a procesos patolgicos, siendo en muchos casos el sistema inmune en s la causa de enfermedad. Esto se evidencia, por ejemplo en lo que ocurre cuando el individuo reacciona de forma exacerbada frente a sustancias que en principio son inocuas, como es el polen de plantas, en cuyo caso aparecen reacciones de hipersensibilidad como las alrgicas y el asma, que cada vez son ms frecuentes en la poblacin. En otros casos, el sistema inmune no reacciona adecuadamente, producto de algn tipo de inmunodeficiencia, haciendo muy vulnerable al individuo a una multitud de infecciones, especialmente las causadas por grmenes oportunistas. O cuando, las clulas encargadas de la defensa inmune, comienzan a proliferar en grandes cantidades, llegando a producir autnticos cnceres de clulas libres como son las leucemias, que incluso en tan slo meses pueden terminar con la vida del individuo. En consecuencia la Inmunologa debe estudiar no slo el papel que tiene el sistema inmune en el mantenimiento de la salud sino tambin en la gnesis y evolucin de la enfermedad.Tambin a veces, por razones todava no muy bien entendidas, el sistema inmune no reconoce como propio sus componentes, ocasionando las enfermedades por autoinmunidad, en las que se lesionan tejidos causando graves trastornos que pueden incluso llevar a la muerte del individuo. Esto es por ejemplo lo que ocurre en la esclerosis mltiple, la artritis reumatoide, la diabetes tipo 1, etc., en las que el sistema inmune trata de destruir la mielina, articulaciones o las clulas beta del pncreas respectivamente.As, la inmunidad protectora y la hipersensibilidad patolgica pueden coexistir porque son manifestaciones del mismo tipo de respuesta inmune especfica, donde las diferencias entre individuos en los patrones de respuesta inmune frente a microorganismos son determinantes importantes de la progresin de la enfermedad y de su resultado clnico. A continuacin en este primer captulo tratemos de aspectos generales de la respuesta inmune innata y adaptativa, los mecanismos de regulacin, consideraciones histricas y lo que en ello ha representado el desarrollo de vacunas, identificando los puntos ms vulnerables y susceptibles de alteracin, sea por defecto o por exceso y que sean el origen de patologas. Tambin se har un resumen de las principales aportaciones de la inmunologa a la medicina, veterinaria, farmacia y biologa moderna, para terminar analizando los retos futuros de esta disciplina que crece de manera vertiginosa con nuevas aportaciones cada da.

Respuesta inmune innata

La respuesta innata forma parte de los mecanismos inespecficos de defensa y representa el primer sistema defensivo del organismo y es de especial significacin frente a la proteccin del mismo ante infecciones ya sean de tipo bacteriano o viral. Como se ha dicho con anterioridad, los mecanismos que conforman la inmunidad de tipo innato estn constituidos por las barreras naturales y que son la piel y las mucosas no solamente actan aislando al individuo del exterior sino tambin por su capacidades bactericidas y promotoras de la inflamacin debido a la presencia de mltiples molculas, factores y clulas con funcin defensiva en la piel y mucosas o que se pueden acumular en caso de necesidad. La piel que representa casi el 20 % del peso corporal del individuo consta de tres capas con funciones diferenciadas (Figura: Piel). Son la: 1. La epidermis, que es la ms superficial y donde abundan los queratocitos, importantes pos su capacidad de produccin de linfocinas proinflamatorias, y las clulas de Langerhans, con gran capacidad transportadora y presentadora de antgenos. 2. La dermis que posee una importante red de vasos linfticos y sanguneos y en donde se encuentran importantes clulas e inmunomediadores con funciones inmunes. 3. La hipodermis que es la capa ms profunda est formada por tejido graso subcutneo en donde puede haber diferentes tipos de celulares inmunocompetentes pero cuyas funciones no estn claramente establecidas. Las mucosas que actan como puesto fronterizo entre el interior y exterior de la cavidad ocular, oral, uretra, vagina, intestinal y pulmonar principalmente tiene en su conjunto una extensin en el organismo humano equivalente a 500 metros cuadrados y que posee diferentes mecanismos tanto microbicidas como microbiostticos de suma importancia. Las mucosas segn su localizacin posee adicionalmente la capacidad de producir elementos defensivos como es el moco que las reviste y otras sustancias con accin antimicrobiana directa como son la lisozima, defensinas, aglutininas, histamina e incluso ciertas citocinas y quimiocinas. As pues entre las molculas y factores de la respuesta inmune innata presentes en la piel y mucosas y que forman parte de la respuesta inmune innata se encuentran ciertas citocinas, quimiocinas y factores del complemento. Las citocinas son prioritariamente de los tipos IL-1, 6. 7 y 15 y poseen una accin relevante como elementos proinflamatorios e incluso contribuyendo al inicio de la respuesta inmune adaptativa. Las quimiocinas esenciales son Il-8 y RANTES e intervienen atrayendo nuevas clulas al foco inflamatorio en caso de una agresin por patgenos por ejemplo. El complemento, que como se sabe se encuentra preformado en cada individuo, puede intervenir en los procesos de destruccin de microorganismos con una gran eficacia al poseer una accin directa destructiva de los mismos o ser inductores de su destruccin por clulas fagocticas, as como por su accin quimiotctica y anafilotxica. A su vez dentro de las clulas de la respuesta inmune innata presentes en la piel y mucosas destacan los fibroblastos, las clulas dendrticas, monocitos, neutrfilos, macrfagos, clulas NK e incluso

linfocitos T y B. Estas clulas, con la excepcin de los linfocitos, se caracterizan por su capacidad para actuar de manera inmediata sin requerir de un aprendizaje previo siempre que cualquier patgeno sobrepasa las barreras naturales. Esto es por ejemplo lo que ocurre, tras una herida de piel como consecuencia de una cada en la que se puede producir una entrada de microorganismos patgenos (Figura: Inflamacin local). Cuando se produce una invasin local de microorganimos o incluso un trauma de otra naturaleza se activan una serie de componentes de la respuesta innata a nivel local produciendo lo que se conoce como inflamacin. El proceso inflamatorio es como la sntesis de todas las actuaciones de la inmunidad innata a nivel de un foco de infeccin. En la inflamacin se ponen en marcha elementos que directamente interfieren con el invasor y adems se generan seales encaminadas a atraer nuevas clulas al foco al objeto de contribuir de manera ms eficiente la destruccin del invasor. Entre los mecanismos directos de lisis en la respuesta inmune innata,

pueden intervenir las clulas NK por su accin

citotxica, pero son las clulas con capacidad fagoctica las que desempean un papel ms decisivo en la eliminacin del microorganismo patgeno. La fagocitosis se lleva a cabo en varias fases, aproximacin, fagocitosis y lisis (Figura 1.8). Es importante realzar que este proceso de fagocitosis puede iniciarse cuando el fagocito reconoce de alguna manera al microorganismo. En este sentido hay dos vas de suma importancia, una es la participacin del complemento, debido a los fagocitos poseen receptores del complemento y la otra es mediante diversos tipos de receptores presentes en los fagocitos y que tienen la capacidad de reconocer estructuras presentes en la mayora de las bacterias y muchos virus y que se conocen como receptores tipo Toll (TLR). Probablemente la fagocitosis es el principal elemento que acta en este tipo de respuesta. La fagocitosis se lleva a cabo en varias fases, aproximacin, fagocitosis y lisis. En resumen, las principales caractersticas de la respuesta inmune innata se exponen a con- tinuacin y son: Ser la primera lnea de defensa frente a invasiones externas Acta de manera inmediata al inicio de la agresin No est basada en la expresin clonal de linfocitos Intervienen receptores con muy poca variabilidad de reconocimiento Puede reconocer una amplia variabilidad de patgenos

Los mecanismos de defensa innata aportan un buen sistema de proteccin. Sin embargo, en muchas ocasiones no son suficientes para defender eficazmente al organismo, pero por fortuna ste dispone de la respuesta inmune adaptativa que puede actuar a continuacin de la
respuesta innata si sta no ha sido suficiente para eliminar el patgeno.

Respuesta inmune adaptativa

La respuesta inmune adaptativa se caracteriza porque es efectiva solo frente a aquellos antgenos que iniciaron este tipo de respuesta y es mediada por linfocitos que cuentan con la colaboracin de clulas dendrticas y macrfagos prncipalmente. Los linfocitos que participan en este tipo de respuesta son de dos tipos: linfocitos B y linfocitos T. Los linfociotos T a su vez pueden ser de los tipos colaborador (Th), citotxico (Tc) o regulador (Treg). La respuesta inmune especfica, se considera que puede ser de tipo tipo humoral o tipo celular. Aunque la separacin de ambos tipos de respuesta es mas de tipo didctico que real, en general se considera que cuando los elementos implicados son los linfocitos B, se trata de una respuesta tipo humoral mientras que cuando participan los linfocitos T , se trata de una respuesta tipo celular. Para que se inicie la respuesta tanto humoral como celular el primer paso es el reconocimiento del antgeno (Figura 1.9). Reconocimiento del antgeno Los linfocitos B reconocen el antgeno mediante inmunoglobulinas de membrana (mIg) mientras que los linfocitos T lo reconocen mediante el receptor de linfocitos T (TCR) (Figura 1.10). La activacin de los linfocitos B conduce a la sntesis de Inmunoglobulinas por los mismos mientras que cuando lo que se activan son los linfocitos T su funcin prioritaria es la produccin de linfocinas o la de lisar clulas respectivamente. Las inmunoglobulinas (Ig) son glicoprotenas formadas, al menos, por cuatro cadenas mientras que el receptor de los linfocitos T (TCR) es tambin una glicoprotena pero de solo dos cadenas. Ambos tipos de molculas tienen la propiedad de reconocer y unirse al antgeno de manera especfica.

RESPUESTA INMUNE CELULAR La respuesta inmune de tipo celular cubre una importante funcin como mecanismo inmunolgico de defensa, actuando principalmente frente a virus, as como evitando la aparicin y desarrollo de clulas tumorales. En ella participan los linfocitos T tanto de tipo colaborado (Th) como citotxico (Tc).

Presentacin del antgeno Para que los linfocitos T, tal como se ha dicho anteriormente puedan reconocer el antgeno, ste debe ser debidamente presentado. Esta funcin se realiza por las clulas presentadoras de antgeno (APC) que expone sus determinantes antignicos en su superficie en el seno de las molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Figura 1.11). Es importante destacar que las clulas presentadoas y en concreto las clus dendrticas pueden tambin transportar el antgeno desde el foco inflamatorio a los ganglios linfticos regionales, lo cual es importante en el inicio de la respuesta adaptativa y una prueba ms de la colaboracin entre respuesta innata y adaptativa. Las molculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad son glicoprotenas presentes en las membranas de la mayora las clulas nucleadas, entre las que se encuentran las clulas inmunocompetentes. Estas molculas son esencialmente de dos tipos, tipo I y tipo II y tienen entre otras funciones las de presentar el antgeno a los linfocitos as como participar en el proceso de maduracin de los linfocitos T en el timo. Las clulas presentadoras de antgeno (APC) tienen como misin captar, procesar proteolticamente en el interior de estas clulas y despus presentar el antgeno a los linfocitos T conjuntamente con las molculas de histocompatibilidad. Interaccin celular Para que la activacin antignica se lleve a cabo se requiere que previamente se halla producido la interaccin entre las clulas presentadoras y las respondedoras. Este fenmeno se lleva a cabo prio- ritariamente por las molculas de adhesin que son un grupo muy heterogneo de sustancias que se encuentran en la superficie tanto de clulas presentadoras como respondedoras del mismo y que como se ha dicho hacen posible la adherencia entre ellas y en consecuencia permiten la unin entre el receptor de las clulas T y el complejo MHC-Ag de las APCs (Figura 1.12).

Inmunomoduladores de la respuesta inmune

La respuesta inmune es regulada por molculas conocidas como citocinas, que son sustancias pro- ducidas por linfocitos y otras clulas en respuesta a una gran variedad de estmulos y que son capaces de regular el funcionamiento de otras clulas del sistema inmune. Las linfocinas actan como seal complementaria facilitando la activacin, proliferacin y diferenciacin de los linfocitos y en general de todas las clulas implicadas en la respuesta inmune. En la Figura 1.13 podemos observar el proceso de activacin de linfocitos Th y la produccin de interleucinas. Activacin Th y Tc Aunque existen excepciones, la separacin de las funciones de los linfocitos Th y Tc viene dada por el origen de los antgenos que reconocen. Los linfocitos Tc reconocen a los antgenos presentados en superficie por molculas MHC de clase I (Figura 1.14), mientras que los linfocitos Th interaccionan con el antgeno en el contexto de molculas MHC de clase II. Asociados a las dos cadenas polipeptdicas polimrficas que constituyen el TCR se encuentra un grupo de molculas monomrficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando as el complejo TCR/CD3 y que sabemos que es imprescindible para la transmisin de la seal del reconocimiento antignico al interior celular.

En consecuencia se desencadena una cascada de reacciones bioqumicas en el citoplasma de la clula T, dando as lugar al proceso de activacin, proliferacin y diferenciacin celular. Estos mecanismos implican la participacin de una serie de sustancias intracitoplasmticas, conocidas como segundos mensajeros. Como consecuencia de estos eventos se producir finalmente la transcripcin de los genes

implicados en la sntesis de las protenas y factores implicados en una determinada funcin. La activacin de las clulas Th es el ncleo central de la respuesta celular que a su vez acta sobre, macrfagos, clulas NK y linfocitos Tc que adquieren entonces la capacidad de lisar las clulas que portan el antgeno que indujo su activacin. RESPUESTA INMUNE HUMORAL La ausencia de este tipo de respuesta deja al individuo tan indefenso frente a toda clase de grmenes patgenos y otras agresiones, que es incompatible con la vida si no se instaura a tiempo un tratamiento adecuado. En la respuesta inmune humoral inter vienen, como pieza central, los linfocitos B, que como se ha dicho anteriormente reconocen al antgeno a travs de las inmunoglobulinas pesentes en su membrana. Sin embargo este estmulo no es suficiente para que se inicie y desarrolle la respuesta inmune humoral. Para ello es necesario que los linfocitos B, adems del estmulo antignico, reciban el estmulo de ciertas citocinas (Figura 1.15) producidas por los linfocitos T colaboradores. Slo cuando confluyen estos estmulos, el antignico y el mediado por las citocinas, se produce la activacin, proliferacin y diferenciacin de los linfocitos B hasta la formacin de clulas memoria y clulas plasmticas productoras de inmunoglobulinas, que sern el elemento efector final de la respuesta humoral. En la (Figura 1.16) se muestra un esquema con una visin general de la respuesta inmune tanto innata como adaptativa con indicacin de los prin- cipales componentes celulares que participan en cada una de ellas. Caractersticas respuesta inmune adaptativa La respuesta inmune adaptativa se caracteriza por reconocer unos antgenos y no otros (especificidad), ser de carcter clonal, desarrollar memoria y ser autorregulable. Veamos con ms detalle estas carcttristicas.

Especificidad. Se sabe que cada antgeno estimula solo a aquel linfocito o grupo de linfocitos que han desarrollado y en consecuencia poseen en su membrana los receptores capaces de reconocer y unirse especficamente a l. Estos receptores, tal como se ha indicado anteriormente, son las inmunoglobulinas de superficie cuando se trata de linfocitos B o el TCR cuando se trata de linfocitos T. Clonalidad. Cuando un linfocito o grupo de linfocitos es activado, este prolifera y se diferencia en mltiples clulas derivadas, todas ellas con idnticos receptores de superficie. Se dice entonces que todas estas clulas constituyen lo que se denomina clon celular. Tanto la especificidad como la clonalidad de la respuesta inmune fueron originariamente definidos en los aos cincuenta por varios inmunlogos entre los que se encontraba Burnet y se conoci despus por la teora de seleccin clonal de Burnet. Esta teora deca que cada antgeno estimular a aquel linfocito o grupo de linfocitos que poseen en su membrana receptores capaces de reconocer y unirse especficamente a l y que como consecuencia se produca su proliferacin y diferenciacin en clulas con las mismas caractersticas de reconocimiento que los linfocitos originales (Figura 1.17) Este carcter clona, le confiere a este tipo de respuesta el carcter de gran eficiencia en cuanto que cada individuo solo pone en marcha aquellos elementos, celulares y moleculares, que le son necesarios para una determinada accin.

Memoria Inmunolgica. Otra caracterstica importante de este tipo de repuesta es que el organismo mantiene memoria de un estmulo a otro cuando son de la misma ndole. Eso se debe a la permanencia de linfocitos sensibilizados de larga vida despus de un estmulo antignico. Autorregulacin. Este tipo de respuesta dispone de meca- nismos internos de control, de tal forma que la intensidad de la misma se regula por accin de diversos tipos de molculas entre las que destacan las inmuno- globulinas y sobre todo las citocinas. En la (Figura 1.18) se recogen las distintas fases de la respuesta inmune.

RESPUESTA PRIMARIA Y SECUNDARIA Cuando por primera vez un antgeno se pone en contacto con el organismo, se produce una respuesta inmune que se denomina respuesta primaria. Por el contrario, cuando al cabo de un tiempo el mismo antgeno vuelve a activar al sistema inmune, se produce una respuesta que denominamos respuesta secundaria o adaptativa (Figura 1.19). Ambas respuestas son, cualitativa y cuantitativamente, diferentes. Las diferencias esenciales son: En la respuesta primaria los niveles mximos de inmunoglobulinas se alcanzan tras un largo perodo de latencia despus del estmulo antignico, mientras que en la respuesta secundaria se alcanza ms rpidamente. Ello se debe a que cuando un antgeno activa por primera vez a los linfocitos B, stos necesitan tiempo para diferenciarse en las clulas plasmticas responsables de la sntesis de inmunoglobulinas, mientras que cuando se trata de la respuesta secundaria, gracias a la permanencia de las clulas memoria, se alcanza en menor tiempo el nivel de clulas plasmticas. La respuesta primaria predomina la IgM, mientras que en la secundaria predomina la IgG La respuesta primaria es de menor intensidad que la secundaria. Ello se debe al tipo de inmunoglobulina predominante y a la presencia de clulas memoria predominantemente en la respuesta secundaria. La respuesta secundaria, al predominar en ella la IgG, de vida media ms larga que la IgM, y adems por el predominio antes indicado de clulas memoria, es ms permanente y duradera en su accin que la primera.

En su conjunto podemos decir que el sistema inmune funciona de forma secuencial, envindose intercambindose informacin entre los diferentes compartimentos al objeto de aumentar la eficiencia entre ellos para eliminar los microorganismos patgenos. As, una vez que entra el patgeno superando las barreras fisicoqumicas, se pone en funcionamiento el sistema inmune innato, con clulas y factores solubles que van a tratar de eliminarlos. Si este sistema falla, en los vertebrados puede ponerse en marcha el sistema inmune adaptativo que es muy selectivo y en donde participan clulas con un sofisticado procedimiento de reconocimiento y activacin. Como ejemplos de esta cooperacin se encuentran el papel desempeado por los macrfagos como clulas presentadoras de antgeno a los linfocitos T; los anticuerpos IgM e IgG son capaces de activar el sistema del complemento por la va clsica; o la citotoxicidad dependiente de anticuerpo por parte de las clulas natural killer.

Concepto de antgeno y hapteno

Se entiende por antgeno toda sustancia con capacidad para generar una respuesta inmune, o lo que es lo mismo, que posee capacidad para ser reconocida como extraa por el sistema inmune. Sabemos que prcticamente cualquier tipo de molcula biolgica, incluyendo azcares, lpidos, hormonas,

metabolitos intermediarios, carbohidratos complejos, fosfolpidos, cidos nuclicos y protenas pueden actuar como antgenos. Las partes del antgeno que actuan induciendo la formacin de anticuerpos se conocen como grupo determinante. Sin embargo estos grupos no tiene capacidad inductora de anticuerpos si no van formando parte o unidos a otra molcula mayor. A su vez los anticuerpos frente a los antgenos se unen concretamente a sus grupos determinantes a los que tambien se les denominan epitopos (Fig 1.20). Esta capacidad de unin antgenoanticuerpo (Ag-Ac), es la caracterstica ms importante y comn de todas las inmunoglobulinas. Esta unin es no covalente y dbil, de tal forma que la reaccin es reversible, encontrndose los antgenos y los anticuerpos libres en equilibrio dinmico con los unidos. Es conocido que la mayora de los antgenos poseen mltiples eptopos, con lo que pueden unir mltiples anticuerpos a la vez siempre que los eptopos estn suficientemente alejados entre ellos para que no existan interferencias estricas que lo impidan. Clsicamente se llamaba antgeno a toda molcula capaz de generar un anticuerpo. En la actualidad sin embargo, se considera antgeno a cualquier molcula capaz de unirse a un anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola, generarlo. A su vez auellas molculas que son capaces de generar anticuerpos se les considera poseer capacidad inmungena. En este sentido las molculas demasiado pequeas como son los haptenos para generar anticuerpos necesitan ir unidas a molculas ms grandes llamadas transportadores. Una vez que se han generado de este modo, anticuerpos contra el hapteno, ste puede unirse a los anticuerpos. El hapteno es por tanto, una molcula antignica pero no inmungena. Tras la unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), las sustancias extraas (o antgenas) son neutralizadas y posteriormente destruidas por las inmunoglobulinas a travs de mecanismos, que pueden ser diferentes segn el tipo de inmunoglobulina que participa.

Introduccin a la Inmunopatologa
Hay multitud de casos en los que los sistemas de defensa son en s causa de enfermedad. Esto es, por ejemplo, lo que ocurre cuando el individuo reacciona incluso frente a sustancias que en principio son inocuas, como es el polen de plantas, etc. Entonces se habla de reacciones de hipersensibilidad (Figura 1.21). En otros casos, por razones todava no muy bien conocidas, el sistema inmune reacciona frente a componentes propios, que destruye, ocasionando graves trastornos, o incluso la

muerte. Se trata de enfermedades por autoinmunidad, que pueden presentarse frente al sistema nervioso central, frente a casi todas las glndulas endocrinas, frente a componentes musculares, etc. Tambin a veces, las clulas encargadas de la defensa inmune, comienzan a proliferar en grandes cantidades, llegando a producir autnticos cnceres de clulas libres como son las leucemias, que incluso en tan slo meses pueden terminar con la vida del individuo. La Inmunologa, en consecuencia, debe estudiar no slo el papel que tiene el sistema inmune en el mantenimiento de la salud sino tambin en la gnesis y evolucin de la enfermedad.

Aportaciones y desafos de la Inmunologa

La Inmunologa ha contribuido de forma notoria al progreso de la ciencia actual, primero por aportaciones sobre bases empricas y despus sobre fundamentos slidos, fruto del intenso esfuerzo desplegado en el estudio de los mecanismos de actuacin del sistema inmune Tabla 1.2). Durante la fase emprica que podemos considerar anterior al comienzo del presente siglo, la inmunologa ofreci la solucin a uno de los grandes problemas que ha azotado a la humanidad, las pandemias. Ello fue posible gracias a Jenner quien a finales del siglo XVIII y a Pasteur quien a su vez a finales del siglo XIX, prepararon las vacunas de la viruela y de la rabia respectivamente. Posteriormente se desarrollaran, entre otras, las vacunas antitifoidea (1898), anticlera (1892) y antidiftrica (1913). Despus, en lo que podramos denominar fase cientfica, y debido a un mejor conocimiento de las bases biolgicas y celulares del sistema inmune, la inmunologa se ha desarrollado ampliamente, siendo una de las ciencias que ms ha evolucionado en los ltimos aos. Hasta aproximadamente los aos sesenta los aspectos inmunolgicos conocidos aparecan, en el contexto de la Microbiologa, como el sistema capaz de defender al organismo frente a las infecciones. Desde entonces, los continuos avances en el conocimiento de los mecanismos implicados en la respuesta inmune han dotado a esta disciplina de un slido cuerpo de conocimientos. A este desarrollo han contribuido de manera especial la puesta a punto de tcnicas modernas, tales como los cultivos celulares, obtencin de lneas de clulas puras e hbridos celulares, posibilidad de obtener animales transgnicos, disponibilidad de las tcnicas de biologa molecular tales como clonaje de genes, tcnica de PCR, el uso del lser y la microscopa electrnica. En consecuencia, hoy da la Inmunologa posee su propia contextura interna y puede ser firmemente considerada como ciencia independiente al tiempo que hace posible el desarrollo de otras reas gracias a la aplicacin de reactivos y tcnicas puramente inmunolgicas, adquiriendo as una amplia proyeccin en Medicina, Veterinaria, Biologa, Bioqumica, Agronoma y Farmacia. En resumen, la Inmunologa ha influido en las siguientes reas: Prevencin de enfermedades infecciosas Posibilidad de realizar transfusiones de rganos Inicio de la era de los trasplantes de rganos slidos y de mdula Contribucin a la oncologa en cuyo rea se termina de desarrollar la primera vacuna Inmunopatologa como consecuencia de las diversas alteraciones del sistema inmune Mtodos analticos que estn siendo de gran utilidad en las ciencias biosanitarias actuales y Biotecnologia, industria y farmacia permitiendo nuevos mtodos diagnsticos y nuevos inmunofrmacos Enfermedades infecciosas: Haciendo posible la profilaxis de la mayora de las enfermedades infecciosas mediante un progresivo y espectacular perfeccionamiento de las tcnicas de vacunoterapia durante el presente siglo. Es de destacar a modo de ejemplo el descenso drstico que se observan en las tasas de

morbilidad declaradas por poliomielitis, por sarampin o que la viruela ha sido completamente erradicada. Transfusiones sanguneas: La Inmunologa hizo posible el descubrimiento de los grupos sanguneos y los anticuerpos sricos frente a los mismos, gracias a lo cual se pueden realizar las transfusiones sanguneas sin riesgo para el enfermo. Trasplantes de rganos: Haciendo posible la prevencin del rechazo de muchos de los rganos trasplantados. Eso se ha debido a un perfeccionamiento de las tcnicas quirrgicas pero, sobre todo, al descubrimiento de los antgenos responsables del rechazo (antgenos de histocompatibilidad) y a un mejor conocimiento de los mecanismos inmunolgicos responsables del rechazo del trasplante, que estn permitiendo la utilizacin de modernas terapias inmunosupresoras de gran efectividad en la actualidad. Los avances ms recientes indican que pronto ser posible el trasplante de animales al hombre (xenotrasplante) con lo cual se podr dar solucin a la escasez de donaciones de rganos. Oncologa: En donde la inmunologa ha permitido un mejor conocimiento de la interrelacin clula cancerosa-husped. Estos conocimientos ya comienzan a repercutir en una mayor sobrevivencia de ciertos pacientes cancerosos y existen fundadas esperanzas de que en un futuro inmediato la inmunologa pueda contribuir an ms, ofreciendo nuevas vas de solucin a esta enfermedad. El descubrimiento reciente, por un lado, de oncogenes responsables de la malignizacin celular y, por otro, de los mediadores qumicos de la respuesta inmune, entre los que cabe destacar las linfocinas y los interferones, ofrecen una amplia esperanza en la terapia de muchos cnceres y de sus metstasis. En la actualidad se encuentran en va de ensayo varias vacunas teraputicas con resultados verdaderamente alentadores. Inmunopatologa: En donde el conocimiento del sistema funcional, ha hecho posible conocer la etiologa y patogenia de una gran variedad de enfermedades surgidas por alteracin del propio sistema inmune, tales como inmunodeficiencias, alergias, autoenfermedades, etc. Sin embargo, quedan problemas pendientes sin resolver, como es el reto que actualmente tiene planteada la Inmunologa con el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), de una extraordinaria capacidad expansiva y alta mortalidad, y frente al cual no se dispone de un remedio eficaz que elimine de manera definitiva el virus HIV. Mtodos analticos: Una gran variedad de mtodos analticos de gran precisin y sensibilidad se han desarrollado gracias a los conocimientos inmunolgicos. Entre estas tcnicas las ms importantes que se pueden destacar son la inmunoelectroforesis, radio-inmunoensayo, hemaglutinacin, etc. Hoy se puede considerar que, por ejemplo, la endocrinologa moderna se ha podido desarrollar gracias a la aparicin de un mtodo, el radioinmunoensayo, capaz de medir los niveles de las distintas hormonas. Tambin ha permitido disponer de nuevos mtodos de estudio basados en la inmunologa, sin cuya existencia hubiese sido imposible alcanzar los niveles actuales de excelencia en la investigacin biosanitaria. Biotecnologa, industria y farmacia: Esto est siendo realmente posible gracias al extraordinario grado de cooperacin existente entre los inmunlogos y cientficos dedicados a la bioqumica, biologa molecular, gentica y farmacia, cuyos mtodos como, por ejemplo, la tecnologa del DNA recombinante, hibridaciones celulares, etc., estn permitiendo la obtencin de manera industrial, de sustancias y factores de gran inters farmacolgico, entre los que podemos destacar, como mas sobresaliente, los anticuerpos monoclonales (AcMo). Otras aportaciones. Adems de lo indicado anteriormente, la inmunologa ha contribuido a la solucin de otros muchos problemas. Citemos, por ejemplo, la prevencin de la eritroblastosis fetal en casos de incompatibilidad Rh entre la madre y el feto. Otra sensible y reciente aportacin de la inmunologa ha sido el esclarecimiento de la etiologa de mltiples enfermedades, al descubrir una estrecha relacin entre el padecimiento de las mismas y ciertos factores genticos relacionados con el control del sistema inmune. Tambin la inmunologa ha aportado conocimientos y tcnicas de gran utilidad en la Medicina Legal, alguna de cuyas reas, como por ejemplo la identificacin, se benefici ampliamente despus del

descubrimiento de los grupos sanguneos y tambin durante la ltima dcada, gracias al descubrimiento de los antgenos de histocompatibilidad. La inmunologa es una ciencia que actualmente se encuentra en pleno desarrollo, por lo que es de suponer que en el futuro siga aportando nuevos conocimientos para la solucin de muchos de los problemas que tiene planteado la medicina y biologa. En la Tabla 1.3 se expone una lista de los Premios Nobel concedidos a investigadores en el campo de la inmunologa, como prueba de las grandes aportaciones realizadas en esta rea. CULES SON LOS DESAFIOS DE LA INMUNOLOGA? Los grandes desafos en el futuro de la inmunologa son la supresin de enfermedades infecciosas a escala global. Este objetivo figura entre los desafos de la agenda de la inmunologa del siglo XXI. Para ello se requiere de un esfuerzo pblico importante, sobre todo potenciando programas de vacunacin. Esto es esencial en el caso de la gripe aviar, SIDA y malaria frente a cuyas infecciones no se dispone de vacunas. Todas estas infecciones estn causando numerosas muertes al ao y en consecuencia son un desafo serio y preocupante para la inmunologa. En unos casos, la dificultad se debe a la aparicin de mutantes virales que les permite escapar a la respuesta inmune del individuo; esto es que una vez que el sistema inmune ha aprendido a luchar contra el patgeno, ste cambia y ya no le sirve de nada el aprendizaje y tiene que comenzar de nuevo. En otros casos se debe a la aparicin de resistencias de los patgenos a los medicamentos, que toman normalmente para curarse, en cuyo caso el medicamento no ejerce el efecto deseado. En el caso de la gripe aviar el panorama es preocupante debido a que es capaz de infectar a seres humanos desde los animales y aunque afortunadamente no es capaz de pasar de unos seres humanos a otros, s existe preocupacin de que pueda combinarse con el virus de la gripe humana y de ese modo aprender a hacerlo y dar lugar a una pandemia. No se puede olvidar que la pasada pandemia de gripe ocurrida en 1918 mat entre 20-40 millones de personas. Otro de los objetivos de la inmunologa del siglo XXI se centra en prevenir las alergias. Los investigadores estn mirando actualmente la posibilidad de desarrollar vacunas contra la mayora de las formas de alergias. Por ejemplo, identificando las protenas del polen o los cacahuetes que son responsables de causar alergia y utilizndolas a muy bajas dosis poder actuar como vacuna. Aunque es importante sealar que este caso sera una vacuna que enseara al sistema inmune a no responder en vez de a responder como las vacunas utilizadas hasta ahora contra las enfermedades infecciosas. Encontrar mejores remedios para las enfermedades autoinmunes, figura tambin entre los programas destacados de trabajo. En este rea se esperan nuevos inmunomoduladores de gran capacidad de accin, por ejemplo en la artritis reumatoide y otras enfermedades de tipo autoinmune. Tambin se est trabajando en mejorar los resultados en trasplantes en donde dos de los grandes problemas son la escasez de donantes y alcanzar mejores resultados a largo plazo. Hasta ahora para evitar que el individuo destruya el rgano trasplantado se le trata con inmunosupresores que actan disminuyendo la capacidad del sistema inmune del individuo trasplantado de atacar el trasplante pero tambin de defenderse de infecciones. Por ello, uno de los objetivos futuros es ayudar al sistema inmune para que tolere de manera selectiva el trasplante al que ha sido sometido y evitar as las complicaciones de la inmunosupresin tradicional, como por ejemplo son la aparicin de infecciones virales, tumores y otros. Se tratara en definitiva de copiar lo que la naturaleza ya realiza en la mujer gestante que acepta de manera selectiva a su feto (trasplante natural) lo cual permite que ste sea tolerado aunque lleva el componente paterno que es extrao a la madre desde el punto de vista biolgico. Por otra parte los avances ms recientes indican que pronto ser posible el trasplante de animales al hombre (xenotrasplante) y el uso de clulas madre, que por su gran capacidad de crecimiento multidireccional,

son una gran esperanza en el futuro en programas de terapia regenerativa de muy diversos tipos de tejidos daados, aspectos stos que son tratados mas extensamente en otros captulos. Una mayor contribucin a la nueva biotecnologa, figura tambin en la agenda de trabajo del inmunlogo, ya que mediante la inmunotecnologa ser posible seguir produciendo agentes que protejan a las personas y animales contra muchos tipos de enfermedades. Mientras tanto, la tercera generacin de vacunas empleando DNA ya ha comenzado. Hasta ahora para desarrollar vacunas hay que purificar o producir las protenas del patgeno lo cual es caro y poco estable, y obliga en la mayora de los casos a administrar varias dosis. Todo ello dificulta por ejemplo las campaas de vacunacin en pases en desarrollo con malos medios tcnicos y malas comunicaciones, donde en muchos casos no es posible administrar una segunda dosis de la vacuna. Las vacunas de DNA podrn permitir desarrollar campaas de vacunacin ms baratas y estables y sin necesidad de administrar ms de una dosis. Consisten en introducir parte del DNA de un patgeno dentro de un individuo, entonces el individuo producir una respuesta frente a ciertos componentes del germen. Tienen como ventaja no causar la enfermedad y de poder producirse de forma duradera.

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Caractersticas del Sistema Inmune

El concepto de inmunidad clsicamente se ha entendido como defensa contra las enfermedades infecciosas. Hoy por inmunidad entendemos el reconocimiento de lo propio y, la defensa contra lo no propio y contra aquello que siendo propio est alterado. Los individuos se defienden de los microorganismos y sustancias extraas mediante barreras fisicoqumicas, clulas fagocticas, eosinfilos, clulas lticas naturales (NK), y con una amplia serie de factores solubles. Estas defensas que no son especficas para cada uno de los microorganismos o sustancias extraas (llamados antgenos) se les denomina Inmunidad Natural o Innata. Otras formas de defensa estn constituidas por clulas especiales, llamadas linfocitos T y B, y factores solubles (en especial las inmunoglobulinas/anticuerpos) que aumentan con cada una de las exposiciones a cada uno de los antgenos. Estas respuestas son especficas para cada antgeno y a estos mecanismos de defensa se les denomina Inmunidad Adquirida o Especfica. La respuesta inmune innata amplifica la respuesta inmune adquirida, una vez que sta a entrado en contacto con el antgeno. Si bien en la respuesta inmune que se produce en un organismo, actan todos los mecanismos de defensa de forma coordinada, acadmicamente se pueden distinguir dos tipos de respuesta especfica: a) La Inmunidad humoral mediada por los anticuerpos. Estos son producidos por clones de linfocitos B especficos para cada antgeno. b) La Inmunidad celular mediada por linfocitos T. Cada clon de linfocitos T es tambin especfico de antgeno. La respuesta inmune tiene varias caractersticas importantes, la especificidad, la diversidad, la memoria y la tolerancia. A) ESPECIFICIDAD Cada clon de linfocitos B es capaz de responder y producir anticuerpos contra un antgeno distinto. Los antgenos pueden ser componentes proteicos, polisacridos o cidos nucleicos, presentes o no en microorganismos o clulas eucariotas. Al interaccionar con un antgeno, los linfocitos B respondern produciendo anticuerpos frente a ese antgeno en concreto, pero no frente a otros no relacionados. Por esta razn se dice que el sistema inmune es especfico. La parte ms pequea de un antgeno a la que se une un anticuerpo se denomina determinante antignico. Un anticuerpo producido en respuesta a un estmulo en particular, por ejemplo un virus, no reconoce toda la partcula viral, sino un determinante antignico, por ejemplo una parte de una de sus protenas. B) DIVERSIDAD Se calcula que el sistema inmune es capaz de producir ms de 109 tipos distintos de anticuerpos. Cada tipo es producido por un clon de linfocitos B en particular. Este "repertorio" de anticuerpos, que se genera por un mecanismo gentico complejo, servir para reconocer y responder a la mayora de los determinantes antignicos a los que un individuo puede exponerse. C) MEMORIA La primera vez que el sistema inmune especfico responde contra un antgeno lo hace lentamente, con poca intensidad y los anticuerpos producidos desaparecen rpidamente de la circulacin, es la denominada Respuesta Primaria. Con cada uno de los contactos posteriores, con el mismo antgeno, la respuesta inmune es ms rpida, ms intensa y ms duradera, es decir es ms eficiente. A ste tipo de respuesta se le denomina Respuesta Secundaria. La memoria inmunolgica explica porqu un individuo queda protegido frente a una enfermedad, por ejemplo el sarampin, despus de haber superado una primera infeccin o haber sido vacunado. D) TOLERANCIA Por el mismo mecanismo por el que el sistema inmune se capacita para responder frente

a una gran diversidad de antgenos, genera algunos linfocitos B y linfocitos T que pueden reconocer componentes del propio organismo. Durante su maduracin, sin embargo, estas clulas son eliminadas o inactivadas. ste proceso se denomina tolerancia: el sistema inmune "aprende" a reconocer lo que es propio y a no responder agresivamente contra ello. Como consecuencia, todo lo que no sea propio lo considerar, por definicin, extrao. El mecanismo natural de la tolerancia tiene una contrapartida: los trasplantes de rganos pueden ser rechazados por el sistema inmune actuando de manera similar a como actuara frente a agentes patgenos. LINFOCITOS B Los anticuerpos son producidos exclusivamente por los linfocitos B. Los linfocitos B humanos, son clulas que se generan, e inician su maduracin, en la Mdula sea, expresan inmunoglobulinas en su membrana y utilizan esta inmunoglobulina de membrana como receptor para el reconocimiento del antgeno. Estas clulas activadas por un determinante antignico y por diversas seales procedentes de linfocitos T activados, terminan de diferenciarse convirtindose en clulas que secretan anticuerpos al medio en gran cantidad, es decir, en clulas plasmticas. Los anticuerpos secretados tienen la misma especificidad por el antgeno que las inmunoglobulinas de membrana y se unirn a los antgenos que iniciaron la respuesta. Los anticuerpos al unirse a los antgenos van a cumplir varias funciones importantes. Por un lado pueden bloquear su actividad biolgica, por ejemplo neutralizando una toxina o bloqueando la infectividad de una partcula viral. Por otra parte los anticuerpos pueden facilitar la captacin del antgeno por otras clulas del organismo, como los macrfagos, que los destruirn y eliminarn. Adems de las inmunoglobulinas (receptor para el antgeno), los linfocitos B expresan en su membrana diversas molculas ms o menos caractersticas, entre las que cabe destacar las molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de clase II. Estas molculas, que se denominan HLA-II en humanos, estn encargadas de presentar el antgeno en forma de pequeos fragmentos peptdicos a los linfocitos T para que se activen. Con la misma finalidad de interaccionar con los linfocitos T, los linfocitos B expresan molculas adicionales entre las que destacan especialmente B7 (CD80) y CD40. Otras molculas son los receptores para los fragmentos C3b y C3d del complemento, receptores para el fragmento Fc de la IgG y molculas de activacin como CD19, CD20, CD21. Los linfocitos B cuando se activan, expresan en membrana receptores para citocinas (factores solubles que regulan la respuesta inmune), que actan como factores de crecimiento y diferenciacin. LINFOCITOS T Los linfocitos T se originan en mdula sea y maduran en el Timo. De manera anloga a como los linfocitos B expresan inmunoglobulinas de membrana que funcionan como receptor de antgeno, los linfocitos T expresan un receptor antignico exclusivo de cada clon celular. El receptor antignico de los linfocitos T (TCR) tiene la peculiaridad de reconocer antgenos extraos no en forma libre, sino como pequeos pptidos fsicamente asociados a molculas del MHC presentes en la membrana de otras clulas. Al tener lugar el reconocimiento TCR(pptido/MHC), el linfocito T inicia su activacin y lleva a cabo su funcin efectora. Adems del TCR los linfocitos T tienen dos importantes molculas accesorias que se expresan de manera excluyente: CD4 y CD8. Los linfocitos T CD4+ reconoce pptidos antignicos asociados a las molculas de HLA de clase II, que se expresan en linfocitos B, macrfagos y otras clulas que se denominan "presentadoras de antgeno". Las clulas presentadoras se especializan en presentar los antgenos que captan del medio extracelular a los linfocitos T CD4+, que decidirn finalmente si los pptidos son normales o proceden de protenas extraas (toxinas, microorganismos,...). En este ltimo caso los linfocitos T CD4+ se activarn y secretarn citocinas que sirven para regular la funcin de otros linfocitos y de diversos tipos de clulas. Tambin al activarse expresan en membrana receptores para citocinas, incluso para las mismas que secretan, y molculas para interaccionar con linfocitos B e inducir su diferenciacin a clulas plasmticas. Entre estas molculas destaca CD40L, que interacciona especficamente con CD40. Por todas estas razones, los linfocitos T CD4+ se denominan linfocitos T cooperadores. Por otro lado, los linfocitos T

CD8+ reconoce pptidos antignicos en asociacin con las molculas de HLA de clase I, que se expresan en todas las clulas del organismo exceptuando los eritrocitos. La funcin de las molculas HLA-I es presentar pptidos procedentes de protenas intracelulares. Las clulas infectadas por virus o que han sufrido transformacin tumoral, presentarn pptidos que sern reconocidos como extraos por los linfocitos T CD8+. Al activarse, estos linfocitos adquieren la capacidad de lisar a la clula que presenta los pptidos extraos. Por esta razn los linfocitos T CD8+ se denominan "citotxicos". Los linfocitos T citotxicos constituyen un arma del sistema inmune relativamente eficaz para proteger al organismo de la diseminacin de infecciones virales y para eliminar clulas tumorales, casos en los que los anticuerpos no son eficaces. Los linfocitos T expresan tambin otras molculas, que se denominan accesorias, y que sirven para interaccionar con mayor firmeza con linfocitos B u otras clulas y para contribuir a la activacin de los propios linfocitos T. Entre estas molculas estn CD2, CD5, CD11a (LFA1) y especialmente CD28, cuyo ligando es la molcula CD80 anteriormente nombrada. CLULAS NK Las clulas NK derivan de mdula sea, al parecer de un precursor comn con los linfocitos T pero sufriran maduracin extratmica. La denominacin NK, Natural Killer o clulas lticas naturales, hace referencia a que estas clulas muestran actividad citotxica frente a algunas clulas tumorales y clulas infectadas por virus. En esta caso, sin embargo, no requieren una exposicin previa a la clula a lisar ni la expresin de molculas HLA-I que requieren los linfocitos T citotxicos. Por el momento se desconoce si las clulas NK tienen receptor especfico distribuido clonalmente. MACRFAGOS Son clulas importantes en la respuesta inmune natural y puesto que son clulas presentadoras de antgeno tienen un papel fundamental en la respuesta inmune adquirida. Los macrfagos fagocitan sustancias extraas, las digieren enzimticamente y presentan los pptidos resultantes en molculas MHC-II a los linfocitos T CD4+ para que se activen. Adems producen citocinas inflamatorias, y amplifican la respuesta inmune especfica. GRANULOCITOS Los granulocitos o clulas polimorfonucleares constituyen una primera barrera defensiva del organismo, que acta rpidamente fagocitando microorganismos antes de que una respuesta de anticuerpos especficos tenga lugar. Adems participan en las respuestas efectoras del Sistema Inmune respondiendo a estmulos quimiotcticos y aumentando su capacidad fagoctica al ser activados por citocinas. Los neutrfilos son las clulas predominantes en las reacciones de inflamacin aguda. TEJIDO LINFOIDE El tejido linfoide est constituido por dos grandes grupos de rganos: rganos linfoides primarios que inician la diferenciacin linfoide y rganos linfoides secundarios donde los linfocitos responden a antgenos extraos. Los rganos linfoides primarios, en humanos, son: la mdula sea y el timo. Los rganos linfoides secundarios son: los ganglios linfticos, el bazo, los tejidos linfodies asociados a las mucosas y el sistema inmune cutneo adems de otros acmulos linfoides repartidos por todo el organismo. MDULA SEA En la mdula sea se generan las stem cells o clulas pluripotenciales hematopoyticas de las estirpes eritroide, megacarioctica, granuloctica, monoctica y linfoctica. En la propia mdula sea se incia la maduracin de los linfocitos B, antes de su salida al torrente circulatorio. Adems, en la mdula sea hay linfocitos B maduros y gran cantidad de clulas plasmticas que provienen de linfocitos B, que se han activado en los rganos linfoides secundarios y que han recirculado hasta la mdula sea.

TIMO Aquellos linfocitos que tras salir de la mdula sea entran en el timo (timocitos), o bien mueren (la gran mayora), o bien maduran hacia linfocitos T. GANGLIOS LINFTICOS Los ganglios linfticos son acmulos de tejido linfoide. En su interior, formando folculos hay una gran cantidad de clulas fagocticas dispuestas a fagocitar los antgenos extraos, que son transportados hasta ah a travs de los vasos linfticos. Adems, hay linfocitos que reconocen los antgenos presentes en la membrana de las clulas fagocticas activndose y pudiendo migrar al torrente circulatorio. BAZO Los linfocitos y las clulas accesorias tienen, en el bazo, una localizacin similar a la de los ganglios linfticos. El bazo es el lugar donde se realizan la mayor parte de las respuestas frente a antgenos circulantes por sangre perifrica. RESPUESTA INMUNE Todas las repuestas inmunes especficas tienen su inicio en el reconocimiento del antgeno extrao por los linfocitos. Tras el reconocimiento, los linfocitos se activan proliferando y, por tanto, expandiendo su clon. A continuacin los linfocitos B se convierten en clulas plasmticas productoras de anticuerpos. Unos linfocitos T activan a macrfagos, otros activan a linfocitos T capaces de lisar clulas con antgenos extraos, otros linfocitos T son clulas cooperadoras de los linfocitos B para que stos produzcan inmunoglobulinas y, otros linfocitos T son clulas supresoras que inhiben la produccin de anticuerpos. Los anticuerpos producidos interaccionan con los antgenos libres formando inmunocomplejos que son eliminados de la circulacin por las clulas fagocticas. As mismo, los anticuerpos inducen la liberacin de protenas de fase aguda que ayudan a combatir infecciones. Los linfocitos T, especialmente los cooperadores, producen protenas que tienen actividad sobre las propias clulas del sistema inmune y sobre otras clulas, con mecanismos de accin que recuerdan a las hormonas. A estas protenas se les denomina citocinas. Las citocinas, entre otras muchas funciones, aumentan la fagocitosis y las respuestas inflamatorias. AUTOINMUNIDAD Como se ha indicado antes el Sistema Inmune distingue lo propio de lo extrao. La falta de respuesta a las sustancias propias se denomina autotolerancia. En ocasiones se pierde la autotolerancia y se induce la respuesta inmune contra antgenos propios, a este fenmeno se le denomina autoinmunidad. El fenmeno autoinmune puede desencadenar una enfermedad autoinmune. El fenmeno autoinmune puede ser consecuencia de alteraciones intrnsecas de los linfocitos B, de los linfocitos T, o de su regulacin. Adems de las alteraciones inmunolgicas que inducen los fenmenos autoinmunes, se necesitan otros factores genticos, infecciosos, hormonales, anatmicos, etc., para que aparezca la enfermedad autoinmune. HIPERSENSIBILIDAD La respuesta inmune especfica va asociada a mecanismos efectores inespecficos como la activacin del complemento, activacin de las clulas fagocticas, induccin de citocinas, etc., que no son especficos de antgeno. En ocasiones los fenmenos de inflamacin, como consecuencia de la respuesta inmune, van asociados a lesiones locales o sistmicas. La falta de control de algunas respuestas excesivas produce patologas denominadas enfermedades por hipersensibilidad.

Estas patologas pueden ser desencadenadas por inmunocomplejos, por lisis celular mediada por el complemento, por lesiones tisulares mediadas por linfocitos T y por anticuerpos del tipo IgE que activan la degranulacin de los mastocitos (la alergia). INMUNODEFICIENCIAS Las deficiencias de alguno de los elementos del Sistema Inmune pueden provocar patologas denominadas inmunodeficiencias. Las inmunodeficiencias pueden ser congnitas o primarias y adquiridas o secundarias. Los pacientes con inmunodeficiencias tienen una mayor susceptibilidad a sufrir infecciones por microorganismos y suelen tener mayor tendencia a sufrir procesos neoplsicos especialmente los inducidos por virus. Las inmunodeficiencias adquiridas se suelen relacionar con la malnutricin, neoplasias, tratamientos inmunosupresores, o enfermedades de tipo autoinmune.

02 Clulas Inmunocompetentes
C.Alonso y J.Pea
La accin del sistema inmune es posible gracias a la participacin e interrelacin de diferentes poblaciones celulares, conocidas como clulas inmunocompetentes. Estas clulas son fundamentalmente los linfocitos T y B, las clulas NK, clulas dendrticas, macrfagos y polimorfonucleares (tabla 2.1). TABLA 2.1 Tipos de clulas inmunocompetentes y sus funciones principales Clula B Th Tc NK Macrfagos Dendrticas Neutrfilos Funcin Produccin de Igs y presentacin Ag. Produccin de linfocinas Citotoxicidad Citotoxicidad y produccin de linfocinas Fagocitosis y presentacin de Ag Presentacin de antgenos Fagocitosis

Las clulas inmunocompetentes se encuentran distribuidas por toda la economa, como epitelios y mucosas, pero su concentracin es mxima en los ganglios linfticos y bazo. En estos tejidos se dan las condiciones ptimas para su estimulacin antignica gracias a que a ellos afluyen con facilidad las sustancias extraas (antgenos) a travs de los vasos linfticos y es posible la interrelacin celular, ptima para que se pueda iniciar y desarrollar la respuesta inmune. En este captulo estudiaremos las caractersticas morfolgicas y fenotpicas ms importantes de estas clulas inmunocompetentes, as como tambin el sistema linftico, especialmente la estructura funcional de los ganglios linfticos, bazo y timo. LINFOCITOS T Y B Los linfocitos son clulas de tamao pequeo con un ncleo muy voluminoso y provistos de una membrana citoplasmtica de especial importancia en la regulacin de su funcionalidad. Estas clulas se dividen en linfocitos T y linfocitos B. Ambos tipos de linfocitos al igual que todas las clulas sanguneas derivan de una clula progenitora pluripotencial que en el feto se encuentra en el hgado y despus del nacimiento en la mdula sea. A esta clula precursora comn se le denomina CFU-LH o Unidad formadora de colonias linfoides y hematopoyticas (Figura 2.1). Posteriormente esta clula se diferenciar para dar lugar, por un lado, a la clula madre hematopoytica pluripotencial (CFU-GMEM) para las series eritroctica, granuloctico-macrofgica y megacarioctica. Por otro lado, dar lugar a una clula progenitora unipotencial (CFU-L), especfica para la serie linfoide.

Fig.:2.1

Cada una estas clulas progenitoras continuar diferencindose hacia otras clulas inmaduras, originndose as las CFU-E (precursor eritroctico), CFUGM (precursor mielomonoctico) y CFU-Meg (precursor megacarioctico) a partir de la clula precursora hematopoytica. de

De la clula madre linfoidea derivarn dos clulas precursoras, CFU-T y CFU-B, que tras un proceso de maduracin, conocido como linfopoyesis, originarn los linfocitos T y B respectivamente. En sangre perifrica la proporcin de linfocitos T es aproximadamente de un 70% mientras que la proporcin de linfocitos B es de un 15%. En la Figura 2. 2. Se muestra una imagen de microscopa electrnica de barrido de un linfocito B (a) y un linfocito T (b) donde pueden observarse las diferencias en su superficie.
Fig.:2.2

Existen otras clulas de estirpe linfoide que no presentan caractersticas de linfocitos T ni B, denominadas clulas NK que poseen actividad citotxica y secretora de ciertas citocinas. Linfopoyesis

Las clulas pluripotentes, en las aves, se diferencian y transforman en clulas tambin inmaduras, que emigran, unas hacia el timo y otras hacia la bolsa de Fabricio, donde se transforman y maduran en linfocitos T o timo dependiente y linfocitos B o bolsa dependiente, respectivamente (figura 2.3).

Fig.:2.3

En los mamferos, y entre ellos el hombre, estos procesos se realizan en el timo (linfocitos T) y en la propia mdula sea (linfocitos B) (Figura 2.4).
Fig.:2.4

Veamos a continuacin los aspectos ms importantes de la linfopoyesis en el timo y en la bolsa de Fabricio o en los rganos equivalentes a la misma en los mamferos.

Linfopoyesis T El timo es un rgano situado en la parte superior del mediastino anterior, donde maduran los linfocitos T. El timo presenta su mximo desarrollo en el feto y en el nio, mientras que a partir de los 10-12 aos comienza un proceso atrfico y degenerativo con gran invasin grasa, de tal forma que en el adulto slo quedan residuos del mismo (Figura 2. 5).
Fig.:2.5

Los precursores de los linfocitos T, durante el proceso de maduracin intratmica, reciben el nombre de timocitos. Durante esta fase mueren muchos timocitos, aproximadamente el 95 por 100 de ellos, debido a que se eliminan aquellos que reconocen los antgenos propios del organismo. El resto de las clulas abandonan el timo, va sangunea, como linfocitos T maduros. Estos linfocitos colonizan los rganos linfoideos secundarios, situndose en la zona paracortical de los ganglios linfticos y vainas paracorticales linfocticas del bazo.

Se han identificado algunos factores de transcripcin que son imprescindibles para la diferenciacin de los linfocitos a lo largo de la linfopoyesis. Entre estos destacan PU.1 e IKAROS que controlan el desarrollo de clulas T y B mientras que GATA-3 solo afecta el compromiso de las clulas T y E2A, EBF y Pax controlan el compromiso B. En el timo se han identificado clulas precursoras que poseen capacidad de generar clulas T, NK, B y clulas dendrticas del timo, y a lo largo de su diferenciacin los precursores mas evolucionados van perdiendo paulatinamente la capacidad de generar clulas B, NK y clulas dendrticas en este orden. Durante el proceso de maduracin intratmico, los timocitos adquieren una serie de molculas nuevas en su superficie. Estas molculas van apareciendo secuencialmente en los diferentes estados de maduracin intratmica as como, en general, en todos los procesos de maduracin y diferenciacin hematopoyticos. Se les denomina marcadores de diferenciacin hematopoytica ya que son propios de los diferentes estados madurativos y pueden ser utilizados para definirlos. Se denominan con las siglas CD (cluster of differentiation o grupo de diferenciacin) seguido de un nmero ordinal. La CFU-T, no expresa todava en su superficie ninguno de los marcadores de los linfocitos T. Posteriormente estas clulas, ya en el timo, maduran distinguindose varios estados diferenciativos con la presencia de diferentes marcadores de superficie. As en los timocitos inmaduros aparecen los marcadores CD7 y CD2, aadindose en un estadio posterior de maduracin (timocito comn), el marcador CD1. Ya en el timo va a ocurrir una especializacin funcional, distinguindose dos subpoblaciones de timocitos maduros: Una es aquella que expresa en su superficie el marcador CD4 y que ser el precursor inmediato de los linfocitos T colaboradores que aparecen en sangre perifrica. La otra expresa en la superficie el marcador CD8 y dar origen a los linfocitos T citotxicos/supresores circulantes. En ambas subpoblaciones se pierde la expresin de la molcula CD1 (Figura 2.6.).

Fig.:2.6

En la Tabla 2.2 se muestran algunos de los marcadores de diferenciacin de las clulas linfoides de estirpe T. Los timocitos ms inmaduros no expresan CD3, CD4 ni CD8, por lo que son conocidos como clulas triples negativas. A medida que van madurando, en estas clulas se produce la reorganizacin del TCR, la expresin del complejo CD3 y de las molculas CD4 y CD8 conjuntamente (clulas dobles positivas), para despus perder una u otra quedando bien como CD4-CD+

o como CD+CD8-. En el proceso de diferenciacin de los timocitos a linfocitos maduros se destruyen gran nmero de clulas, tal como se ha indicado con anterioridad. Esto se debe a un proceso de seleccin tmica que se realiza en dos fases y est condicionado por el grado de afinidad del TCR con las molculas del MHC de las clulas epiteliales del timo. En una de las fases tanto los timocitos CD4-CD8+ como CD8-CD4+ se seleccionan positivamente, es decir, solo aquellos timocitos que poseen capacidad de reconocer las molculas del MHC presentes en las clulas epiteliales del timo se van a diferenciar y crecer mientras que el resto mueren. Por el contrario, en el proceso de seleccin negativa se destruyen los timocitos que ahora poseen la capacidad de reconocer las molculas del MHC presentes en el timo, con lo que se eliminan los clones celulares autorreactivos. No se conoce bien cuando se efecta uno u otro proceso, aunque todo parece indicar que se relaciona con la afinidad del TCR de los timocitos con las molculas del MHC, de tal manera que cuando la afinidad es alta se efectuara una seleccin negativa, mientras que cuando es baja la seleccin sera positiva.

TABLA 2.2 Marcadores propios de las clulas de estirpe linfocitaria T Marcador CD7 CD2 CD5 CD1 a, b, c CD3 PM (daltons) 40.000 50.000 67.000 45.000 25.000 20.000 20.000 55.000 34.000 34.000 80.000 55.000

Funcin Activacin clulas T con TCR Receptor para CD58 o LFA-3 y adhesin celular Ligando para CD72 Asociado a -2-microglobulina Asociado al TCR y transmisin seal activacin

CD4 CD8 CD44 CD27

Unin al MHC- II en el fenmeno de presentacin Ag Unin al MHC- I en el fenmeno de presentacin Ag Modulacin de la apoptosis de linfocitos T. Seal coestimuladora para activacin linfocitos T

Mediante el empleo de ratones transgnicos para el TCR se han estudiado los factores responsables de la maduracin de timocitos que conduce especficamente a linfocitos Tc maduros. As, cuando el TCR del timocito reconoce molculas del MHC clase I las clulas que preferentemente se desarrollan son los linfocitos Tc (CD8+), mientras que cuando lo que reconoce el TCR son molculas MHC clase II las clulas que esencialmente se desarrollan son los linfocitos Th (CD4+). Linfopoyesis B. En las aves, la maduracin de los linfocitos B se realiza en la bolsa de Fabricio, rgano linfoideo primario asociado a la cloaca y ausente en los mamferos. En los mamferos este proceso se realiza en la mdula sea. El proceso de diferenciacin conducente a la formacin de linfocitos B es independiente de todo estmulo antignico y se regula por factores presentes en el microambiente de los rganos linfoideos primarios. Durante el proceso de maduracin de los linfocitos B, a partir de la clula progenitora (CFU-B), se distinguen varios estadios de diferenciacin, que incluyen las clulas pre-pre-B, las clulas pre-B, clulas B inmaduras y linfocitos B maduros (Figura 2.7). En cada uno de estos estados de maduracin las clulas expresan distintas molculas en la superficie, utilizadas como marcadores de diferenciacin
Fig.:2.7

En la Tabla 2.3 se detallan los pesos moleculares y funcin de algunos marcadores de diferenciacin de las clulas B, que estn siendo utilizados para estudiar y clasificar las

enfermedades originadas por alteraciones en el proceso de diferenciacin linfoctica B (leucemias y linfomas). TABLA 2.3 Marcadores diferenciacin de linfocitos B CD CD19 CD20 CD24 CD10 CD21 CD22 CD37 CD40 Pm (daltons) 95.000 35.000 35.000 100.000 130.000 145.000 45.000 50.000 Funcin reguladora de Proliferacin cel. B Activacin cel. B Diferenciacin cel. B Endopeptidasa Receptor de C3d/EBV Ligando de CD45Ro Desconocida Activacin/diferenciacin

Ya en las clulas pre-B se detecta la presencia de cadena pesada m intracitoplasmtica, adquirindose en la siguiente fase madurativa la capacidad de sintetizar las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas IgM e IgD, detectables en la superficie celular. En consecuencia, la mayora de los linfocitos B expresan estos dos tipos de inmunoglobulinas en su superficie. Posteriormente estos linfocitos, mediante un proceso de reordenamiento gnico, se especializarn en la produccin de una sola clase de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE (Figura 2.8).
Fig.:2.8

Linfocitos B

Morfolgicamente los linfocitos B son indistinguibles de los linfocitos T. Sin embargo, es posible establecer diferencias de tipo molecular que justifican su distinta funcin (Tabla 2.4). La caracterstica ms importante de los linfocitos B, por contribuir a su actividad funcional, es el hecho de que poseen inmunoglobulinas unidas a su membrana citoplasmtica. Estas inmunoglobulinas son los receptores especficos para los antgenos, de tal forma que cuando se realiza la unin del antgeno a la inmunoglobulina de superficie, se va a producir la activacin del linfocito B y su posterior transformacin en clula plasmtica. stas, son clulas ms grandes que los linfocitos, muy ricas en retculo endoplsmico, y especializadas en la sntesis y secrecin de grandes cantidades de inmunoglobulinas (Figura 2.9.).

Fig.:2.9

Tambin los linfocitos B poseen receptores para mitgenos y para el virus EpsteinBarr (EBV). Precisamente el tratamiento de linfocitos con EBV es el procedimiento de eleccin para la preparacin de lneas celulares de tipo B (inmortalizacin de una poblacin celular) de gran utilidad en la actualidad para el estudio de estas clulas. El receptor que utiliza el EBV en la superficie del linfocito B es el mismo receptor que la fraccin C3d del sistema del complemento o CD21. TABLA 2.4 Algunas caractersticas diferenciales de las clulas de estirpe linfoctica Marcador CD2 (Receptor de LFA-3) CD3 (Asociado a TCR) CD19 CD16 (Recept. de FcIII) CD56 (N-CAM) CD11b (Recep. C3bi) CD11a (LFA-1) Ig de superficie HLA-clase I HLA-clase II B +++ -++++ +++ +++ T +++ +++ +++ +++ NK +++ +++ +++ ++ +++ +++ -

Linfocitos T Los linfocitos T son una poblacin celular muy heterognea formada por, al menos, tres tipos diferentes de clulas. Entre los marcadores de diferenciacin que definen los linfocitos cabe destacar el marcador CD2 que acta de receptor para la molcula LFA-3, fundamentales para la unin entre el linfocito y la clula diana. En la Figura 2.2b se muestra una imagen de un linfocito T al microscopio electrnico de barrido. Los linfocitos T poseen receptores especficos para los antgenos. Estas molculas conocidas como receptores T o TCR, han sido identificadas, utilizando tecnologa de DNA recombinante, resultando ser altamente polimrficas y de gran importancia funcional. Estructuralmente constan de dos cadenas glicoproteicas ancladas en la membrana celular y unidas por puentes disulfuro y que estudiaremos en el captulo 7. El receptor T se encuentra asociado estrechamente en la superficie celular al complejo molecular CD3. Tipos de linfocitos T No todos los linfocitos T son idnticos entre s. Analizando las caractersticas funcionales de los linfocitos T, se observan al menos tres comportamientos muy distintos entre s que deben basarse en diferencias moleculares y estructurales de estas clulas. Los tres tipos de linfocitos T funcionalmente distintos son: Clulas T de colaboracin (T helper cells). Clulas T citotxicas (T cytotoxic cells).

Clulas T supresoras/reguladoras (T suppressor cells)

Clulas T de colaboracin (Th) Esta subclase de linfocitos T participa de forma importante en la iniciacin y desarrollo de la respuesta inmune, tanto humoral como celular, debido a su capacidad de produccin de linfocinas, entre las que destacan la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-4 (IL-4) e interfern gamma. Fenotpicamente, la caracterstica esencial de esta subpoblacin linfocitaria viene definida por la presencia de la molcula CD4 en la superficie celular. Esta molcula es de gran importancia funcional y tambin se utiliza para la cuantificacin de esta subpoblacin. Se distinguen dos poblaciones diferentes de estas clulas, Th1 y Th2. La Th1 produce IL-2 e interfern gamma mientras que la Th2 produce IL-4, 5y 6. Clulas T citotxicas (Tc). Una vez activada esta subclase de linfocitos T, adquiere capacidad citotxica, siendo, por tanto, los principales responsables de los fenmenos de citotoxicidad de la respuesta inmune celular. Estas clulas se caracterizan por expresar el marcador CD8 y, al igual que lo hacen los linfocitos Th, el complejo TCR-CD3 y otras molculas importantes funcionalmente tales como CD2 y LFA-1. Clulas T supresoras (Ts) y/o reguladoras. Estos tipos de clulas poseen accin reguladora de la respuesta inmune. La regulacin de la actividad del sistema inmune es de gran importancia en todo el comportamiento del mismo y, sobre todo, en el desarrollo de tolerancia frente a los componentes propios del organismo. Estas clulas expresan en su membrana molculas CD8 al igual que lo hacen los linfocitos T citotxicos y su mecanismo de accin no solo no es muy bien conocido en la actualidad sino que tambin la propia presencia de estas clulas se est cuestionando. Clulas Asesinas Naturales (NK) En la dcada de los aos 70 Herberman observ que los linfocitos obtenidos de individuos sanos eran capaces de destruir clulas tumorales sin que existiera sensibilizacin previa. La citotoxicidad mediada por estas clulas se denomin citotoxicidad natural, y a las clulas encargadas de desarrollar esta actividad se las denomin Natural Killer (NK) o clulas asesinas naturales. Estas clulas representan aproximadamente el 10% de las clulas mononucleares de sangre perifrica y fenotpicamente no poseen marcadores ni de los linfocitos T ni de los linfocitos B y corresponden con un tercer tipo de clulas linfoides conocido anteriormente como linfocitos nulos o tercera poblacin. Desde el punto de vista morfolgico la mayora de las clulas con actividad NK corresponden con los linfocitos granulares grandes (LGL) por su gran tamao y la presencia de abundantes grnulos citoplasmticos (Figura 2. 10.). Aunque hoy se sabe que los linfocitos pequeos tambin pueden desarrollar esta accin citotxica.
Fig.:2.10

Las clulas NK se definen como linfocitos que no reorganizan los genes de las inmunoglobulinas ni tampoco los del TCR y que, por tanto, no expresan sus productos as como tampoco el complejo CD3 completo. Por el contrario, expresan en su superficie las molculas CD16 y CD56 y para su accin citoltica no requieren la expresin de molculas del MHC en la clula diana. Estas clulas son responsables de la citotoxicidad celulomediada dependiente de anticuerpos (ADCC), es decir, destruyen clulas con antgenos extraos en su superficie frente a los que se han producido anticuerpos. Las clulas NK contribuyen a la defensa frente a clulas infectadas por virus, bacterias, hongos y parsitos. Pero la principal actividad de la clula NK es su capacidad de actuar frente al crecimiento de clulas tumorales impidiendo su expansin y la formacin de metstasis. El sndrome de Shediack-Higashi es una deficiencia selectiva de actividad NK y cursa con una alta incidencia de tumores. Las clulas NK derivan de clulas hematopoyticas stem cell presentes en el hgado fetal o en mdula sea del adulto. Su proceso de maduracin se efecta fuera del timo en rganos linfoides perifricos, desconocindose los procesos requeridos para que esta diferenciacin se produzca, y el rgano donde se desarrolla. Esto explica que no se afecten sustancialmente los niveles de clulas NK en animales atmicos y en inmunodeficiencia severa combinada observada tanto en animales como el hombre. Tambin las clulas NK podran derivar directamente, de las clulas doble negativas que sabemos son tambin CD16 positivas que se encuentran en el timo y que son precursoras de las clulas T. Clulas mielomonocticas Las clulas inmunocompetentes de estirpe mielomonoctica son los macrfagos y los granulocitos. Ambos tipos de clulas proceden de un precursor comn, la CFU-GM o Unidad formadora de colonias granuloctico-macrofgicas, de la mdula sea. Esta clula progenitora, mediante un proceso de diferenciacin, dar lugar a dos series de clulas sanguneas: a) la serie mieloide, cuyo ltimo eslabn madurativo son los granulocitos, y b) la serie monoctica, cuyo elemento diferenciativo final lo constituyen los macrfagos. El proceso de diferenciacin y maduracin de las clulas monocticas en mdula sea se denomina monopoyesis y al proceso de formacin y maduracin de las clulas mieloides se le conoce como mielopoyesis,
Fig.:2.11

Monopoyesis

Durante el proceso de maduracin de los macrfagos, a partir de la clula progenitora (CFU-GM) de mdula sea, se distinguen varios estados diferenciativos, que incluyen los monoblastos, promonocitos, monocitos y macrfagos. En cada uno de estos estados de maduracin las clulas expresan distintas molculas en su superficie, cuya funcin, en la mayora de los casos, es an desconocida (Figura 2.11). Las mejor caracterizadas son las molculas CD16 y CD11b que, como ya hemos indicado, actan como receptores para el extremo Fc de la IgG y para la fraccin C3bi del complemento respectivamente.

TABLA 2.5 Marcadores de de clulas mielopoyticas

CD Pm* CD33 67 CD34 120 CD35 190 CD14 55 CD15 CD16 50 CD11a 180 CD11b 160 CD13 150 *103 dalton

Funcin Desconocida Desconocida Receptor C3b Receptor LPS/LBP Adhesin neutrfilos Receptor FcgIII Adhesin celular Receptor C3bi

En la Tabla 2.5 se detallan algunas caractersticas de estos marcadores, muchos de los cuales estn siendo utilizados para clasificar las leucemias de estirpe monoctica. Mielopoyesis

TABLA 2.6 Algunas caractersticas diferenciales de las clulas de estirpe mielomonoctica Caractersticas Fagocitosis Produccin de Il-1 Recep. FcgII(CD16) Recep. C3bi (CD11b) Receptor Il-2 CD14 CD17 HLA- clase I HLA- clase II un origen comn. Macrfago +++ +++ + +++ +++ +++ + +++ +++ Granulocito +++ +++ + +++ +++ -

El proceso de diferenciacin de los granulocitos en mdula sea incluye varios estados madurativos: mieloblasto, promielocito, mielocito, metamielocito y granulocito. En cada uno de estos eslabones diferenciativos las clulas mieloides expresan distintas molculas de superficie. Los marcadores de diferenciacin son compartidos, en su mayora, con clulas de la serie monoctica ya que, como hemos indicado anteriormente, ambas estirpes celulares tienen

En la Tabla 2.6 se resumen algunas de las caractersticas diferenciales de los macrfagos y granulocitos. Se observa que los granulocitos carecen de la propiedad de sintetizar interleucina 1 y adems no poseen la molcula CD14 ni los antgenos de histocompatibilidad clase II. Macrfagos La denominacin de macrfagos engloba, en realidad, a una serie de clulas con caractersticas ligeramente distintas y con funciones similares, distribuidas en varios lugares del organismo. As, los macrfagos van a recibir diferentes denominaciones segn los diferentes tejidos donde se encuentren (Tabla 2.7). A este conjunto de clulas hsticas, se le da la denominacin genrica de sistema retculo endotelial o sistema mononuclear fagoctico.

Los macrfagos son clulas TABLA 2.7 Denominacin macrfagos segn su localizacin grandes con un solo ncleo, un aparato de Golgi muy desarrollado, gran cantidad de lisosomas y muy ricos en Localizacin Denominacin enzimas de diferentes tipos, entre los que destacan proteasas, peroxidasas y Sangre Monocitos lipasas. Estas clulas poseen, adems Tejido conectivo Histiocitos de la capacidad fagoctica ya indicada, Hgado Clulas de kupffer capacidad de adherencia a los tejidos, Pulmn Macrfagos al vidrio y al plstico, as como una gran Hueso Osteoclastos movilidad en estas superficies Sistema nervioso Clulas microgla (quimiotaxis). Los macrfagos tienen Cavidad peritoneal Macrfagos peritoneales una vida media de varios meses. Poseen tambin gran actividad metablica, sobre todo en lo que se refiere a sntesis de protenas, incluso cuando se encuentran en reposo. En la Figura 2.12 se muestra una imagen al microscopio electrnico de barrido correspondiente a un macrfago.
Fig.:2.12

Los macrfagos poseen en su membrana una serie de receptores de gran importancia funcional, como son los receptores para la fraccin Fc de la IgG, receptores para las fracciones C3bi y C3b del complemento que se conocen como CD-11b y CD-35 y los receptores para interleucinas e interferones, todos ellos, de gran inters en la iniciacin de la respuesta inmune.

Granulocitos
Fig.:2.13

El otro grupo de clulas, los granulocitos neutrfilos, se caracterizan por poseer una vida muy corta (vida media de menos de 48 horas) por lo que se encuentran en continua renovacin, para mantener los niveles sanguneos. Son clulas de gran tamao cuya caracterstica ms llamativa es la segmentacin del ncleo en varios lbulos. Se les denomina tambin polimorfonucleares neutrfilos. En la sangre estas clulas se encuentran en perodo de trnsito hacia los tejidos, donde esencialmente ejercen sus funciones, al igual que ocurre con los otros tipos de polimorfonucleares: eosinfilos y basfilos (Figura 2. 13.).

Otras clulas Adems de las clulas tratadas hasta el momento, hay otras clulas que pueden intervenir como clulas inmunocompetentes. Estas son los eosinfilos, basfilos, clulas cebadas, clulas dendrticas y clulas de Langerham.

Fig.:2.14

Las clulas dendrticas, son de gran importancia en la presentacin antignica a los linfocitos y se encuentran en los ganglios linfticos y en el bazo. Fenotpicamente estas clulas se caracterizan por poseer en su membrana una gran densidad de molculas de histocompatibilidad de clase II. En la Figura 2.14.se muestra una imagen de microscopia electrnica de barrido correspondiente a una clula dendrtica.

Las clulas de Langerham de la epidermis, cuya caracterstica morfolgica ms llamativa es la presencia de grnulos en raqueta de tenis denominados grnulos de Birbeck, tambin son ricas en antgenos MHC-clase II. Su misin es captar y transportar los antgenos extraos hasta los ganglios linfticos de la proximidad, a travs de los vasos linfticos. Durante su paso por los vasos linfticos estas clulas se adaptan y cambian de morfologa denominndoselas clulas a vela. Una vez en el ganglio linftico las clulas a vela se introducen en la paracorteza que es el rea de las clulas T, se interdigitan y presentan el antgeno a los linfocitos T. Ahora estas clulas presentadoras reciben la denominacin de clulas interdigitadas reticulares por su particular disposicin en los ganglios. ANTIGENOS DE DIFERENCIACION En la membrana plasmtica de los linfocitos se han podido identificar mltiples molculas, gracias al empleo de la tecnologa de los anticuerpos monoclonales (AcMo). A estos antgenos y se les denominan antgenos de diferenciacin. La celebracin peridica de talleres (workshops) internacionales, donde los investigadores remiten sus AcMo para la realizacin de estudios multicntricos, ha propiciado la progresiva sistematizacin de la abundante informacin obtenida. Estos se adscriben, segn su especificidad, a grupos de diferenciacin conocidos como CD clusters of differentiation, cada uno de los cuales incluye a todos aquellos AcMo que reconocen una misma molcula o, en casos excepcionales, un complejo molecular (ej. CD3). Los antgenos de diferenciacin leucocitaria son estructuras cuya distribucin no est necesariamente restringida a estos tipos celulares; no obstante, algunos pueden llegar a constituir, por su patrn selectivo de expresin, marcadores de diferentes propiedades de la clula, tales como: la estirpe de diferenciacin a la que pertenece, su estadio madurativo, el estado de activacin metablica o, incluso, su especializacin funcional. La secuencia habitual seguida en la caracterizacin de un antgeno de diferenciacin se inicia con el anlisis de su distribucin celular y tisular, habitualmente realizado por tcnicas de inmunofluorescencia, combinadas con la citrometra de flujo, y mtodos inmunohistoqumicos. El aislamiento para su anlisis electrofortico se realiza por medio de tcnicas de inmunoprecipitacin, a partir de lisado de clulas radiomarcadas, que permiten valorar algunas de las principales caractersticas bioqumicas tales como su masa relativa (Mr), punto isoelctrico (pI), la presencia de uniones covalentes intercatenarias, y determinadas modificaciones postraduccionales (ej. glicosilacin, fosforilacin), as como explorar el proceso de biosntesis. DISTRIBUCION DE LAS CLULAS INMUNOCOMPETENTES. Las clulas que componen el sistema linfoide se agrupan formando rganos discretamente encapsulados o bien acmulos difusos de tejido linfoide (Figura 2.15). Los rganos linfoides contienen linfocitos en estado variable evolutivo y se clasifican en primarios (rganos centrales) y en secundarios (rganos perifricos).

Fig.:2.15

Los rganos linfoides primarios constituyen el principal origen de la linfopoyesis, es decir, donde los linfocitos se diferencian a partir de clulas madre linfoides y proliferan y maduran hacia clulas con capacidad efectora. En mamferos, incluyendo al hombre, los linfocitos T son producidos en el timo, mientras que los linfocitos B se producen en el hgado fetal y en la mdula sea fetal y adulta. En los rganos linfoides primarios, los linfocitos adquieren sus receptores antignicos especficos, y tambin aprenden a discriminar entre autoantgenos, que sern tolerados y antgenos extraos que sern atacados. Los rganos linfoides secundarios que incluyen bazo, ganglios linfticos y MALT (mucosal associated lymphoid tissue) (amgdalas, placas de Peyer del intestino y cmulos linfoides del tracto urogenital), proporcionan el medio en el que las clulas implicadas (macrfagos, clulas presentadoras de antgeno, linfocitos T y B) pueden interaccionar entre s y con el antgeno. rganos linfoides primarios Timo Es un rgano linfoepitelial de forma bilobulada situado en posicin retroesternal sobre la cara anterior del pericardio. Deriva de un esbozo epitelial formado a partir de la tercera y cuarta bolsas faringeas, de aparicin muy temprana en el embrin. En el hombre su estructura aparece completamente desarrollada en el tercer mes de gestacin. El parnquima tmico est constituido por una malla de clulas epiteliales rellena de clulas linfoides (denominadas timocitos) y se organiza formando lobulillos tabicados por trabculas conjuntivas. Dentro de cada lobulillo se puede distinguir una zona externa o corteza, que contiene la gran mayora de los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos (Figura 2.16.).

Fig.:2.16

El estroma del timo est constituido fundamentalmente por la malla de clulas epiteliales que adoptan diferentes formas. En la mdula se hallan tambin clulas dendrticas interdigitadas, derivadas de la mdula sea, que son clulas presentadoras de antgeno. En la unin corticomedular se hallan tambin macrfagos. En la mdula existen, adems, unas estructuras denominadas corpsculos de Hassal formados por clulas epiteliales y macrfagos dispuestos de forma concntrica. Las clulas epiteliales del timo, tanto de la corteza como de la mdula, expresan una gran riqueza en molculas del MHC clase II, imprescindibles para el reconocimiento de autoantgenos por los linfocitos T.

Bursa de Fabricio y su equivalente en mamferos En las aves, los linfocitos B se diferencian en la bolsa de Fabricio, rgano constituido por un segmento intestinal con pliegues dirigidos hacia una luz central. Estos pliegues se componen de tejido linfoide formando corteza y mdula. En los mamferos, islotes de tejido linfoide en el hgado fetal y en la mdula sea fetal y adulta se ocupan de la produccin de linfocitos B. rganos linfoides secundarios Bazo Se trata de un rgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrs del estmago y cerca del diafragma. Su superficie externa se compone de una cpsula fibrosa con algunas fibras musculares lisas y penetra profundamente en el parnquima del rgano. Bsicamente, en el bazo se distingue la pulpa roja que es un reservorio vascular para hemates y la pulpa blanca que contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central, presentando reas T y B. Las clulas T se disponen ms prximas y alrededor de la arteriola central, mientras las clulas B se disponen exteriores a la misma. Tambin son frecuentes las clulas reticulares dendrticas y macrfagos en el centro germinal, as como macrfagos especializados en la zona marginal (rea que rodea a los folculos linfoides) que junto a las clulas foliculares dendrticas de los folculos primarios (folculos no estimulados sin centro claro germinal) se ocupan de la presentacin del antgeno al linfocito B (Figura 2.17.)

Fig.:2.17

Ganglios linfticos Conforman junto a los vasos linfticos una compleja red corporal cuya funcin es filtrar los antgenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulacin desde la periferia hasta el ducto torcico. Los ganglios linfticos, en el humano, son redondeados u ovoides y presentan un hilio donde los vasos sanguneos entran y salen respectivamente. Bsicamente, se distingue un rea B denominada crtex, un rea T denominada paracrtex y un rea medular central (Figura 2.18.).
Fig.:2.18

El paracrtex, contiene linfocitos T y abundantes clulas presentadoras de antgeno (clulas interdigitantes o histiocitos de la zona T) quienes presentan abundantes antgenos MHC clase II en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las clulas plasmticas y los macrfagos sinusales de los ganglios linfticos.

Fig.:2.19

El crtex contiene agregados de linfocitos B dispuestos formando folculos primarios y secundarios. Los folculos primarios son primordiales sin centro claro germinal (anteriores al estmulo antignico) y los folculos secundarios poseen claros centros germinales (tras el estmulo antignico). Estos ltimos contienen adems clulas presentadoras de antgeno y algunos macrfagos, linfocitos T, y clulas NK, quienes junto a los macrfagos sinusales parecen jugar un papel en el desarrollo de la respuesta de las clulas B, como su adquisicin de memoria; esta parece ser la funcin primordial de los centros germinales (Figura 2.19.).

Tejido linfoide asociado a mucosas (MALT)

Fig.:2.20

Acmulos dispersos de tejido linfoide no encapsulado se observan frecuentemente en diversos rganos, particularmente en reas submucosas gastrointestinales, respiratorias y urogenitales. Los elementos linfoides se encuentran formando agregados difusos u organizados formando folculos con centro claro germinal (Figura 2.20).

En el tracto intestinal, se observan elementos linfoides difusos en la submucosa del rgano, y formando folculos linfoides con centro germinal en las denominadas placas de Peyer. El epitelio que reviste las placas de Peyer transporta el antgeno y en sentido inverso, la IgA secretora producida por las clulas plasmticas muy abundantes en el epitelio (Figura 2.21.).

Fig.:2.21

En el hombre, adems se encuentra abundante tejido linfoide con centros germinales en las amgdalas farngeas y tambin en paredes bronquiales y a lo largo del tracto urogenital. CIRCULACIN LINFOCITARIA Una vez que los linfocitos B y T abandonan los rganos primarios, pasan al torrente circulatorio, a travs del cual circulan por el organismo. A los tejidos llegan a travs del torrente sanguneo, siendo recogidas por los vasos perifricos del sistema linftico que las conduce a los distintos ganglios linfoideos, de donde pueden de nuevo volver a la sangre y a los diferentes tejidos o almacenarse en el bazo (Figura 2.22).
Fig.:2.22

En la Tabla 2.8 se recoge la proporcin de leucocitos en sangre.

De esta forma el contacto de los linfocitos con los antgenos se puede establecer en el organismo a nivel de los diferentes tejidos, sistema linftico, bazo y Tipo % sangre, aunque es fundamentalmente a nivel de los ganglios y el bazo donde se puede Neutrfilos 40-75 desarrollar una respuesta inmune, ejerciendo Eosinfilos 5 una accin, bien local en ganglios y bazo, o Basfilos 0.5 bien general, dado que los elementos efectores (las inmunoglobulinas y linfocitos Linfocitos 20-50 activados) pueden ser distribuidos por toda la Monocitos 1-5 economa a travs del sistema circulatorio y linftico. En la Figura 2.23. se representa un esquema de las circulaciones sangunea y linftica con la distribucin porcentual de los linfocitos en sangre, bazo y rganos linfticos. TABLA 2.8 Leucocitos en sangre
Fig.:2.23

BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. Lewis, C.E. and McGee, J.O.D. (1992). The Macrophage. IRL Press. Lewis, C.E. and McGee, J.O.D. (1992). The Natural Killer Cell. IRL Press. Nasal, G.J. (1997). Annual Review of Immunology, 1. P.F. Ed. Metzger

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TEMA 2 CLULAS DEL SISTEMA INMUNE. El sistema inmune de los vertebrados superiores est compuesto por una variedad de clulas morfolgica y funcionalmente diferentes, que se diferencian a partir de clulas primordiales pluripotenciales. Todos estos tipos celulares ejercen funciones diferentes, interaccionando constantemente entre s. Estas interacciones pueden estar mediadas por contacto fsico o a travs de factores solubles que ejercen su funcin en clulas con receptores especficos. Las clulas que forman el sistema inmune se organizan a su vez en tejidos y rganos, estructuras que reciben el nombre genrico de sistema linfoide. Los tejidos y rganos linfoides se pueden dividir en primarios o centrales y en secundarios o perifricos. Los rganos primarios son los lugares de la linfopoyesis, mientras que los perifricos son los lugares de interaccin entre las distintas clulas y tienen como misin proveer un ambiente favorable para que se desencadenen las respuestas inmunolgicas. 2.1 Hematopoyesis: linfo y mielopoyesis: Ya vimos en el captulo anterior cules eran los tipos celulares fundamentales tanto de la inmunidad innata como de la adquirida (diapositiva 2.3). Todas las clulas del s. inmune provienen de clulas madre pluripotenciales o stem cells. Del hgado embrionario surge la mdula sea (diapositiva 2.4), all existen stem cells que dan lugar a todas las clulas. Las clulas stem de la mdula sea siguen dos lneas fundamentales de diferenciacin : linaje mieloide, linaje linfoide. Del progenitor mieloide o promielocito (diapositiva 2.5) derivan los eritrocitos e inflamocitos , este ltimo grupo se subdivide en : Megacariocitos: que van a originar las plaquetas, Mastocitos, Granulocitos (Eosinfilos , Basfilos y Neutrfilos) Fagocitos (Eosinfilos , Neutrfilos , Macrfagos y Monocitos) Existen mltiples clulas dendrticas con distintos precursores (tanto mieloides como linfoides). Del progenitor linfoide derivan : Algunas clulas dendrticas, Linfocitos B, Linfocitos T (tanto cooperadores Th, como citotxicos Tc) Linfocitos NK, Aparecen sealadas en la figura, adems, algunas agrupaciones morfolgicas de clulas (granulocitos) pero tambin agrupaciones funcionales: inflamocitos (clulas que participan en el proceso inflamatorio), fagocitos (clulas con capacidad fagoctica) y clulas presentadoras de antgeno (linfocitos B, Monocitos-macrfagos y clulas dendrticas). 2.2. Las clulas

a) Promielocito (diapositiva 2.6): Tiene forma esfrica, es el precursor entre otros de los granulocitos. Tiene grnulos 1 azurfilos, Aparato de Golgi (AG) muy desarrollado, y un ncleo sencillo. Su Retculo endoplsmico rugoso (RER) est poco desarrollado.
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b) Granulocitos: Neutrfilo o Polimorfonuclear (diapositiva 2.7): presentan ncleo multilobulado, con AG poco desarrollado y grnulos primarios y secundarios adems de grnulos de glucgeno. Eosinfilo (diapositiva 2.8): su ncleo es, normalmente, bilobulado. Presenta un AG poco desarrollado y grnulos con centro cristalino. Basfilo (diapositiva 2.9): ncleo con lobulaciones suaves. Tiene grnulos primarios, otros con cristaloides y estructuras lamelares concntricas y grnulos pequeos con glucgeno. Su RER y AG estn poco desarrollados. c) Mastocitos (diapositiva 2.10): Durante un tiempo se crey que mastocitos y basfilos eran el mismo tipo de clulas (la primera en tejidos y la segunda en la sangre). Hoy se sabe que son dos estirpes celulares diferentes con funciones muy similares: liberacin de mediadores inflamatorios (en tejidos o en sangre, respectivamente). Los mastocitos tienen un ncleo sencillo y gran profusin de microvilli en su superficie. Pero adems, hay otras diferencias entre ambos tipos celulares (diapositiva 2.11): 1-Los basfilos viven en sangre perifrica y los mastocitos en el tejido conectivo y mucosas. 2-Los basfilos tienen ncleo bilobulado y los mastocitos ncleo sencillo. 3-El dimetro de los basfilos es de 10 micras y los mastocitos llegan a las 30 micras. 4-Los basfilos tienen grnulos de glucgeno y los mastocitos no. 5-Los grnulos en los mastocitos son ms pequeos y estn en mayor nmero. d) Plaquetas (diapositiva 2.12). Son clulas anucleadas que derivan del megacariocito, por fragmentacin. Presentan grandes vacuolas y grnulos (de glucgeno entre otros) .En su citoplasma hay microtbulos concentrados en la zona exterior. e) Monocitos (diapositiva 2.13) y Macrfagos (diapositiva 2.14): El macrfago pueden tener forma y funcin diferentes segn el tejido en el que se encuentren, adems de recibir distintos nombres: Monocito al macrfago en sangre, Histiocito al macrfago en los tejidos, Osteoclasto al macrfago en los huesos , Microgla a los macrfagos del tejido nervioso. Clula de Kupffer: macrfagos del hgado Todos ellos hacen dos cosas: 1) fagocitan y digieren patgenos y 2) avisan mediante factores solubles a otras clulas para que echen una mano con la infeccin y para reparar el posible desaguisado que haya hecho el patgeno. En cualquier caso , presentan un ncleo simple o ligeramente lobulado. Su AG es mediano; en el macrfago existen vacuolas fagocticas, lisosomas (1 s y 2s).Sus mitocondrias son filamentosas. Presentan cuerpos multilaminares y pueden aparecer pseudpodos en la superficie celular (en el caso de los macrfagos) o microvellosidades (en el caso de los monocitos).

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f) Linfocitos T y B en reposo (diapositiva 2.15): Los linfocitos T y B, cuando no estn activados presentan un gran ncleo simple rodeado por una aureola de citoplasma (en anillo), AG pequeo , pocos grnulos y RER poco desarrollado. Adems tiene gran nmero de ribosomas libres. Los linfocitos B, al activarse deben sintetizar Inmunoglobulinas; sufren una diferenciacin final a Clulas Plasmticas (diapositiva 2.16). Para una sntesis activa de protenas, su RER y AG ocupan gran parte del contenido celular y su ncleo pasa a ocupar menos espacio y presenta una estructura en rueda de carro (la heterocromatina representa los radios). g) Linfocitos NK (diapositiva 2.17): Tambin llamados Linfocitos grandes granulares (LGL): tienen un ncleo simple, con un AG mediano y gran profusin de grnulos (para su funcin ltica) en el citoplasma. h) Clulas dendrticas (diapositiva 2.18): Poseen velos o pseudpodos de gran envergadura, su citoplasma es claro con pocos grnulos. Las mitocondrias se han redondeado. Su ncleo es simple con un nucleolo. Su AG y RER estn poco desarrollados. Existen tres tipos dependiendo de la localizacin: I)Las clulas dendrticas del tejido linfoide se denominan interdigitantes .Existen en la mdula sea y timo. Tambin se llaman de la zona marginal, cuando estn presentes en bazo. II)Las clulas dendrticas de los tejidos slidos no linfoides se denominan clulas de Langerhans (cuando se localizan en la epidermis) y clulas inersticiales (corazn y rin). III)Las clulas dendrticas de los fluidos se denominan clulas veladas (conductos linfticos aferentes) o clulas dendrticas sanguneas. 2.3 Funciones y gestin de receptores para antgenos:

En sangre no existen ni mastocitos ni macrfagos (diapositiva 2.19). Los linfocitos tienen 3 subtipos fundamentales (T: 70-75 %, B: 15 20 %, NK 5-10%). Las plaquetas son las ms abundantes, seguida por neutrfilos, linfocitos, y otras clulas. A parte de fagocitar (diapositiva 2.20), los macrfagos inician la respuesta inmune y son responsables de la hipersensibilidad retardada y los neutrfilos fagocitan en respuesta a seales (complemento y anticuerpos). Durante la Fagocitosis: se forman fagosomas y al fusionarse con lisosomas se lisa la bacteria.Los eosinfilos pueden llegar a fagocitar aunque su funcin principal es la respuesta frente a parsitos (diapositiva 2.21): los grnulos del eosinfilo les exocita y las sustancias liberadas (toxinas ) atacan al parsito.Tienen actividad citotxica y neurotxica. Exocitosis e inflamacin: los mastocitos y basfilos reconocen patgenos concretos y liberan sus grnulos al medio, provocando reacciones de hipersensibilidad. En sus grnulos, se encuentran grandes cantidades de mediadores inflamatorios preformados (diapositiva 2.22) provocando: a)vasodilatacin, b)quimiotxis, c)edema (hinchazn), d) extravasacin de clulas al tejido. Uno de los componentes de los grnulos provoca quimiotxis , son las quimiocinas. Su concentracin disminuye progresivamente al alejarse del foco de liberacin y atraen a macrfagos y leucocitos y a mastocitos.
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Las clulas NK realizan una funcin de vigilancia de ausencias , al perder una clula marcadores que deberan tener la asesinan. Esto sucede en procesos tumorales e infecciones virales. Para realizar sus funciones, estas clulas presentan una serie de receptores en su superficie celular (diapositiva 2.23): a) Algunos reconocen estructuras del propio patgeno: existen en clulas de la inmunidad natural, fagocitos, dendrocitos e inflamocitos. Incluyen receptores MR (manosa), SR (scavenger), LPSR (lipopolisacridos) que reconocen estas sustancias directamente en la superficie de los patgenos. b) Otros reconocen patgenos opsonizados por protenas del sistema inmune: como las Inmunoglobulinas (FcR) o fragmentos de activacin del sistema de complemento (CR). Estos receptores estn presentes en clulas de la inmunidad innata (fagocitos, dendrocitos, inflamocitos, linfocitos NK) y de la inmunidad adaptativa (Linfocitos B). c) Receptores de linfocitos NK: NKPR1 (receptor de lisis) reconoce azcares en la superficie de otras clulas , KIR (receptor de inhibicin) reconoce pptidos propios en la cavidad de molculas MHC de clase I. Hay un equilibrio entre receptores de lisis e inhibitorios (diapositiva 2.24) para decidir si la clula NK va a proceder o no a la lisis de la clula diana. d) Receptores especficos de linfocitos T y B: los linfocitos T presentan el TcR (en sus 2 formas: o ) y los linfocitos B presentan el BcR (que incluye la Inmunoglobulina de superficie. Estos receptores reconocen el patgeno en pequeos pptidos dentro del antgeno HLA (caso del linfocito T) o intacto y en solucin (caso del linfocito B). Adems, los linfocitos T pueden ser de dos tipos: cooperadores (Th) o citotxicos (Tc), segn su funcin. En cada caso presentan un co-rreceptor diferente: CD4 y CD8 alternativamente que reconoce porciones conservadas de los antgenos HLA de clase II o clase I, respectivamente.

Indice de contenidos del Tema 2

Clulas del Sistema Inmune 2.1 Hematopoyesis: Hematopoyesis: linfo y mielopoyesis 2.2 Las Clulas: lulas: * Granulocitos: Eosinfilos, filos, Bas Basfilos y Neutr Neutrfilos / Mastocitos Granulocitos: Eosin * Plaquetas, Plaquetas, MonocitosMonocitos-Macr Macrfagos * Linfocitos (T y B), Clulas plasm plasmticas y LGL (linfocitos NK) NK * Clulas dendr dendrticas 2.3 Funciones y gesti gestin de receptores para ant antgenos

2.2.-Clulas del sistema Inmune

(Clulas de la inmunidad innata y espec especfica) fica)

Elementos no especficos Macrfagos Neutrfilos Basfilos Eosinfilos Linfocitos NK Mastocitos

Elementos bsicos del Sistema Inmune

Linfocitos: T B APCs

Saco embrionario de Yolk Hgado fetal

Elementos especficos

Mdula sea

Timo

Linfocitos Monocitos Granulocitos Trombocitos Eritrocitos

3

Linfocitos T Linfocitos B

Clula hematopoytica pluripotente

Promielocito
Progenitor linfoide

Progenitor mieloide

Grnulos 1 azurfilos
Inflamocitos

Retculo endoplsmico rugoso (RER) Nucleo sencillo Centriolo Nucleolo

Vacuolas
(?)
NK

Linfocito B
Eritoblasto Megacariocito Mastocito Basfilo Eosinfilo Neutrfilo
Macrfago Monocito

Clula dendrtica

Linfocito T h (cooperador)

Linfocito T c (citoltico)

Linfocito NK

Microtbulos Golgi (muy desarrollado)

Granulocitos Fagocitos

Heterocromatina

Eritrocito

Plaquetas

Clulas presentadoras de antgeno profesionales

Clula plasmtica

T h1

T h2

Linfocito T c Linfocito NK activado activado

Fig. 2.1. T odas las clulas del sistema inmune provienen de clulas hematopoyticas pluripotentes. NK (natural killer): linfocito citoltico natural.

Neutrfilo
Ncleo multilobulado Grnulos 1 azurfilos Grnulos 2 especficos Golgi pequeo

Eosinfilo
Retculo endoplsmico rugoso (RER)

Grnulos con centro cristalino

Ncleo bi lobulado Grnulos de glucgeno Golgi pequeo

Basfilo

Mastocito
Profusin de grnulos Profusin de microvilli

Nucleo sencillo Golgi muy pequeo Grnulos con cristaloides y estructuras lamelares concntricas Golgi pequeo

RER reducido

RER muy reducido Grnulos de glucgeno

Ncleo lobulado (suave)

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Plaquetas
Similitudes y Diferencias entre Basfilos y Mastocitos:

Caracterstica

Basfilos

Mastocitos
Vacuolas Microtbulos

Distribucin Dimetro Grnulos glucgeno Superf. Celular Ncleo Grnulos

Sangre 10-12 um SI microvilli plano bi-lobulado pocos y grandes

Tej. Conectivo y mucosas 20-30 um NO microvilli largos y profusos simple muchos y pequeos

Grnulos de glucgeno

Grnulos

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12

Monocitos
Ncleo sencillo suavemente lobulado Grnulos pequeos (lisosomas)

Macrfagos
Pseudpodos Acmulos lipdicos

Vacuola fagoctica

RER pequeo Lisosomas 1s

Cuerpos multilamelares

Lisosomas 2s Mitocondrias filamentaosas

Golgi mediano RER pequeo

Golgi mediano

Ncleo simple con nucleolo Vesculas

13

14

Linfocito (T, B)
Grnulos Golgi pequeo

Clula plasmtica (B)

Golgi grande

Centriolo

RER abundante

Citoplasma en llanta Ncleo grande y sencillo con nucleolo Ribosomas libres

Ncleo compacto distribucin radial de heterocromatina

Citoplasma engrosado RER muy reducido

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Linfocito NK (LGL)
Ncleo simple Vesculas Profusin de grnulos

Clulas dendrticas
Citoplasma irregular, alargado, casi vaco con pseudpodos y velos.

Golgi mediano

Tipos de clulas dendrticas

Gotas lipdicas

Clula
Mitocondrias

Tejidos
Mitocondrias redondeadas

*Interdigitante *De zona Marginal *Cl. Langerhans *Intersticial *Cl. Velada *De Sangre
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Mdula o Timo Bazo Epidermis Otros tejidos (corazn, rin) Linfa aferente Sangre

Ncleo simple con nucleolo pequeo Golgi pequeo RER muy reducido

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Fagocitosis

Tamaos y presencia en sangre de las diferentes clulas:

Clula Dimetro n celulas/litro

Macrfago

Inicio de la respuesta inmune; Hipersensibilidad retardada (DTH)

Total clulas blancas ----4-10 x 109 Neutrfilos 8-12 um 2-7 x 109 Eosinfilos ~12 um 0.4-4 x 109 Basfilos 10-12 um 0.1-1 x 109 Mastocitos 20-30 um NO (Tej. Conectivo y mucosa) Monocitos 9-12 um 0.2-0.8 x 109 Macrfagos 10-12 um NO (infiltrados en tejidos) Linfocitos 8-12 um 1.5-3.5 x 109 T (70-75%) B (15-20%) NK (5-10%) Plaquetas ~3 um 15-400 x 109 Clulas Dendrticas 10-12 um indetectables

Neutrfilo

Fagocitosis en respuesta a seales (complemento y anticuerpos)

Eosinfilo

Involucrado en respuesta anti-parsitos

Basfilo

Libera mediadores de la inflamacin

Mastocito

Libera mediadores de la inflamacin; Involucrado en respuestas alrgicas

Clula NK 19

Mata clulas infectadas o malignas; Vigilante de ausencias 20

Fagocitosis y lisis

Exocitosis y dao
Parsito

Exocitosis e inflamacin

+ + +

Bacteria
+ Mastocito + +

Eosinfilo

Macrfago o granulocito

T oxinas Lisosoma

Neurotoxicidad Citotoxicidad

Fagosoma (lisis)

Vaso dilatacin Extravasacin Quimiotaxis Edema (Inflamacin)

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22

T c
T CR
NKRP1

T c
NKRP 1

KIR

Clula infec tada reconocible por linfoc itos T c, pero no por NK

Clula infectada reconocible por linfoc itos NK, pero no por T c

Clula infectada reconocida por inmunoglobulinas

T c

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Clula lisada

Clula lisada

Clula lisada

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NEUTRFILOS Caractersticas citolgicas: Los granulocitos segmentados se originan a partir de las bandas por segmentacin nuclear, y son los elementos ms maduros de la granulopoyesis. Circulan por la sangre perifrica donde ejercen sus funciones de fagocitosis y bacteriolisis. Segn el tipo de granulacin especfica se identifican los neutrfilos, eosinfilos y basfilos. A comps de la maduracin de los polinucleares acontecen importantes cambios, entre los que citaremos el aumento de su capacidad de movilizacin, gracias a la presencia de protenas contrctiles. En el polinuclear adulto un 10% de sus protenas totales corresponden a actina y un 1% a miosina. La aparicin de receptores de superficie para la fraccin Fc de la inmunoglobulina G y para la fraccin 3 del complemento tambin acontece en este avanzado estadio de maduracin.

Los granulocitos segmentados neutrfilos son clulas redondeadas, de tamao entre 12 y 14 um. Su ncleo est segmentado en 2 a 5 lbulos, unidos por unos finos puentes cromatnicos. El citoplasma contiene numerosos grnulos neutrfilos que se tien de color marrn con las coloraciones panpticas habituales, as como cierto nmero de grnulos primarios o azurfilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrfilos. Citoqumicamente los granulocitos segmentados neutrfilos son positivos a la mieloperoxidasa, fosfatasa cida, cloroacetatoesterasa, catepsina G y elastasa. Contiene, asimismo, material PAS positivo y lactoferrina, entre otras sustancias detectadas citoqumicamente. Imgenes:

EOSINFILOS Caractersticas citolgicas: Los granulocitos segmentados se originan a partir de las bandas por segmentacin nuclear, y son los elementos ms maduros de la granulopoyesis. Circulan por la sangre perifrica donde ejercen sus funciones de fagocitosis y bacteriolisis. Segn el tipo de granulacin especfica se identifican los neutrfilos, eosinfilos y basfilos. A comps de la maduracin de los polinucleares acontecen importantes cambios, entre los que citaremos el aumento de su capacidad de movilizacin, gracias a la presencia de protenas contrctiles. En el polinuclear adulto un 10% de sus protenas totales corresponden a actina y un 1% a miosina. La aparicin de receptores de superficie para la fraccin Fc de la inmunoglobulina G y para la fraccin 3 del complemento tambin acontece en este avanzado estadio de maduracin. Los granulocitos segmentados eosinfilos tienen un tamao semejante a los neutrfilos, se caracterizan morfolgicamente por contener en su citoplasma grnulos acidfilos. Tienen una forma redondeada, tamao entre 0.5 y 1.5 m, ocupan todo el citoplasma de la clula y se tien de color naranja o marrn anaranjado con las coloraciones panpticas. A diferencia de los grnulos basfilos nunca se disponen por encima del ncleo. Desde el punto de vista ultraestructural, los eosinfilos poseen distintos tipos de granulacin : 1/ granulacin primaria, donde se localiza la lipofosfolipas, tambin denominada protena del cristal de Charcot Leyden. estos grnulos no tienen centro cristaloide y constituyen aproximadamenten un 5% de la granulacin del eosinfilo. 2/ Una granulacin secundaria, con centro cristaloide, que representa ms del 95% de la granulacin en el eosinfilo maduro y 3/ microgrnulos o estructuras tubulovesiculares que son ricos en fosfatasa cida y protenas catinicas. citoqumicamente se caracterizan por poseer gran cantidad de mieloperoxidasa, fosfatasa cida y arilsulfatasa. La peroxidasa se dispone fundamentalmente en la matriz del grnulo y posee caractersticas diferenciales bioqumicas, antignicas y ontognicas con respecto a la peroxidasa de la serie neutrfila. tambin contienen protenas catinicas y mucosustancias sulfatadas; poseen, asimismo, un alto contenido en fosfolipasa y lisofosfolipas. Por el contrario, est desprovisto de fosfatasa alcalina y lactoferrina. Su papel biolgico principal es el de modulador de la reaccin anafilctica al ser capaces de inactivar sustancias liberadas por los mastocitos y el control de la infestacin por ciertos parsitos, cuyo ataque no tiene lugar por mecanismos de fagocitosis, sino por adherencia y subsiguiente citotoxicidad al segregar diversas sustancias nocivas. Imgenes:

BASFILOS Caractersticas citolgicas: Los granulocitos segmentados se originan a partir de las bandas por segmentacin nuclear, y son los elementos ms maduros de la granulopoyesis. Circulan por la sangre perifrica donde ejercen sus funciones de fagocitosis y bacteriolisis. Segn el tipo de granulacin especfica se identifican los neutrfilos, eosinfilos y basfilos. A comps de la maduracin de los polinucleares acontecen importantes cambios, entre los que citaremos el aumento de su capacidad de movilizacin, gracias a la presencia de protenas contrctiles. En el polinuclear adulto un 10% de sus protenas totales corresponden a actina y un 1% a miosina. La aparicin de receptores de superficie para la fraccin Fc de la inmunoglobulina G y para la fraccin 3 del complemento tambin acontece en este avanzado estadio de maduracin. Los granulocitos segmentados basfilos son clulas redondeadas cuyo tamao oscila entre 10 y 13 m. El ncleo, de cromatina densa, posee generalmente dos o tres lbulos unidos por puentes cromatnicos, en ocasiones difciles de visualizar dada la presencia de las numerosas granulaciones basfilas propias de esta clula. Los grnulos basfilos se disponen encima del ncleo. la granulacin basfila, de tamao entre 0.2 y 1 um, adquiere una coloracin rojo-violcea oscura con las tinciones panpticas y tiene una forma poligonal. En ocasiones, los grnulos basfilos se disponen en el interior de vacuolas citoplasmticas, imagen ptica que traduce la disolucin parcial de estos grnulos tras las maniobras de fijacin. La caracterstica principal de los grnulos basfilos es su metacromasia con los colorantes azules (azul de metileno, azul de toluidina), con los que adquiere una tonalidad rojiza, mientras que el resto de las estructuras celulares se tien de color azul. La metacromasia se debe a la riqueza de estos grnulos en mucopolisacridos cidos sulfatados. Los grnulos basfilos tambin son ricos en histamina, heparina, glucgeno y determinados enzimas ( peroxidasa). Otro enzima a destacar es la omega exonucleasa, localizada en la zona intercelular del basfilo y mastocito y que es de gran utilidad para la identificacin de basfilos degranulados presentes en ciertas hemopatas. A diferencia de los mastocitos, no contienen cloroacetatoesterasa; tampoco tienen fosfatasa alcalina. Otra caracterstica diferencial entre los grnulos basfilos y los del mastocito es la hidrosolubilidad de los primeros, por lo que el citoplasma del basfilo aparece, a veces, con numerosas vacuolas que no son ms que grnulos parcialmente extrados. Imgenes:

MONOCITOS Caractersticas citolgicas: Los monocitos son las clulas de mayor talla halladas en la sangre perifrica. Su tamao oscila entre 15 y 30 m de dimetro, adquiriendo una forma irregular, cuadrangular u oval. El ncleo, situado en posicin central, es voluminoso y adopta formas abigarradas en herradura, indentado o doblado; la cromatina es densa y con aspecto como peinada en finas franjas cromatnicas, lo cual es caracterstico de estas clulas. Los monocitos estn desprovistos de nucleolos. El citoplasma es amplio con ocasionales mamelones perifricos, de color azul plomizo y contiene un nmero variable de grnulos azurfilos. Estudios ultraestructurales han permitido obsevar en los monocitos dos tipos de granulacin: la primaria, peroxidasa positiva, que aparece en estadios evolutivos ms jvenes,y la secundaria, peroxidasa negativa tpica de los monocitos maduros. Este segundo tipo de granulacin no tiene nada que ver con la granulacin secundaria de la granulopoyesis. El citoplasma puede contener alguna vacuola. Citoqumicamente estas clulas se caracterizan por su riqueza en esterasas inespecficas (naftol-As-Dacetatoesterasa, alfa-naftilacetatoesterasa cida y butiratoesterasa) que se inhiben casi totamente con el fluoruro sdico. Asimismo son ricas en fosfatasa cida, lisozima, beta-glucuronidasa, catepsina y arilsulfatasa. A diferencia de la granulopoyesis neutrfila, los monocitos son naftol-As-Dcloroacetaroesterasa negativos; tampoco contienen fosfatasa alcalina y lactoferrina.

Los histiocitos y macrfagos constituyen el ltimo estadio evolutivo de las clulas del sistema mononuclear fagoctico. Originados a partir de los monocitos sanguneos, los histiocitos adoptan un aspecto morfolgico caracterstico y diferencial dependiendo del tejido u rgano donde finalmente se ubiquen. Los histiocitos del tejido conjuntivo se caracterizan por poseer un ncleo pequeo en relacin con la gran extensin del citoplasma, que adopta una forma variable (redondeada, oval, incurvada, bilobulada) situndose, generalmente, en un extremo de la clula. La cromatina, tpicamente reticulada, puede contener uno o dos nucleolos de tonalidad basfila. El citoplasma incoloro o dbilmente basfilo se caracteriza por su gran extensin y por sus lmites imprecisos. Agunas veces puede contener abundante granulacin azurfila y vacuolas. Los macrfagos son aquellos histiocitos que contienen en su interior restos de material fagocitado. Son fciles de identificar y se observan con frecuencia en la mdula sea, ganglios linfticos, bazo, etc. En circunstancias patolgicas los macrfagos se transforman adoptando diversos aspectos morfolgicos (clulas gigantes de Langhans, de cuerpo extrao y clulas epitelioides). Estas modificaciones morfolgicas traducen, sin duda, ciertas actividades funcionales inducidas por txicos qumicos o bacterianos. En condiciones normales los histiocitos pueden ofrecer una variada expresividad morfolgica segn el tejido donde asienten (clulas de Kupffer en el hgado, macrfagos de los alveolos pulmonares, macrfagos de las cavidades serosas, osteoclastos de la mdula sea, microgla en el sistema nervioso central). Los histiocitos y macrfagos son muy ricos en hidrolasas cidas (fosfatasa cida, beta-glucuronidasa, alfanaftilacetatoesterasa cida) y esterasa inespecficas en adaptacin a su intensa capacidad digestiva, por lo que deben considerarse como fagocitos profesionales. Tambin contiene muramidasa, proteasa neutras, inhibidores enzimticos como la alfa-2-macroglobulina, factor quimiotctico de los neutrfilos y ciertas proteinas como fibronectina, transcobalamina II, etc. No contiene habitualmente peroxidasa. Las funciones del monocito-macrfago pueden resumirse en capacidad de migracin, fagocitosis, actividad

microbicida y modulacin de la respuesta inmune, y sntesis de mltiples factores solubles como interfern, interleucinas, prostaglandinas, factor de necrosis tisular y factores de crecimiento de als clulas hematopoyticas. Su papel en el complejo mecanismo de la inmunidad es decisivo; as, en este contexto se ha comparado al linfocito con el director de orquesta y al monocito con el primer violn. Imgenes:

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

3.-Tejidos del sistema Inmune

(rganos linfoides primarios y secundarios; rganos encapsulados y difusos)
A. Corell UVA
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Indice de contenidos del Tema 2

Tejidos del Sistema Inmune

3.1 Los Tejidos: el sistema Linfoide 3.2 rganos linfoides primarios * Mdula sea * Timo 3.3 rganos linfoides secundarios * Bazo * Ganglios linfticos * Tejido linfoide asociado a mucosas (MALT) 3.4 Recirculacin de linfocitos en el organismo

Estructura esquemtica del Timo humano arteria

cpsula trabcula

Folculo linfoide Tejido linfoide difuso

capilares cortex

mdula

Placas de Peyer

Amgdalas
vena cortex

Bazo

Ganglio linftico

Timo

mdula

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Estructura esquemtica del Bazo humano

Pulpa roja

Corriente linfoide periarteriolar Zona marginal

Folculo

Pulpa blanca Arteria trabecular Folculo

Zona marginal

Cpsula trabcula Arteria esplnica

Arteriola central Corriente linfoide periarteriolar

Folculo

Linftico eferente

Seno venoso

Pulpa roja Pulpa blanca

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Inmunologa General, 2 Medicina (2005-2006)

TEMA 3 TEJIDOS DEL SISTEMA INMUNE 3.1 Los tejidos: el sistema Linfoide (diapositiva 3.3).

Los rganos linfoides se pueden clasificar en: rganos linfoides primarios o centrales y secundarios o perifricos (desde un punto de vista funcional) y encapsulados y difusos (desde un punto de vista anatmico-estructural). En los rganos linfoides primarios es donde se produce la diferenciacin de linfocitos (linfopoyesis) T y B. La de linfocitos B ocurre en hgado fetal y mdula sea. La de linfocitos T sucede en el timo. En los rganos linfoides secundarios se presentan los antgenos y se monta la respuesta inmune especfica (ganglios linfticos, bazo, MALT [tejido linfoide asociado a mucosas]) Los conductos linfticos se distribuyen por todo el organismo (diapositiva 3.4), llegan a todas las zonas y tienen cadenas de ganglios intercalados. Destacan las cadenas ganglionares localizadas en la zona inguinal, axilar y amigdalar. El punto de conexin entre vasos linfticos y vasos sanguneos es el llamado Ducto (o conducto) torcico: la linfa se vuelca en la vena subclavia. No hay que confundir el concepto de ganglio linftico con el de folculo linfoide (diapositiva 3.5). Estos ltimos no son otra cosa que acumulaciones de linfocitos que adquieren forma esfrica. Es un modo, pues, de organizacin de tejidos linfoides. Existen folculos linfoides en todos los rganos linfoides encapsulados: ganglios, bazo, timo. Adems, en los rganos linfoides difusos (como el MALT) se han observado la presencia de folculos linfoides en unas estructuras denominadas Placas de Peyer, pero no en el resto del tejido. 3.2 rganos Linfoides Primarios. a) Mdula sea: La mdula sea est formada por islotes de clulas hematopoyticas situados en el interior de los huesos. Todas las clulas del sistema inmune se originan a partir de las clulas hematopoyticas primordiales pluripotentes (clulas stem) de la mdula sea a travs de los linajes mieloide y linfoide (diapositiva 3.6). Durante la edad fetal estas funciones se realizan por el hgado, que abandona esta actividad despus del nacimiento. Adems, la mdula sea acta como rgano linfoide secundario (diferenciacin final de clulas B a clulas plasmticas). b) Timo: El timo es el lugar donde maduran los linfocitos T. Es un rgano bilobulado que se localiza en el mediastino anterior. Cada lbulo est dividido en varios lobulillos por tabiques fibrosos y cada lobulillo est formado por una corteza externa y una mdula interna. Los linfocitos del timo, tambin denominados timocitos, son clulas de estirpe T en diferentes estadios de maduracin. En general, los linfocitos T ms inmaduros llegan a la corteza del timo a travs de los vasos sanguneos. Los precursores de los Linfocitos T llegan por va arterial llegan a la corteza y a travs de los capilares pasan a la mdula (diapositivas 3.7, 3.8 y 3.9) .De la mdula salen por los capilares venosos. Los linfocitos se diferencian en el trayecto de la corteza a la mdula. La diferenciacin (diapositiva 3.10) consiste en la presentacin por parte de las clulas epiteliales de sus protenas HLA sucediendo la llamada seleccin positiva. Despus las clulas dendrticas y los macrfagos ensean a los timocitos los antgenos HLA con pptidos propios en su
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Inmunologa General, 2 Medicina (2005-2006)

hendidura (seleccin negativa).Con esta seleccin se eliminan el 95 % de los posibles linfocitos T. La seleccin positiva (elimina linfocitos T con receptores poco apropiados) se realiza en la corteza y en la seleccin negativa (mdula ) se eliminan los linfocitos que reconocen elementos propios del organismo. 3.3 rganos Linfoides secundarios: a) Ganglio Linftico (diapositivas 3.11, 3.12 y 3.13): Los ganglios linfticos son agregados nodulares pequeos de tejido rico en linfocitos que se distribuyen a lo largo de los conductos linfticos por todo el organismo. Los ganglios linfticos estn formados por una corteza externa y una mdula interna. Cada ganglio linftico est rodeado por una cpsula fibrosa atravesada por numerosos vasos linfticos aferentes que drenan la linfa en un seno capsular o marginal. La linfa difunde a travs de la corteza hacia el seno medular y abandona el ganglio por los vasos linfticos eferentes en el hilio. Algunos folculos contienen reas centrales denominadas centros germinales, que se tien ligeramente con las tinciones histolgicas habituales. Los folculos que carecen de centros germinales reciben el nombre de folculos primarios y los que presentan centros germinales son folculos secundarios. Presenta dos vas; las de entrada son conductos linfticos aferentes , venas postcapilares y arterias postcapilares. La de salida es un conducto linftico eferente. Existen tres zonas estructuralmente distinguibles: -corteza , en esta zona existen clulas B y folculos linfoides. Estos folculos pueden ser primarios (presentan clulas B vrgenes en reposo) o secundarios (presentan centros germinales con Linfocitos B activados tras la presentacin de antgenos) -paracorteza, muy rica en linfocitos T. -mdula , en esta zona se encuentran los linfocitos maduros que estn listos para salir del ganglio. b) Bazo (diapositiva 3.14, 3.15 y 3.16): El bazo es el lugar principal donde tienen lugar las respuestas inmunitarias a los antgenos que transporta la sangre. El bazo es un rgano que pesa alrededor de 150 g en los adultos y que se localiza en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Recibe su irrigacin a travs de una arteria esplnica nica, que perfora la cpsula en el hilio y se divide progresivamente en ramas ms pequeas que estn rodeadas por trabculas fibrosas protectoras y de sostn. Los folculos linfticos, algunos de los cuales contienen centros germinales, estn unidos a las zonas T. Igual que en los ganglios linfticos, los folculos son las zonas de linfocitos B. Los folculos estn rodeados por un anillo de linfocitos y macrfagos, denominado zona marginal. Estos tejidos linfticos densos forman la pulpa blanca del bazo. Las arteriolas terminan en sinusoides vasculares, entre los que estn dispersos un gran nmero de eritrocitos, macrfagos, clulas dendrticas, escasos linfocitos y clulas plasmticas. Todos estos constituyen la pulpa roja. Los sinusoides terminan en vnulas que drenan en la vena esplnica, que transporta la sangre fuera del bazo y alcanza la circulacin portal. En la pulpa blanca se realiza la presentacin de antgenos. Los linfocitos llegan por la arteria esplnica y capilares arteriales y salen por las venas y vasos linfticos eferentes.

Inmunologa General, 2 Medicina (2005-2006)

c) Tejido Linfoide Asociado a Mucosas (MALT): Como en la piel, las superficies mucosas de los aparatos respiratorio, digestivo y genitourinario, estn colonizadas por linfocitos y clulas presentadoras de antgeno que inician las respuestas inmunitarias frente a antgenos ingeridos o inhalados.. Igual que en la piel, estos epitelios mucosos son barreras entre el medio interno y externo y, por tanto, son un lugar importante de entrada de microorganismos. Gran parte del conocimiento de la inmunidad de las mucosas se basa en estudios del aparato digestivo. Los MALT son agrupaciones de tejido linfoide no encapsulado, situado en la lmina propia y reas submucosas (diapositiva 3.17 y 3.18) de los tractos gastro-intestinal (GALT), respiratorio (BALT) y tracto gnito-urinario. Tiene particular inters (dada su extensin) el tejido asociado a la mucosa gastro-intestinal o GALT. En las microvellosidades de los enterocitos existen redes capilares y vnulas adems de un conducto linftico que recibe el nombre de lacteal. Los linfocitos estn dispersos (tejido difuso) en todo el tejido, salvo en las placas de Peyer (diapositiva 3.18), donde existen folculos linfoides no encapsulados pero que aparecen agrupados. 3.4 Recirculacin de linfocitos en el organismo: Hay 2 sistemas circulatorios en el cuerpo: la sangre y la linfa. La sangre llega hasta todos los tejidos a travs de arterias, arteriolas y capilares arteriales. Parte del fluido sanguneo de los tejidos drena y entra en los conductos linfticos eferentes. As los canales linfticos forman una red, cuando confluyen varios canales se constituyen los ndulos linfticos a los que llegan varios conductos aferentes (de entrada), y que drenan por un nico eferente (de salida). Finalmente, la linfa encuentra el camino hacia el llamado Ducto torcico que es donde la linfa se vuelca a la sangre (el ducto torcico se funde con la vena subclavia) (diapositiva 3.19). Una caracterstica nica de los linfocitos es que pueden cruzar el cuerpo a travs de la sangre y la linfa. Este trfico de sangre a linfa se denomina recirculacin linfocitaria. Los linfocitos abandonan los tejidos infectados hacia los ganglios linfticos regionales. All, son activados tras encontrar clulas presentadoras de antgeno. Una vez activados, va conductos linfticos se vuelcan en el ducto torcico a la circulacin sangunea. Y por ltimo, a travs de la circulacin vuelven al tejido infectado para ejercer su funcin (diapositiva 3.20).

Tema 03. Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas son sustancias de una gran importancia en la defensa del organismo al tener la capacidad de identificar y colaborar en la destruccin de antgenos extraos al organismo. Son los principales responsables en lo que se ha venido en denominar respuesta inmune humoral, cuyo funcionamiento normal es imprescindible para la defensa de los organismos. De lo contario el individuo morira por infecciones de todo tipo y su defecto, es por tanto, incompatible con la vida si no se instaura un tratamiento con inmunoglobulinas. La historia de las inmunoglobulinas arranca cuando a finales del siglo XIX, Von Behring observ que los sueros de animales que haban padecido difteria contenan sustancias que neutralizaban el efecto de la toxina diftrica. A estas sustancias se les denomin anticuerpos, debido a su capacidad de reconocer las toxinas bacterianas. Despus cuando se aplica la electroforesis al fraccionamiento de protenas plasmticas, se identifican los anticuerpos como las protenas del suero que corresponden con las -globulinas, quedando as asociados temporalmente, los conceptos de anticuerpo y de -globulina, como equivalentes (Figura 3.1). Posteriormente, se comprueba que no todos los anticuerpos migran electroforticamente con las -globulinas, sino que muchos de ellos lo hacen con las globulinas y por lo que Hebermans propone el trmino de inmunoglobulinas para designar a todas las sustancias con capacidad de anticuerpo. As hoy se entiende por inmunoglobulinas ciertas glicoprotenas que se producen por los linfocitos B o sus clulas derivadas, las clulas plasmticas, y que poseen la capacidad de reconocer y unirse al antgeno que indujo su formacin. Las inmunoglobulinas se pueden encontrar bien unidas a las membranas de los linfocitos B o de forma soluble. En el primer caso actuaran como receptores para antgenos y as iniciar la activacin de estos linfocitos, mientras que en el segundo caso, cuando se encuentran solubles, actan neutralizando o/y colaborando en la destruccin de los antgenos. De manera sinttica podramos decir que las inmunoglobulinas son glicoprotenas con funcin de anticuerpo. Se distinguen cinco clases de inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas con ciertas caractersticas diferenciales (Tabla 3.1 y que estudiaremos en este captulo comenzando por su estructura para terminar con su funcin

Estructura y funcin de las Inmunoglobulinas

Todas las inmunoglobulinas poseen una estructura comn formada por cuatro cadenas polipeptdicas, dos de mayor tamao, denominadas cadenas pesadas, y dos, de menor tamao, llamadas cadenas ligeras. Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se agrupan de tal manera que existe una proximidad espacial entre

los cuatro extremos amnicos todos ellos, y entre los dos extremos carboxlicos de las cadenas pesadas por otra. Una inmunoglobulina, como es la IgG por ejemplo, puede ser fraccionada mediante la utilizacin de enzimas (papana, pepsina, etc.), obtenindose diferentes tipos de fragmentos (Figura 3.3). Esto fue realizado por Porter en 1959, y permiti no slo conocer la estructura de molculas sino tambin deducir la funcin de cada una de sus partes (Tabla 3.2). As se vi que el tratamiento con papana produce la ruptura especfica de las cadenas pesadas, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro que las une entre s y los puentes que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que define la actividad biolgica, la clase y subclase de cadenas pesadas y otros dos fragmentos denominados cada uno de ellos Fab, que es por donde la molcula se une a los antgenos. Cadenas ligeras Hay dos tipos de cadenas ligeras, diferentes, cadenas ligeras tipo kappa () y cadenas ligeras tipo lambda (). En cada molcula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras son del mismo tipo, o bien , pero nunca de distinto tipo. Las cadenas ligeras estn formadas por unos 200 aminocidos con la particularidad de que existen dos puentes disulfuro que unen grupos de unos cincuenta aminocidos (Figura 3.4). A su vez, estas cadenas ligeras tienen otro puente disulfuro intercatenario, por el cual se unen a la cadena pesada. Cadenas pesadas Estas cadenas poseen unos cuatrocientos aminocidos establecindose entre algunos de ellos puentes disulfuro (intracatenarios) que asocian unos 60 aminocidos y que condicionan su estructura secundaria. Estas dos cadenas pesadas estn unidas la una a la otra por puentes disulfuro intercatenarios, que pueden estar constituidos desde uno a cinco unidades, dependiendo del tipo de inmunoglobulina. En las cadenas pesadas, y a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios, hay una zona de unos 15 aminocidos, de gran flexibilidad que constituye lo que se denomina zona bisagra que es por donde se deforma la molcula de inmunoglobulina cuando se produce la unin con el antgeno, facilitndose as su acoplamiento con ste. Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas Las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo carboxlico que constituye la parte constante de las cadenas ligeras (C L ) y otra que corresponde al extremo amnico, que es muy variable y constituye la parte variable de las cadenas ligeras (V L ) correspondiendo a la zona de interaccin con el antgeno. Tambin las cadenas pesadas poseen una parte variable (VH) y otra constante (CH).

La estructura de este fragmento variable, depende del tipo de antgeno que reconoce, dado que este extremo tambin participa en la unin con el mismo. Por otra parte, aproximadamente los dos tercios del extremo carboxlico de todas las cadenas pesadas de un mismo tipo de inmunoglobulinas poseen una estructura idntica. De ah que esta parte de las cadenas pesadas se conozca como parte constante de las cadenas pesadas (C H ).Esta parte constante es diferente segn la clase de inmunoglobulina que consideremos, determinando la existencia de cinco tipos de cadenas pesadas: , , , y que definen a su vez las cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE respectivamente. (Figura 3.5). CARACTERSTICAS DE LAS DISTINTAS CLASES DE INMUNOGLOBULINAS Debido a esta distinta estructura, las cadenas pesadas van a presentar distintas propiedades biolgicas, tales como la capacidad de unirse entre s, fijar complemento, fijar la pieza de secrecin y unirse a macrfagos, neutrfilos y clulas NK. En la Tabla 3.1 se recogen los principales tipos de inmunoglobulinas y en la (Tabla 3.3) las principales propiedades de las mismas. Hemos de considerar que incluso entre molculas de una misma clase existen, segn a la subclase a la que pertenezcan, ciertas diferencias cmo se observa en la Tabla 3.4. Isotipos Se entiende por isotipo las distintas clases y subclases de una familia de protenas o pptidos presentes en todos los miembros de una especie. As los isotipos de las inmunoglobulinas son las clases, G, A, M, D y E. Los genes que codifican para las distintas variantes isotpicas estn presentes en todos los individuos sanos, es decir, todos los individuos sanos poseen los genes que codifican respectivamente para las regiones constantes G, M, A, D y E de las cadenas pesadas y para las regiones constantes y de las cadenas ligeras. Dominios moleculares en las cadenas ligeras y pesadas. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras poseen grupos de aminocidos unidos por puentes disulfuro intracatenarios, conocidos como dominios. La cadena L tiene dos dominios, uno corresponde a la regin variable (V L ) y otro a la constante (C L ). La cadena H tiene un dominio en la regin variable (V H ) y tres o cuatro en la constante dependiendo de la clase de inmunoglobulina que consideremos (tres en la IgG, IgA e IgD y cuatro en las IgM e IgE). (Figura 3.6). Regiones hipervariables Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez unas regiones en donde se concentra fundamentalmente la variabilidad. Son tres pequeos segmentos que constituyen las denominadas regiones o segmentos hipervariables o regin determinante de complementariedad CDR (Complementarity Determining Region), pues determinan la forma del centro activo que permite el reconocimiento y unin al antgeno.

Cada una de estas regiones hipervariables se compone de 17 a 20 aminocidos. Cambios en muy pocos aminocidos de estas zonas suponen una enorme diversidad de posibilidades de unin al antgeno sin variar el resto de la molcula (Figura 3.7).Las otras partes variables son relativamente constantes, de modo que sustituciones en los residuos que la constituyen, no afectan la especificidad de combinacin.

Molculas adicionales a la estructura bsica En las inmunoglobulinas aparecen, adems de las cuatro cadenas polipeptdicas bsicas, un componente glucdico (que representa el 2-14 % del peso total de la molcula) y otras inmunoglobulinas contienen glicoprotenas adicionales conocidas como cadena J y pieza de secrecin. La cadena J es una glicoprotena con un 12 % de azcares y un peso molecular de 15 kD que se une, mediante puentes disulfuro, al extremo Fc tanto de la IgA como de la IgM haciendo posible la formacin de complejos dimricos o pentamricos, segn se trate de la IgA o IgM. La pieza de secrecin es una glicoprotena de 58 kD de peso molecular que sintetizan las clulas epiteliales de las mucosas y glndulas exocrinas y que unindose a la IgA hace posible el paso de esta inmunoglobulina a travs de las clulas epiteliales. Estructura espacial inmunoglobulinas. de las

Las inmunoglobulinas pueden estar constituidas por unidades bsicas simples, como es el caso de la IgG, IgD e IgE; en forma de dmeros (dos unidades bsicas unidas), como es el caso de la IgA, o incluso por hasta cinco estructuras bsicas unidas por sus extremos Fc como es el caso de la IgM. Esto se debe a la cualidad que tienen las cadenas y de unirse entre s. Esta unin se realiza a travs de la cadena J y mediante puentes disulfuro (Figura 3.9). Las cadenas pesadas y ligeras estn plegadas sobre si mismas, tal como se ha visto mediante anlisis cristalogrfico (Figura 3.10). Cada uno de los dominios de las cadenas est constituido a modo de cilindros en los que se encuentran plegados en forma de sndwich dos grupos de cadenas proteicas, una con tres cadenas polipeptdicas y la otra con cuatro, que presentan estructuras secundarias es de hoja plegada . Estas dos capas proteicas estn alineadas paralelamente rodeando un espacio interior en el que predomina la presencia de aminocidos hidrfobos (Figura 3.11).

Subclases de inmunoglobulinas Se sabe que no todas las Inmunoglobulinas de una misma clase tienen idntica estructura, sino que dentro de las clases se pueden establecer subclases considerando la secuencia de aminocidos de la regin constante de las cadenas H y el diferente nmero y situacin de los puentes disulfuro intercatenarios establecidos entre las cadenas pesadas. As, la IgG humana se divide en cuatro subclases (IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 e IgG 4 ) y la IgA e IgM en dos (IgA1 e IgA 2 ; IgM 1 e IgM 2 ) respectivamente (Tabla 3.4). Alotipos Si se inmuniza un animal con inmunoglobulinas de otro animal de la misma especie (Figura 3.12) se pueden obtener antisueros que van dirigidos contra ciertas regiones constantes de las inmunoglobulinas que son distintas entre ambos animales. Ello se debe a la presencia de diferentes formas allicas (pequeos cambios en las zonas constantes de las cadenas pesadas y ligeras) que distinguen la Ig de unos individuos a otros de la misma especie y que se conocen como alotipos. En humanos se han descrito tres tipos de alotipos: Gm en las cadenas g de las IgG Am en las cadenas a de las IgA y Km en las cadenas ligeras que dan lugar a tres alotipos: Km (12), Km (1) y Km (3), cuyas diferencias estructurales se recogen en la (Tabla 3.5) Idiotipos Se entiende por idiotipo el conjunto de determinantes antignicos situados en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un determinado anticuerpo que es precisamente por donde se produce su acoplamiento al antgeno que indujo su formacin. Es pues una zona de estructura complementaria al antgeno y que a su vez puede actuar como antgeno induciendo nuevos

anticuerpos en el individuo y as sucesivamente (Figura 3.13). Los idiotipos parecen tener importancia fisiolgica en la regulacin del sistema inmune. Segn la teora de la red de Jerne, frente a los idiotipos se formaran anticuerpos que al unirse a los mismos formaran un entramado (red) de anticuerpos unidos a otros anticuerpos que tendran como accin final la regulacin del proceso de sntesis de nuevas inmunoglobulinas. DISTRIBUCIN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas se encuentran distribuidas en todos los fluidos orgnicos de la economa de los vertebrados y en las membranas de los linfocitos B y clulas plasmticas. Las cantidades relativas de cada una de las clases de inmunoglobulinas en los diferentes compartimentos del organismo son muy diferentes. En el torrente sanguneo predomina la IgG mientras que en las secreciones (saliva, lgrimas, secrecin bronquial, as como en el lquido cefalorraqudeo y mucosas) la IgA es la predominante. Los niveles de inmunoglobulinas sricas fluctan ampliamente en funcin de diversos aspectos, tales como el estado nutricional, la edad, etc. Los valores normales en suero de un hombre adulto (entre 20 y 40 aos) se recogen en la (Tabla 3.6) Ontognicamente se producen mltiples cambios en los niveles de inmunoglobulinas desde el nacimiento hasta los 8 10 aos, en que estos se estabilizan. En la figura 3.17 se expresan las concentraciones de inmunoglobulinas desde antes del nacimiento hasta los 5 aos de edad. Los niveles de IgG son muy altos en la vida fetal y en las primeras semanas de vida extrauterina, debido a que esta inmunoglobulina es la nica que pasa de la madre al feto a travs de la placenta. Durante la lactancia, descienden los niveles de IgG por catabolismo de esas molculas que no son repuestas por carecer el nio an de la capacidad de sntesis de las mismas. Tambin en la edad fetal se sintetizan pequeas cantidades de IgM (Figura 3.14). Cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos (inmunoglobulinas de membrana), actan como receptores de las seales de activacin antignicas por su capacidad de reconocimiento del antgeno constituyendo el receptor para el antgeno del linfocito B. SUPERFAMILIA DE LAS INMUNOGLOBULINAS La estructura de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas posee ciertas similitudes entre s (por ejemplo, la estructura en dominios equivalentes). Esto hizo pensar que ambas cadenas procedan de una molcula ancestral comn. Idntica similitud se ha observado con la -2-microglobulina y con una gran cantidad de molculas, todas ellas agrupadas, por tanto, bajo el mismo epgrafe de superfamilia de las inmunoglobulinas. Estas molculas son: el receptor T para el antgeno, las molculas de histocompatibilidad clase I y II, LFA-3, ICAM-1 y otras muchas que irn siendo estudiadas en

diferentes captulos de este libro, especialmente en el captulo 8, donde se estudian las molculas de adhesin (Figura 3.15). La superfamilia de inmunoglobulinas son protenas que tienen uno o ms dominios extracelulares homlogos a las inmunoglobulinas. Entre las diferentes molculas de la superfamilia, stas participan y forman parte: En el reconocimiento de los antgenos Los receptores antignicos de los linfocitos T y B Anticuerpos Las molculas del MHC Como protenas de adhesin celular y fijadoras del complemento. Molculas de adhesin que en algunos casos son ligandos para las integrinas. Molculas estn involucradas en la circulacin y trfico de los leucocitos a los rganos linfoides y a los sitios de dao tisular por medio de interacciones clula-clula y clula-matriz extracelular.

FUNCIN DE LAS INMUNOGLOBULINAS. La funcin esencial de las inmunoglobulinas es la de unirse al antgeno. De esta manera las inmunoglobulinas actan como receptoras de seales antignicas o bien pueden colaborar en la destruccin de los mismos. La primera funcin se presenta cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos B (inmunoglobulinas de membrana), y las restantes cuando stas se encuentran solubles. Unin antgeno anticuerpo. La unin del antgeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) o inmunoglobulina es semejante a la que se establece entre la enzima y su substrato o entre protenas que pertenecen a cualquier va de sealizacin intracelular. Estas interacciones se deben a la formacin de mltiples enlaces no covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones electrostticas, de Van der Waals e hidrfobas), cada uno de los cuales por si solos son dbiles. Los anticuerpos (Igs) se unen al antgeno en unos lugares determinados conocidos como eptopos. Eptopos. Los eptopos de un antgeno pueden estar formados por aminocidos consecutivos en la secuencia de la protena, como las protenas se encuentran normalmente dobladas sobre si mismas segn lo que llamamos estructura terciaria, en la mayora de los casos los anticuerpos generados contra este tipo de eptopos solo reconocern a la protena desnaturalizada o linearizada y por ello se les llama eptopos lineales. En la mayora de los casos los eptopos suelen estar formados por aminocidos del antgeno que solo se encuentran suficientemente cerca unos de otros en la protena nativa, es decir en la protena que tiene estructura terciaria conservada, es decir una conformacin adecuada, por lo que a estos eptopos se les llama eptopos conformacionales (Figura 3.16).

Partopo. Las inmunoglobulinas se unen a los eptopos de los antgenos por sus sitios activos, constituidos como se ha indicado anteriormente, por los segmentos variables de las cadenas pesadas y ligeras (Figura 3.17) y donde intervienen principalmente las regiones hipervariables. Esta zona de unin de una inmunoglobulina al eptopo de un antgeno se conoce con el nombre de partopo. Fuerzas de unin Ag-Ac La unin ag-ac es la consecuencia de mltiples interacciones entre unos y otros de tal manera que la fuerza total de la unin puede ser muy elevada. Para que las interacciones mencionadas lleguen a ser efectivas, los grupos entre los que se establece deben estar situados a distancias muy cortas, y para que esto sea posible y se puedan producir un gran nmero de interacciones, el eptopo y el partopo deben encajar perfectamente, dependiendo de ello la fuerza de la interaccin que conocemos con el nombre de afinidad. La afinidad de la interaccin es de vital importancia, por cuanto de ello depender tanto la utilidad diagnstica y de investigacin de un anticuerpo como su importancia fisiopatolgica. Para cuantificar la afinidad de una interaccin, deberemos entender primero una serie de conceptos de los que nos ocuparemos a continuacin. Al tratarse de uniones no covalentes, la unin Ag/Ac ser reversible de modo que cuando el antgeno y el anticuerpo se mezclan en solucin, se estarn formando y disociando complejos constantemente de acuerdo con la siguiente ecuacin:

donde k a representa la constante de velocidad y k d la de disociacin. Llegara un momento en que la velocidades de asociacin y disociacin se igualen, es decir, que el numero de complejos Ag/Ac que se formen sea el mismo que el que se disocie, entonces decimos que se ha llegado a una situacin de equilibrio dinmico. Una forma indirecta de medir la afinidad de la interaccin de una pareja Ag/Ac, ser medir la velocidad de asociacin y disociacin antes de que se llegue al equilibrio, lo cual puede realizarse actualmente mediante biosensores. Cuanto mayor sea la velocidad de asociacin y menor la de disociacin mayor ser la afinidad de la interaccin de esa pareja Ag/Ac. Otra forma complementaria y ms directa de cuantificar la afinidad de la interaccin Ag/Ac, es hacerlo una vez que se ha alcanzado el equilibrio y utilizando concentraciones bajas de anticuerpo. En estas condiciones la concentracin de antgeno que permite que la mitad de los anticuerpos estn unidos a ellos y la otra mitad libre, medida en molaridad, se denomina constante de disociacin (K D ) y es una medida directa de la afinidad de la interaccin. Cuanto menor sea la K D mayor ser la afinidad puesto que indica que es necesaria una menor concentracin de antgeno para que la mitad de los anticuerpos estn ocupados. La inversa de la K D es la constante de asociacin (K A ) cuyo valor es directamente proporcional a la afinidad de la

interaccin. Para determinar experimentalmente estas constantes tendremos que conocer las concentraciones de antgeno libre y unido, para lo cual existen varios mtodos entre los que destacan anlisis mediante dilisis de equilibrio (Figura 3.18). Esta tcnica se basa en la utilizacin de una membrana semipermeable de un poro tal, que permita el paso de un antgeno suficientemente pequeo (un hapteno) pero no del anticuerpo. A concentraciones bajas de antgeno, la concentracin de anticuerpo libre ira bajando rpidamente hasta que se alcance el equilibrio, puesto que todo el antgeno que entre a travs de la membrana semipermeable quedara retenido por el anticuerpo. Realizando el experimento anterior con varias concentraciones de antgeno, podremos encontrar aquella en la que la mitad del anticuerpo se encuentra unido al antgeno que como hemos dicho corresponde a la K D . La afinidad que hayamos calculado corresponder exclusivamente a la de la interaccin de esa pareja Ag/Ac. Un determinado anticuerpo podr unirse a ms de un antgeno con afinidades distintas en cada caso. Avidez de la unin Ag-Ac Como apuntbamos anteriormente, el fenmeno de la unin Ag/Ac es en realidad mucho ms complejo, pues cada uno de los antgenos poseen varios eptopos distintos, por lo que podrn unir ms de un anticuerpo. Cada molcula de anticuerpo, por su parte, podr unir al menos dos molculas de antgeno, una por cada Fab y en el caso de la IgM hasta diez molculas (como se comento anteriormente las inmunoglobulinas IgM se ensamblan en unidades funcionales constituidas por cinco molculas de anticuerpo). Finalmente en un antgeno, un determinado eptopo puede estar representado varias veces siendo capaz de unir varias molculas del mismo anticuerpo. La fuerza total de la interaccin que considera todas las interacciones eptopo/partopo que tienen lugar entre antgenos y anticuerpos multivalentes (con varios sitios de unin), se denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades puesto que las distintas interacciones se estabilizan entre ellas. Estas interacciones multivalentes poseen una gran importancia fisiopatolgica cuando se encuentran Ag y Ac en solucin, como es el caso del plasma o tejidos, se forman agregados inmunocomplejos constituidos por muchas molculas. A concentraciones equivalentes de Ag y Ac estos inmunocomplejos sern de gran tamao y podrn quedar atrapados en los tejidos, iniciando una respuesta inflamatoria y dando lugar a las llamadas enfermedades por depsito de inmunocomplejos. Especificidad de la unin Ag-Ac La unin entre el Ag e Ig tiene una gran especificidad, de tal manera que una Ig se unir fundamentalmente y con mayor avidez, a un antgeno determinado. En algunos casos la inmunoglobulina podr unirse a antgenos con eptopos muy similares, aunque en este caso la afinidad de la unin es mucho menor (Tabla 3.7). La consecuencia final de la accin de las inmunoglobulinas es la de destruir al antgeno y/o neutralizar los efectos nocivos de los mismos. Para la consecucin de estos objetivos todas las inmunoglobulinas poseen, como ya se ha indicado, una caracterstica esencial y comn, que es la de unirse especficamente al antgeno. PROPIEDADES BIOLGICAS DE LAS INMUNOGLOBULINAS Tras la unin del antgeno y la inmunoglobulina, sta puede anular la accin del antgeno por neutralizacin, precipitacin o aglutinacin. As si la Ig es especfica para una toxina bacteriana, cuando se produce la unin ag-ig (toxina-antitoxina) quedan neutralizados los efectos txicos de la toxina. De ah que

clsicamente cuando no se conoca la estructura, se le denominase antitoxinas, precipitinas o aglutininas en funcin de la reaccin que se detectaba en cada caso. Los fenmenos de neutralizacin, precipitacin y aglutinacin de los antgenos no son suficientes por s solos para la destruccin y total eliminacin de stos. Para ello, adems de las inmunoglobulinas se requiere de la colaboracin de otros muchos elementos, tales como el sistema del complemento, macrfagos, polimorfonucleares o clulas NK. Podemos decir que las inmunoglobulinas, al detectar los antgenos y producirse la subsiguiente unin a ellos, actan como transductores de la informacin de la presencia de los mismos que seran destruidos por el complemento, macrfagos, los polimorfonucleares o clulas NK a los que dan especificidad. Opsonizacin. Cuando se produce la unin de antgeno e inmunoglobulina se producen una serie de cambios alostricos en el extremo Fc de la Ig que hacen que se una a receptores que se encuentran en la membrana de macrfagos y polimorfonucleares. A este fenmeno se le denomina opsonizacin (Figura 3.19). Al producirse esta unin, los macrfagos se activan, inicindose el fenmeno de fagocitosis y subsiguiente destruccin de los complejos antgeno anticuerpo por los procesos lticos intracelulares, propios de la accin de los enzimas contenidos en los lisosomas de estas clulas Estos receptores pueden ser de distinta naturaleza, conocindose en la actualidad tres: FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) y FcgRIII (CD16). Adems de en los macrfagos estos receptores se encuentran en otras clulas como plaquetas, linfocitos B y NK (Tabla 3.8) Cuando se produce la unin a clulas NK estas se activan y lisan a las clulas portadoras del antgeno por un mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Algunos de estos receptores e encuentran en los mastocitos y basfilos en cuyo caso a ellos se puede unir la IgE activndolos y produciendo su degranulacin con liberacin de histamina y otros sustancias vasoactivas que darn lugar a proceso de hipersensibilidad que pueden ser graves.

Lisis por complemento Cuando la inmunoglobulina que se une a un antgeno es de las clases IgM o IgG, en sus extremos Fc se producen ciertos cambios alostricos gracias a los cuales stas adquieren la propiedad de fijar y activar uno de los componentes del complemento. Las fracciones activas del complemento poseen diferentes acciones de gran importancia en la defensa del organismo, una de las cuales es la lisis celular. Este fenmeno se conoce como citotoxicidad mediada por el complemento, ser estudiada en el captulo dedicado al complemento. Inmunoglobulinas como receptor de linfocito B Adems de las funciones arriba indicadas, las inmunoglobulinas, especialmente la IgM tienen la capacidad de intervenir en el reconocimiento del antgeno por los linfocitos B cuando se encuentran ligadas a la

membrana celular de estas clulas como inmunoglobulinas de membrana constituyendo parte del receptor para el antgeno del linfocito B (BCR). Este proceso ser estudiado con detalle en el captulo dedicado a la activacin de linfocito B. RESPUESTA PRIMARIA Y SECUNDARIA Se entiende por respuesta primaria aquella que aparece como consecuencia de un primer contacto del sistema inmune con un determinado antgeno, mientras que por respuesta secundaria se entiende aquella respuesta que aparece frente a un determinado antgeno que ya ha tenido previamente contacto con el individuo. Las caractersticas de estas respuestas se esquematizan en la figura y tabla anexa. En resumen se puede decir que la respuesta primaria es de aparicin ms inmediata que la secundaria, pero que sta suele ser ms duradera y en muchos casos ms eficiente que la primaria. (Figura 3.20) (Tabla 3.7) PROPIEDADES Y FUNCIN DE CADA UNA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mencin a las propiedades y funcin de las inmunoglobulinas, a continuacin estudiaremos brevemente y por separado las caractersticas funcionales ms importantes de cada una de ellas. Inmunoglobulina G. Es la inmunoglobulina ms abundante y representa ms del 70 % de las Igs sricas totales. Las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes, as la IgG 1 es la subclase ms frecuente (ms del 60 %), seguida de la IgG 2 (aproximadamente un 18 %), mientras que IgG 3 e IgG 4 se encuentran en mucha menor proporcin. Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a clulas NK y a macrfagos (opsonizacin) y es capaz de atravesar activamente las membranas biolgicas, incluida la placenta. La propiedad de atravesar activamente las membranas biolgicas es de sumo inters por lo que, adems de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda la economa del organismo, lo hace tambin en el feto al atravesar la placenta desde la madre, merced a la existencia de receptores para la porcin Fc en el sincitiotrofoblasto. Como el feto slo sintetiza pequeas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno, sino incluso durante la lactancia, perodo en el cual todava no ha desarrollado la capacidad total de sntesis de inmunoglobulinas. Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el feto. De todos es sabido que cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el feto, se puede desarrollar el sndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la destruccin de glbulos rojos fetales, de nefastas consecuencias si no se acude a tiempo. Esto no se presentara si la IgG no pasase de la madre al feto. La IgG se sintetiza tardamente tras un primer contacto con el antgeno, sin embargo, tras un segundo contacto la mayora de las Igs formadas pertenecen a esta clase (Respuesta Secundaria) (Tabla 3.9) Inmunoglobulina M. Los anticuerpos del tipo IgM son los que ms rpidamente se forman en respuesta a un estmulo antignico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza tambin por poseer capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la respuesta inmune, sin embargo no atraviesa activamente las membranas biolgicas. Esta ltima propiedad hace que esta inmunoglobulina ejerza su accin normalmente en los espacios intravasculares. Representa del 5 al 10 % de las Igs sricas totales y

junto a la IgD es la ms frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como inmunoglobulina de membrana. Inmunoglobulina A. Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su capacidad de fijar complemento y de opsonizacin son muy dbiles, limitndose su efecto a neutrfilos y no a macrfagos. La propiedad ms importante de esta inmunoglobulina viene determinada por su capacidad de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la cual puede ser secretada por las mucosas y glndulas exocrinas, ejerciendo su accin ms importante en la superficie de mucosas y lquidos biolgicos (sobre todo IgA 2 ), tales como el liquido cefalorraqudeo, secrecin bronquial, lgrima, saliva, etc. Esto es importante porque as protegen precisamente los puntos ms vulnerables del organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriramos es de unos 300 m2, superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a travs del aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los mecanismos de defensa local entre los cuales la IgA tiene un papel esencial. Esta inmunoglobulina se encuentra tambin en la leche materna. Los niveles de todas las inmunoglobulinas, a excepcin de la IgG en recin nacidos son muy bajos, siendo por tanto de gran significacin el hecho de que la IgA se transfiera desde la madre al lactante a travs de la secrecin lctea. De ah que tengamos que insistir en que los lactantes se amamanten en el mayor grado posible directamente por las madres y no con leche de otros orgenes, a lo que actualmente existe excesiva tendencia. La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de todo el aparato digestivo. En ello parece que influyen las especiales caractersticas de pH gstrico del lactante que es menos cido que en el adulto y una especial resistencia de esta inmunoglobulina frente al mismo, por lo que no se destruye a su paso por el estmago. Inmunoglobulina D. La concentracin de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy recientes no se haba demostrado que esta inmunoglobulina posea capacidad de unirse a antgenos, por lo que se dudaba de que actuase con funcin de anticuerpo. Sin embargo, aunque actualmente se ha demostrado su accin de anticuerpo, no se conoce con precisin cules son sus funciones especficas, aunque se piensa que colabora de forma importante en la activacin de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de los mismos. Inmunoglobulina E. En muchos individuos alrgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes cantidades. El estmulo para su sntesis puede proceder de una gran variedad de antgenos, a los que en este caso se conocen como alrgenos. Estos alrgenos pueden penetrar en el organismo a travs de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del aparato digestivo, etc., as como por inyectables, como es el caso de la penicilina u otros medicamentos. La vida media de la IgE en sangre perifrica es de 24-48 horas. No tiene capacidad de atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de hipersensibilidad inmediata no pueden transferirse de manera pasiva de la madre al feto. Sin embargo, puede existir una predisposicin de tipo familiar a padecer enfermedades de naturaleza alrgica. Esta predisposicin parece estar relacionada con una tendencia a producir anticuerpos de tipo IgE en la respuesta secundaria frente a antgenos, en lugar de IgG que sera la respuesta normal en individuos no alrgicos. La IgE se encuentra en forma libre en sangre (Tabla 3.10) en donde se observa que los niveles cambian a lo largo de la edad. Tambin la IgE se encuentra en otros lquidos biolgicos as como unidos a basfilos y clulas cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta inmunoglobulina de unirse por su extremo Fc a receptores de

superficie presentes en dichas clulas. Estas clulas se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener abundantes grnulos citoplasmticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan una vez se activan.

Gentica de las Inmunoglobulinas

A partir de los estudios de Tonegawa en 1976, aparece un acumulo de conocimientos por los que se sabe que la sntesis de las cadenas ligeras y pesadas se regula por genes que se encuentran en cromosomas distintos (Figura 4.1). Esto fue puesto de manifiesto empleando tcnicas de digestin enzimtica del DNA de clulas B y posterior hibridacin con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la tcnica de Southern Blot (ver capitulo Mtodos). Mediante esta tcnica, se pudo observar que usando un cDNA marcado radiactivamente como sonda correspondiente a parte de una cadena pesada, ste se una a segmentos de DNA de lneas celulares de ratn que contenan el cromosoma 12. Por otra parte, empleando igualmente sondas de cDNA marcadas radioactivamente frente al DNA de cadenas ligeras de tipo k, stas se unen a clulas que contienen el cromosoma 6, mientras que las sondas para DNA de cadenas ligeras l lo hacen al cromosoma 16. Segmentos de genes y sntesis de inmunoglobulinas. Otra caracterstica importante de la formacin de inmunoglobulinas es que, en la sntesis de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas participan varios segmentos de genes de cuyas combinaciones resultan los diversos genes funcionales, responsables directos de la codificacin de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas. Esto explica las mltiples posibilidades de formacin del gran nmero de inmunoglobulinas partiendo de un limitado material gentico. La codificacin multignica de las inmunoglobulinas fue demostrada tambin por Tonegawa analizando DNA de clulas embrionarias de ratn y de un mieloma tambin de ratn. Tipos de gnicos segmentos

Estos segmentos codifican por separado la parte variable, la parte constante y las partes por las que ambas regiones se unen, esto es, las regiones bisagra. Los segmentos que codifican la parte variable son de dos tipos, segmentos V y segmentos D, responsables de la variabilidad y diversidad

de las inmunoglobulinas respectivamente. Le siguen los segmentos J o de unin, responsables de unir los fragmentos anteriores con los segmentos C que codifican para la parte constante. El nmero de segmentos responsables de la codificacin de la parte constante es muy limitado en relacin con el nmero de segmentos que codifican la parte variable de las inmunoglobulinas (Figura 4.2). En las clulas embrionarias los segmentos de una misma clase se encuentran separados del resto de tal forma que, por una parte, se encuentran los segmentos V, por otra los D, los J y los C. Estos segmentos estn contenidos en los exones, que son aquellos fragmentos de DNA que sern transcritos para dar lugar a la sntesis de protenas, y que se encuentran separados entre s por fragmentos de DNA no codificadores de protenas denominados intrones. En consecuencia se puede concluir que: La sntesis de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas est regulada por cromosomas distintos. En esta sntesis participan varios segmentos de genes que combinados dan lugar a los genes funcionales responsables de la codificacin de las cadenas de las inmunoglobulinas. REORDENAMIENTO DE LOS SEGMENTOS GNICOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS. Las observaciones anteriores se interpretaron como que a lo largo del proceso madurativo de los linfocitos B, se produce un reagrupamiento de segmentos de genes para la iniciacin de la sntesis de las cadenas ligeras y pesadas. A este fenmeno se denomina recombinacin intracromosmica. A medida que se produce el proceso madurativo de los linfocitos B, los segmentos V, D y J cambian de sitio en el cromosoma de tal manera que se colocan juntos. Posteriormente este conjunto V/D/J se reagrupa con el segmento C correspondiente quedando constituido en consecuencia un gen con toda la informacin de la cadena. Cuando el linfocito B es maduro posee ya reagrupados los genes correspondientes a sus cadenas ligeras y pesadas y slo podr producir un determinado tipo de anticuerpo. Reordenamiento de genes de cadenas ligeras En la sntesis de cadenas ligeras participan los segmentos V, J y C (es decir, no hay genes D para la cadena ligera). As pues, en el proceso de recombinacin de genes de cadenas ligeras se acopla un segmento V con un segmento J y el conjunto V/J se recombina con el segmento correspondiente a la parte constante C. El proceso de transcripcin se hace de tal manera que el RNA mensajero contiene informacin secuenciada V, J y C. En la (Figura 4.3) se esquematiza el proceso de recombinacin y trascripcin ocurridos en la lnea celular B conducente a la sntesis de cadenas k. Reordenamiento de genes de cadenas pesadas A su vez, un proceso similar, si bien esta vez en dos etapas, ocurre para la formacin de una cadena pesada. En este caso participan los segmentos V, D, J, y C. Primero se produce la recombinacin entre un segmento D y un segmento J. En la segunda fase, este conjunto D/J se recombina con un segmento V. El complejo V/D/J se puede por ltimo recombinar con cada uno de los segmentos que codifican las regiones constantes, segn la inmunoglobulina a formar. El proceso de recombinacin con los genes C tiene lugar a nivel de RNA. Vamos a encontrar en este momento el siguiente orden: el segmento lder;

un fragmento V/D/J reordenado y unido y a continuacin cada uno de los genes que codifican para las regiones constantes (C m ; C d ; C t , etc) separados entre s por los correspondientes intrones y a su vez precedidos por sus respectivos promotores. Se piensa que el gen C m es el situado en primer lugar en la secuencia de genes C, seguido de C d . En clulas B en reposo, el nico y largo transcrito primario de RNA va a contener la informacin del complejo V/D/J ms la correspondiente a los genes C m y C d . Mediante mecanismos de procesamiento del RNA que analizaremos posteriormente, se va a proceder a la escisin en el transcrito primario de la informacin correspondiente a C m o bien a C d . Se da lugar de esta manera a una inmunoglobulina de tipo IgM o IgD, y este mecanismo es adems el responsable de que en las clulas B en reposo se encuentre la expresin simultnea de ambas inmunoglobulinas. En la (Figura 4.4) se esquematiza el proceso de recombinacin y transcripcin ocurrido en la lnea celular B concerniente a la sntesis de cadenas pesadas en este caso del tipo m3. En este caso la recombinacin se ha producido entre VH3, D1, JH2, responsables de la parte variable de la cadena pesada que se ha recombinado con la parte constante del segmento del gen Cg3, que originar la cadena pesada correspondiente a la IgG3. En el caso de los genes V de las cadenas pesadas, al igual que hemos visto para las cadenas ligeras, junto a su segmento gnico se encuentran las estructuras lder y cerca de las mismas se sitan las secuencias promotoras. Segmentos lder y promotores Asociados a los segmentos V y situados en direccin 5' de los mismos, existen otros segmentos gnicos conocidos como segmentos lder (L). Estos segmentos gnicos codifican un pptido pequeo que servir de gua tanto para las cadenas ligeras como pesadas a su paso por el retculo endoplsmico pero que se separa de estas cadenas antes de que las mismas se unan entre s para formar la molcula completa de inmunoglobulina. Junto a estos segmentos gnicos se sitan otros conocidos como segmentos promotores y que son responsables de iniciar la seal del proceso de transcripcin del mRNA. La secuencia promotora comienza normalmente a una distancia de alrededor de 25 pares de bases antes del lugar de inicio de la transcripcin y contina alejndose del mismo en direccin 5', aunque su localizacin y longitud no son siempre las mismas. El lugar preciso de la iniciacin de la transcripcin es reconocido por la combinacin conservada de cuatro bases en las que se alternan timina y adenina, para formar lo que se conoce como caja "TATA", siendo continuada por el triplete de bases que codifica el aminocido metionina, que suele ser el primero codificado de manera casi constante en la mayora de los genes eucariticos. Dentro de las secuencias promotoras, vamos a encontrar los denominados motivos de secuencias, esto es, secuencias del DNA a las que se van a unir de manera especfica ciertas protenas nucleares que son las que van a regular su funcin. En definitiva, las protenas que van a unirse a estos motivos en el DNA van a regular, en ltima instancia, la transcripcin del DNA, por lo que tambin estos factores o

protenas de unin son conocidos como factores transcripcionales. En el caso de los genes de las inmunoglobulinas, encontramos en la regin promotora la presencia conservada de un octmero (secuencia de ocho bases) en la regin 5' no traducida de los genes V k , mientras que la secuencia complementaria pero invertida de este octmero es encontrada en los genes V H . La presencia de este octmero se ha revelado de gran importancia en el control gentico de la sntesis de inmunoglobulinas, en tanto que confieren a las regiones promotoras de los genes de las inmunoglobulinas contenidos en las clulas B no slo de especificidad tisular (esto es, slo las clulas B producen inmunoglobulinas), sino que adems es necesaria para la adecuada funcin del promotor. Esto parece alcanzarse mediante la unin especfica de varios factores transcripcionales, entre los que sealamos los conocidos como Oct-1, Oct-2 y Oct-3. De manera general, los promotores eucariticos pueden contener varias regiones de unin especficas para cada uno de los factores de transcripcin que regulan su funcin. Regulacin del proceso de reordenacin de las inmunoglobulinas. Este complejo proceso de recombinacin que hemos estudiado hasta ahora ha de tener, necesariamente, un mecanismo de regulacin muy estricto. Este mecanismo est constituido por, al menos, los genes RAG-1 y RAG-2 (genes activadores de la recombinacin 1 y 2). Genes RAG-1 y RAG-2 Estos genes fueron descubiertos en el laboratorio de David Baltimore en 1990. El descubrimiento previo de que cada uno de los genes V, D y J era precedido de una corta secuencia nica de DNA cuya funcin es la de servir de seal para los procesos de recombinacin, y que es conocida como secuencia de seal de recombinacin (SSR) permiti la identificacin de estos genes. Utilizando un sistema experimental de transfeccin en diversas clulas de vectores retrovirales conteniendo genes de resistencia al cido micofenlico como indicador de actividad, y que contenan los genes germinales de V k y J k junto con sus SSR, estos investigadores comprobaron que slo las lneas preB y pre-T tenan capacidad de recombinacin, lo que indicaba un mecanismo de regulacin comn a ambas estirpes. Este sistema experimental permiti la posterior identificacin de RAG-1, seguido del descubrimiento de un segundo gen (RAG-2) muy ligado al anterior tanto en su localizacin como en su estructura, y que actuaba de una manera sinrgica con RAG-1 facilitando los procesos de recombinacin. El papel in vivo que cada uno de estos genes juega en el desarrollo ontognico del sistema inmune es crtico. Para demostrarlo, se generaron mediante un proceso de ingeniera gentica, conocido como gene targeting, ratones que carecan especficamente de RAG-1 o de RAG-2. El anlisis de estos ratones demuestra que no se producen fenmenos de recombinacin en ninguno de los dos casos, y que como consecuencia, no se encuentran presentes en la periferia ni linfocitos B ni T maduros. Esto indica que los procesos de recombinacin gnica tanto de los genes del TCR y de las inmunoglobulinas van a estar sometidos a mecanismos comunes de regulacin. An ms importante, se ha encontrado recientemente un grupo de pacientes que tienen mutaciones en RAG-1 o RAG-2, dando como resultado la aparicin de una inmunodeficiencia combinada severa por bloqueo en los procesos de recombinacin tanto de linfocitos B como T.

Fenmenos de aproximacin de regiones

El proceso de reordenamiento gnico, adems de juntar los segmentos de genes que formarn la estructura de las futuras cadenas ligeras y pesadas, aproxima las regiones promotoras a las regiones amplificadoras (regiones enhancer), lo cual facilitar posteriormente la regulacin y control del inicio as como la adecuada transcripcin del RNA mensajero correspondiente. Las regiones amplificadoras se localizan normalmente a miles de pares de bases de distancia de las regiones promotoras, en tanto que las regiones amplificadoras pueden encontrarse, segn el gen, despus de los segmentos J y antes de los segmentos C.

Por tanto, este acercamiento implica la formacin de un bucle en la estructura espacial del DNA, de manera que la aproximacin entre ambas regiones no es lineal, sino espacial. Al igual que en el caso de los segmentos promotores, las regiones enhancer van a contener motivos de unin que van a interactuar con los factores transcripcionales. Uno de los primeros factores en ser descubierto y ms relevante funcionalmente es el factor de transcripcin NF-kB, que se une a la regin amplificadora del gen k. En la (Figura 4.5) se muestra un esquema del proceso por el cual se eliminan los segmentos de genes que no se van transcribir.

Unin de segmentos de genes Otro mecanismo importante en la regulacin del reordenamiento de los genes de las inmunoglobulinas es el que controla las uniones entre los genes V, D y J. Es decir, cuales son las seales que hacen que un gen D identifique, dentro del

cromosoma, la secuencia de un gen J con el que puede unirse, y, a su vez, el gen V identifique la secuencia del complejo DJ ya formado. Los reconocimientos y uniones de unos genes con otros estn controlados por combinaciones de secuencias de DNA que se encuentran conservadas y son nicas de los genes de las inmunoglobulinas. Estas secuencias estn formadas por un heptmero palindrmico, un espaciador variable de 23 pares de bases y un nonmero palindrmico (Figura 4.6). Este motivo va a reconocer otro formado por un nonmero de secuencia igual pero invertida al anterior, continuado por un espaciador variable de 12 pares de bases y un heptmero cuya secuencia es, otra vez, igual pero invertida al heptmero anterior. La longitud conservada de los espaciadores no es casual, en tanto que se ha sugerido que 12 pares corresponden a una vuelta de la hlice de DNA, y 23 a dos. As, los segmentos que contienen un espaciador de 12 bases slo se pueden unir a otro de 23. Esto asegura, en el caso de las cadenas pesadas, que los genes se reordenen en el orden correcto. El mecanismo exacto por el que estas secuencias conservadas regulan la unin de los genes de las inmunoglobulinas no se conoce todava con exactitud. Los modelos actualmente considerados para explicar este fenmeno implican la formacin de un bucle en el DNA, lo que conlleva la aproximacin de las secuencias reguladoras entre s. Al ser los heptmeros y nonmeros de secuencia igual pero invertida, ello hace que al formarse el bucle cada uno de ellos se encuentre con su complementario, permitiendo de esta manera la unin del DNA. Se especula que las recombinasas (que pudieran ser codificadas por RAG-1 y/o RAG-2) tengan a estas estructuras como diana de su mecanismo de accin. Aunque, como ya hemos sealado, no podemos excluir que la actividad recombinasa a este nivel sea modulada por otros genes todava no descubiertos. Cambio de isotipo de las inmunoglobulinas. Cuando las clulas B reconocen al antgeno, una poblacin de las mismas secretarn IgM llevando a cabo la respuesta primaria, mientras que, en menor medida, otras clulas van a comenzar a producir IgG, IgA e IgE. Esto quiere decir que las clulas B tienen la propiedad de cambiar la subclase o isotipo de las inmunoglobulinas que producen Por tanto, en respuesta a un mismo antgeno se van a generar anticuerpos que van a mantener su parte variable, pero van a ser diferentes en los segmentos constantes que van a ensamblar. Se cree que el cambio de isotipo se produce por dos mecanismos. El primer mecanismo implica que las clulas B cambian su isotipo tiene lugar esta vez a nivel de DNA, as una clula que ha sido comprometida a producir anticuerpos de un determinado isotipo, va a sufrir una deleccin de todos los genes C a excepcin del correspondiente a la subclase que va a ser producida (Figura 4.7). El segundo mecanismo es conocido como splicing alternativo (Figura 4.8). Este proceso molecular genera polimorfismo proteico debido a la transcripcin alternativa de los exones Estos fenmenos pueden ser influenciados por ciertas citocinas. As por ejemplo, la IL-4 induce el cambio de isotipo de IgM a IgG1 o bien a IgE.

CAUSAS DE LA DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS. La diversidad de las inmunoglobulinas deriva de la variabilidad de las cadenas ligeras y pesadas, por una parte, y por otra de las diversas posibilidades de unirse entre s estas cadenas. La variabilidad de cadenas, tanto L como H, que un mismo organismo es capaz de producir, se debe al alto nmero de segmentos V existentes, a las diversas regiones J y D tambin existentes y a la multiplicidad de formas de combinacin de V/J, en las cadenas ligeras, y V/J y J/D, en las cadenas pesadas. Es decir, el primer mecanismo de generacin de diversidad procede de las diferentes posibilidades combinatorias de cada uno de los genes entre s. As, si consideramos que para la cadena pesada de las inmunoglobulinas del ratn existen unos 300 genes V H (aunque stos pueden llegar hasta 1000), 12 genes D H y 4 genes J H , las posibilidades de combinacin diferentes son como mnimo de 1.4x104 (300x12x4). A esto hay que aadir las provenientes de las cadenas ligeras. La cadena k tiene 300 genes V k y 4 J k , mientras que la l slo tiene 2 genes V l (aunque en humanos contiene muchos ms) y 3 J l . Las posibilidades combinatorias son por tanto de 1.2x103 en el primer caso y de 6 en el segundo. Al necesitarse la unin de cadenas pesada y ligera, las posibilidades combinatorias son las resultantes de multiplicar cada una de ellas. Un segundo mecanismo generador de diversidad se debe a la imprecisin de las uniones de los segmentos V, D y J debido posiblemente a desequilibrios en la unin entre los intrones y exones correspondientes, y que se traduce en un pequeo cambio en la estructura primaria de la cadena peptdica. Al parecer este mecanismo desempea un importante papel en la maduracin de la afinidad de los anticuerpos, de tal manera que a medida que progresa la respuesta frente a un antgeno, los anticuerpos formados presentan cada vez mayor grado de afinidad por los eptopos del antgeno. Este mecanismo multiplica por, al menos, nueve las posibilidades combinatorias de los genes de la cadena pesada y por tres las posibilidades de los genes de las cadenas ligeras, en tanto que por trmino medio se producen tres reordenamientos por cada unin. Adems, toda la diversidad generada por los dos mecanismos ya mencionados, puede verse amplificada por la aparicin de mutaciones puntuales en el gen responsable de una determinada cadena de inmunoglobulinas. La ocurrencia de hipermutaciones somticas como va de generacin de diversidad se ha demostrado al encontrarse cadenas de inmunoglobulinas que, obtenidas del mismo tipo de mieloma, posean secuencias de aminocidos ligeramente diferentes a pesar de estar codificadas por un mismo gen.

Estas mutaciones somticas son de gran importancia en los procesos de incremento de la afinidad del anticuerpo. Sabemos que conforme se produce en el tiempo la respuesta de inmunoglobulinas, esta no slo incrementa el nmero de molculas producidas, sino que igualmente lo hace la afinidad de las mismas. Tambin, hay que indicar que a la diversidad de las cadenas ligeras y pesadas en s mismo, hay que aadir la diversidad derivada de las diferentes formas de unin de las cadenas ligeras con las pesadas.
EXCLUSIN ALLICA EN LA SNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.

Normalmente cada clula productora de anticuerpos slo expresa un tipo de cadena pesada y otro de cadena ligera. Este fenmeno se produce a pesar de que los genes que codifican estas cadenas se encuentran presentes en los dos cromosomas, uno de origen paterno y otro de origen materno, en tanto que las clulas productoras de inmunoglobulinas son diploides. Es decir, a pesar de que existan dos copias para cada uno de los segmentos gnicos V, D, J y parte constante de las cadenas pesadas y ligeras, slo una es expresada. De no ser as se generara un serio problema en el individuo que generara anticuerpos por una misma clula con especificidades diferentes. Se piensa que este fenmeno, conocido como exclusin allica, se debe a que slo los genes de un cromosoma sufren los procesos de reagrupamiento antes indicados de manera que slo la informacin del cromosoma no reorganizado es abortada y no se expresa. Esto implica que una vez que se ha producido una unin productiva V/D/J, los procesos de recombinacin son bruscamente detenidos en el otro cromosoma, de manera que no se puede dar lugar a un segundo anticuerpo maduro. El mecanismo exacto por el que se produce la exclusin allica no est completamente definido. No obstante, se piensa que una vez producido un reordenamiento efectivo de los genes de las inmunoglobulinas, la protena madura va a enviar una seal negativa de manera que la clula no produzca nuevos reordenamientos. As, la presencia de un reordenamiento completo de la cadena pesada va suponer el envo de una seal que inhiba nuevos reordenamientos de otras cadenas pesadas, por un lado, y por el otro va a hacer que se inicien los reordenamientos correspondientes a las cadenas ligeras, comenzando por las cadenas k. Si no se produjeran reordenamientos productivos de k, entonces se permitira el reordenamiento de l. El ensamblaje final de las cadenas pesadas y ligeras impedira nuevos reordenamientos, como ya hemos discutido, mientras que si no se consiguieran reordenamientos productivos en ninguno de los dos alelos de k y l, entonces la clula B entrara en un fenmeno de muerte celular programada, cesando su maduracin y siendo posteriormente eliminada. El proceso de exclusin allica tiene como fin asegurar que cada una de las clulas B produce un nico tipo de anticuerpo, a fin de evitar el reconocimiento de ms de un eptopo mediante la produccin de anticuerpos multireactivos.
FASES FINALES DE LA SNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.

El RNA mensajero correspondiente al pptido a sintetizar se forma mediante la transcripcin de los segmentos V, D, J y C ya reagrupados, de manera que la informacin de estas regiones se transcribe en un solo mRNA al que se aade la cola de poliadenilacin (poli-A). Tambin se transcribe el segmento L (Figura 4.9).Las partes del RNAm correspondientes a los segmentos intrnicos es eliminada. Esta eliminacin implica los procesos de corte del RNAm y posterior unin de los extremos exnicos restantes. Despus, el RNAm abandonar el ncleo para

alcanzar los ribosomas en donde se producir la sntesis de los pptidos mediante el proceso de traduccin. En el proceso de traduccin en el ribosoma se sintetizan los pptidos. Una vez formados los pptidos de una Ig se produce la glicosilacin de los mismos en el propio retculo endoplsmico, as como su ensamblaje para la formacin de la Ig completa, antes de ser secretada por la clula. El proceso de ensamblaje parece desarrollarse en las siguientes fases: H+H H2+LH2L+LH2L2. En el caso de la IgM, parece que por el contrario se unen primero una cadena pesada con una ligera, unindose esta media molcula a su otra media independientemente formada. Una vez que se ha producido el ensamblaje de la inmunoglobulina, esta molcula tiene dos opciones funcionales. Una primera es la de permanecer en la membrana de las clulas B, convirtindose de esta forma en el receptor de las clulas B para el antgeno. La segunda opcin es la de ser secretada al medio, con la funcin de interaccionar directamente con el antgeno y conseguir su destruccin. La nica diferencia entre ambas es que las formas de Igs de membrana tienen en la regin carboxiterminal de la cadena pesada un fragmento aadido de 19 aminocidos. La decisin de optar entre una forma u otra es tomada a nivel de transcripcin del RNA, una vez ms mediante un proceso de splicing. En el caso que nos ocupa, el proceso conlleva la transcripcin adicional de dos exones (M1 y M2) situados en la regin 3' del gen C H , lo que a su vez da como resultado que se genere el fragmento de 19 aminocidos que origina una regin transmembrana hidroflica continuada por una muy corta regin intracitoplasmtica. Si esto ocurre as, se origina el anclaje de la molcula a la superficie celular, dando por tanto lugar a una inmunoglobulina de superficie, mientras que si estos dos exones no son transcritos, la hidrofobicidad conferida a la inmunoglobulina hace que la molcula no pueda anclarse a la superficie y sea secretada. ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS POR HIBRIDOMAS

Cuando se realiza una inmunizacin con el objeto de producir anticuerpos frente a un antgeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen funcin de anticuerpo frente a los diferentes eptopos del antgeno. Esta produccin de inmunoglobulinas es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se activan y diferencian para la produccin de anticuerpos (Figura 4.10). Este fenmeno es de gran utilidad biolgica por cuanto ofrecen una amplia barrera de proteccin del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los antisueros as obtenidos, aunque se han utilizado ampliamente y han sido de gran inters en el conocimiento de la biologa y la bioqumica de las inmunoglobulinas (inmunoprecipitaciones e inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificacin de sustancias u otros fines anlogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que poseen. Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en 1975 (Figura 4.11) consiguieron la produccin de anticuerpos monoespecficos, conocidos como anticuerpos monoclonales (AcMo).

Con ello se abri un amplio campo en la Inmunologa y la Biologa Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo eptopo del antgeno y son entre si homogneos. Fundamentos de la produccin de anticuerpos monoclonales. El mtodo seguido para la produccin de estos anticuerpos consiste en la unin (fusin) de una clula B productora de anticuerpos , con una clula de gran capacidad de crecimiento (clulas de mieloma) con lo cual se forma un hbrido (hibridoma) que posee la informacin gentica necesaria para la sntesis del anticuerpo deseado, que le es aportada por la clula B, y una activa capacidad de sntesis proteica al tiempo que puede multiplicarse tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas ltimas que son aportadas por la clula mielomatosa (Figura 4.12). De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los anticuerpos as producidos homogneos, ofrecen patrones de reaccin de gran especificidad con los antgenos utilizados en la inmunizacin. Kholer y Milstein para la puesta a punto de esta tcnica escogieron eritrocitos de oveja como inmungenos, ya que el anticuerpo contra tales clulas se detectaba fcilmente mediante la tcnica de placas hemolticas de Jerne. Esta tcnica se basa en la deteccin de la formacin de anticuerpos frente a glbulos rojos de carnero, comprobando la capacidad ltica de los glbulos frente al complemento. As, mezclando clulas de mieloma de ratn con clulas de bazo procedentes de ratones inmunizados con glbulos rojos de carnero en presencia de un agente promotor de la fusin celular, identificaron con xito las clulas hbridas en un medio selectivo y observaron que segregaban inmunoglobulinas de ambos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos contra los eritrocitos. Haban logrado por tanto, aislar clones que segregaban una sola especie molecular de anticuerpo y que, adems, podan mantenerse en cultivo. Por primera vez se haban desarrollado cultivos continuos de clulas hbridas que segregaban un anticuerpo monoclonal de especificidad predefinida. Una vez seleccionado el hibridoma adecuado, ste puede conservarse largo tiempo congelado. En cualquier momento el clon puede hacerse crecer para la produccin de anticuerpos por inyeccin a ratones o siembra en cultivo. Generalmente el clon se inyecta intraperitonealmente generndose ascitis extraordinariamente ricas en anticuerpos, de donde son fcilmente purificables. Cuando el clon se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta a partir del sobrenadante del cultivo.

Tecnologa de la obtencin de AcMo. Generalmente se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antgeno frente al cual se desea obtener el anticuerpo. El protocolo de inmunizacin suele ajustarse a tres dosis del material antignico que se administran intraperitonealmente, con intervalos de unas dos semanas. Aproximadamente a los veinte das de la primera dosis, se comprueba la presencia de anticuerpos dirigidos frente al antgeno en el suero del ratn. Comprobada la presencia de anticuerpos se procede al aislamiento de las clulas B productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad. Las clulas as obtenidas sern utilizadas para su fusin con clulas mielomatosas, generalmente del tipo NSI. La lnea mielomatosa NSI procede de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que ha perdido la capacidad de secretar inmunoglobulinas, por lo que no interferir en la produccin de anticuerpos con los hibridomas que se obtengan. Mientras los linfocitos B, sensibilizados frente al antgeno correspondiente aportan al hbrido los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas, la lnea mielomatosa dota al hbrido de la capacidad de crecimiento ilimitado propia de las clulas tumorales y, por tanto, de la posibilidad de desarrollarse tanto in vitro como in vivo. Esta lnea mielomatosa se ha hecho resistente a la 8- azaguanina porque carece de la enzima HGPRT (hipoxantin-guanidin-fosforibosil-transferasa). La sntesis de su DNA la tiene que realizar a travs de la va de novo que obtiene nucletidos a partir de aminocidos y azcares. La aminopterina bloquea la sntesis de novo de nucletidos, por lo que las clulas de la lnea NSI no sobrevivirn en presencia de este frmaco. Esta caracterstica permitir eliminar las clulas NSI que no se han podido fusionar en el medio rico en aminopterina. Las clulas NSI no fusionadas morirn, mientras que los hbridos podrn seguir creciendo porque poseen la enzima HGPRT, aportada por los esplenocitos. La fusin celular entre los esplenocitos del ratn inmunizado y la lnea mielomatosa NSI se realiza en el medio de cultivo adecuado que contiene, adems de los nutrientes necesarios para un cultivo celular, polietilen glicol (PEG) que es un detergente capaz de disolver parte de la membrana celular permitiendo as la formacin de clulas que contienen dos ncleos (fusin celular).Posteriormente se procede a la seleccin de los hbridos que se inicia a partir de las 24 horas despus de la fusin. Para ello se aade medio de cultivo con HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas en donde se encontraban las clulas en cultivo. Hacia la tercera semana, se retira la aminopterina de los cultivos aadindose medio HT (hipoxantina-timidina) y, por ltimo, durante la cuarta semana las clulas se mantienen slo en medio de cultivo. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los hbridos para determinar si producen anticuerpos. Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden y si siguen siendo positivos se clonan cuando se estabilizan en cultivo. La clonacin tiene como objetivo aislar el hibridoma productor del anticuerpo deseado y que todas las clulas que lo constituyen procedan de la misma clula progenitora, dado que los hibridomas productores de anticuerpos se encuentran mezclados en cultivo con otros hibridomas que, o bien no son productores o sintetizan anticuerpos que no interesan. Utilidad de los anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biolgico homogneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas. El uso ms generalizado de los AcMo se centra: En la caracterizacin y cuantificacin de sustancias de inters biolgico que se

encuentran en cantidades muy pequeas, tales como hormonas, enzimas, interferones, etc (Tabla 4.1).

En la identificacin de antgenos presentes en las membranas celulares, tales como las molculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no solamente la cuantificacin de subpoblaciones celulares, sino tambin su fraccionamiento y aislamiento. En este sentido cabe destacar el empleo de equipos conocidos como clasificadores de clulas activados por fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter)

En trasplantes de rganos y enfermedades autoinmunes en donde los AcMo dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente en casos de amenaza de rechazo agudo.

En oncologa para la localizacin de clulas tumorales y/o su destruccin. Para ello los anticuerpos especficos frente a antgenos tumorales tales como el antgeno carcinoembrionario pueden ser marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In111 o Tc99, y as localizar su situacin en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son administrados a individuos afectos de tumores. Tambin los AcMo pueden ser utilizados en la destruccin de clulas tumorales en oncologa, para lo cual los anticuerpos son marcados con drogas citostticas y citotxicas. En esta panormica general de la utilizacin de los anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a una impresionante dispersin hacia otros muchos campos, lo cual permite vislumbrar esperanzadores horizontes a partir de una tcnica que en principio surgi simplemente de la pretensin de desvelar la organizacin y expresin gentica de las inmunoglobulinas, lo que acabo constituyendo un verdadero hito en la historia de la medicina y las ciencias biolgicas. As pues, paulatinamente, los anticuerpos monoclonales van sustituyendo a los antisueros convencionales en base a las ventajas que su uso conlleva y en tanto que pueden producirse industrialmente. Se expone un esquema del procedimiento seguido para la produccin de AcMo para su posterior utilizacin tanto en el laboratorio como en la clnica como medio teraputico y diagnostico (Figura 4.13). Sin embargo, sera deseable que, para su aplicacin teraputica, los anticuerpos procedieran de linfocitos humanos y no de ratn o rata. Contrariamente a lo que se esperaba en un comienzo, la utilizacin de linfocitos humanos ha resultado difcil, en tanto que los intentos de inmortalizar hibridomas humanos mediante su fusin con clulas mielmicas de ratn o rata, han sido, hasta la fecha, decepcionantes. El problema reside en que, cuando se fusionan clulas humanas con clulas animales, hay una rpida prdida preferencial de los cromosomas humanos en las clulas hbridas interespecies resultantes. En la actualidad se comienza a producir AcMo humanos empleando linfocitos B a los que se transforma en tumorales mediante su infeccin con el virus de Epstein Barr, obtenindose as linfocitos B productores

de AcMo que pueden ser clonados y, por consiguiente, anticuerpos monoclonales homogneos en su composicin y especificidad. AcMo quimricos humanizados. Como se ha comentado con anterioridad, uno de los problemas del uso de AcMo en medicina es que al ser en su mayora de origen murino, cuando son administrados a individuos, stos producen anticuerpos frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden presentar problemas de tipo alrgico cuando se usan reiteradamente. Para evitar este problema se estn ya obteniendo mediante tcnicas de ingeniera gentica anticuerpos humanizados de tipo quimrico. Estos anticuerpos se preparan mediante la creacin de una molcula hbrida en la que se mantienen las partes del anticuerpo monoclonal de ratn que le confieren la especificidad (regiones V, D y J), y sustituir la regin constante del anticuerpo de ratn por una regin igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana. Para ello, es necesario disponer previamente del cDNA que codifica la inmunoglobulina de ratn de nuestro inters. Las regiones del DNA de ratn que contienen la especificidad del anticuerpo han de ser unidos a otro cDNA de humano que codifica para la regin constante de una inmunoglobulina del mismo isotipo. Una vez que se han ligado las diferentes regiones de DNA de ratn y humano, esta construccin ha de ser subclonada en un vector apropiado y transfectada a una clula B a fin de que sta produzca el anticuerpo humanizado, y que este posea una adecuada glicosilacin. De acuerdo con esto, es posible eliminar de un anticuerpo de ratn (al menos parcialmente) sus regiones ms inmungenas, de manera que no sea reconocido como extrao por la persona que es inyectada el organismo humano (Figura 4.14).Un paso ms adelante en la humanizacin de los anticuerpos monoclonales producidos en ratn ha sido ya dado mediante la realizacin de los llamados anticuerpos hiperquimricos. En este caso se redisea la parte variable del anticuerpo, de manera que los aminocidos correspondientes a la secuencia del anticuerpo de ratn que codifican las partes hipervariables para el sitio de unin se introducen en el constructor que codificar la parte variable dentro del marco de la regin variable de un anticuerpo humano. Es decir, el anticuerpo humano va a servir nicamente como vehculo o vector de las regiones de determinantes complementarios (CDR) murinas, que son en realidad las responsables de la unin especfica del anticuerpo con el antgeno.

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2 cadenas pesadas idnticas 2 cadenas ligeras idnticas (N o O)

6.-El receptor para Ag del linfocito B

(Inmunoglobulinas: protenas y genes; BCR; Receptores para Fc; Funciones y propiedades de los Ab)
A. Corell UVA
Fab Fab Fc

Papain
F(ab)2

Pepsin

pFc

Dominio bsico tipo Inmunoglobulina

Indice de contenidos del Tema 6
El Receptor para antgeno del linfocito B
6.1 Las Inmunoglobulinas: * Estructura bsica proteica * Isotipos * Variabilidad * Organizacin gentica 6.2 Funcin de las Igs: * Caractersticas de los anticuerpos * Funciones * Salida de IgA a mucosas 6.3 Receptores para Inmunoglobulinas 6.4 El complejo BCR (Receptor de la clula B) * Estructura * Co-receptor * Transduccin de seales * Tipos de antgenos 6.5 Diferenciacin de linfocitos B

90-120 aa (2 lminas E por hlices D anti-paralelas) Muy estable Puente disulfuro intra-dominio (entre las 2 lminas E) Muy esparcido en el genoma: superfamilia Igs

Isotipos - determinados por el tipo de cadena pesada

IgG IgM IgD IgA IgE

La IgM se secreta en forma pentamrica. La IgA se secreta como monmero, pero puede dimerizarse en clulas endoteliales y ser secretada al exterior como dmero.

El isotipo viene determinado exclusivamente por la cadena pesada de la molcula de IgG. Hay 5 isotipos fundamentales o clases (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) Hay isotipos menores (o subclases): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgA1 e IgA2

J chain

Los individuos normales producen todos los isotipos. Los clones de clulas B pueden producir potencialmente todos los isotipos (cambiando los genes que codifican para las regiones constantes de las Igs que se van a secretar), manteniendo las regiones variables VDJ (cambio de isotipo).

En cada regin variable la protena se pliega: las regiones hipervariables spuntan al contacto con el antgeno (como dejos) HV CDR. Las regiones menos variables flanquean las anteriores (FR)

La variabilidad entre Igs se localiza bsicamente en las regiones hipervariables de los dominios variables(tanto de las cadenas pesadas como ligeras).

La regin constante de las cadenas pesadas pueden ser codificadas por una coleccin de diferentes genes (uno por clase o subclase)

Despus de unirse los genes para los fragmentos V, D y Jo para fromar la regin variable, los genes que codifican las regiones constantes permanecen separados en el DNA. Hay un gen constante para cada isotipo o subclase de cadena pesada. CP = IgM, CG = IgD, CJ = IgG, CH = IgE, CD = IgA

Las clulas B en reposo transcriben RNA que incluye ambos genes (CP y CG. Por procesamiento alternativo del RNA, las clulas pueden simultneamente separar RNAs para IgM e IgD, ambos con la misma especificidad de antgeno.

Secreccin de IgA secretora.

Cadena J

Pieza Secretora

Las Inmunoglobulinas existen en 2 Formas

Las Igs pueden estar en la superficie celular (forma unida a membrana (mIg) y sirven de seal a las clulas B sobre la presencia de un antgeno en el entorno. Las mIg siempre son monomricas. Las clulas B, cuando se activan, se diferencian en clulas plasmticas y secretan Igs solubles (sIg). Algunas sIg pueden existir en forma pentamrica (IgM). Algunas se pueden secretar como dmeros (IgA). Otras clulas B activadas se diferencian en clulas B memoria, mantiendo su Ig de superficie. Si se encluye el dominio transmembranal, la Ig permanece unida a la superficie celular. Si no, pasa a travs de la membrana y es secretada al exterior. As, el que una cadena pesada se sintetize para unirse a membrana o para secretarse, depende de que los genes MC estn incluidos o no en el RNA mensajero.

Las clulas B se estimulan por la unin de Ag a 2 o ms Igs de superficie para puentearlas.

Como el TCR, el BCR necesita de molculas accesorias para la adhesin, soporte y sealizacin.

La mayora de clulas B requieren cooperacin de clulas T CD4

Las clulas Pre-B desarrollan Igs de superficie

Cuando se detecta Ag sin clulas T, ste se tolera

La deteccin de Ag en presencia de cel. T induce activacin

Se produce entonces la diferenciacin en cel. Plasmticas.

En la mdula sea se da la diferenciacin: Stem- Pro-B- Pre-B -B madura

Los Ag T-Dependientes (TD) (99+% de Ag) requieren de interaccin T - B para la secrecin de Igs. Los Ag T-Independientes (TI) pueden estimular clulas B para secretar Igs en ausencia de cooperacin T. No inducen respuestas secundarias TI-1 estimulan nindose a receptores distintos de las Igs (como LPS) TI-2 activan por cross-linking las Igs de las clulas B por estructuras homogneas y repetitivas (como dextrano)

Las clulas B maduras circulan a rganos secundarios Las clulas B que encuentran Ag y clulas T migran a la corteza y forman folculos y centros germinalesdonde se diferencian a clulas plasmticas Las clulas plasmticas abandonan los rganos 2s. Las clulas plasmticas entran en la circulacin y pasana diferentes tejidos (includa la mdula sea)

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TEMA 6 EL RECEPTOR PARA ANTGENO DEL LINFOCITO B. La Respuesta Inmune especfica se basa en el reconocimiento especfico de los antgenos, tanto en la respuesta de linfocitos B, como en la de los T. Para este reconocimiento especfico hay unas protenas fundamentales en cada tipo de linfocito, y las Inmunoglobulinas son las molculas especficas para antgeno propias de las clulas B. Por tanto, el principal papel del linfocito B va a ser la sntesis de dichas molculas. Las Inmunoglobulinas son un grupo grande de protenas presentes en el suero y otros fluidos del organismo. Se pueden encontrar de 2 formas principales: forma soluble, entonces las denominamos anticuerpos, o ancladas en la membrana de los linfocitos B, formando parte del Receptor para antgeno (BcR) de dichas clulas. 6.1 Las inmunoglobulinas.

Estructura bsica proteca: La estructura bsica de una inmunoglobulina (Ig) consta de 4 cadenas polipeptdicas iguales dos a dos (diapositiva 6.3). Existen dos cadenas pesadas (H=heavy) y dos cadenas ligeras (L=light). El Pm de las cadenas H oscila entre 55 77 Kd y el Pm de las cadenas L es de 25 Kd. Las Igs son glicoprotenas. Las distintas cadenas se estabilizan con puentes disulfuro tanto entre dos cadenas pesadas como entre cada cadena pesada y otra ligera pero nunca entre dos cadenas ligeras. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras presentan una unidad estructural bsica de 110 / 120 aa cada una. Es el llamado dominio inmunoglobulina, que se repite 4-5 veces en las pesadas y 2 veces en las lgeras. Este dominio est constituido por dos lminas beta, cada una integrada por 3 4 hlices antiparalelas, estabilizadas por interacciones hidrofbicas y un puente disulfuro intracatenario entre dos cistenas, cada una perteneciente a una de las hlices de cada lmina. Todas las protenas que presentan este motivo en su estructura pertenecen a la denominada superfamilia de las inmunoglobulinas. Estos dominios tienen una nomenclatura (diapositiva 6.3 derecha): La porcin ms conservada de molcula a molcula, que es la zona carboxilo-terminal, se denomina regin constante (C) y en el nombre del dominio se hace constar si es de la cadena pesada o ligera con un subndice (H o L): as tenemos dominios CH y CL. En cada cadena, ya sea pesada o ligera, los extremos amino-terminales son los responsables del reconocimiento de antgeno, son los dominios variables (V); de nuevo, la pertenencia a cadenas pesadas o ligeras se hace constar con subndices: VH y VL. Por ltimo, slo en el caso de las pesadas (ya que las ligeras tienen un nico dominio constante), los dominios constantes se numeran: CH1, CH2, CH3. Entre el primer y segundo dominios constantes de la cadena pesada existe una zona bisagra de longitud variable (o no existente en algunos casos) que confiere flexibilidad a la Ig. Cuando se somete la molcula de Ig a la accin de proteasa vegetales (pepsina y papana) se liberan diferentes fragmentos proteicos (diapositiva 6.3 izquierda, abajo):
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Papana: se produce un corte por la zona bisagra . Obtenemos 3 fragmentos: uno con los 2-3 dominios constantes de cadenas pesadas o fragmento cristalizable (Fc) y 2 fragmentos que incluyen los dominios variables llamados Fab (antigen binding fragment) Pepsina: se dan distintos puntos de corte en las cadenas pesadas. Obtenemos un gran fragmento con los dos sitios de unin al antgeno unidos, denominado F(ab)2 y diferentes fragmentos de la porcin constante de las cadenas pesadas denominados pFc.

En las diapositivas 6.4 y 6.5 se aprecia el modelo molecular en 3-D de la estructura de la inmunoglobulina completa. Isotipos (clases) de Igs (diapositivas 6.6 y 6.7): Pequeas variaciones en la secuencia de aminocidos de las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas (que afectan al tamao, carga y solubilidad de la protena) definen diferentes subtipos de las cadenas. a) Se conocen 5 isotipos o versiones de la cadena pesada: , , , y ) Adems hay 2 isotipos de cadenas ligeras: y . Las Igs toman su nombre de la cadena pesada, independientemente del tipo de cadena ligera que lleven. As hay: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Las cadenas y son estructural y funcionalmente idnticas. Pero adems, pequeas variaciones dentro de las molculas de los isotipos IgG e IgA permiten diferenciar cuatro subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; con cadenas pesadas 1, 2, 3 y 4, respectivamente) y dos subclases de inmunoglobulinas IgA (IgA1 e IgA2; cadenas 1 y 2). Por lo tanto, en conjunto hay nueve isotipos de Igs, cada uno de los cuales puede contener cadenas ligeras . Las molculas Ig E y Ig M carecen de regin bisagra y tienen un cuarto dominio constante. El resto de las Ig tienen regin bisagra. Cada Ig tiene, adems, puntos de glicosilacin que se representan mediante hexgonos, la Ig menos glicosilada es la IgG. Para dos de los isotpos existen estructuras adicionales, debido a su carcter multimrico. As, la Ig M se presenta habitualmente en pentmeros (5 unidades estructurales bsicas), que en conjunto suman 10 cadenas pesadas y 10 ligeras. Las cinco Igs estn unidas por una cadena J (join=unin). La IgA se presenta habitualmente en dmeros unidos por una cadena J. Adems la IgA puede aparecer con otro pptido asociado (componente secretor) para formar IgA secretora (Igs) que tiene un papel importante en las mucosas. Variabilidad de las Inmunoglobulinas (diapositiva 6.8): Los dominios variables son los que reconocen especficamente el antgeno. En cada regin variable la protena se pliega: las regiones ms variables (denominadas hipervariables) son las que apuntan al contacto con el antgeno, como si fueran los dedos de las inmunoglobulinas. Estas regiones se llaman HV (de hipervariable) o tambin CDR (regiones determinantes de la complementariedad con el antgeno). Las
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regiones, menos variables, que flanquean a las anteriores se denominan regiones flanqueantes (FR). En los dominios variables (tanto de las cadenas pesadas, como de las ligeras) existen tres regiones hipervariables: CDR1, CDR2 y CDR3. Alguno de los aminocidos de estas regiones hipervariables pueden presentar un 100% de variabilidad de Ig a Ig. La zona de contacto ntimo con el antgeno (conjuncin de las porciones CDR de cadenas pesadas y ligeras) se denomina partopo. Organizacin gentica (diapositiva 6.9): Cada cadena de la Ig (pesada o ligera) est codificada por un conjunto de genes. El dominio variable est codificado por genes V, D y J (en las pesadas) slo V y J (en as ligeras). Los dominios constantes estn codificados por un nico gen (C). Hay un gen C para cada uno de los isotipos de cadena pesada: IgM C, existe slo un gen para esta cadena. IgD C, existe 1 gen para esta cadena. IgG C, existen 4 genes: 1, 2, 3 y 4. IgE C, existe 1 gen para esta cadena. IgA C, existen 2 genes: 1 y 2. 6.2 Funciones de las Inmunoglobulinas: Caractersticas de los anticuerpos: La estructura mnima de un antgeno que es reconocida por un anticuerpo (diapositiva 6.10) y es capaz de generar una respuesta inmune se denomina eptopo. Estos eptopos pueden resultar de la consecucin de aminocidos en la estructura primaria (eptopos lineales) o pueden resultar del plegamiento (estructura terciaria) de la protena (eptopos conformacionales). Las tres caractersticas fundamentales de un anticuerpo son la afinidad, la avidez y la especifidad (diapositiva 6.11). La especificidad para un antgeno determinado viene determinada por la secuencia de aminocidos de sus dominios variables. La afinidad determina la rapidez con la que el Ac se une al Ag y viene determinada por la fuerza de la unin. Esta fuerza de unin, y por tanto la afinidad depende de los enlaces entre la Ig y el Ag. Estos enlaces pueden ser de varios tipos (diapositiva 6.12): Puentes de hidrgeno, iones de H compartidos por tomos del Ag y Ac. Enlaces electroestticos, se dan cargas de polaridad opuesta entre Ac y Ag. Fuerzas de Van der Waals, existen nubes electrnicas polarizadas. Enlaces hidrfobos, grupos hidrofbicos del Ac y del Ag se unen excluyendo molculas de agua.

Dependiendo del tipo y nmero de enlaces habr mayor o menor afinidad de un anticuerpo por su antgeno. La avidez viene dada por el nmero de sitios de unin. Hay antgenos con secuencias repetitivas en su estructura. Estos antgenos se comportan de modo multivalente, y la fuerza de unin Ag-Ac es mayor que la simple suma de las afinidiades de cada uno de los sitios de unin del anticuerpo al antgeno. As, a mayor nmero de sitios de unin, mayor avidez. Por ejemplo la Ig M pentamrica suele ser la ms avida para un antgeno al presentar 10 sitios de unin.

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La especifidad, la avidez y la afinidad vienen determinadas por la regin Fab del anticuerpo. La funcin es determinada por el fragmento Fc. Funcin de los anticuerpos: La funcin bsica de los anticuerpos es unirse al antgeno. Consecuencia de esta unin Ac-Ag, se producirn diferentes funciones: I) Aglutinacin-Neutralizacin del antgeno. Al ser los anticuerpos bi-valentes (2 lugares de reconocimiento de antgeno), pueden producir la aglutinacin del mismo, para su mejor eliminacin. Adems, cuando se recubre toda la superficie del patgeno con molculas de anticuerpos, estamos hablando de neutralizacin del mismo. Existen toxinas que atacan a las terminaciones nerviosas, al unirse los anticuerpos a ellas neutralizan su efecto. II) Opsonizacin Fagocitosis. Pero este recubrimiento de la superficie, puede tener consecuencias posteriores. As, los macrfagos, que tienen receptores para la porcin cristalizable del anticuerpo (Fc) que se denominan FcR, pueden engullir los patgenos que han sido recubiertos por anticuerpo. En este caso, al recubrimiento se le reconoce con el nombre de opsonizacin. III) Inmovilizacin del patgeno. Si el anticuerpo se une a la parte mvil del patgeno (cilios, flagelos), va a producir una inmovilizacin del mismo, reduciendo su patogenicidad. IV) Activacin del complemento. Al unirse un Ac a un Ag se produce un cambio conformacional en la regin Fc del anticuerpo que induce la activacin del sistema del complemento. V) Expulsin. Cuando las anticuerpos son del tipo IgE, y los antgenos son de parsitos, la unin IgE-Ag promueve la liberacin de aminas vasoactivas que relajan la musculatura lisa y provocan diarrea en el intestino para expulsar al parsito. VI) Citolisis mediada por anticuerpos (ADDC). Otra funcin que viene mediada por receptores para la porcin Fc del anticuerpo es la llamada citolisis mediada por anticuerpos (ADCC). Las clulas efectoras son mayoritariamente los linfocitos NK, que al reconocer el anticuerpo en una superficie del patgeno, liberan sustancias citotxicas que atacan al antgeno. VII) Inmunidad en feto y neonato. En los primeros meses de vida las Igs maternas son el nico mecanismo de defensa especfica que tiene el recin nacido. Su sistema inmune no ha madurado an, y no tiene modo de fabricar sus inmunoglobulinas propias en primera instancia. Cada isotipo de anticuerpo desarrolla ms efectivamente alguna de estas funciones efectoras (se resumen para cada isotipo en la diapositiva 6.13 y 6.14). As, con una misma regin variable, diferentes regiones constantes van a llevar asociadas diferencias en la funcin efectora del anticuerpo. Slo por citar algunos ejemplos:
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IgG, A y M: activan el complemento y neutralizan antgenos. IgA es el anticuerpo por excelencia de la inmunidad mucosa. IgM es el Ac responsable de las respuesta primaria en tanto que IgG es responsable de la respuesta secundaria y de la inmunidad neonatal. La IgD no tiene funcin aparente, en sangre est en bajas concentraciones. IgG1 es la ms abundante en sangre. IgE es poco abundante, y es la especialista en la respuesta a parsitos. Salida de IgA a mucosas (diapositiva 6.15): La Inmunoglobulina A es el isotipo fundamental en las secreciones, especialmente en los epitelios de los tractos digestivo y respiratorio. Las clulas plasmticas (estado de diferenciacin final de linfocitos B) productoras de IgA se encuentran predominantemente en el tejido conectivo (lamina propia) que subyace inmediatamente por debajo de muchas superficies epiteliales. La IgA sintetizada en la lmina propia se secreta como IgA dimrica asociada a una cadena de unin J. Esta forma polimrica de IgA se une selectivamente a un receptor de poli-inmunoglobulina (poli-Ig-R) que est presente en las superficies vasolaterales de las clu8las epiteliales. Una vez que la IgA dimrica se ha unido a dicho receptor, el complejo se internaliza en la clula y se transporta por el citoplasma de la clula epitelial en vesculas de transporte, hasta la porcin apical de la clula. Este proceso se denomina transcitosis. Una vez en la zona apical de la clula epitelial el receptor de poli-Ig se fragmenta proteolticamente, liberando la porcin ms externa del receptor todava unida a la IgA dimrica. Este fragmento del receptor liberado junto a la IgA se denomina componente secretor, y parece que protege a la IgA dimrica de posibles degradaciones enzimticas. Los tejidos con mayor sntesis de IgA son el intestino, el epitelio respiratorio, la mama (en pocas de lactancia) y otras glndulas exocrinas como las salivares y lacrimales. 6.3 Receptores para Inmunoglobulinas: Ya hemos visto en el apartado anterior, que muchas de las funciones efectoras de las Inmunoglobulinas estn mediadas por su porcin constante (fragmento cristalizable =Fc). Para que esto sea as, el sistema Inmune ha desarrollado una serie de receptores capaces de reconocer la porcin Fc de los diferentes isotipos de Inmunoglobulinas, que se llaman de modo genrico Receptores para Fc (FcR) (diapositiva 6.16). Estos receptores se encuentran ampliamente expresados (diapositiva 6.17) en diferentes clulas del sistema inmune (leucocitos y plaquetas). Su nomenclatura va en funcin del isotipo de Inmunoglobulina que reconocen. As, el receptor para Fc de la IgG se denomina FcR, y el de la IgE FcR. Posteriormente, segn se fueron descubriendo diferentes tipos de receptor se les fue poniendo un nmero romano (I, II, III). Una caracterstica importante de estos receptores es que slo se unen a la Inmunoglobulina cuando esta, a su vez, se ha unido al antgeno. Slo en estas circunstancias la porcin constante de la Ig ha sufrido un cambio conformacional que la permite ser reconocida por el Receptor. Una excepcin a esta regla, la constituyen algunos receptores para IgE, en particular FcRI, que se expresa fundamentalmente en mastocitos. Es tan elevada la afinidad de estos receptores por la IgE, que es habitual que los mastocitos se encuentren cargados de IgE en su superficie, de modo que si esa IgE encuentra su antgeno especfico, las consecuencias del reconocimiento son inmediatas. En la diapositiva 6.18 se muestran detalles de la estructura de los diferentes receptores para Fc de algunos isotipos de Inmunoglobulinas. Obsrvese que todos (exceptuando el FcRII) tienen dominios tipo inmunoglobulina en su estructura, y pertenecen por lo tanto a la superfamilia de las Igs. Los receptores para las Igs poseen colas citoplasmticas implicadas en transduccin (envo) de sea al interior celular (a
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travs de motivos ITAM), o bien se asocian a otras protenas especializadas en esta funcin. La naturaleza de la respuesta iniciada por la unin de la molcula de anticuerpo depende del isotipo de inmunoglobulina reconocido y del tipo de clula que expresa el receptor. En cualquier caso, es necesario el entrecruzamiento de receptores para que se inicien los procesos de sealizacin (ver diapositiva 6.21 arriba izquierda). Las respuestas inducidas por los receptores para Igs son variadas: endocitosis (fagocitosis de los patgenos para su destruccin o para la presentacin de antgeno), exocitosis (secrecin de sustancias lticas para destruir las clulas infectadas, o secrecin de sustancias inflamatorias o de citocinas) 6.4 El Complejo BcR (Receptor de la clula B) Como comentbamos al principio del captulo, la Inmunoglobulina se presenta en 2 formas diferentes: en solucin (anticuerpo) o anclada en la membrana del linfocito B. En este ltimo caso, forma parte de un complejo de protenas que en su conjunto se denomina Receptor de la clula B (BcR). Estas dos formas alternativas de Ig, tambin se denominan sIg (soluble) y mIg (transmembranal). El que se expresen de un modo u otro depende del procesamiento del RNA mensajero de la cadena pesada (diapositiva 6.19) y se exprese o no el exn correspondiente a los aminocidos transmembranales de la protena. Cabe destacar, que las formas polimricas de Ig (pentmeros de IgM y dmeros de IgA) slo se van a expresar en su forma soluble. Todas las mIg van a ser, monomricas. Estructura del BcR (diapositiva 6.20): La parte variable del BcR, entre diferentes linfocitos B, la constituye la molcula de Ig completa (2 cadenas pesadas y 2 ligeras) que se inserta en la membrana a travs de las 2 cadenas pesadas. Pero adems, forman parte del BcR 2 heterodmeros iguales, compuestos de 2 cadenas, denominadas Ig e Ig. Ms recientemente, estas dos molculas se han denominado CD79 y CD79. La cadena es comn para todas la inmunoglobulinas de superficie, en tanto que la cadena vara segn el isotipo de Ig, presentando adems diferentes patrones de glicosilacin. Ambas cadenas, pertenecen, no obstante a la superfamilia de las Igs, por presentar dominios bsicos tipo Ig en su estructura. En el BcR, la Ig es la responsable del reconocimiento especfico del Ag, en tanto que las protenas CD79 median la posterior transduccin de la seal hacia el ncleo celular. Sin embargo, hay otras protenas implicadas en el proceso de transduccin de seales, constituyen el complejo correceptor y las veremos ms adelante. La mayor parte de los linfocitos B expresan BcR con IgM en superficie (muy a menudo, de modo simultneo expresan IgD). Estos linfocitos B IgM+IgD+, son linfocitos maduros que an no han sido estimulados por el Ag que reconocen. Una pequea proporcin de linfocitos B expresan slo BcR con alguno de los otros isotipos (G1, G2, G3, G4, A1, A2, E, D); ya han reconocido su antgeno especfico y se han especializado en la sntesis de un isotipo en concreto. Un tipo especial de linfocitos B, son aquellos que expresan CD5 en su membrana. Su Ig de superficie es siempre IgM (pero no IgD). Son minoritarios y su expresin parece restringida. Parecen ser menos evolucionados y ser capaces de reconocer muchos Ag diferentes (poli-especificos). Adems, a diferencia de la mayora de linfocitos B, estos linfocitos CD5 tienen capacidad de autorenovacin. Debido a estas caractersticas diferenciales, y a su posible funcin primaria en la respuesta inmune, a los linfocitos B CD5 se les denomina B1, mientras que a los convencionales se les denomina B2.
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El Correceptor del BcR: Como ya hemos explicado, el BcR, es la nica molcula capaz de reconocer especficamente el Ag, pero no es la nica que participa en la activacin del linfocito B. Hay una serie de molculas accesorias que ayudan al linfocito B a activarse, entre las que desteca el complejo correceptor. Este complejo se compone de 3 molculas asociadas de modo no covalente: CD19, CD21 y CD81 (diapositiva 6.21, imagen derecha).CD21 reconoce a la molcula CD23 de las clulas dendrticas foliculares, o alternativamente fragmentos del componente 3 del complemento (CD21 es tambin llamado CR2, o receptor de complemento 2). CD19 se expresa en todos los linfocitos B maduros y su activacin activa a cinasas intracitoplasmticas. La funcin de CD81 (TAPA-1) es hasta el momento desconocida. Adems del complejo correceptor, hay otras molculas accesorias importantes en la activacin del linfocito B: CD45 (cuya porcin intracelular tiene actividad fosfatasa), CD22, CD40, CD72 y los antgenos HLA de clase II, todas estas participando en el intercambio de seales entre linfocitos B y T, ya que sus ligandos ms probables se encuentran en los linfocitos T (protenas sializadas, CD40L, CD5 y TcR/CD4, respectivamente) Transduccin de seales al interior celular (diapositivas 6.21 y 6.22): Para que la respuesta humoral (y produccin de anticuerpos) se inicie, es necesario que los linfocitos B se activen. Para ello, tiene que haber contacto directo con el antgeno y entrecruzamiento de receptores (BcR). Como consecuencia de este entrecruzamiento, y de la activacin del correceptor y otras molculas accesorias, se concatenan una serie de procesos, que tienen como misin ltima mandar seales al ncleo de que hay que entrar en un proceso de activacin: a) Hay una primera ronda de fosforilaciones y defosforilaciones, realizadas por enzimas cinasas (Fyn, Lyn, Lck, Btk, Syk, PI3K) y fosfatasas (CD45). El resultado final de esta etapa es la activacin de la fosfolipasa C (PLC). b) La PLC hidroliza fosfolpidos de membrana, generando 2 segundos mensajeros fundamentales: Inositol trifosfato (IP3) y diacil-glicerol (DAG). c) El DAG activa a una cinasa nueva: la proten cinasa-C (PKC) d) El IP3 se une a canales de calcio, activndolos, tanto en la membrana plasmtica como en el retculo endoplsmico: el resultado final es el incremento del in calcio en el citoplasma celular. As se activan una serie de protenas dependientes de Ca: calcineurina. e) Se produce una segunda ronda de fosforilaciones- defosforilaciones, producto de la activacin cinasas (PKC, Raf, Ras, MAPK) y de fosfatasas (mediada por la calcineurina). El producto final es que determinados factores de transcripcin que estaban inactivos, pasan a su forma activa. f) Los factores de transcripcin activos se translocan al ncleo celular: lo que conduce finalmente a una modificacin en los perfiles de expresin de varios genes celulares que permitirn al linfocito B desarrollar sus funciones efectoras. Entre los genes que se activarn, hay genes comunes a otros tipos celulares, necesarios para la mitosis, y genes especficos de linfocitos B: Inmunoglobulinas, citocinas y receptores de citocinas. Tipos de antgenos: Para la puesta en marcha de una respuesta inmune humoral, en la mayor parte de los casos no es suficiente la nica participacin de los linfocitos B. Los linfocitos T tambin juegan un papel determinante. A las clulas T que ayudan a los linfocitos B en su
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activacin se les denomina clulas T cooperadoras, y proporcionan ayuda una vez reconocido el antgeno presentado por la propia clula B-mediante molculas de membrana que se unen a ligandos de los linfocitos B o mediante la liberacin al medio de factores solubles (citocinas), que se unen a receptores en los linfocitos B. A este tipo de antgenos se les denomina T-dependientes (diapositiva 6.23). Pero no todos los Ag inducen respuestas B de tipo T-dependiente, hay algunos que pueden desencadenar dicha respuesta en ausencia de clulas T: son los denominados Ag T-independientes. 6.5 Diferenciacin de linfocitos B: Los linfocitos B son generados por el organismo a lo largo de la vida, aunque cada vez en cantidades menores. Esta generacin se inicia en el hgado fetal (a partir de clulas stem) y luego es continuada por la mdula sea, que es tras el nacimiento (y para toda la vida) el principal centro productor de clulas B. Las clulas stem de la mdula sea no tienen Ig en superficie, no han reordenados sus genes an, y para diferenciarse requieren de la participacin de clulas del estroma de la mdula sea (adiposctos, fibroblastos, reticulocitos, endoteliocitos, etc...) que participan en el proceso a 2 niveles: mediante contactos directos y mediante factores solubles (diapositivas 6.24 y 6.25). El proceso de diferenciacin se inicia por la interaccin del CD44 de la clula stem con cido hialurnico de clulas del estroma. Esta interaccin parece favorecer contactos entre el c-kit de la clula precursora con SCF (stem cell factor) de la clula del estroma o soluble. As, la clula pro-B temprana se diferencia en clula pro-B tarda. La interaccin c-kit-SCF favorece la proliferacin de estos precursores. Posteriormente, en las clulas pro-B tardas y clulas pre-B es necesaria la participacin de factores solubles de activacin y en concreto de la IL-7. Esta citosina, producida por las clulas del estroma, induce proliferacin de los precursores. En las ltimas etapas de diferenciacin, los contactos entre los precursores B (clulas pre-B y B inmaduras) con las clulas estromales parecen estar mediados por molculas de adhesin. Las Igs de membrana no se expresan hasta la fase de clulas B inmaduras. En las clulas pre-B es posible encontrar la cadena pesada en superficie, formando parte de un pre-BcR, pero nunca inmunoglobulinas completas. La clula B inmadura ya expresa IgM en superficie, pero no es hasta la ltima etapa de clula B madura, que se expresa la IgD. Las clulas B inmaduras (con IgM sin IgD) son eliminadas o inactivadas si interaccionan con antgenos abundantes en el entorno con objeto de que respeten ms tarde las molculas propias. Este proceso se conoce como seleccin negativa de clulas B, y tambin juegan un papel importante los linfocitos T. As, solo salen de la mdula sea, a la sangre perifrica, las clulas B que no reconocen ningn antgeno propio durante la seleccin. Como la mayora de los antgenos con los que estn en contacto en la mdula sea son de origen propio, la posibilidad de encontrar clulas B autorreactivas en sangre perifrica es muy remota. En el camino de la maduracin, van encendiendo y apagando la expresin de ciertas protenas de superficie (con diferente CD), que permiten determinar en que estado de diferenciacin se encuentran las clulas.

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TEMA 7 SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.

7.1 Estructura de los genes para las cadenas pesadas y ligeras de Inmunoglobulinas: diversidad potencial. La eficacia del sistema inmune depende de su mayor o menor capacidad de reconocer antgenos de forma especfica. Tanto las clulas B como las clulas T se encuentran implicadas en este reconocimiento, y aunque lo hacen de forma diferente, ambas poblaciones celulares pueden interaccionar con un gran nmero de antgenos distintos. El nmero total de receptores (tanto del linfocito T como del linfocito B) se denomina repertorio. Y se ha estimado que el repertorio de anticuerpos necesarios asciende a 109 molculas diferentes. La totalidad del genoma humano se empieza, apenas, a conocer, pero el nmero de genes no exceder en cualquier caso de los 50.000. Por lo tanto no tenemos un gen para cada posible anticuerpo, porque no nos caben 109 genes para anticuerpos en un total de 50.000. Para resolver esta aparente imposibilidad, los genes para los receptores especficos del sistema inmune (BcR y TcR) se han organizado en la evolucin de un modo especial. La organizacin de los genes que codifican las inmunoglobulinas (diapositivas 7.3 y 7.4) es caracterstica y asegura la generacin de la diversidad de anticerupos necesaria para responder a casi cualquier antgeno. La mayor parte de las protenas del organismo son codificadas por genes nicos. Esto no es as en el caso de las inmunoglobulinas, ya que para codificar los dominios variables, y a veces, los constantes de sus protenas, el genoma contiene mltiples versiones, ligeramente distintas, que se combinan entre s al azar. Genes para las cadenas pesadas: Todos los genes de las cadenas pesadas se encuentran localizados en el cromosoma 14. Los dominios constantes de las cadenas pesadas (CH) son codificados por un nico gen para cada isotipo. De modo que existen 9 genes C (constante) que no contribuyen a la diversidad ya que estos dominios slo modifican el isotipo y no la especifidad para Ag. El orden de estos genes C en el cromosoma 14 es siempre el mismo (diapositiva 7.4) y se nombran igual que el isotipo (o subclase) para el que codifican pero con la correspondiente legra griega (, , , ). En cambio, para codificar el dominio variable de la cadena pesada (VH), los genes se organizan en 3 grupos: V, D y J. Los genes V (variable) en un nmero de 50, a continuacin 30 genes D (diversidad) y 6 genes J (unin). Cada combinacin particular V-D-J codificar para un dominio variable diferente. La diversidad potencial de la cadena pesada de una inmunoglobulina es pues de: (50) x (30) x (6)= 9000 cadenas pesadas distintas Genes para las cadenas ligeras: Los genes de la cadena ligera se localizan en el cromosoma 2, y los de en el cromosoma 22. La disposicin de fragmentos en dichos cromosomas es siempre la misma (diapositiva 7.4). En el caso de : 40 genes V y 5 genes J que al unirse al azar (V-J) codifican para los distintos dominios variables (VL), y a continuacin un nico gen C. Para la cadena : 30 genes V, 3 genes J 3 genes C. La diversidad potencial de las cadenas ligeras es de 200 y 270 respectivamente (lo que suma 470). De este modo la diversidad potencial de anticuerpos = 9000 x ( 270 + 200) = 4 . 106 Igs posibles. Esta cantidad potencial queda lejos del repertorio necesario, como hemos dicho al inicio.
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7.2

Reordenamiento de los genes de Inmunoglobulinas: pesadas y ligeras:

Los segmentos gnicos que codifican las regiones variables de las inmunoglobulinas se encuentran muy separados en el genoma en todas las clulas del organismo, excepto en las del linaje B. La aproximacin de estos genes se produce en la mdula sea durante el proceso de maduracin de los linfocitos B y tiene lugar por un proceso de recombinacin entre los diferentes segmentos gnicos denominado recombinacin somtica. En el caso de la cadena ligera (diapositiva 7.5) uno de los fragmentos V se yuxtapone a un fragmento J por recombinacin somtica, eliminndose un gran segmento de DNA. Este fenmeno de reordenamiento de genes ocurre durante la maduracin del linfocito B en la mdula sea. Esta recombinacin posibilita la sntesis de un RNA mensajero con los segmentos V, J y C necesarios, que se alinearn por excisin intrnica (se eliminan grandes segmentos de RNA en el procesamiento). As el dominio variable de la cadena ligera est codificado por los segmentos V-J yuxtapuestos, y el dominio constante est codificado por el segmento C. En las cadenas pesadas (diapositivas 7.6, 7.9, 7.12 y 7.13), y tambin en los precursores de linfocitos B, una de las versiones del fragmento D se yuxtapone a una versin del fragmento J en un primer paso de recombinacin. Despus una versin de V se recluta para yuxtaponerse a las anteriores. Em ambas recombinaciones, hay prdidas de grandes fragmentos de DNA. Ahora ser posible la transcripcin de un RNAm con los segmentos V-D-J-C necesarios. Estos segmentos se alinearn definitivamente durante el procesamiento (ayuste) del RNA mensajero. La inmunoglobulina resultante tendr el dominio variable codificado por los fragmentos V-D-J, y los dominios constantes codificados por el fragmento C. El que dicha inmunoglobulina sea de membrana o soluble depender de que en el procesamiento del RNA se incluyan o no los exones que codifican para la porcin transmembranal y citoplasmtica de la protena. Y la inmunoglobulina ser IgM o IgD tambin dependiendo de dicho procesamiento del RNA. El resto de isotipos no se pueden producir inicialmente, ya que requieren cambios adicionales en el DNA. De modo que las inmunoglobulinas que puede producir un linfocito B maduro inicialmente son: -mIgM, sIgM, mIgD, sIgD (donde s y m indican soluble o membrana). No se conocen en detalle los mecanismos moleculares de recombinacin somtica, pero se han encontrado secuencias muy repetitivas antes y despus de cada fragmento gnico y que parecen actuar como seales de recombinacin. Estas seales (diapositiva 7.7) constan de una secuencia de 7 pares de bases (heptmero) y otra de 9 (nonmero) separadas por una regin espaciadora de 12 o 23 bases. Estas seales de recombinacin son reconocidas por enzimas especializadas (recombinasas) RAG1 y RAG2, que al aproximarse entre s, son responsables de la aproximacin al azar entre los fragmentos formando un bucle en el ADN, que se estabiliza por los palndromos entre los heptmeros y nonmeros sealizadores. A continuacin, las recombinasas, resuelven el bucle cortando, ligando los 2 fragmentos y esciendiendo los flecos (en forma de ADN circular). En este corte y empalme de los fragmentos, que tiene imprecisiones se arrastran nucletidos al azar (son los llamados nucletidos P, de palindrmicos). Debido a que el sistema de reordenamiento tiene muchas imprecisiones, tanto en los linfocitos B como en los T pueden ocurrir errores al reordenar los fragmentos produciendose protenas abortivas (codn STOP o cambio en la pauta de lectura) al
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azar que no valen para nada. Son los reordenamientos no productivos (diapositiva 7.8). Por ello, tanto en el procesamiento de cadenas pesadas como ligeras pueden rescatarse reordenamientos iniciales no productivos y volver a reordenar los cromosomas correspondientes al azar hasta obtener reordenamientos productivos. Una vez conseguido un reordenamiento productivo existe una seal que paraliza el proceso. 7.3 Mecanismos de amplificacin del repertorio: Diversidad de unin y Mutacin somtica (diapositiva 7.10) Hemos dicho que con las combinaciones de todas las cadenas ligeras y pesadas se pueden obtener 4 millones de Ac distintos. Se sabe que el organismo puede producir hasta 109 clases de Ac. Por tanto se hacen necesarios una serie de mecanismos que permitan aumentar ms an la diversidad de Ac en el organismo. a) Diversidad de las uniones. Estos mecanismos actan en la mdula sea. Se produce porque la recombinacin somtica VDJ (en cadenas pesadas) VJ (en cadenas ligeras) no es un mecanismo de alta precisin. De modo que el corte y empalme entre los diferentes fragmentos no es siempre igual, aunque participen los mismos fragmentos. Los nucletidos arrastrados al azar en los procesos de recombinacin somtica reciben el nombre de nucletidos P (y son responsables de un gran incremento en la variabilidad, pero tambin de posibles cambios en la pauta de lectura que daran lugar a protenas abortivas). Los nucletidos P se aaden tanto en las cadenas ligeras como en las pesadas. Adems el punto de corte en el DNA de los 2 fragmentos puede variar, producindose codones alternativos que codificaran para diferentes aminocidos (diapositiva 7.10 inferior izquierda). Pero adems, y slo en cadenas pesadas, le enzima deoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) puede aadir unos pocos nucletidos al azar sin molde en las zonas de uniones VD y DJ. Su incorporacin genera una considerable diversidad. A estos nucletidos se les denomina nucletidos N. (diapositiva 7.10 superior izquierda). b) Mutaciones somticas. (diapositiva 7.10 derecha). Ocurre en linfocitos B maduros cuando se encuentra en los rganos linfoides secundarios activndose frente a un antgeno. Experimentalmente se ha podido comprobar que al introducir un antgeno en un ratn al cabo de unos das aparecen mutaciones en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. Despus, si existe inmunizacin secundaria se observan an muchas ms mutaciones en las regiones variables. Como resultado de estas mutaciones se originan anticuerpos mucho ms especficos que los originales (tambin pueden aparecer anticuerpos peores o truncados, en cuyo caso esos linfocitos B no progresan). 7.4 Expresin de las Igs en el BCR: Exclusin allica y Cambios de Isotipo

Se denomina exclusin allica al fenmeno por el cual tras la sntesis de una Ig funcional o productiva se detiene el reordenamiento (las recombinasas se paran y no se producen ms bucles). As cada clula B slo tiene un tipo de Ac en su superficie o secretado. La clula B madura solo puede sintetizar IgM o IgD como hemos visto anteriormente. Para sintetizar otros isotipos tiene que pdoducirse el denominado cambio de isotipo. El cambio de isotipo se produce varias veces en una lnea clonal (diapositivas 7.11 y 7.14) y no implica a las regiones variables (que se mantienen constantes, por ejemplo V1D3J9),
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sino a los genes constantes. Es muy frecuente en clulas B en la mdula sea. El cambio de isotipo, es un nuevo proceso de reordenamiento del ADN, en el que se van perdiendo genes constantes de las diferentes cadenas pesadas. Se puede producir mltiples veces en la vida de un clon, pero es irreversible (si se ha cambiado de IgM a IgE, esa clula jams producir IgM de nuevo). El lmite lo pone cuando se cambia al isotipo IgA2 (puesto que el gen C2 es el ltimo gen constante en el cromosoma 14) El cambio de isotipo es inducido durante la cooperacin entre Linfocitos B y T, las clulas T obligan a las clulas B activadas a reordenar de nuevo su DNA para moverse a nuevos segmentos constantes adyacentes a los segmentos VDJ. Estas clulas y su progenie cambian de secretar Ig M a otros isotipos. Para esto es preciso un contacto clula a clula entre T y B que esta mediado por el CD40L y CD40, respectivamente. Pero adems, el linfocito T secreta diferentes citocinas (diapositiva 7.15) que le dan la seal de cambio de isotipo especfica al linfocito B: as IL 4 , que activa la sntesis de IgE, IFN activa la sntesis de IgG, TGF induce el cambio al isotipo IgA, y por ltimo la accin conjunta de IL-4 e IL-13 induce la sntesis de IgM sin cambio de isotipo.

7.5 Maduracin de los linfocitos B: Secuencia de eventos genticos, Cooperacin T-B, Delecin de clones autorreactivos y Subtipos de linfocitos B Como ya hemos dicho al inicio, el proceso de maduracin sucede en la mdula sea. (diapositiva 7.16) Las clulas pro-B tempranas reordenan en primer lugar los fragmentos D-J de la cadena pesada. A continuacin en la etapa pro-B tarda se reordenan V-DJ. Cuando se produzca un reordenamiento productivo, se prodr sintetizar cadena pesada. Esto le permite en la fase pre-B grande expresar una inmunoglobulina incompleta (pre-BcR), con cadena pesada adecuada pero una cadena ligera alternativa. Es en el estado pre-B pequeas cuando se reordenan las cadenas ligeras (primero y luego , si fall la primera). Cuando se expresa una cadena ligera productiva, ya se expresa una inmunoglobulina completa en superficie (B inmadura) del isotipo IgM. Finalmente, en la ltima etapa de maduracin se co-expresarn en superficie IgM e IgD (B madura). Los pasos que sigue la clula en los procesos de reordenamiento de las cadenas pesadas y ligeras en los diferentes estados de diferenciacin se resumen en la diapositiva 7.17 a modo de algoritmo. Como se aprecia hay mltiples posibilidades, por eso aunque los procesos de reordenamiento sean imprecisos, hay bastantes posibilidades de que los precursores B progresen y maduren. Para que un linfocito B se active y sintetice inmunoglobulinas es casi siempre necesario la denominada Cooperacin entre las clulas B y clulas T (diapositiva 7.18). La clula T (normalmente TH2) se adhiere a la clula B por medio de las molculas de adhesin CD40L (en el linfocito T) y CD40 (en el linfocito B). Tras la unin el Linfocito T reorienta su aparato secretor (como se aprecia con la talina) hacia la zona de contacto con el linfocito B. Y justo en la zona de contacto es donde secreta las citocinas (no en toda la superficie celular como podra pensarse, ver tincin de secreccin de IL-4). La citocina le dar al linfocito B la seal correspondiente para el cambio de isotipo, si este es necesario. La clula B se diferenciar a clulas plasmtica y sintetizar anticuerpos (diapositiva 7.19) habitualmente en la mdula sea.

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Pero adems de inducir el cambio de isotipo, la cooperacin entre LB / LT juega un papel importante en la eliminacin de clones autorreactivos (en linfocitos B maduros). As, en la mdula sea en la fase B-inmadura, si los linfocitos B que expresan IgM reconocen autoantgenos (diapositiva 7.22) en las clulas del estroma de la mdula sea: al no recibir seales de cooperacin por parte de una clula T, entran en apoptosis y mueren (Deleccin clonal). Alternativamente, si la IgM de las clulas B inmaduras reconoce sustancias propias en solucin, como la albmina: dicha clula cambia su isotipo a IgD y se vuelve anrgica. (intil, no se podr activar nunca). As que las cluas B inmaduras cuya IgM no reconozca nada propio en la mdula, sufrirn la ltima etapa de diferenciacin, co-expresarn IgM e IgD (B-maduras) y migrarn a la periferia. Pero en la mdula sea no estan representados todas las protenas de nuestro organismo (potenciales autoantgenos). Si los linfocitos B maduros se encuentran que al entrar en algn tejido su inmunoglobulina de superficie es especfica para protenas propias: si el autoantgeno es de superficie, en ausencia de cooperacin, entrarn en apoptosis y morirn. Si el autoantgeno es soluble, en ausencia de cooperacin, dejan de expresar IgM, expresan slo IgD y por lo tanto entran en anergia. Todo lo que hemos comentado en este captulo hasta el momento, hace referencia a una subpoblacin de linfocitos B mayoritaria, son las denominadas clulas B-2. Pero hay otra poblacin minoritaria, menos evolucionada que se diferencia antes (en el feto) y que se denominan clulas B-1 (diapositiva 7.20). Estas clulas se distinguen por expresar en su superficie el antgeno CD5 (las B-2 no lo expresan) y se han implicado en algunas enfermedades autoinmunes. Son clulas mas primitivas, aparecen antes en el desarrollo, carecen de algunas enzimas importantes, y se han equiparado a las clulas T-. Tienen una especificidad menor (diapositiva 7.21), no sufren mutacin somtica y apenas cambio de isotipo (producen IgM mayoritariamente), pero producen ms cantidad de anticuerpos que las clulas convencionales B-2.

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7.-Sntesis de Inmunoglobulinas
(Inmunoglobulinas: reordenamiento de genes; generacin del repertorio B; delecin clonal de linfocitos autoreactivos)
A. Corell UVA

Indice de contenidos del Tema 7

Sntesis de Inmunoglobulinas
7.1 Estructura de los genes para las cadenas pesadas y ligeras de Inmunoglobulinas -Diversidad potencial 7.2 Reordenamiento de los genes de Inmunoglobulinas: pesadas y ligeras: -Secuencias intrnicas implicadas en la recombinacin -Enzimas implicadas -Procesamiento de los transcritos 7.3 Mecanismos de amplificacin del repertorio: -Diversidad de unin -Mutacin somtica 7.4 Expresin de las Igs en el BCR: -Exclusin allica -Cambios de Isotipo 7.5 Maduracin de los linfocitos B: -Secuencia de eventos genticos -Cooperacin T-B -Delecin de clones autorreactivos -Subtipos de linfocitos B

Tanto las cadenas pesadas como ligeras, tienen genes que codifican para las regiones variables y constantes

El reordenamiento cromosmico sucede por mecanismos recombinacionales (enzimas RAG-1 y RAG-2) entre secuencias alineadas de DNA. Este alineamiento puede darse de varios modos.

Las clulas B (como las T) tienen la oportunidad de rescatar reordenamientos iniciales no productivos y sufrir reordenamientos adicionales. Esto ocurre tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras.

Mutacin somtica

V, D, J genes

CP CG

CJ3 CJ1 CJ2b CJ2a CH

CD
DNA

VDJ

CP CG

CJ3 CJ1 CJ2b CJ2a CH

CD
DNA

VDJ

CP CG
mRNA

VDJ CP CG
mRNA

VDJ CG
mRNA

Traduccin a IgM

Traduccin a IgD

Cambio de isotipo

V
H

V1 D3 J9

V1 D3 J9

V1 D3 J9

V1 D3 J9

V1 D3 J9

Puede ocurrer que clulas que estn secretando IgE cambien a producir IgG3 ?

VDJ CH

CD

C
IgM

El cambio de Isotipo ocurre multiples veces en una lnea clonal.

IgE
Citocinas producidas por la clula T controlan los cambios de isotipo (lista parcial)

H
IgM

IgM

IgM

IgM IgD IgG IgE IgA

IgM

IgM

IgG

IgM

IgG

IgM

IgG

IgG

IgG

IgM IgG IgG IgA IgM IgA IgG IgA IgG IgG IgE IgG

Pro-B

Pre-B

La clula T (normalmente Th2) se adhiere a la clula B La clula T reorienta su aparato secretor

La cadena pesada se reordena primero (P). P se expresa en superficie con una cadena ligera subtitutiva. La cadena ligera se reordena. La cadena ligera definitiva (N o O) se une a P en la sufperficie (IgM). G se empieza a formar y se expresa con la misma cadena ligera (IgD).

La clula T secreta citocinas (e.g., IL-4)

Las clulas B pueden unir virus y bacterias, procesarlos y presentar pptidos (en MHC II) a clulas Th2 activadas. Las clulas Th2 activadas, producen las seales necesarias para la activacin de clulas B. La comunicacin entre clulas incluye la unin del TCR, la unin entre CD-40 y CD-40L y la secrecin y unin de citocinas.

Activacin

Proliferacin

Diferenciacin en cel. plasmatica

Las clulas B-1 aparecen temprano en el desarrollo y no utilizan algunas de las enzimas de reordenamiento cromosmico como las otras clulas B

Subtipos de clulas T y B
T Cells DE T cells JG T cells B Cells B-2 cells B-1 cells

Las clulas B-1 pueden ser una sub-poblacin primitiva especializada (como las clulas T JG )

Interacciones entre antgeno y anticuerpo

6. 1. INTRODUCCIN Antes de tratar sobre los detalles de las reacciones antgeno-anticuerpo, se recomienda el repaso de los siguientes conceptos: antgeno epitopo (determinante antignico) hapteno y conjugados hapteno-portador experimentos de Landsteiner, que demuestran el papel clave de la configuracin global del hapteno: lo que reconoce el Ac es la nube tridimensional de la capa externa de electrones del hapteno anticuerpos: el sitio de unin con el antgeno est formado por el conjunto de las seis CDR. Este conjunto interacciona con el epitopo, y es lo que se denomina paratopo la cristalografa de rayos X demuestra la complementariedad (de tipo llave-cerradura) entre el paratopo y el epitopo flexibilidad en la unin: puede darse un ajuste inducido en una CDR al unirse al correspondiente grupo qumico del epitopo, permitiendo un mejor encaje molecular entre ambos.

6.2 CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS DE LA UNIN Ag-Ac La unin Ag-Ac es una interaccin reversible en la que slo intervienen enlaces no-covalentes entre el epitopo del Ag y las CDRs de la pareja VH-VL del Ac. 6.2.1 Fuerzas implicadas en la unin Ag-Ac Los enlaces no covalentes son dependientes de la inversa de la distancia entre los grupos qumicos implicados. Puentes de hidrgeno Fuerzas electrostticas (enlaces inicos) Fuerzas de van der Waals Enlaces hidrfobos La clave de la unin est en la complementariedad entre Ag y Ac: si sta es buena, se produce la exclusin de agua, lo que permite un acercamiento estrecho entre epitopo y paratopo, lo que determina altas fuerzas de unin. 6.2.2 Afinidad La afinidad de un anticuerpo(Ac) concreto (p. ej., cuando usamos un anticuerpo monoclonal) por un epitopo (H) es la suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un sitio de unin de ese anticuerpo y el correspondiente epitopo. Ello se puede definir a travs de la correspondiente constante de equilibrio (K), segn la ley de accin de masas: siendo [Ac] la concentracin de sitios libres de Ac y [Ac-H] la concentracin de sitios ocupados del Ac. La determinacin de la constante de afinidad K se realiza en experimentos de dilisis, que conducen a la determinacin de la ecuacin de Scatchard: 6.2.3 Avidez Es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los determinantes individuales de ese antgeno, su valor es mucho mayor que la suma de afinidades. Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales suelen tener ms de un tipo de determinante antignico. Cuando un antgeno de este tipo entra en un individuo, ste produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un tipo diferente de determinante antignico del Ag original. En esta caso se habla de avidez del antisuero, que es la fuerza

conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero que reconocen al antgeno multivalente complejo: n Ac + mAg Acn Agm}, donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del antgeno. Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy interesante es el derivado de la multivalencia del antgeno. La fuerza de unin de un antgeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma aritmtica de las fuerzas de unin de cada anticuerpo: La avidez refleja mejor la situacin fisiolgica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo concreto en su interaccin con el epitopo. 6.3 CINTICA DE LAS REACCIONES Ag-Ac Parece que existen indicios de que durante la maduracin de la respuesta humoral de produccin de anticuerpos se produce no slo una seleccin de anticuerpos con mayor afinidad (seleccin termodinmica), sino con mayor rapidez (seleccin cintica). 6.4 SITIOS DE UNIN POLIFUNCIONALES Puede darse el caso de que una misma molcula de anticuerpo pueda ser complementaria de varios determinantes antignicos distintos. En este caso, la unin de cada epitopo al anticuerpo es competitiva, aunque existen lugares distintos para cada epitopo dentro del paratopo del anticuerpo. Cuando inducimos una respuesta humoral frente al Ag "A", se produce una poblacin de Ac polifuncionales, que tienen en comn el tener un sitio para "A" (aunque en dicha poblacin se dan subpoblaciones, que, adems podran reconocer parte de otros Ag). La reactividad neta del antisuero es alta frente a "A" (el Ag inductor), pero baja frente a los dems Ag.

Tema 13. Mtodos

Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos bioqumicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hace que estos mtodos se empleen ampliamente. Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin Ag-Ac (Tabla 17.1). As tenemos: Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos se encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos y anticuerpos especficos.

Tcnicas de precipitacin
Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales: 1. Tcnica de propiamente dicha. precipitacin

2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony. 3. Tcnica de inmunoelectroforesis. 4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini. Tcnica de precipitacin El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la (Figura 17.1) se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un antisuero. La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado. Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 17.2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difundan, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado. La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas. Tcnica de inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el

antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de lneas de precipitacin que pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar (Figura 17.3). En Inmunologa clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de mieloma. Tcnica de difusin radial simple de Mancini Esta tcnica se basa en la difusin de un antgeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo especfico. Este anillo de precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones antignicas estn en relacin directa con el rea del crculo de precipitacin. Al difundir el antgeno se genera un gradiente de concentracin desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentracin del antgeno es la adecuada (zona de equivalencia) el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin (Figura 17.4).

Tcnicas de Aglutinacin
En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente se utilizan glbulos rojos (hemaglutinacin) o partculas de ltex. Hemaglutinacin directa La presencia de antgenos en la superficie de los glbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinacin producida cuando se aade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antgenos. Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 17.2). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos grupos Rh.

Hemaglutinacin indirecta Se basa en el principio de la inhibicin de la hemaglutinacin. Para su realizacin se precisan glbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 17.5). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la hemaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotropina corinica (HCG) para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.

Tcnicas de Inmunofluorescencia
La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con molculas fluorescentes (Figura 17.6). Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta).

Citometra de flujo
La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas de sangre perifrica. Actualmente el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se hace circular en forma de gotas

microscpicas. Las clulas pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se realiza su separacin (Figura 17.7). Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 17.8).

La seal producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot) (Figura 17.9) o en una dimensin (Histograma) (Figura 17.10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjuga los avances de informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un antisuero que las identifique.

Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin de las molculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de molculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo. Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de clulas T de colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular T se expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molcula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de molculas de superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69). n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*) <--- h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag) >

En donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno marcado con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos marcados.

Otras tcnicas
TCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos especficos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un istopo. Al establecerse esta competicin resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa (ver esquema anexo). Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fcilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada.

A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a investigar. En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en cuestin. El fundamento y la deteccin no sufriran cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo que se une a la fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de inhibicin se incuba una concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno. Existe una tcnica no competitiva que es la denominada sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. Una vez realizado el bloqueo, se aade el antgeno en concentraciones variables. Posteriormente se aade un segundo anticuerpo contra el antgeno, pero esta vez marcado. Adems del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez ms frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos para su posterior aplicacin en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antgenos especficos, en tcnicas inmunorradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo que pueden ser una alternativa al RIA en la determinacin de algunas molculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastsicos (inmunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas (inmunorradioterapia). Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de protenas o pptidos con yodo radiactivo I125 I132 puede realizarse por diferentes mtodos. La incorporacin del yodo a la molcula se realiza en los aminocidos aromticos que forman parte de la estructura de la cadena peptdica: tiroxina, fenilalanina, triptfano o histidina. La tcnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar istopos. Adems de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilizacin, existen istopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad. TCNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO. Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar. b) Se aade la muestra con el antgeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 17.11) e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas

concentraciones. Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como test en fase slida y est orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra con el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo antiinmunoglobulinas marcadas con el enzima. Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimticas es cuando el antgeno se encuentra fijo en clulas o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso tambin se emplean dos anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antgenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que acta de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa /antiperoxidasa (PAP) (Figura 17.12). La diferencia principal entre las tcnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un istopo y la segunda la actividad de un enzima, as el RIA directo y el ELISA competitivo seran equivalentes, y tambin existira ELISA de inhibicin y ELISA en Sandwich. Existen inmunoensayos que se denominan homogneos en los cuales no es necesario la separacin de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son tcnicas muchas de ellas patentadas por diferentes firmas comerciales. (Figura 17.13).

TCNICAS NEFELOMTRICAS Estas tcnicas se basan en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 17.14). Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificacin de protenas en suero y en otros lquidos biolgicos.

SELECCIN DE CLULAS UNIDAS A UN ANTICUERPO En la actualidad disponemos de varios mtodos para seleccionar clulas a las que previamente se ha unido un anticuerpo. La adicin de complemento elimina dicha poblacin celular (seleccin negativa), es la denominada tcnica de inmunotoxicidad. La separacin inmunomagntica se basa en la interaccin entre antgenos celulares superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnticas (Figura 17.15). La aplicacin de un campo magntico permite separar las clulas unidas a las bolas (seleccin positiva) de las clulas no unidas (seleccin negativa). Es un mtodo fcil, rpido y no muy costoso. Este mtodo presenta muchas aplicaciones no slo en Inmunologa sino tambin en Microbiologa, utilizando bolas unidas a anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biologa Molecular

para aislamiento de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucletidos respectivamente. Tambin se pueden usar para la purificacin de protenas si se unen las bolas a anticuerpos especficos. La separacin de clulas puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated cell sorting) en la que adems de los dispositivos de citometra ya mencionados se dispone de mecanismos de separacin celular en funcin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas con anticuerpos. Esta es la tcnica que actualmente ofrece mejores resultados. TCNICAS USADAS EN EL AISLAMIENTO DE ANTICUERPOS O ANTGENOS PUROS. Esta tcnica es ampliamente utilizada en Bioqumica e Inmunologa. Puede aplicarse en el aislamiento de una poblacin pura de anticuerpos. Para ello se prepara un inmunoabsorbente en fase slida, que es un antgeno unido covalentemente a un soporte inerte, como por ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a travs de l bajo condiciones fisiolgicas. Los anticuerpos especficos para el antgeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampn de elucin que disocia la unin antgeno-anticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se uni al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando anticuerpos en la columna se tendr antgeno puro. Esta tcnica permite obtener otros tipos de molculas. As una columna de lectina absorber todas las molculas con determinados residuos azcar, que pueden eluirse en un tampn con el azcar libre, ya que ste compite con la protena ligada por los sitios de unin a la lectina. INMUNOPRECIPITACIN E INMUNOBLOTTING La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptdica, su sntesis y degradacin, la interaccin con protenas, cidos nucleicos u otros ligandos. La tcnica de inmunoprecipitacin se divide en cuatro pasos: Marcaje del antgeno (opcional). Lisis de las clulas para liberar el Ag. Formacin del complejo Ag-Ac. Purificacin de los inmunocomplejos.

En la mayora de los casos el antgeno se marca incubndolo con un precursor radiactivo aunque muchos antgenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje directo. El antgeno se extrae de las clulas mediante lisis. Despus, los anticuerpos se aaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. stos se unen por adsorcin a una fase slida que contiene protena A. Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero tambin pueden ser usados en diferentes tcnicas incluyendo estudios enzimticos, unin a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc. Una de estas tcnicas es el Western blot que combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad es el test confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA. Se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa

y secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan aadiendo una antiIgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH. OTRAS TCNICAS BASADAS EN LA UNIN ANTGENO-ANTICUERPO Hay otros modos para detectar el complejo antgeno-anticuerpo una vez que ste se ha formado, adems de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las tcnicas basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en microscopa electrnica. La tcnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de esta molcula est formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser detectado en microscopa electrnica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u otras protenas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o la bencidina bidiazoica entre otros. La tcnica basada en el marcaje de anticuerpos con oro coloidal y su uso en microscopa electrnica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas molculas a los electrones. Estas tcnicas son de gran utilidad en inmunohistologa e inmunocitologa humana, animal y vegetal. Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de istopos radiactivos en el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. Las tcnicas anteriores as como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanlisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliacin de las seales empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoprotena, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al anticuerpo a travs de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias molculas de biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada molcula proteica, se vera unida, a travs de la biotina, con varias molculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR TILES EN INMUNOLOGA. Otro grupo de tcnicas ampliamente utilizadas en inmunologa son de biologa molecular. Una de las ms utilizadas es la Southern Blot. Esta tcnica consiste en la separacin de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con enzimas de restriccin. La separacin se hace mediante electroforesis y despus este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa

(blot). Despus, para la identificacin de la banda que interesa se realiza un proceso llamado hibridacin, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada, generalmente con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografa la banda en la cual se ha producido unin (Figura 17.16).

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

8.-Tcnicas diagnsticas en el laboratorio de Inmunologa

(Reaccin Ag-Ab; citometra de flujo; pruebas cuantitativas y funcionales de la inmunidad)
A. Corell UVA

Indice de contenidos del Tema 8 Tcnicas diagnsticas en el laboratorio de Inmunologa

8.1 La reaccin Ag-Ab y sus aplicaciones diagnsticas -Produccin de anticuerpos monoclonales -Tcnicas basadas en la reaccin Ag-Ab Citometra de flujo y sus aplicaciones -Estudios de fenotipo de linfocitos -Estudios funcionales y de DNA Estudios de la inmunidad innata: Complemento Fagocitos Estudios de la inmunidad adaptativa: In vivo: pruebas cutneas In vitro: proliferacin de linfocitos Pruebas inmunolgicas complementarias

8.2

8.3

8.4

8.5

Aadir la sangre Muy despacio Sin mezclar Con el Ficoll

Sangre diluida Con RPMI (1:1) 6 ml Lymphoprer 4 ml

Centrifugar 40 minutos 1.800 rpm

Plasma Linfocitos Lymphoprerp Granulocitos Eritrocitos

Lymphoprer 4 ml Recoger con mucho cuidado La nube de linfocitos

Poner los Linfocitos en Un tubo limpio

Aadir medio RPMI

Centrifugar 10 minutos 1.200 rpm Pellet de linfocitos

Objetivo 40 x

Clulas /ml = n clulas (en 8 cuadros) x 2 x 10.000 n clulas (en 16 cuadros) x 10.000

Mitgeno Phytohemaglutin ina Concanavalina-A Anti-CD3 Anti-CD2 Anti-CD28 Acetato de Phorbol Mirstico Lipopolisacrido Mitgeno Pokeweed Ionforos de Ca Interleucina-2

Abreviatura PHA ConA CD3 CD2 CD29 PMA LPS PWM IONO IL-2

Fuente Phaseolus vulgaris Canavalia ensiformis Hibridoma MoAb Hibridoma MoAb Hibridoma MoAb Qumica Bacterias Phytolacca americana Qumica Recombinante

Especificidad Clulas T Clulas T Clulas T Clulas T Clulas T Clulas T y B Clulas B Clulas B, Tdependiente Clulas T y B Linfocitos

70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 D as de cultiv o 4 5 6

cpm (x1000)

C onPH A SinPH A

ERROR: undefined OFFENDING COMMAND: BCDDUE+ArialNarrow-Bold STACK: [/.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /space /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef / parenleft /parenright /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /period /slash /zero /one /two /.notdef /four /five /six /.notdef /eight /.notdef / .notdef /.notdef /.notdef /equal /.notdef /.notdef /.notdef /A /.notdef /C /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef / .notdef /.notdef /.notdef /.notdef /O /.notdef /.notdef /.notdef /S / .notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef / .notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /a /b /c /d /e /.notdef / .notdef /.notdef /i /j /.notdef /l /m /n /o /p /.notdef /r /s /t /u /v / .notdef /x /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /eacute /oacute /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /ordmasculine /.notdef /.notdef /.notdef / .notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef / .notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef /.notdef / .notdef ] /BCDDUE+ArialNarrow-Bold*1

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

19.-Generacin de Linfocitos B efectores

(Cooperacin T-B; Cambio de isotipo; maduracin de afinidad; antgenos T independientes)
A. Corell UVA

La finalidad ltima de los linfocitos B es la produccin de Anticuerpos. Para ello se diferencian en clulas plasmticas. Los anticuerpos median funciones efectoras:
-neutralizacin -opsonizacin y fagocitosis -degranulacin -citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) -activacin complemento -inmunidad neonatal y epitelial

Indice de contenidos del Tema 19 Generacin de linfocitos B efectores 19.0 Funciones efectoras de los Anticuerpos 19.1 Cooperacin entre linfocitos Th y linfocitos B 19.2 Cambio de isotipo: -mediadores: CD40 y citocinas -mecanismos genticos 19.3 Mutacin somtica (de afinidad): -seleccin positiva versus anergia -clulas plasmticas y de memoria 19.4 Antgenos T-independientes

Neutralizacin
Los anticuerpos se unen directamente a estructuras virales o bacterianas que bloquean su entrada en las clulas humanas (ej: HIV-CD4, Epstein Barr-CD21). Los anticuerpos se unen a productos solubles y dainos producidos por los patgenos (ej, toxinas, venenos).

Opsonizacin
La unin del Anticuerpo a las superficies virales o bacterianas, activa por cambio conformacional su porcin Fc. Las clulas Fagocticas tienen Receptores de Fc que se unen a los Fc, facilitando la fagocitosis de los microbios recubiertos de anticuerpo. La unin del anticuerpo a la superficie microbiana activa el sistema de complemento: fragmentos de esta activacin (C3b y C4b) tambin recubren ahora la superficie del patgeno y promueven la fagocitosis mediante receptores especficos (CRs).

Degranulacin
Los Mastocitos tienene Receptores para Fc de la IgE (FcHR): tras Su unin al anticuerpo liberan histamina y otras sustancias vasoActivas (inflamacin) histamina

Citotoxicidad Celular dependiente de Anticuerpos (ADCC)

La realizan las clulas NK que poseen receptores para IgG (FcJIII) Tambin los Eosinfilos que poseen receptores para IgG Los receptores permiten la unin directa de estas clulas a los patgenos: ahora estas clulas efectoras eliminarn (lisarn) al microbio.

Interacciones entre linfocitos Th y B activados: inicio de la Cooperacin T-B

El cambio de isotipo est mediado por secuencias especficas a la cabeza de los genes constantes: secuencias S (switch): Tras la unin de CD40-CD40L y la accin de citocinas

En ausencia de cooperacin T-B las clulas B no progresan

Distintas Citocinas favorecen distintos cambios de isotipo

Tras la maduracin de afinidad se seleccionan las clulas B que producen mejores anticuerpos frente a los antgenos

Hay antgenos que inducen respuestas de clulas B sin mediar la Cooperacin T-B: se llaman T-independientes En algunas de estas respuestas estn implicadas clulas B ms Primitivas (subpoblacin B-1), que expresan CD5 en superficie

Descubrimiento de las clulas B

1954 - Bruce Glick, Universidad del estado de Ohio Estudia la funcin de los rganos linfoides en la Bolsa de Fabricio en la regin cloacal de los pollos Bursectoma: sin efecto aparente Pollos bursectomizados fueron usados en experimentos para producir anticuerpos conta Salmonella

Clulas B

Ninguno de los pollos bursectomizados tena anticuerpos anti-Salmonella

Posteriormente se observ que la Bursa era el rgano en el que se desarrollaban las clulas productoras de anticuerpos. Estas clulas fueron llamadas clulas B Los mamferos no tienen la Bolsa de Fabricio

Origen de las clulas B y rganos de maduracin

Desarrollo de las clulas B en la mdula sea

Maduracin de Transferencia de clulas las clulas B de hgado fetal en la periferia Mdula sea normal Las clulas B no maduran Mdula sea defectuosa

B B B B

Regula la formacin de un receptor de antgeno Asegura que cada clula tenga una sola especificidad Testa las clulas B auto-reactivas Exporta clulas tiles a la periferia Proporciona un lugar para la producin de anticuerpos

Las clulas B inician su desarrollo en el hgado fetal Despus de nacer, continan el desarrollo en la mdula sea
La mdula sea proporciona un MICROAMBIENTE PARA LA MADURACIN Y DIFERENCIACIN de las clulas B

Las clulas estromales educan a las clulas B en desarrollo

Hay contactos especficos clula-clula entre clula estromales y clulas B en desarrollo Las clulas estromales secretan citocinas

Etapas del desarrollo de las clulas B

Stem Cell Contacto clula-clula

pro-B temprana

pro-B tarda

pre-B grande B madura

Factores - CITOCINAS secretados

Clula estromal

pre-B pequea

B Inmadura

Perifrica

Se necesitan diferentes citocinas y contactos clulaclula en cada etapa de diferenciacin

Cada etapa del desarrollo est definida por reordenamientos de los genes de las cadenas IgH, IgL, su expresin en la membrana, expresin de molculas de adhesin y receptores para citocinas

Las citocinas y los contactos clula-clula son diferentes en cada etapa

Las citocinas y los contactos clula-clula son diferentes en cada etapa

Receptor interleucina-7 Interleucina-7 Factor de crecimiento pro-B temprana pro-B tardo

VLA-4 (Integrina) VCAM-1 (superfamilia Ig) Molcula de adhesin celular

Stem

pro-B temprana

Conjunto Receptor Tyrosine kinase Stem cell Factor de crecimiento unido a la clula

Pre-B

Clula estromal

Clula estromal

Las etapas de diferenciacin en la mdula sea estn definidos por reordenamientos de los genes de las Ig
Light chain VLJLCL

Receptor Pre-B
Cadena Pesada VHDHJH VpreB CH 5 Ig e Ig Molculas de transducin de seales

Etapa clula B Configuracin Genes IgH

Stem cell Lnea germinal

pro-B temprana D H a JH

pro-B tarda VH a DHJH

pre-B grande VHDHJH Receptor expresado en Pre-B

Este receptor se expresa transitoriamente cuando el reordenamiento VHDHJH CH es productivo VpreB/5 - sustituye a la cadena ligera, es necesario para la expresin en membrana El ligando del receptor pre-B se desconoce

Los genes de las cadenas ligeras todava no se han reordenado

Evidencias de la exclusin allica Formacin del receptor pre-B

Suprime posteriores reordenamientos de las cadenas H Opta por entrar en el ciclo celular El ligando del receptor pre-B es desconocido Asegura una nica especificidad del anticuerpo expresado Expande solo las pre-B con fragmentos VHDHJH unidos Clula estromal La supresin de reordenamientos de la cadena H en las pre-B cell evita la expresin de dos especificidades en una misma clula ALOTIPO - Un polimorfismo en la regin C de las Ig Los alotipos pueden ser identificados marcando las Ig de membrana con anticuerpos

Pre-B grande

a/a

b/b

a/b

AND b

EXCLUSIN ALLICA

Y
a

La exclusin allica evita respuestas no deseadas

Un receptor antignico por clula SI hubiera dos receptores antignicos por clula

La exclusin allica es necesaria para una eficaz seleccin clonal

YYY
B

S. aureus

La supresin del reordenamiento de los genes de las cadenas H asegura una sola especificidad del anticuerpo expresado por la clula Evita la inducin por patgenos de repuestas indeseadas

La exclusin allica es necesaria para evitar agujeros en el repertorio

Un receptor antignico por clula Anticuerpos anti-cerebro SI hubiera dos receptores antignicos por clula Anticuerpos anti-cerebro y anti-S. Aureus

Y
B

Y
B
Pero

Exclusin de B anticerebro por ej. tolerancia a lo propio B Deleccin

Anrgia

Y
B

Anticuerpos Anti-S. aureus

Anticuerpos anti-cerebro

B anti-S. Aureus popdran ser excluidas dejando un agujero en el repertorio

Y Y

Y Y Y Y

Anticuerpos Anti-S. aureus

S. aureus

Y Y Y

YY
S. aureus

Expresin de antgenos propios por clulas por ej. cerebro

Y BY

Anticuerpo
S. typhi S. typhi

YY

Todas las clulas hijas deben expresar la misma especificidad, de lo contrario la eficacia de la respuesta inmune se vera comprometida La supresin del reordenamiento de los genes de la cadana H ayuda a evitar la aparicin de nuevas especificidades durante la proliferacin y seleccin clonal

Formacin del receptor pre-B

Suprime posteriores reordenamientos de las cadenas H Opta por entrar en el ciclo celular El ligando del receptor pre-B es desconocido Asegura una nica especificidad del anticuerpo expresado Expande solo las pre-B con fragmentos VHDHJH unidos Clula estromal

Pre-B grande

Y Y

EXCLUSIN ALLICA

Las clulas pre-B grandes necesitan la unin de los fragmentos VHDHJH para madurar
Secuencia de nucletidos de la cadena H de la IgG3
ATGAAACANCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGG TGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGG TGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG GGGAAGCCTCCAGAGCTCAAAACCCCACTT GGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGC CCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCC CCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCT TGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGC CCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCC CCGTGCCCNNNGTGCCCAGCACCTGAACTC TTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCC CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCNNNNGTCCA GTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGACAGCCC GAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACG CCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT CCGGGTAAATGA

Transcripcin del fragmento 1

MKXLWFFLLLVAAPRWVLSQ VHLQESGPGLGKPPELKTPLG DTTHTCPRCPEPKSCDTPPPC PRCPEPKSCDTPPPCPRCPEP KSCDTPPPCXXCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDXXVQFKWYVD GVEVHNAKTKLREEQYNSTFR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQP EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYNTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNIFSCSVMHEALHNRYTQK SLSLSPGK*

La unin del receptor pre-B condiciona la entrada en el ciclo celular

Pre-B Pre-B grande grande Large Large Pre-B Pre-B Pre-B Pre-B Large grande Large grande Pre-B Pre-B Pre-B Pre-B grande grande

Contina el desarrollo Large pre-B El receptor de la pre-B puede unirse a la clula estromal pre-B grande Proliferacin

Muchas pre-B grandes con idnticos receptores

Transcripcin del fragmento 2 (no protena) Transcripcin del fragmento 3

ETXVVLPSPGGSSQMGPVPGA PAGVGPRTGEASRAQNPTW*

Desarrollo interrumpido

pequea

pre-B Large pre-B

IgM

Desarrollo interrumpido

La proliferacin para el prereceptor no expresado

Cadena intracelular VDJCH Reordenamiento VL-JL

Expresin de la cadena ligera y presentacin de la IgM en la membrana

El reordenamiento de las cadenas pesada y ligera puede ser desperdiciado

V V V D J C C C Lnea germinal Unin DH-JH Unin VH-DHJH pre-B grande

Las clulas B tienen muchas posibilidades de B cells have several chances to successfully reordenar los genes de las Ig correctamente rearrange Ig genes
pro-B temprano Early Pro B
DH-JH On first en el primer chromosome cromosoma

D D J V D J

pro-B Late Pro tardo B

VH-DJH enOn el primer first cromosoma chromosome

pre-B Pre B
on first en el primer SI chromosome cromosoma

Clula B inmadura

B inmaduro Immature B IgM

SI

SI

With two random joins to generate a heavy chain there is a 1:9 chance of a rearrangement of being in frame V V V J J C C Lnea germinal Unin VL-JL
pre-B pequeo

NO SI
en el segundo on second cromosoma chromosome

NO
DH-JH On en el second segundo chromosome cromosoma

SI

NO
VH-DJH second enOn el segundo chromosome cromosoma

SI

Y B
IgM

NO
enel primer on first cromosoma chromosome

SI

With one random join to generate a light chain there is a 1:3 chance of a rearrangement being of frame There is, therefore, only a 1:27 chance of an in frame rearrangement Out of frame rearrangements arrest further B cell maturation

NO NO B

NO
en el segundo on second cromosoma chromosome

SI

Y B

NO

La adquisicin de la especificidad antignica obliga a testar el reconocimiento de antgenos propios

Clulas B auto-tolerantes: Seleccin clonal

pre-B pequeo

B
B inmaduro

Pre-B pequeos
Sin receptor de antgeno en la membrana Incapaz de percibir el antgeno Puede ser auto-reactivo

B inmaduros
Expresan Ig en la membrana Capaz de percibir el antgeno Puede ser testada su autoreactividad pre-B pequeas forman las Ig B inmaduros reconocen antgenos propios MULTIVALENTES Deleccin clonal por apoptosis

Eliminados del repertorio DELECCIN Parada de la funcin ANERGIA Alteracin de la especificidad MODIFICACIN DEL RECEPTOR

Clulas B auto-tolerantes: anergia

IgD normal IgM baja V

Edicin del receptor

El reordenamiento del receptor para un antgeno propio puede ser sustituido

IgD

pre-B pequeas forman las Ig

B inmaduros reconocen antgenos propios Sin reaccin cruzada

Anergia B

B inmaduro

IgD

pre-B pequeo

YY

IgM IgD B Para del desarrollo y reactivacin de RAG-1 y RAG-2 V V V D J C !! El receptor reconoce antgenos propios!! B

YY
V D J C

Y
Y Y

La edicin del receptor ahora reconoce un antgeno diferente y puede ser retestada su especificidad

Apoptosis o anergia

B auto-tolerancia: exportacin de la auto-tolerancia

IgD y IgM normal IgD IgM IgM

Diferenciacin en la periferia

B
IgD

IgD

IgM

IgM B maduros perifericos

pre-B pequeas forman las Ig

B inmaduros no reconocen ningn antgeno propio

Las clulas B maduras salen a la periferia

B reconce antgenos no propios en la periferia

Clula plasmtica secretora de Ig

Las clulas B recirculantes pasan a travs de los rganos linfoides

B en sangre rea T

Las clulas B recirculantes son atrapadas por los antgeno extraos en los rgano linfoides
Las clulas B entran en los ndulos linfoides y salen a la sangre va vnulas endoteliales

Las clulas B proliferan rpidamente rea B El antogno entra en los ndulos linfticos va vasos aferentes

Y Y Y Y Y Y

Vaso linftico eferente

CENTRO GERMINAL Estructura transitoria de proliferacin intensa

El centro germinal clulas B que se diferencian en clulas plasmticas

YY Y libera

YY YY YY

Y Y Y Y Y Y

YY Y

YY

YY

IgD

YY

Immature B

YY

Small pre-B

YY

YY

YY

YY
B

YY
Y
B

YY

YY Y

YY

Anatoma del Centro Germinal

2. Las clulas B (centrocitos) regulan las Ig de membrana, para la divisin y reciben seales coestimuladoras de las clulas T y de clulas foliculares dendrticas 4. Las clulas selecionadas
dejan los ndulos linfoides como clulas de memoria o como clulas plasmticas

Resumen:
Las clulas B se desarrollan en el hgado fetal antes del nacimiento y de adultos en la mdula sea Las etapas de diferenciacin B estn definidas por reordenamientos gnicos La unin del receptor pre-B es esencial para el desarrollo de las clulas B La exclusin allica es esencial para el carcter clonal de la inmunidada Zona oscura

Zona clara B Las clulas foliculares dendrticas selecionan clulas B tiles T

Las clulas B tienen varias oportunidades para reordenar su recepto antignico Las clulas B auto-reactivas son eliminadas por deleccin clonal y aneria

1. Las clulas B (centroblastos)

regulan las Ig de membrana, proliferan, hipermutan somticamente sus genes de las Ig. AFINIDAD DE LA MADURACIN

Las clulas B maduras se desarrollan en los centros germinales

3. Apoptosis de clulas
auto-reactivas y de clulas no seleccionadas

Receptor B
Cadena Pesada VHDHJH Light chain VLJLCL

CH Ig e Ig

Tema 04. Molculas de Histocompatibilidad

Las molculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas tras demostrarse que estaban relacionadas las reacciones de rechazo de tejidos y rganos trasplantados entre individuos de la misma especie. Sin embargo hoy sabemos que las molculas de histocompatibilidad juegan un papel esencial en la respuesta inmunolgica capturando y presentando antgenos a las clulas T sin cuya funcin sera imposible la defensa del organismo frente a todos aquellos microorganismos, principalmente virus, que consiguen entrar en las clulas de cada individuo. En el humano se denominan antgenos HLA (Histocompatibility Leucocyte Antigens) y una de las principales caractersticas de estas molculas es su extraordinario polimorfismo, esto es cada uno de los genes que las codifican pueden expresarse de mltiples maneras. Los loci genticos reguladores de la sntesis de estas molculas se agrupan en una regin denominada Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de padres a hijos de acuerdo con las leyes de Mendel. Aunque fueron originalmente descritas estas molculas como HLA por su implicacin en la histocompatibilidad de trasplantes por lo que tambin se le reconoci como antgenos presentes en los leucocitos, hoy sabemos que se pueden encontrar en la mayora de las clulas del organismo y que por su polimorfismo son responsable de la diversidad biolgica de cada miembro de la especie humana, por lo que su denominacin ms adecuada podra ser la de Molculas/marcadores Celulares de Diversidad (MCD). Los primeros trabajos sobre estas molculas fueron realizados por Gorer (1936) en ratones viendo como se produca rechazo de ciertos trasplantes entre ratones de distintas cepas endogmicas y la obtencin de aloantisueros mediante inmunizacin con clulas de entre distintas cepas. En el caso humano, el primer antgeno de histocompatibilidad descrito fue Mac (en la actualidad conocido como HLA-A02+*), descubierto por Jean Dousset en 1958, (Figura 5.1). Pronto el propio Jean Dausset y otros investigadores demostraron la existencia de una estrecha relacin entre estas molculas y la supervivencia de riones trasplantados. En la actualidad, son ya centenares los antgenos de este tipo que se han definido en humanos gracias a la intensa colaboracin establecida entre los laboratorios que trabajan en histocompatibilidad, a travs de los Workshops Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran peridicamente. En este captulo estudiaremos la estructura de estas molculas y la organizacin de los genes que las codifican. Tambin se estudiarn las funciones de estas molculas en la presentacin de pptidos a los receptores TCR de las clulas T y su implicacin en la eliminacin de timocitos potencialmente autorreactivos. Por otra parte se estudiara el alcance de polimorfismos de las mismas y su importancia en la definicin del individuo como ser biolgicamente nico y su utilidad en el diagnstico de ciertas enfermedades, estudios de paternidad y de migraciones de poblaciones humanas.

Estructura y funcin molculas histocompatibilidad

Segn su estructura las molculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes grupos: molculas de histocompatibilidad clase I y clase II con estructuras y funciones diferentes. Entre las primeras se encentran las molculas clsicas de clase I que corresponde con los antgenos HLA-A, B C y las molculas no clsicas entre las que se encuentran HLA-E, F, G y CD1. Las molculas HLA clase II pueden ser HLA-DR, DQ y DP. (Tabla: Clases y formas de HLA) Estructura de las molculas HLA de clase I Las molculas HLA clase I se encuentran constituidas por 2 cadenas polipeptdicas: una cadena pesada, glicosilada, de mayor tamao, que se encuentra asociada, mediante interacciones no covalentes a una cadena ms pequea, cadena ligera, la -2-microglobulina. (Figura: HLA I y II). La cadena pesada, es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la responsable del polimorfismo antignico de las molculas de histocompatibilidad clase I, mientras que la cadena ligera es igual en todos los individuos (Figura: Variabilidad HLA).

En la cadena pesada, se distinguen tres zonas bien definidas, una zona extracelular de mayor tamao y otras ms pequeas que corresponde a la regin transmembrana, e intracitoplasmtica. La zona extracelular se halla organizada en tres dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados -1, -2 y -3 mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios. Los dominios -1 y -2 constituyen regiones de contenido variable en aminocidos mientras que el dominio -3 es bastante y pertenece a la superfamilia de las Igs y por tanto muestra una notable homologa con la regin constante de las inmunoglobulinas y con la -2 -microglobulina

La cadena -2-microglobulina, es un polipptido idntico al encontrado en el componente srico y los genes que la codifican no se encuentran en el MHC, situndose en el cromosoma 16 en el hombre. El anlisis estructural de la -2-microglubulina revela que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, con una notoria homologa con el tercer dominio constante de la cadena pesada de las mismas. (Figura Estructura HLA-I) Estructura de las molculas HLA clase II. Las molculas de clase II son glicoprotenas que se encuentran en la superficie celular y estn formadas por dos cadenas, y unidas entre s mediante interacciones de naturaleza no covalente. Tanto la cadena como se encuentran codificadas por genes situados en el MHC. Estn constituidas por dos dominios extracelulares, -1 y -2 y -1 y -2 en cada una de ellas. Estructura tridimensional. El anlisis de la estructura tridimensional de los antgenos de histocompatibilidad de clase I y clase II, determinada mediante cristalografa, demuestra que los dominios estn estructurados de forma diferente. As, dentro de los antgenos clase I, el dominio -3 y la -2-microglobulina estn organizados en estructura de hoja plegada . Por el contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona formada por cuatro fragmentos en estructura de hoja plegada seguido de otro segmento organizado en forma de a-hlice. Esta organizacin delimita una hendidura denominada sitio de unin al pptido (peptide binding groove) en el que los residuos ms polimrficos se encuentran en el suelo y las paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un pptido que no pertenece a la molcula y de aproximadamente 8-10 aminocidos. Ese pptido procede de protenas endgenas, como veremos en el captulo siguiente e interacciona con las molculas de histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas estructuras. Un determinado antgeno de histocompatibilidad puede unirse a pptidos diferentes siempre que stos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la molcula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimrficos. La estructura tridimensional de los antgenos de clase II tambin ha sido determinada por cristalografa y es semejante a la de los antgenos de clase I. Los dos dominios proximales ( 2 y 2) son los equivalentes al dominio -3 y a la -2-microglobulina de los antgenos clase I, mientras que los dos dominios distales (-1 y -1) de los antgenos clase II se corresponden con los dominios -1 y -2 de la molcula clase I. La hendidura donde se ubica el pptido se forma entre los dominios -1 y -1 de las molculas clase II. Distribucin tisular de las molculas clase I y II. Las molculas de clase I se encuentran presentes en la mayora de las clulas nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresin es mnima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glndulas de Brunner duodenales, trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central. La expresin de las molculas de clase II se encuentra fundamentalmente restringida a

macrfagos, monocitos, linfocitos B y cuando estn activados tambin en linfocitos T y NK. Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras clulas que actan como presentadoras de antgenos, tales como clulas dendrticas del bazo, epidrmicas de Langerhans o clulas endoteliales. Tambin se encuentran en progenitores hematopoyticos, clulas leucmicas y clulas de diferentes tipos de tumores. Esta distribucin diferencial de las molculas de histocompatibilidad de clase I y II se encuentra directamente relacionada con la diferente funcin de cada tipo de molculas. En suma las molculas de histocompatibilidad estn presentes en la mayora de clulas del organismo actuando as para las clulas del sistema inmunitario "como marcadores lo propio" (el yo inmunolgico) en tanto que han intervenido en el proceso de seleccin de los linfocitos T en el proceso madurativo en el timo y en donde se han eliminado todos aquellos clonos que potencialmente son autorreactivos pero permanecen precisamente aquellos que reconocen a las molculas de histocompatibilidad propias (Tabla: distribucin HLA). Molculas de histocompatibilidad no clsicas Entre este grupo destacan de manera ms significativa, las molculas de histocompatibilidad HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homologa con las molculas clsicas clase I (HLA-A, -B y -C), aunque poseen funciones muy diferenciadas Molcula HLA-E: La estructura tridimensional de la molcula de HLA-E, es muy similar a la de las molculas clsicas HLA-A, B y C presentando sitios de unin conservados para la -2-microglobulina aunque tiene mucho pero no el polimorfismo de las anteriores. Esta molcula se encuentra en la mayora de las clulas del organismo y su importancia radica en que cuando es reconocida por los receptores CD94/NKG2A presentes en la mayora de las NK y ciertos linfocitos T, los inhiben. De esta manera parece que se protegen las clulas del organismo frente a su destruccin sobre todo de clulas NK. Recientemente se ha descubierto que la protena UL40 presente en los citomegalovirus, es capaz de unirse ella, Molcula HLA-F: Se sabe que esta molcula se expresa principalmente en clulas de amgdalas, bazo y timo. La localizacin de la protena es intracelular y est descrito que los tetrmeros de HLA-F se unen a los receptores ILTR2 (LIR1) y ILTR4 (LIR2) que son receptores inhibidores presentes en NK y otros leucocitos.

Molcula HLA-G: esta molcula se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribucin celular y tisular restringida al trofoblasto fetal y clulas del epitelio tmico. Esta molcula puede presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de ellas son protenas unidas a membrana (HLA-G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son protenas solubles (HLA-G5, G6 Y G7). Parece que juega un papel muy importante inhibiendo el sistema inmune de la madre para proteger al feto que en definitiva es un trasplante, debido a contenido paterno presente en el mismo. Familia de molculas CD1. Los antgenos CD1 son glicoprotenas no polimrficas constituidos por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la -2-microglobulina (-2-m). Se ha definido como una molcula presentadora de antgeno presente en la mayora de los mamferos encontrndose tanto en las clulas dendrticas como en timocitos. Mientras que en ratones las molculas CD1 pueden presentar pptidos y molculas no peptdicas como glicolpidos a clulas T, en

humanos slo hay evidencia de presentacin de antgenos no peptdicos de origen microbiano, generalmente a clulas T de TCR restringido Las clulas T implicadas en el reconocimiento de antgeno presentado por CD1 son denominadas NKT. En humanos la familia de los genes de CD1 contiene 5 miembros: CD1A, CD1B, CD1C, CD1D y CD1E, que se agrupan en dos grupos en base a la similitud de la secuencia de aminocidos entre ellas y entre especies. En general, las molculas de CD1 se expresan predominantemente en timocitos y en algunas APCs derivadas de mdula sea como las clulas dendrticas. Se ha descrito que las clulas del epitelio intestinal expresan las molculas de CD1d. GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Como ya se ha dicho, los genes que codifican las molculas de histocompatibilidad que se encuentran agrupados en el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad que se extiende aproximadamente 2-3 centimorgans (aproximadamente 4x106 pares de bases) y en el humano contiene al menos 50 genes distintos. Este grupo de genes se encuentra organizado de forma diferente en las distintas especies, conocindose con precisin la organizacin gentica del MHC en el hombre, sistema HLA. Recientemente se ha propuesto una nueva taxonoma para clasificar los distintos genes que codifican las molculas de histocompatibilidad. (Tabla: Funciones HLA) Complejo Mayor de Histocompatibilidad hombre.

en

el

El Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre est constituido por un grupo de genes situado en el brazo corto del cromosoma 6. El complejo mayor de histocompatibilidad humano es donde se codifican los loci que de los distintos antgenos HLA clase I y II. (Figura Complejo Mayor de Histocompatibilidad) Entre los de clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas a de los antgenos HLA-A, HLA-B y HLA-C y entre los de clase II se encuentran los pares de genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antgenos HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel, como caracteres codominantes simples. La regin gentica de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepcin de los que codifican la beta-2-microglobulina) se denomina haplotipo HLA (Figura Haplotipo HLA) As pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C y los genes clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA- DP. y otros loci que codifican molculas implicadas en el procesamiento de pptidos como son los genes TAP cuyos productos estn implicados en la transferencia de pptidos del citosol al retculo endoplsmico y los genes LMP que codifican componentes del proteosoma responsable de transformar protenas en pptidos que

posteriormente sern presentados en la superficie celular. Asimismo en esta regin se encuentran los genes que codifican algunos factores del complemento, la enzima 21-hidroxilasa, la citocina TNF-alfa y otros genes y pseudogenes con homologa estructural con los genes clase I y clase II con limitado polimorfismo y cuya funcin aun se encuentra insuficientemente aclarada (Figura MHC humano) La existencia de estos diferentes loci fue demostrada por la aparicin espontnea de recombinaciones entre los mismos o la existencia de lneas celulares mutantes, con prdidas de uno o varios loci y ha sido confirmada a lo largo de los ltimos aos por el empleo de tcnicas de biologa molecular que han permitido aislar y secuenciar estos genes. Gracias a estas tcnicas de biologa molecular se ha descubierto la existencia en esta regin de numerosos genes y pseudogenes pero solamente una minora tienen estructura clase I o clase II mientras que la mayora no estn relacionados estructuralmente. Cada clula del organismo, (excepto las clulas germinales), poseen un haplotipo procedente del padre y otro de la madre. La mayora de los genes del MHC son altamente polimrficos, es decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas, prcticamente idnticas en todos los individuos y zonas altamente variables. Cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a nivel genmico. Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos, el nmero de combinaciones tericas posibles en la poblacin considerada en su conjunto es muy alto. A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades subtpicas que aparecen por divisin de otras anteriores y a las antiguas especificidades supertpicas. As por ejemplo, las especificidades HLA-B51 y HLA-B52 se consideran como productos de la divisin del antgeno HLA-B5. De hecho la secuenciacin de los genes HLA ha demostrado que el polimorfismo que es detectado a nivel serolgico es slo una parte del que se encuentra a nivel genmico. As por ejemplo existen numerosos subtipos de HLA-A2 y numerosos subtipos de HLA-B27. Ello ha hecho que se establezca un nuevo sistema de nomenclatura para los diferentes alelos HLA que utiliza la letra del loci seguida de 4 dgitos tal como se muestra en el Apndice. Los dos primeros dgitos seran los de la especificidad serolgica y los otros dos indicaran la especificidad detectada por secuenciacin. Los haplotipos heredados de cada padre van a determinar el genotipo del hijo, es decir, el genotipo de ste ser la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de la madre (Figura Herencia haplotipos). Se ilustra grficamente todo lo anteriormente expuesto.

En una familia determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y (b) = A3, B7, Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, Cw2, DR2 y (d) = A11, B13, Cw3, DR5 los hijos podrn heredar cuatro combinaciones distintas de estos haplotipos, siendo (a, b), (b, c) y (b, d) los posibles genotipos resultantes. Tras la secuenciacin del Complejo Mayor de Histocompatibilidad se conoce que esta regin la forman ms de 200 loci, muchos de los cuales an son funcionalmente desconocidos, aunque posiblemente solo la mitad juegue un papel en la funcin del sistema inmune. Probablemente el estudio del polimorfismo de esta regin ayudar a comprender por qu unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance ser una importante herramienta para el estudio filogentico, la biologa y la evolucin de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad. Loci HLA-A, B, C. La regin que codifica las molculas de clase I est dividida en tres loci, conocidos como A (Tabla I) , B (Tabla II-III) y C, (Tabla IV) que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas molculas de clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados mediante tcnicas de hibridacin de DNA y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrndose una estructuracin homloga a los genes que codifican la b-2 microglobulina, las inmunoglobulinas y otros tipos de protenas. El prototipo de gen que codifica molculas de clase I, se encuentra dividido en 8 exones, cada uno de los cuales, se corresponde a cada dominio estructural de la molcula. Si bien se conoce con precisin la funcin de estas tres familias de antgenos de histocompatibilidad de clase I expresados en la superficie celular, se ha demostrado la existencia de otros genes que tambin codifican otros antgenos HLA de clase I con menor polimorfismo y cuya expresin es variable, tanto en su distribucin tisular como en la densidad de la membrana celular. Entre estos genes se incluyen: HLA-E, HLA-F y HLA-G. Gen HLA-E: Este gen presenta una secuencia parecida a la molcula Qa1 murina, que une pptidos hidroflicos de la secuencia leader de las molculas MHC clsicas. Se expresa en pequeas cantidades en la superficie de la clula, y su expresin est regulada por la presencia de las otras molculas de histocompatibilidad presentadas en la superficie celular y es TAP dependiente. Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes de las molculas clsicas. Se transcribe en una gran variedad de clulas y tejidos presentando un polimorfismo limitado. Gen HLA-G: Este gen presenta la estructura tpica de la HLA clase I y su expresin parece estar restringida a la placenta y se asocia con funciones de carcter tolerognico. Regin HLA-D En la regin D se localizan los genes que codifican las molculas HLA-DR (Tabla V-VI ), HLA-DQ (Tabla V ) y HLA-DP. Su anlisis bioqumico demuestra que se trata de molculas de clase II compuestas, como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b. Las molculas HLA-DR y HLA-DQ se estudiaron por serologa y los antgenos HLA-DP fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulacin secundaria de linfocitos previamente sensibilizados (PLT). El empleo de tcnicas de biologa molecular ha permitido el aislamiento y secuenciacin de los genes de esta regin, de manera que hoy se conoce con precisin que la regin D posee un elevado nmero de genes. Los genes de la familia DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena DRalfa y posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que codifican cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo. Se han descrito otra serie de pseudogenes DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse an su funcin y expresin. La cadena proteica DR puede combinarse (Figura Recombinacin genes clase II) Con las diferentes

cadenas codificadas por los genes DRB dando origen a las mol culas de clase II portadoras de las especificidades HLA-DR (la unin de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1 y las especificidades HLA-DRw51, 52 y 53 (la unin de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB5, DRB3 o DRB4, respectivamente). Tanto las familias DQ como DP contienen dos pares de genes, es decir dos genes a y dos genes b, prximos entre s y todos poli- mrficos. Slo uno de estos pares, DQA1 y DQB1 y DPA1 y DPB1, codifican las cadenas a y b de las molculas de clase II HLA-DQ y HLA-DP respectivamente. Los otros 2 pares de genes DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y DPB2 poseen un limitado polimorfismo y no se encuentran expresados en la superficie celular. Adems existe otra subregin que contiene un gen a, denominado DNA, y un gen beta, DOB, que podran codificar un nuevo tipo de molculas clase II. Por otra parte tambin se han localizado una nueva pareja de genes, HLA-DM, no polimrficos, que se encuentran implicados en el proceso de procesamiento y presentacin de antgeno como se expone en el prximo captulo. Cada uno de estos genes est estructurado en secuencias de intrones y exones relacionados con los dominios estructurales de la protena codificada por ellos.

FUNCIN MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Las molculas de histocompatibilidad estn presentes en la mayora de clulas del organismo actuando as para las clulas del sistema inmunitario "como marcadores lo propio" (el yo inmunolgico) en tanto que han intervenido en el proceso de seleccin de los linfocitos T en el proceso madurativo en el timo y en donde se han eliminado todos aquellos clonos que potencialmente son autorreactivos pero permanecen precisamente aquellos que reconocen a las molculas de histocompatibilidad propias. Complementariamente a lo indicado anteriormente, la funcin biolgica ms relevante de las molculas de histocompatibilidad propias presentes en las clulas del organismo es la de presentar pptidos antignicos para la activacin de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen molculas HLA clase I y su pptido, pertenecen a la subpoblacin de linfocitos citotxicos mientras que las clulas T que reconocen molculas HLA clase II en su la mayora tienen la funcin de producir citocinas (Tabla funciones HLA). Polimorfismo HLA. El complejo mayor de histocompatibilidad posee un nmero extraordinariamente grande de alelos diferentes en cada locus y es uno de los complejos genticos ms polimrficos que se conocen en vertebrados superiores. Estos alelos difieren en sus secuencias de DNA de una persona a otra y en el nmero de aminocidos entre los alelos. El anlisis de genes de ha revelado mas de mil alelos para HLA clase I y ms de 500 para clase II. Este enorme polimorfismo da como resultado una gran diversidad de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad dentro de una especie.

Todo ello permite calcular una enorme cantidad de diferentes haplotipos clase I y clase II posibles en la poblacin humana, pero como cada haplotipo contiene genes tanto de clase I como de clase II, las cifras se multiplican para obtener un total superior a 5 x 10" posibles combinaciones de estos alelos. Las variaciones de un alelo a otro no estn distribuidas al azar, sino que se concentran en las regiones de la molcula que estn ms relacionadas en la interaccin de estas molculas con los pptidos antignicos. (Tabla Polimorfismo HLA) Desequilibrio de ligamento El clculo del nivel de polimorfismo calculado segn el nmero de alelos es inferior al que realmente se presenta en a poblacin. Este fenmeno se conoce como desequilibrio de ligamento que corresponde, pues, a la diferencia entre la frecuencia observada para una combinacin particular de alelos y la esperada con base en las frecuencias de los mismos en los distintos individuales. Para explicar este fenmeno, se han propuesto la intervencin de varios procesos que no seran excluyentes los unos de los otros. Uno de ellos es que los haplotipos con representacin mayor en la poblacin actual reflejaran las combinaciones de alelos presentes en los fundadores (esto es por ejemplo lo que ocurrira en la poblacin india de americana). Otra es que se presente como consecuencia de los efectos del proceso evolutivo; por ejemplo, algunas combinaciones de alelos proporcionaran resistencia a ciertas enfermedades y haran que se seleccionaran y estuvieran representadas en mayor frecuencia mientras que otros que podran generar efectos perjudiciales, como mayor susceptibilidad enfermedades autoinmunes, y se expresasen con menor frecuencia debido a un proceso de seleccin negativo. Por ltimo es necesario resalta tambin que en ello puede intervenir el hecho de que unas zonas del DNA sean ms propensas a al entrecruzamiento entre los alelos que otras. Cmo se genera la diversidad de las molculas HLA? Las molculas HLA que una persona expresa estn fijadas en los genes y no cambian con el tiempo como hemos visto parta las inmunoglobulinas en los RCTs que se pueden ir generando de manera dinmica mediante procesos somticos, que incluyen reorganizacin gnica y mutacin somtica de los genes. La diversidad de molculas HLA de una especie proviene del polimorfismo que implica la presencia de mltiples alelos en un locus gentico dentro de la especie humana. La diversidad de molculas HLA en un individuo se debe no solo a la presencia de diferentes genes sino tambin a los diferentes alelos que cada uno de ellos se pueden presentar en cada individuo y muy excepcionalmente a mutaciones acaecidas en los genes del complejo mayor de histocompatibilidad acaecida en el momento de conformarse los genes de la descendencia (Tabla: generacin diversidad HLA). Todo hace indicar que el polimorfismo del CMH evolucion con el objeto de contrarrestar la evolucin de los microorganismos hacia variantes cuyos pptidos no son presentados por las molculas del CMH y evitar de esa manera su patogenicidad una el que infectan al organismo. La lucha entre el individuo y

microorganismos, existen desde molcula mismo origen del mismo dado que los microorganismos existen desde antes que el propio individuo, Obviamente si se evade la presentacin antignica de los microorganismos, stos adquieren la capacidad de establecer una infeccin sin ser detectados por el sistema inmune. Por lo tanto, el sistema inmune ha ido mutando los genes del CMH para generar una alta variabilidad en el sitio de unin al pptido de manera de anular la posibilidad de los microorganismos de generar variantes cuyos pptidos no son presentados por las molculas del CMH. Esta presin de seleccin hizo que la frecuencia de sustituciones de secuencias en diferentes alelos del CMH sea muy superior a lo esperado si el proceso fuera una simple introduccin de mutaciones al azar. Sin embargo muchos virus han desarrollado mecanismos de escape del sistema inhibiendo la expresin de molculas HLA y que hay que tratar con IFN por su capacidad de aumentar la expresin de las mismas y as combatir ele efectos potencialmente deletreos de los mismos. Factores inductores de la Generacin de polimorfismo La diversidad en las molculas HLA se va generando de manera permanente aunque lenta han influido mltiples factores y circunstancias. Entre ellas destacona grmenes frente a los cuales tiene que defenderse el individuo y tambin parecen ser decisivos otras fuerzas naturales como son el hecho de la reproduccin sexual y la eleccin de pareja que ello conlleva y que la implantacin embrionaria en el tero es ms factibles en embriones mas heterocigticos as como la progresin del embarazo presentan menos complicaciones feto heterocigticos que homocigticos. Efectivamente, a mayor cantidad de alelos, mayor ser la variabilidad y posibilidades de unin de los distintos pptidos a las molculas HLA. Esto trae como consecuencia que la respuesta inmune mediada por linfocitos T contra cualquier agente patgeno ser ms amplia y eficiente y en consecuencia ms ventajosa la capacidad de defensa a mayor polimorfismo lo que les da a las personas ms poliformas ms posibilidades de sobrevivir ante plagas o infecciones concretas y de la evolucin. Todo ello justifica que al correr del tiempo desaparecen de las poblaciones con menos capacidad de defensa (por ejemplo en una plaga en la antigedad) y slo sobreviven los ms aptos. Por ejemplo al paludismo, sobre todo a la forma grave o el mayor grado de progresin a SIDA de las personas infectadas por el virus HIV que son homocigticas en relacin a las heterocigticas.

Tipaje HLA. Se denomina tipaje HLA, al anlisis que se realiza en el laboratorio para conocer las molculas de histocompatibilidad o los alelos HLA de un determinado individuo mediante mtodos serolgicos o de sus genes por biologa molecular (Figura Tipaje HLA) El tipaje HLA tiene especial inters en las siguientes situaciones:

Estudio de la asociacin con distintas formas clnicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente est asociada a DR3 y DR4 En trasplantes de rganos y medula sea y en Estudios de filiacin familiar. La mayora de los genes del HLA son altamente polimrficos, como ya se explic en el apartado anterior, y cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a nivel genmico. As se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA.

Mtodo Serolgico. El mtodo serolgico ms comnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una poblacin de linfocitos a una batera de sueros o anticuerpos monoclonales que son especficos para cada uno de los antgenos posibles. Posteriormente se aade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero especfico para los antgenos de un individuo determinado, se producir la lisis celular que podr ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una tcnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etdio. El bromuro de etdio se fija al ADN de las clulas muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que tie a las clulas vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular (Figura Tipaje serolgico) Para llevar a cabo la tipificacin de los antgenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas clulas los antgenos de clase II se expresan ms abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las clulas T expresan cantidades significativas de molculas MHC de clase II slo cuando estn activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de linfocitos totales a travs de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las clulas B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulacin mecnica de la columna de la que previamente se han eliminado, por lavado, las clulas no adherentes. Existe a su vez, otro mtodo ms utilizado y menos perjudicial para la separacin de las clulas B que consiste en el uso de microesferas magnticas acopladas a anticuerpos contra antgenos especficos de estas clulas (el antgeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego stas se separan en un campo magntico (con un imn) y se lavan para proceder a su tipificacin por serologa. Mtodos de Biologa Molecular Las tcnicas de biologa molecular ms usadas (no las nicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los mtodos de: a. Secuenciacin directa del ADN. b. Anlisis del tamao de los fragmentos de restriccin del ADN (RFLP restriction fragment lenght polymorphism). c. Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). La secuenciacin directa del ADN no es prctica para

su uso rutinario. Actualmente son utilizadas tcnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR. La tcnica de RFLP incluye la fragmentacin del ADN con enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibridacin con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con istopos radiactivos o con enzimas y la deteccin del producto por autoradiografa, quimioluminiscencia o colorimetra. La tcnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas horas (ver captulo sobre mtodos inmunolgicos). Las tcnicas que actualmente ms se utilizan para realizar tipaje HLA son PCRSSO y PCR-SSP. La PCR-SSO (Figura Tipaje por biologa molecular) se basa en la amplificacin de la zona polimrfica del ADN por PCR, hibridacin con oligonucletidos especficos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la tcnica de PCR-SSP (Primers especficos de secuencia) slo se consigue amplificacin en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son especficos por lo tanto lo nico que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. Regulacin de la expresin de los genes del MHC En la parte 5' no traducida de los genes se encuentran las reas reguladoras (llamadas elementos cis) constituidas por el promotor (rea estrictamente necesaria) y los aumentadores e inhibidores que modulan la expresin basal de los genes. El promotor suele estar situado a una distancia de unas 300 bases desde el inicio de la transcripcin, mientras que los aumentadores o inhibidores se encuentran a distancias variables. Sobre estas reas cis se fijan unas protenas llamadas factores de transcripcin (elementos trans) que son necesarios para que se active la polimerasa II, enzima que inicia la transcripcin. En muchos casos, la induccin de la expresin de los genes se debe a modificaciones posttranstraducionales de estas protenas como son la fosforilacin o la glicosilacin. Hasta ahora no se conoce el mecanismo exacto de la expresin de los genes de clase I y II aunque se han descrito algunos de sus elementos cis y trans. Los genes de clase I y -2-microglobulina tienen regiones cis muy parecidas y su expresin est coordinada. Se han detectado tres regiones cis en el promotor a las que se unen factores de transcripcin y que se llaman aumentadores A y B y entre ellos el IRE (elemento de respuesta al interfern) (Figura Regulacin genes). Adems, existen dos inhibidores en dos regiones a unas -700 y -400 bases. Sobre las reas cis se unen factores de transcripcin que no son especficos del promotor de clase I, sino que regulan muchos genes. En la regin I del aumentador A se une RXRb que es un elemento de la familia de los receptores de la hormona tiroidea y del cido retinoico y que se une a AP-1 (Protena Activadora 1) que es un complejo de los oncogenes jun y fos originando un heterodmero

que aumenta su afinidad por el DNA. En la regin II del aumentador A se une el NF-kB (Nuclear FactorkB). En la regin IRF se unen protenas que se inducen por efecto del interfern y que se fosforilan por una tirosina qui- nasa. Por ltimo, en el aumentador B parece que se unen protenas del grupo AP-1 que responde a la induccin con AMP cclico. En el promotor de todos los genes de clase II y de todas la especies descritas, existen tres reas con secuencias que tienen una gran homologa entre los genes y que se denomina X, Y y W separadas entre s por unas 20 bases. Estas reas son esenciales para la transcripcin (elementos cis) y sobre ellas se unen una serie de factores de transcripcin. La caja Y contiene una secuencia CCAAT sobre la que se une el NFY (Nuclear Factor Y) compuesto por dos protenas A y B, ambas se requieren para una unin eficiente al DNA. Sobre la caja W se une un factor no caracterizado hasta ahora y sobre la caja X, dependiendo del extremo 5'(X 1 ) se han descrito protenas RF-X y NF-X y sobre el extremo 3'(X 2 ) se unen hXBP y el complejo AP-1 (fos-jun) aunque estas interacciones con el DNA no estn muy claras. La distancia crtica que separa estas cajas sugiere que los factores de transcripcin que se unen a ellas interaccionan dando lugar a que se inicie la transcripcin. Sin embargo, no sabemos que es lo que hace que se induzca clase II por efecto del gamma-interfern o porque en algunos casos la induccin de clase II sea constitutiva. Otros genes del sistema HLA. Situados en el complejo HLA se encuentran un grupo de genes que codifican tanto el componente Bf de la cascada alternativa del complemento, como los componentes de la va clsica C2 y C4 que se estudian en el captulo dedicado al complemento. Otros genes de esta regin y de inters en la respuesta inmune son los genes que codifican Las formas y del factor de necrosis tumoral (TNF-) HSP (Heat Shock Protein) lmp que codifican los componentes del proteosoma y TAP1 y 2 que son protenas transportadoras. Estas estructuras como veremos en el captulo 6, poseen una gran importancia en la funcin de procesamiento antignico asociada a las molculas del MHC. Tambin dentro del sistema HLA e ntimamente relacionado con los genes anteriores, se encuentran los genes que codifican la enzima 21-hidroxilasa, que participa en el metabolismo de ciertas hormonas sexuales. Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el ratn. El complejo mayor de histocompatibilidad en el ratn se ha llegado a conocer despus de diversos procesos de recombinacin gentica de ratones hasta la obtencin de cepas recombinantes (Figura Ratones recombinantes). Incluye varios loci, entre ellos los K, IA, IE, S y D y como en el humano, cada locus contiene uno de varios genes alternativos.

Como en el humano, los genes H-2 se heredan en bloque (como haplotipos), son codominantes y se segregan siguiendo las leyes de Mendel (Figura ratones recombinantes). En la (Tabla Haplotipos H-2) se muestran los distintos haplotipos H-2 de las cepas murinas ms comunes y en la Figura 5.16 se compara la organizacin del complejo de histocompatibilidad murino con los de otras especies. Mecanismo de polimorfismo generacin de

El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolucin a lo largo de miles de millones de aos como consecuencia de la presin evolutiva ejercida por los agentes infecciosos. Para la generacin de este elevado polimorfismo el MHC ha utilizado diferentes mecanismos que han contribuido de diferente forma a la creacin de nuevos alelos. As, algunos son el resultado de mutaciones puntuales mientras que otros proceden de la combinacin de secuencias completas entre diferentes alelos, bien mediante un proceso de recombinacin gnica o bien mediante el proceso denominado conversin gnica, segn el cual una secuencia es reemplazada por otra semejante de un gen homlogo. La recombinacin entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo ms frecuentemente utilizado para la creacin del polimorfismo y as muchos alelos diferentes pueden proceder de procesos de recombinacin repetidos a partir de un pequeo nmero de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la funcin de los antgenos de histocompatibilidad. Ventajas y desventajas aportadas por polimorfismo HLA Para un individuo, la ventaja de tener mltiples genes del CMH de clase I y de clase II es que estos genes aportan diferentes especificidades de unin a los pptidos, lo que permite que se pueda presentar un mayor nmero de pptidos derivados del patgeno durante cualquier infeccin determinada. Esto

mejora la potencia de la respuesta inmunitaria contra el patgeno al aumentar el nmero de linfocitos T especficos del patgeno activados. El mismo argumento es vlido para el polimorfismo de cualquier locus determinado del CMH; la ventaja de ser heterocigoto es que pueden ponerse en juego dos especificidades diferentes de HLA, en comparacin con una sola en el caso del homocigoto. Adems, el alto grado de polimorfismo de los isotipos presentadores de antgeno del HLA asegura que la mayora de los miembros de la poblacin sean heterocigotos. Sin embargo, la magnitud de la ventaja de ser heterocigoto variar de acuerdo con la diferencia de especificidades de unin a los pptidos de los dos alotipos. Puede suponerse que este tipo de ventaja surge de una seleccin compensadora porque acta para mantener una variedad de isoformas del CMH en la poblacin al tener ms posibilidades de sobrevivir. Ejemplos de este fenmeno de distribucin selectiva de un determinado alelo que confiere ventajas evolutivas al antgeno en una poblacin son frecuentes. Veamos por ejemplo lo que ocurre en oeste de frica don del el paludismo es endmico y mortal en algunos casos. Pues bien se ha visto que los individuos de dichas zonas suelen enfermarse desarrollando un cuadro leve de la enfermedad lo que no ocurre con los individuos de otras zonas o endmicas para el paludismo de frica. Hoy sabemos cmo esta resistencia est ligada antgeno la presencia de una molcula HLa clase I, HLA-Bw52, que se encuentra en muy alta proporcin en las regiones arriba indicados y por el contrario en muy baja proporcin en otras regiones en donde el paludismo no es endmico. (Tabla Ventajas y desventajas del polimorfismo) As los individuos que no tiene este antgeno moriran ms fcilmente antes de procrear, con lo que al pasar el tiempo solo sobreviviran los ms aptos, que son los que posen la molcula HLA-Bw53 que como decimos confiere la capacidad de defensa frente al paludismo. En suma se ha efectuada una seleccin positiva del antgeno HLQA-Bw53 que ha hecho que se mantengan en la poblacin debido antgeno que proporciona una clara ventaja evolutiva en las regiones donde el paludismo es endmico. Una cuestin interesante es lo que ocurre con las enfermedades reumtica tan ampliamente ligas a genes de del CMH y es que no estn influyendo en un proceso de seleccin negativa de la poblacin que los porta. Una explicacin a ello deriva del hecho de que la manifestacin de estas enfermedades es tarda (habitualmente pasados los 35-40 aos) fecha ya en donde se ha realizado la seleccin de pareja y esta ha procreado. En este mismo sentido es de destacar que incluso se observa una seleccin favorecedora de procesos autoinmunes (reumticos sobre todo) y ello tiene su explicacin en el hecho de que el haplotipo mas autoinmuntiario es a la vez el haplotipo con mayores potencialidades defensivas frente a la infeccin como es en la actualidad la epidemia actual de infeccin por VIH proporciona una oportunidad nica para estudiar los efectos del polimorfismo del HLA sobre una enfermedad infecciosa. As se sabe que el carcter de heterocigoto para el HLA proporciona grande ventajas (Figura: Sida y HLA). Como desventajas del polimorfismo HLA cabe destacar el mayor nmero de enfermedades autoinmunes presentadas en estos individuos, los inconvenientes de la realizacin de trasplantes por incompatibilidad entre donante y receptor y la dificultad en el generacin de vacunas de tipo celular (Tabla: ventajas y desventajas polimorfismos HLA). Asociacin entre HLA y enfermedad

Desde hace varias dcadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociacin cuando tiene un valor estadsticamente significativo, se viene considerando como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer una determinada enfermedad. Esto puede cifrarse estadsticamente como riesgo relativo (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen. Efectivamente, a pesar del alto polimorfismo de las molculas HLA y de la ampliacin del nmero de subtipos allicos de clase I y de clase II, hoy se conocen diversas enfermedades que estn asociadas a clase I y otras a clase II. El nmero de enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II (Tabla Enfermedades asociadas) Las causas de esta asociacin HLA y enfermedad no son conocidas completamente. Por ejemplo en espondilitis anquilopoytica (EA), enfermedad invalidante y que afecta a las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociacin con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos pptidos antignicos de origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 especficamente que inducira fenmenos de autoinmunidad, bien por generar en la molcula B27 modificaciones conformacionales que la haran no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-pptido con cierta similitud con antgenos bacterianos que provocaran reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLA-B27, previamente sensibilizados a tales antgenos bacterianos. En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destruccin selectiva de los islotes de Langerhans del pncreas, con infiltracin linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antgenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.

Procesamiento y presentacin de antgenos

Los linfocitos, las nicas clulas con receptores especficos para antgenos, son responsables de iniciar y llevar a cabo la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos B interaccionan con el antgeno mediante su receptor (BCR), una inmunoglobulina de membrana (mIg) que reconoce determinantes antignicos tridimensionales en protenas y otras molculas antignicas, solubles o particuladas, en estado nativo. En cambio, el receptor clonotpico de los linfocitos T (TCR) reconoce complejos moleculares en la membrana de las clulas presentadoras de antgeno (APC), formados por molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I (MHC-I) o de clase II (MHC-II) y pptidos antignicos resultantes de la degradacin intracelular del antgeno. Las clulas T, por tanto, a diferencia de los linfocitos B, necesitan de clulas presentadoras de antgeno (APC) accesorias que captan el antgeno, lo procesan y lo presentan en la membrana. El TCR interacciona molecularmente con el pptido contenido en la cavidad de las molculas del MHC y con las propias molculas presentadoras, de forma que

el reconocimiento del antgeno por el linfocito T, tal como se ha visto en captulos anteriores, queda restringido por el MHC (Figura 6.1). El fenmeno de la restriccin por el MHC del reconocimiento de antgeno fue originalmente descrito por Zinkernagel y Doherty (1974) en la respuesta de los linfocitos T al virus de la linfocoriomeningitis (LCV). Estos investigadores demostraron que las clulas T citotxicas especficas de virus slo reconocen las clulas infectadas si stas expresan determinadas molculas de histocompatibilidad en su superficie. Este trabajo mereci el Premio Nobel de Medicina en 1996. CLULAS PRESENTADORAS DE ANTGENO Y SU FUNCIN Los requerimientos para la presentacin de antgeno de las clulas son: capacidad de captacin de antgenos del medio externo, maquinaria proteoltica eficiente que permita la degradacin del antgeno en pptidos capaces de ser presentados, expresin de molculas de MHC-II y expresin de molculas coestimuladoras y de adhesin. Los tres tipos celulares que cumplen en diferentes grados estos requisitos, llamadas APC profesionales, son las clulas dendrticas, los macrfagos y los linfocitos B. Existen otras estirpes celulares que, an no siendo APCs profesionales, son capaces de expresar molculas de MHC-II bajo determinadas condiciones, tales como clulas endoteliales y fibroblastos. Clulas dendrticas como presentadoras de antgeno. Mientras estn en estado inmaduro, las clulas dendrticas tienen gran capacidad de captacin de antgeno del medio y una maquinaria proteoltica eficiente, expresan bajos niveles de MHC y de molculas coestimulatorias; expresan receptores Fc (CD32), de manosa y de complemento, implicados en captacin de antgeno por endocitosis, fagocitosis y, sobre todo, macropinocitosis. Al activarse su maduracin en presencia de citocinas inflamatorias, aumenta considerablemente su capacidad de macropinocitosis y la expresin de receptores que permiten la captacin de antgeno; tambin se activa la sntesis de molculas de MHC-I y II que unirn con gran eficiencia tanto pptidos originados en la propia clula dendrtica como pptidos externos que se hallan en el lugar de inflamacin. Desde el sitio de la herida, las clulas dendrticas maduras expresan un alto nmero de complejos MHC/pptido de alta estabilidad en su membrana, paran la sntesis de novo de MHC, pierden la capacidad de captacin de antgeno y la expresin de algunos receptores iniciando su migracin los rganos linfoides secundarios (ganglios linfticos, bazo o mucosas). Durante el transporte de los tejidos perifricos a los rganos linfoides por los vasos linfticos, las clulas cambian de morfologa y reciben el nombre de clulas veladas (veiled cells). A su llegada a los rganos linfoides secundarios, las clulas dendrticas maduras se emplazan en las zonas ricas en clulas T (recibiendo el nombre de clulas dendrticas interdigitantes) donde realizan su funcin de presentar pptidos a clulas T especficas que all se encuentren, inicindose as la respuesta inmune contra el agente agresor. Las clulas dendrticas son especialmente eficientes en la activacin y estimulacin de clulas T pre-inmunes, tanto CD8 como CD4. Mediante la unin de pptidos exgenos o endgenos a sus molculas de MHC-I, altamente expresadas, pueden iniciar una respuesta de clulas T CD8+, incluso simultnea a la activacin de clulas T CD4+. Por otra parte, se las ha propuesto como responsables en gran parte del mantenimiento de la memoria T ya que los complejos MHC-II/pptido formados permanecen expuestos en su membrana durante un perodo de tiempo largo proporcionando a las clulas T de memoria un contacto continuado con el antgeno que las ha estimulado en la respuesta primaria. Macrfagos como clulas presentadoras de antgeno Los macrfagos activados en el lugar de infeccin inician un proceso de fagocitosis muy activo mediante receptores especficos, receptores tipo toll (TLR) y receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en los patgenos. Los macrfagos tambin

pueden endocitar antgenos opsonizados con molculas del complemento o anticuerpos, va receptores del complemento o receptores Fc (CD64, CD32, CD23). Los monocitos y macrfagos no activados expresan niveles bajos de MHC-II, en cambio en los macrfagos activados se induce la expresin de molculas de clase II y las molculas accesorias en su superficie que aumentan su capacidad de presentacin de antgeno. Consecuencia de la activacin, los macrfagos secretan quimiocinas que reclutan clulas inflamatorias y citocinas implicadas en la activacin de las clulas T como IL-12 dirigiendo la respuesta adaptativa en las fases iniciales. Linfocitos B como clulas presentadoras de antgeno. Los linfocitos B pueden actuar como clulas presentadoras de antgeno ya que expresan MHC-II constitutivamente, expresin que aumenta cuando se activan, aunque su capacidad de captacin de antgeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son clulas presentadoras muy eficientes si expresan una inmunoglobulina de superficie (BCR) especfica del antgeno. La eficiencia de la presentacin de un antgeno por clulas B aumenta 100-1000 veces cuando el antgeno se internaliza tras su unin con el BCR, permitiendo que un antgeno se presente con gran eficiencia incluso en bajas concentraciones. La presentacin de antgeno a linfocitos T especficos es parte esencial de la completa activacin y diferenciacin de la clula B en clula plasmtica productora de anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la colaboracin de los linfocitos T. La presentacin de antgeno es su forma de obtener esta colaboracin. La interaccin entre clulas T y B especficas del mismo antgeno requiere segundas seales producidas a partir de la interaccin entre CD40 en la clula B y CD40L en la clula T y por la interaccin entre la IL-4 producida por los linfocitos T y su receptor en la clula B. El papel de las clulas B como APC se refuerza en la respuesta secundaria contra el antgeno, ya que existen un mayor nmero de clulas B especficas expandidas durante la respuesta primaria. Clulas presentadoras de antgeno no profesionales. En humanos, las clulas endoteliales expresan molculas del MHC-II y molculas accesorias que aumentan en condiciones de inflamacin y se las ha implicado en la presentacin de antgeno en reacciones de hipersensibilidad retardada en tejidos perifricos. Adems existen otras clulas, como las epiteliales o los fibroblastos que en presencia de citocinas, especialmente IFN-gamma, expresan MHC-II y como consecuencia podran presentar antgeno en determinadas situaciones. Por otra parte, todas las clulas nucleadas que expresan MHC-I pueden presentar antgeno a clulas T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta inmune. CAPTACIN Y PROCESAMIENTO DE ANTGENO Los antgenos deben de ser captados y despus procesados por las APCs. El procesamiento de antgeno es el conjunto de mecanismos de degradacin de antgenos tanto exgenos como endgenos para su presentacin a clulas T una vez unidos a las molculas de MHC de clase II. Captacin de antgenos exgenos Las clulas captan antgeno exgeno por endocitosis, mediada o no por receptor, proceso por el que la clula incorpora en su citoplasma materiales del medio externo. Se distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. Pinocitosis es la captacin de lquido extracelular en el que se hallan los antgenos en forma soluble, llamada macropinocitosis cuando la clula es capaz de captar grandes volmenes de fluido que despus concentra, mecanismo clsico de las clulas dendrticas.

La fagocitosis es un proceso utilizado por fagocitos mononucleares, neutrfilos y otras clulas para ingerir y eliminar partculas de gran tamao, incluidos agentes infecciosos, clulas seniles y restos celulares. La internalizacin de la partcula se inicia por la interaccin de receptores en la superficie de la clula con ligandos de la superficie de la partcula o por simple invaginacin mecnica de la membrana. Procesamiento de antgenos Despus de la internalizacin, la vescula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusin con compartimentos de la va endoctica en varios pasos, que culminan en la formacin de lisosomas. La va endoctica est constituida por distintos tipos de vesculas cuyo contenido se va modificando a medida que van madurando en el interior de la clula. El pH del interior de estas vesculas es bajo y va acidificndose a medida que stas van evolucionando haca lisosomas. Las primeras vesculas de la va endoctica son los endosomas tempranos que evolucionan a endosomas tardos, pasan a prelisosomas y finalmente se transforman en lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los caracterizan. El procesamiento de antgeno consiste en la desnaturalizacin y protelisis de las protenas captadas en las vesculas acdicas. Las proteasas son activas a pH bajo de forma que si tratamos las APCs con agentes lisosomotrpicos que alcalinizan las vesculas endocticas, como la cloroquina o el cloruro amnico, se bloquea el procesamiento, la generacin de pptidos y, por tanto, la presentacin del antgeno. BIOSNTESIS MOLCULAS DEL MHC Las molculas del MHC son glicoprotenas de membrana cuya funcin es presentar el antgeno en forma de pptidos a los linfocitos T en la respuesta inmune. Las molculas del MHC se dividen en dos clases: de clase I y de clase II y, aunque ambas son protenas de membrana, la va biosinttica y de exocitosis que utilizan es distinta e influye en el tipo y origen de los pptidos que presentan. Va biosinttica de MHC-I Las molculas de clase I estn formadas por una cadena pesada (cadena alfa) y la beta-2microglobulina (beta-2-m) cuya asociacin se lleva a cabo en el retculo endoplasmtico (RE) con la ayuda de diversas chaperonas, desde donde siguen la ruta constitutiva de exocitosis hacia la membrana celular. Esto es, las molculas del MHC-I generadas en el RE pasan al aparato de Golgi, despus pasan a travs del trasGolgi y por va vesicular, llegan a la membrana celular (Figura 6.2). Sin embargo, el heterodmero alfa-beta-2-m formado en el RE es inestable en condiciones fisiolgicas y requiere de la unin de un pptido para alcanzar una conformacin estable que le permita la salida del retculo endoplsmico. La cadena pesada a se une a una molcula de 88 kDa llamada calnexina, chaperona de MHC-I por excelencia, que funciona unindose a protenas de nueva sntesis que an no se han plegado o ensamblado correc-

tamente, retenindolas en el RE. Cuando la beta-2-m se une a la cadena a, la calnexina se des- plaza para que MHC-I se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya funcin es parecida a la calnexina. El complejo calreticulina-alfa-beta-2-m se une a una tercera chaperona llamada tapasina que a su vez se une a la subunidad TAP-1 del transportador de pptidos asociado a la membrana TAP (ver ms adelante). Esta asociacin estabiliza a los heterodmeros alfa-beta-2-m parcialmente plegados hasta que se asocian a un pptido (ver fig. va de clase I). Los dmeros TAP, formados por las subunidades TAP-1 y TAP-2 se encargan de transportar pptidos de degradacin citoslica al interior del RE. Cuando TAP proporciona un pptido con afinidad adecuada para poderse unir a la molcula de clase I, se forma el complejo estable MHC-I/pptido, que se separa de las chaperonas e inicia la va de exocitosis hacia la superficie celular, donde queda expuesto el pptido para su posterior reconocimiento por un linfocito T CD8+ especfico. Entrada pptidos al retculo endoplasmtico La mayora de pptidos presentados por MHC-I derivan de protenas citoslicas. Para transportar pptidos al interior del RE, las clulas han adaptado una molcula transportadora de una familia de molculas conocida con el nombre de transportadores-ABC (ATP-binding cassette (ABC)-transporters) encargados del transporte de iones, azcares, aminocidos e incluso protenas. El transportador de pptidos, conocido con el nombre de TAP (Transporter Associated with antigen Processing) est compuesto por dos protenas homlogas, TAP1 y TAP2. El heterodmero TAP1/TAP2 conserva las caractersticas esenciales de los transportadores-ABC: cada cadena contiene 6 dominios transmembrana, es decir, atraviesa 6 veces la membrana del RE, y dos dominios hidroflicos de unin a ATP. Estas dos cadenas se disponen en la membrana con la posibilidad de generar un poro por el que accede el sustrato al interior del RE. El mecanismo de transporte propuesto de los pptidos generados en el citoplasma, es el siguiente: el pptido interacciona con la parte citoplasmtica de TAP provocando la hidrlisis del ATP que induce un cambio conformacional del transportador permitiendo el paso del sustrato al lumen del RE. Las molculas TAP se han descrito en humanos, ratones y ratas. Se ha demostrado una preferencia en el tamao, de 8-12 aa, y de secuencia del pptido transportado, por lo que se ha involucrado a TAP en la seleccin de pptidos que se van a unir al MHC-I. La mayora de los pptidos no se unen a MHC-I y son rpidamente transportados de nuevo al citosol donde son degradados por mecanismos an desconocidos. Los genes que codifican las subunidades TAP-1 y TAP-2 estn dentro del MHC. Protelisis de antgenos en el citosol Los pptidos transportados por TAP se generan por degradacin de protenas en el citosol celular. Existen varios sistemas de degradacin de protenas en el citosol de los cuales el complejo multicataltico llamado proteosoma es el ms directamente involucrado en la generacin de pptidos para clase I. El proteosoma es un complejo proteico multienzimtico de alto peso molecular resultado de la asociacin de distintas subunidades con capacidad cataltica, muy abundante y ubicuo, que se encuentra en arqueobacterias, eubacterias y eucariotas, y en estos ltimos se localiza en el citosol y en el ncleo. Estructuras de este tipo se hallan muy conservadas entre especies: en eucariotas superiores se han descrito proteosoma

formados por ms de 25 subunidades distintas, en levaduras presentan hasta 14 subunidades y en bacterias se ha descrito el proteosoma de Thermophlasma acidophilum, formado por slo 2 subunidades distintas (Figura 6.3). La gran estabilidad de los enzimas en estos microorganismos termoflicos ha permitido la cristalizacin del proteasoma, revelando una estructura en forma de cilindro formado por las subunidades que encaran su centro cataltico hacia el interior. Los dos extremos estn compuestos por subunidades estructurales denominadas alfa. Los dos anillos internos estn constituidos por subunidades denominadas beta y forman una cmara donde se produce la proteolisis. Las protenas citoslicas semidesnaturalizadas se introducen dentro del cilindro quedando a merced de las actividades catalticas de las subunidades del proteasoma. En vertebrados, las subunidades beta-1, beta-2 y beta-5 son substituidas por otras tres: beta-1 i , (LMP2) beta-2 i (MECL-1) y beta-5 i (LMP-7), cuya expresin se modula en presencia de IFN-gamma (inmunoproteasoma). Las subunidades inducibles se sustituyen de forma cooperativa en la estructura del proteasoma dando lugar al inmunoproteasoma. Los genes que codifican para LMP-2 y LMP-7 se localizan en la regin del MHC-II por lo que, igual que en el caso de TAP, se ha sugerido un papel selectivo del inmunoproteasoma en la generacin de pptidos capaces de unirse a MHC-I.

Va biosinttica de MHC-II Las molculas del MHC de clase II estn formadas por dos cadenas alfa y beta que se sintetizan en el RE, a las que posteriormente se une una cadena llamada invariable (Ii), no polimrfica. Los heterodmeros aparecen como agregados transitorios de elevado peso molecular, puesto que una vez se han ensamblado las dos cadenas se forman trmeros de dmeros alfa/beta. Por su parte la Ii una vez sintetizada tambin se dispone en forma de trmero generndose finalmente un nonmero formado por tres molculas alfa/beta/Ii, (alfa/beta/Ii) 3 . La calnexina tambin se une a la Ii en el RE despus de generarse, en cambio los dmeros alfa/beta se unen a otra chaperona llamada BiP (binding protein), miembro de la familia de las protenas de estrs trmico o heat shock proteins (hsp). La cadena invariante se une al dmero disponindose de tal manera que bloquea el sitio de unin de pptido de la molcula MHC-II, impidindose as la asociacin entre pptidos y molculas de clase II en el retculo citoplasmtico. Una vez se ha generado el nonmero (alfa/beta/Ii) 3 , se inicia una va de exocitosis no constitutiva pasando del complejo de Golgi al transGolgi desde donde, (alfa/beta/Ii) 3 se desva a un compartimento de la va endoctica denominado MIIC. La desviacin de los heterodmeros alfa/beta a la va endoctica responde principalmente a una secuencia seal de la cadena invariante, aunque existen evidencias de que tambin las propias cadenas beta de MHC-II tienen secuencias adicionales de desvo hacia los endosomas. En este compartimento (MIIC), correspondiente a la zona intermedia de la va endoctica, entre los endosomas tardos y los lisosomas (Figura 6.4) , se inicia la proteolisis parcial de la cadena Ii quedndose slo unido a alfa/beta la porcin de Ii que ocupa la hendidura de

unin a pptidos, llamada CLIP (class II-associated invariant chain peptide). CLIP se separa de (alfa/beta/Ii) 3 naturalmente, pero el dmero se mantiene estable gracias a la intervencin de una nueva chaperona residente del MIIC, el dmero codificado en el MHC, HLA-DM (o DM, en otras especies). El dmero se separa de DM si se asocia a un pptido capaz de conferirle suficiente estabilidad. El complejo estable MHC-II/pptido viaja a la superficie celular de la APC por va vesicular, aunque los mecanismos precisos no son conocidos (Figura 6.5). Cadena invariante La cadena invariable es una protena de membrana que se une a los dmeros alfa/beta, ocupando el lugar de unin a pptido, impidiendo as la formacin de complejos MHCII/pptido en el RE. Adems, la cadena invariante es la responsable de la desviacin a la va endoctica del complejo nonamrico (al- fa/beta/Ii) 3 y de la retencin en la va endoctica de los agregados inestables que se forman. La Ii se ha descrito en humanos, ratones y rata. En humanos se han descrito 4 isoformas de Ii, resultantes del procesamiento alternativo del RNA, aunque la forma predominante es la denominada p33. La cadena invariante tiene estructura lineal, lo que permite que el fragmento de Ii que se une a la cavidad bloquee perfectamente el acceso del pptido. El fragmento de la cadena invariante que queda unido a la molcula de MHC-II se denomina con el nombre genrico de CLIP (class II-associated invariant chain peptide, ver pargrafo anterior) y ocupa la regin correspondiente a los aminocidos 80 al 104, con variaciones de tamao (Figura 6.6) HLA-DM y HLA-DO El estudio de la regin gnica de clase II en busca de nuevas molculas homlogas a las molculas clsicas MHC-II, condujo al aislamiento de HLA-DMA y HLA-DMB, en humanos, y de H-2 Ma-lfa, H2Mbeta1 y H-2Mbeta2, en ratones. La molcula de DM es un heterodmero integrado en la membrana, formado por una molcula DM-alfa y un Dm-beta. DM se sintetiza en el RE, viaja por el aparato de Golgi y transGolgi desde donde se desva a la va endoctica, donde permanece por un tiempo. A diferencia de las molculas de clase II, HLA-DM no se expresa en la superficie celular, lo que sugiere que dicha molcula acta preferentemente en la va endoctica. En 1994, dos estudios independientes

demostraron que, en ausencia de HLA-DM, las molculas de clase II no podan generar el complejo MHC-II/pptido, sugiriendo un papel esencial en el intercambio entre CLIP y los pptidos ubicados en la va endoctica. HLA-DM se ha definido como catalizador del intercambio de pptidos en la cavidad del MHC-II, aunque parece ser que su principal funcin es de chaperona, mediando la retencin en el MIIC de complejos alfa/beta vacos o asociados a CLIP, hasta que se asocien con un pptido capaz de conferirles alta estabilidad. HLA-DO es otra molcula codificada en la regin de clase II que interviene en la formacin del complejo MHC-II/pptido. HLA-DO es un heterodmero formado por la unin de las cadenas DOalfa y DObeta al que se le ha atribuido un papel regulador de la funcin de DM en algunas clulas, incluyendo el epitelio tmico y las clulas B. Las vas de procesamiento y presentacin de antgeno endgeno y exgeno no son excluyentes. En la clula presentadora de antgeno profesional que expresa tanto molculas de clase I como de clase II, en un estado de infeccin donde existe alta expresin de molculas de MHC y una gran produccin de antgeno extrao, todas las vas de presentacin de antgeno coexistirn en la misma clula para cubrir todas las posibilidades de presentacin de antgeno y combatir ms efectivamente al patgeno. LAS MOLCULAS DEL RECEPTORES DE PPTIDOS MHC COMO

Las molculas del MHC son receptores de pptido que unen pptido por defecto, es decir, necesitan formar complejo con un pptido para convertirse en molculas estables y maduras. En estado de reposo celular, las molculas del MHC estn ocupadas por pptidos propios, endgenos o exgenos. Cuando el organismo es atacado por un agente extrao, como por ejemplo un virus, estos pptidos naturales son desplazados por los pptidos vricos que durante la infeccin sern mayoritarios en el interior de la clula presentadora. Debido al polimorfismo de las molculas del MHC, cada molcula de histocompatibilidad presenta una secuencia distinta en el lugar de unin al pptido lo cual implica que existan preferencias en cuanto al patrn de pptidos que se unirn a cada molcula de MHC. Por otra parte, los pptidos que se unen a las molculas de MHC-I y MHC-II presentan caractersticas peculiares que describen a continuacin (Figura 6.7). Pptidos unidos por MHC-I Las molculas de clase I unen pptidos cortos, de 8-10 aa. En general, cada molcula de clase I puede unir de 2.000 a 10.000 pptidos distintos, pero dichos pptidos presentan restricciones en su secuencia, motivos estructurales especficos de cada alelo. Estas restricciones se limitan principalmente a los aminocidos en posicin 2 y 9 del pptido que son los "puntos de anclaje" a determinados

residuos de la hendidura en la molcula de clase I (Tabla 6.1) Los aminocidos de anclaje se unen en sus cadenas laterales a bolsillos especficos de los sitios de unin de cada alelo. El resto del pptido, los aminocidos del 3 al 8, queda en medio de la cavidad de unin sobre una base de molculas de agua, lo cual da gran plasticidad al complejo. Estos residuos estn involucrados en la interaccin con el TCR. Pptidos unidos por MHC-II Las molculas de clase II, a diferencia que las de clase I, unen pptidos de mayor tamao que oscilan entre 12 y 34 aa, aunque el tamao preferido para todos los alelos estudiados es de 12 a 17 aa. La forma de unin del pptido a la cavidad de unin es tambin distinta. En la hendidura de MHC-II el pptido queda unido por su secuencia central (core), quedando libres los extremos del pptido a cada lado de la hendidura. La variabilidad observada en la secuencia de dichos pptidos tambin se halla sujeta a una cierta restriccin que depende del alelo del MHC-II. Aunque las posiciones de anclaje del pptido a la hendidura no son tan constantes como para MHC-I, los aminocidos en dos o tres posiciones extremas (generalmente, 2 o 4 y 9) de la secuencia central del pptido son las posiciones principales de anclaje al MHC y por lo tanto las que definen el motivo estructural especfico de alelo (Tabla 6.2) Los pptidos que se unen a las molculas MHC-II son mayores que los de MHC-I y varan en longitud. Debido diferencia de tamao de los pptidos aislados, los residuos de anclaje se hallan en distintas posiciones. No obstante, la secuencia interna del pptido se une a la cavidad presenta rasgos comunes: por ejemplo, en el alelo HLA-DR3, los residuos que ocupan la posicin 4 (P4) estn cargados negativamente como el cido asprtico (D) o el cido glutmico (E) y en la posicin 9 (P9) son residuos hidrofbicos como tirosina (Y), leucina (L), prolina (P) o fenilalanina (F).

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)

Presente en todas las especies de Vertebrados estudiadas Probable equivalente en algunos invertebrados Ocupa un corto segmento cromosmico (1-2 cM): brazo corto del cromosoma 6 humano. Contiene numerosos genes relevantes para diferentes funciones inmunolgicas Alta homologa estructural y funcional entre especies (especialmente ratn y hombre)

11.-El Complejo Principal de Histocompatibilidad.

(Protenas; Genes; Polimorfismo y nomenclatura; Herencia)
A. Corell UVA
1

Indice de contenidos del Tema 11 El Complejo principal de Histocompatibilidad 11.1 El Complejo Principal de Histocompatibilidad: conceptos bsicos 11.2 Genes y Protenas de Clase I: -El "sitio" de unin de antgenos 11.3 Genes y Protenas de Clase II 11.4 Propiedades de los antgenos HLA: -Patrn de expresin -Terminologa y Nomenclatura -Polimorfismo y tipo de herencia -Complementacin

Genes del MHC

Clase IA (clsicos) antgenos de clase I:
- HLA-A, -B, -C

Antgenos HLA de Clase I

Mltiples loci de Clase I 3 clsicos en humanos (HLA-A, -B y -C) Codifican un nico polipptido de ~45 kd (aprox. 350 aminocidos) Se expresan en la superficie de todas las clulas nucleadas Asociados No-covalentemente a b2-microglobulina (b2M) Altamente polimrficos (numerosos alelos /locus)

Clase IB (no clsicos)- HLA-E, -F, -G Clase II antgenos de clase II:

- HLA-DR, -DP, -DQ Protenas implicadas en la presentacin: TAP, LMP, DM

Clase III
componentes del complemento Genes codificantes de molculas que actan en eventos tempranos de presentacin de antgeno Genes codificantes de enzimas y de citocinas
5

Vista lateral

Vista lateral

Vista desde arriba

6

Vista lateral

Antgenos HLA de Clase II

Codifican 2 tipos de polipptidos: cadenas D de ~ 34 kd y cadenas E de ~ 29 kd Las cadenas D y E se sintetizan independientemente, pero se asocian una con otra de modo no-covalente Se expresan mltiples loci de Clase II hasta 8 en humanos (DPA1, DPB1) (DQA1, DQB1) (DRA, DRB1, DRB2, DRB4)

11

MHC Restriction

Antgenos HLA de Clase II

Se expresan constitutivamente en clulas presentadoras de antgeno (APC) como los monocitos, macrfagos, astrocitos, clulas dendrticas y linfocitos B Se pueden expresar transitoriamente en otros tipos celulares (endotelio vascular por ej.) bajos determinadas condiciones Altamente polimrficos (salvo pocas excepciones como el gen DRA humano)
10
12

Expresin de HLA Clase II

DP DQ DR

E2 D2 E1 D1

E2 D2 E1 D1

E1 E2 E3 E4 D

Codficados +/Expresados en la superficie celular

= pseudogenes no expresados

13

15

Vista lateral

Vista lateral

C4 Bf C2

Terminologa HLA
Loci / Alelos / Haplotipos Vista desde arriba Vista lateral
B C A
DPB1 DPA1 DQ%1 DQA1 DRB1 DRB2 DRB4 DRA

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16

Terminologa HLA
(Nueva - basada en la secuencia de nucletidos)

Polimorfismo de los Genes MHC

A*0302 C*0411 DPA*0508 DRB3*0202

(Locus A; grupo 3; alelo 2) (Locus C; grupo 4; alelo 11) (Locus DPA; grupo 5; alelo 8) (Locus DRB3; grupo 2; alelo 2)
17
19

Polimorfismo de los Genes MHC

Variacin del MHC

Expresin Co-dominante Poligenia (mltiples loci homlogos) Polimorfismo (mltiples alelos/locus) Complementacin Cis-, Trans- (slo Clase II)
18
20

Complementacin cis-trans en MHC Clase II

E D
x y
x y x y

E D
x y x y

E E
x y x y

E D
x y

ED ED ED

ED

ED

21

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

12.-El Complejo Principal de Histocompatibilidad (II)

(Funciones; Asociacin a enfermedad)

A. Corell UVA
1
3

Indice de contenidos del Tema 12 El Complejo principal de Histocompatibilidad (II)

12.1

Funcin fisiolgica de los antgenos HLA -Presentacin de Pptidos Tcnicas de tipificacin de los antgenos HLA Aplicaciones del conocimiento del polimorfismo HLA -Estudios de Asociacin a Enfermedad - Aplicaciones en Trasplantes de rganos - Aplicaciones en medicina forense

12.2 12.3

TIPAJE SEROLGICO DEL HLA

Aislar clulas del paciente Poner en contacto las clulas con sueros que contienen anticuerpos anti-HLA conocidos Dejar que los anticuerpos especficos se unan a las molculas de HLA de las clulas Aadir complemento de conejo (slo se va a activar si hay unin antgeno anticuerpo)
5
7

TIPAJE DEL HLA

SEROLGICO Identificamos las molculas de HLA presentes en la superficie de las clulas mediante el uso de sueros con anticuerpos contra los distintos alelos de HLA conocidos Los anticuerpos pueden ser Policlonales o Monoclonales DNA Identificamos la secuencia de nucletidos de los distintos alelos de HLA contenidos en el DNA del indivduo

AISLAMIENTO DE CLULAS
CLASE I Se aislan Linfocitos T y B de sangre anticoagulada mediante un gradiente de densidad (Ficoll) CLASE II Se aislan Linfocitos B de sangre anticoagulada mediante bolitas magnticas que contienen anticuerpos anti-CD19 en su superficie
8

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE EL HLA DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE HLA DISTINTO DEL DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE EL HLA DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE HLA DISTINTO DEL DE LA CELULA

SUEROS CON ANTICUERPOS FRENTE A HLA CONOCIDOS

RECONOCIMIENTO DEL HLA DE LAS CELULAS POR LOS ANTICUERPOS DEL SUERO

11

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE EL HLA DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE HLA DISTINTO DEL DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE EL HLA DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE HLA DISTINTO DEL DE LA CELULA

CELULAS DEL PACIENTE

COMPLEMENTO

ACTIVACION DEL COMPLEMENT O

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12

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE EL HLA DE LA CELULA

SUERO CON ANTICUERPO QUE RECONOCE HLA DISTINTO DEL DE LA CELULA

Clulas vivas: No Reaccin

Clulas muertas: Reaccin

MUERTE CELULAR

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Asociaciones HLA-Enfermedad
Enfermedad Sndrome de Reiter Tiroiditis de Hashimoto TINCIN DE LAS CLULAS Y LECTURA DE LAS REACCIONES
14

Gen HLA Riesgo relativo B27 B47 DR2 DR4 DR3/DR4 37 106 15 5 4 3-6
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Espondilitis anquilosante B27 Esclerosis Mltiple Artritis Reumatoide Diabetes Juvenil

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Polimorfismo de los Genes MHC

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FAMILIA OLMEDO
JULIAN PADRE
A1 B13 Cw6 DR7 DQ2 A32 B61 Cw2 DR11 DQ7

CARMEN MADRE
A1 B49 Cw7 DR7 DQ2 A31 B51 Cw5 DR13 DQ7

SARA
A2 B15 Cw3 DR11 DQ1 A1 B49 Cw7 DR7 DQ2

VIRGINIA
A1 B13 Cw6 DR7 DQ2 A31 B51 Cw5 DR13 DQ7

21

06 Procesamiento de antgenos
M. Mart y D. Jaraquemada
Los linfocitos, las nicas clulas con receptores especficos de antgeno, son responsables de iniciar y llevar a cabo la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos B interaccionan con el antgeno mediante su receptor (BCR), una inmunoglobulina de membrana (IgM) que reconoce determinantes antignicos tridimensionales en protenas y otras molculas antignicas, solubles o particuladas, en estado nativo. En cambio, el receptor clonotpico de los linfocitos T (TCR) reconoce complejos moleculares en la membrana de las clulas presentadoras de antgeno (APC), formados por molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de clase I (MHC-I) o de clase II (MHC-II) (ver ms adelante) y pptidos antignicos resultantes de la degradacin intracelular del antgeno. Las clulas T, por tanto, a diferencia de los linfocitos B, necesitan de clulas presentadoras de antgeno (APC) accesorias que captan el antgeno, lo procesan y lo presentan en la membrana.
Fig.:6.1

El TCR interacciona molecularmente con el pptido contenido en la cavidad de las molculas del MHC y con las propias molculas presentadoras, de forma que el reconocimiento del antgeno por el linfocito T, tal como se ha visto en captulos anteriores, queda restringido por el MHC (Figura 6.1). El fenmeno de la restriccin por el MHC del reconocimiento de antgeno fue originalmente descrito por Zinkernagel y Doherty (1974) en la respuesta de los linfocitos T al virus de la linfocoriomeningitis (LCV). Estos investigadores demostraron que las clulas T citotxicas especficas de virus slo reconocen las clulas infectadas si stas expresan determinadas molculas de histocompatibilidad en su superficie. Este trabajo mereci el Premio Nobel de Medicina en 1996.

CELULAS PRESENTADORAS DE ANTIGENO Los requerimientos para la presentacin de antgeno son: capacidad de captacin de antgenos del medio externo, maquinaria proteoltica eficiente que permita la degradacin del antgeno en pptidos capaces de ser presentados, expresin de molculas de MHC-II y expresin de molculas coestimuladoras y de adhesin. Los tres tipos celulares que cumplen en diferentes grados estos requisitos, llamadas APC profesionales, son las clulas dendrticas, los macrfagos y los linfocitos B. Existen otras estirpes celulares que, an no siendo APCs profesionales, son capaces de expresar molculas de MHC-II bajo determinadas condiciones. Clulas dendrticas. Las clulas dendrticas derivan de la mdula sea, son de linaje mieloide y tienen una morfologa irregular con prolongaciones membranosas. Las clulas dendrticas se generan en la mdula sea desde donde migran en estado inmaduro a los tejidos perifricos, por ejemplo las clulas de Langerhans de la piel.

Mientras estn en estado inmaduro, las clulas dendrticas tienen gran capacidad de captacin de antgeno del medio y una maquinaria proteoltica eficiente, expresan bajos niveles de MHC y de molculas coestimuladoras; expresan receptores Fc (CD32), de manosa y de complemento, implicados en captacin de antgeno por endocitosis, fagocitosis y, sobre todo, macropinocitosis. Al activarse su maduracin en presencia de citocinas inflamatorias, aumenta considerablemente su capacidad de macropinocitosis y la expresin de receptores que permiten la captacin de antgeno; tambin se activa la sntesis de molculas de MHC-I y II que unirn con gran eficiencia tanto pptidos originados en la propia clula dendrtica como pptidos externos que se hallan en el lugar de inflamacin. Desde el sitio de la herida, las clulas dendrticas maduras expresan un alto nmero de complejos MHC/pptido de alta estabilidad en su membrana, paran la sntesis de novo de MHC, pierden la capacidad de captacin de antgeno y la expresin de algunos receptores iniciando su migracin los rganos linfoides secundarios (ganglios linfticos, bazo o mucosas). Durante el transporte de los tejidos perifricos a los rganos linfoides por los vasos linfticos, las clulas cambian de morfologa y reciben el nombre de clulas veladas (veiled cells). A su llegada a los rganos linfoides secundarios, las clulas dendrticas maduras se emplazan en las zonas ricas en clulas T (recibiendo el nombre de clulas dendrticas interdigitantes) donde realizan su funcin de presentar pptidos a clulas T especficas que all se encuentren, inicindose as la respuesta inmune contra el agente agresor. Las clulas dendrticas son especialmente eficientes en la activacin y estimulacin de clulas T preinmunes, tanto CD8 como CD4. Mediante la unin de pptidos exgenos o endgenos a sus molculas de MHC-I, altamente expresadas, pueden iniciar una respuesta de clulas T CD8+, incluso simultnea a la activacin de clulas T CD4+. Por otra parte, se las ha propuesto como responsables en gran parte del mantenimiento de la memoria T ya que los complejos MHCII/pptido formados permanecen expuestos en su membrana durante un perodo de tiempo largo proporcionando a las clulas T de memoria un contacto continuado con el antgeno que las ha estimulado en la respuesta primaria. Macrfagos. Los macrfagos son clulas fagocticas mononucleares de linaje mieloide y con gran capacidad de procesamiento de antgenos tanto solubles como particulados. Los macrfagos inmaduros de sangre perifrica se denominan monocitos. Los macrfagos diferenciados localizados en tejidos se encargan de eliminar restos celulares in situ. Estos macrfagos diferenciados son residentes esenciales de los tejidos linfoides, pero tambin se encuentran en otras localizaciones, en suspensin o integrados en tejidos slidos; all reciben distintos nombres y, aunque mantienen sus propiedades principales, adquieren caractersticas especficas al diferenciarse en los diferentes tejidos. Los macrfagos en suspensin son clulas muy activas en la eliminacin de partculas extraas y restos celulares, entre ellos se encuentran principalmente los peritoneales y los alveolares. Los macrfagos de tejido slido son ms especializados, por ejemplo las clulas de Kupffer del hgado son responsables de la eliminacin de productos particulados y bacterias de la circulacin sangunea. Entre este grupo se agrupan las clulas de la microgla del sistema nervioso central, los osteoclastos del tejido seo o las clulas mesangiales del glomrulo renal, entre otros. Los macrfagos activados en el lugar de infeccin inician un proceso de fagocitosis muy activo mediante receptores especficos, receptores tipo toll (TLR) y receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en los patgenos. Los macrfagos tambin pueden endocitar antgenos opsonizados con molculas del complemento o anticuerpos, va receptores del complemento o receptores Fc (CD64, CD32, CD23). Los monocitos y macrfagos no activados expresan niveles bajos de MHC-II, en cambio en los macrfagos activados se induce la expresin de molculas de clase II y las molculas accesorias en su superficie que aumentan su capacidad de presentacin de antgeno. Consecuencia de la activacin, los macrfagos secretan quimiocinas que reclutan clulas inflamatorias y citocinas implicadas en la activacin de las clulas T como IL-12 dirigiendo la respuesta adaptativa en las fases iniciales.

Linfocitos B. Los linfocitos B pueden actuar como clulas presentadoras de antgeno ya que expresan MHC-II constitutivamente, expresin que aumenta cuando se activan, aunque su capacidad de captacin de antgeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son clulas presentadoras muy eficientes si expresan una inmunoglobulina de superficie (BCR) especfica del antgeno. La eficiencia de la presentacin de un antgeno por clulas B aumenta 100-1000 veces cuando el antgeno se internaliza tras su unin con el BCR, permitiendo que un antgeno se presente con gran eficiencia incluso en bajas concentraciones. La presentacin de antgeno a linfocitos T especficos es parte esencial de la completa activacin y diferenciacin de la clula B en clula plasmtica productora de anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la colaboracin de los linfocitos T. La presentacin de antgeno es su forma de obtener esta colaboracin. La interaccin entre clulas T y B especficas del mismo antgeno requiere segundas seales producidas a partir de la interaccin entre CD40 en la clula B y CD40L en la clula T y por la interaccin entre la IL-4 producida por los linfocitos T y su receptor en la clula B. El papel de las clulas B como APC se refuerza en la respuesta secundaria contra el antgeno, ya que existen un mayor nmero de clulas B especficas expandidas durante la respuesta primaria. APCs no profesionales. En humanos, las clulas endoteliales expresan molculas del MHC-II y molculas accesorias que aumentan en condiciones de inflamacin y se las ha implicado en la presentacin de antgeno en reacciones de hipersensibilidad retardada en tejidos perifricos. Adems existen otras clulas, como las epiteliales o los fibroblastos que en presencia de citocinas, especialmente IFN-gamma, expresan MHC-II y como consecuencia podran presentar antgeno en determinadas situaciones. Por otra parte, todas las clulas nucleadas que expresan MHC-I pueden presentar antgeno a clulas T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta inmune. CAPTACION Y PROCESAMIENTO DE ANTIGENO El procesamiento de antgeno es el conjunto de mecanismos de degradacin de antgenos tanto exgenos como endgenos para su presentacin a clulas T una vez unidos a las molculas de MHC de clase II. CAPTACION DE ANTIGENO EXOGENO Las clulas captan antgeno exgeno por endocitosis, mediada o no por receptor, proceso por el que la clula incorpora en su citoplasma materiales del medio externo. Se distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. Pinocitosis es la captacin de lquido extracelular en el que se hallan los antgenos en forma soluble, llamada macropinocitosis cuando la clula es capaz de captar grandes volmenes de fluido que despus concentra, mecanismo clsico de las clulas dendrticas. La fagocitosis es un proceso utilizado por fagocitos mononucleares, neutrfilos y otras clulas para ingerir y eliminar partculas de gran tamao, incluidos agentes infecciosos, clulas seniles y restos celulares. La internalizacin de la partcula se inicia por la interaccin de receptores en la superficie de la clula con ligandos de la superficie de la partcula o por simple invaginacin mecnica de la membrana. Despus de la internalizacin, la vescula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusin con compartimentos de la va endoctica en varios pasos, que culminan en la formacin de lisosomas. La va endoctica est constituida por distintos tipos de vesculas cuyo contenido se va modificando a medida que van madurando en el interior de la clula. El pH del interior de estas vesculas es bajo y va acidificndose a medida que stas van evolucionando haca lisosomas. Las primeras vesculas de la va endoctica son los endosomas tempranos que evolucionan a endosomas tardos, pasan a prelisosomas y finalmente se transforman en

lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los caracterizan. El procesamiento de antgeno consiste en la desnaturalizacin y proteolisis de las protenas captadas en las vesculas acdicas. Las proteasas son activas a pH bajo de forma que si tratamos las APCs con agentes lisosomotrpicos que alcalinizan las vesculas endocticas, como la cloroquina o el cloruro amnico, se bloquea el procesamiento, la generacin de pptidos y, por tanto, la presentacin del antgeno. BIOSINTESIS DE LAS MOLECULAS DEL MHC Las molculas del MHC son glicoprotenas de membrana cuya funcin es presentar el antgeno en forma de pptidos a los linfocitos T en la respuesta inmune. Las molculas del MHC se dividen en dos clases: de clase I y de clase II y, aunque ambas son protenas de membrana, la va biosinttica y de exocitosis que utilizan es distinta e influye en el tipo y origen de los pptidos que presentan. VIA BIOSINTETICA DE MHC-I Las molculas de clase I estn formadas por una cadena pesada (cadena alfa) y la beta2-microglobulina (beta2-m) cuya asociacin se lleva a cabo en el retculo endoplasmtico (RE) con la ayuda de diversas chaperonas, desde donde siguen la ruta constitutiva de exocitosis hacia la membrana celular. Esto es, las molculas del MHC-I generadas en el RE pasan al aparato de Golgi, despus pasan a travs del tras-Golgi y por va vesicular, llegan a la membrana celular (Figura 6.2).
Fig.:6.2

Sin embargo, el heterodmero alfa-beta2m formado en el RE es inestable en condiciones fisolgicas y requiere de la unin de un pptido para alcanzar una conformacin estable que le permita la salida del retculo endoplsmico. La cadena pesada a se une a una molcula de 88 kDa llamada calnexina, chaperona de MHC-I por excelencia, que funciona unindose a protenas de nueva sntesis que an no se han plegado o ensamblado correctamente, retenindolas en el RE. Cuando la beta2m se une a la cadena a, la calnexina se desplaza para que MHC-I se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya funcin es parecida a la calnexina. El complejo calreticulina-alfa-beta2m se une a una tercera chaperona llamada tapasina que a su vez se une a la subunidad TAP1 del transportador de pptidos asociado a la membrana TAP (ver ms adelante). Esta asociacin estabiliza a los heterodmeros alfa-beta2m parcialmente plegados hasta que se asocian a un pptido (ver fig. va de clase I). Los dmeros TAP, formados por las subunidades TAP-1 y TAP-2 se encargan de transportar pptidos de degradacin citoslica al interior del RE. Cuando TAP proporciona

un pptido con afinidad adecuada para poderse unir a la molcula de clase I, se forma el complejo estable MHC-I/pptido, que se separa de las chaperonas e inicia la va de exocitosis hacia la superficie celular, donde queda expuesto el pptido para su posterior reconocimiento por un linfocito T CD8+ especfico. TAP La mayora de pptidos presentados por MHC-I derivan de protenas citoslicas. Para transportar pptidos al interior del RE, las clulas han adaptado una molcula transportadora de una familia de molculas conocida con el nombre de transportadores-ABC (ATP-binding cassette (ABC)-transporters) encargados del transporte de iones, azcares, aminocidos e incluso protenas. El transportador de pptidos, conocido con el nombre de TAP (Transporter Associated with antigen Processing) est compuesto por dos protenas homlogas, TAP1 y TAP2. El heterodmero TAP1/TAP2 conserva las caractersticas esenciales de los transportadores-ABC: cada cadena contiene 6 dominios transmembrana, es decir, atraviesa 6 veces la membrana del RE, y dos dominios hidroflicos de unin a ATP. Estas dos cadenas se disponen en la membrana con la posibilidad de generar un poro por el que accede el sustrato al interior del RE. El mecanismo de transporte propuesto de los pptidos generados en el citoplasma, es el siguiente: el pptido interacciona con la parte citoplasmtica de TAP provocando la hidrlisis del ATP que induce un cambio conformacional del transportador permitiendo el paso del sustrato al lumen del RE. Las molculas TAP se han descrito en humanos, ratones y ratas. Se ha demostrado una preferencia en el tamao, de 8-12 aas, y de secuencia del pptido transportado, por lo que se ha involucrado a TAP en la seleccin de pptidos que se van a unir al MHC-I. La mayora de los pptidos no se unen a MHC-I y son rpidamente transportados de nuevo al citosol donde son degradados por mecanismos an desconocidos. Los genes que codifican las subunidades TAP-1 y TAP-2 estn dentro del MHC. PROTEASOMA Los pptidos transportados por TAP se generan por degradacin de protenas en el citosol celular. Existen varios sistemas de degradacin de protenas en el citosol de los cuales el complejo multicataltico llamado proteasoma es el ms directamente involucrado en la generacin de pptidos para clase I. El proteasoma es un complejo proteico multienzimtico de alto peso molecular resultado de la asociacin de distintas subunidades con capacidad cataltica, muy abundante y ubicuo, que se encuentra en arqueobacterias, eubacterias y eucariotas, y en estos ltimos se localiza en el citosol y en el ncleo. Estructuras de este tipo se hallan muy conservadas entre especies: en eucariotas superiores se han descrito proteasomas formados por ms de 25 subunidades distintas, en levaduras presentan hasta 14 subunidades y en bacterias se ha descrito el proteasoma de Thermophlasma acidophilum, formado por slo 2 subunidades distintas (Figura 6.3). La gran estabilidad de los enzimas en estos microorganismos termoflicos ha permitido la cristalizacin del proteasoma, revelando una estructura en forma de cilindro formado por las subunidades que encaran su centro cataltico hacia el interior. Los dos extremos estn compuestos por subunidades estructurales denominadas alfa. Los dos anillos internos estn constituidos por subunidades denominadas beta y forman una cmara donde se produce la proteolisis. Las protenas citoslicas semidesnaturalizadas se introducen dentro del cilindro quedando a merced de las actividades catalticas de las subunidades del proteasoma.
Fig.:6.3

En vertebrados, las subunidades beta1, beta2 y beta5 son substituidas por otras tres: beta1i, (LMP2) beta2i (MECL-1) y beta5i (LMP-7), cuya expresin se modula en presencia de IFNgamma (inmunoproteasoma). Las subunidades inducibles se sustituyen de forma cooperativa en la estructura del proteasoma dando lugar al inmunoproteosoma. Los

genes que codifican para LMP-2 y LMP-7 se localizan en la regin del MHC-II por lo que, igual que en el caso de TAP, se ha sugerido un papel selectivo del inmunoproteasoma en la generacin de pptidos capaces de unirse a MHC-I. VIA BIOSINTETICA DE MHC-II Las molculas del MHC de clase II estn formadas por dos cadenas alfa y beta que se sintetizan en el RE, a las que posteriormente se une una cadena llamada invariable (Ii), no polimrfica. Los heterodmeros aparecen como agregados transitorios de elevado peso molecular, puesto que una vez se han ensamblado las dos cadenas se forman trmeros de dmeros alfa/beta. Por su parte la Ii una vez sintetizada tambin se dispone en forma de trmero generndose finalmente un nonmero formado por tres molculas alfa/beta/Ii, (alfa/beta/Ii)3. La calnexina tambin se une a la Ii en el RE despus de generarse, en cambio los dmeros alfa/beta se unen a otra chaperona llamada BiP (binding protein), miembro de la familia de las protenas de estrs trmico o heat shock proteins (hsp).
Fig.:6.4

La cadena invariante se une al dmero disponindose de tal manera que bloquea el sitio de unin de pptido de la molcula MHC-II, impidindose as la asociacin entre pptidos y molculas de clase II en el retculo citoplasmtico. Una vez se ha generado el nonmero (alfa/beta/Ii)3, se inicia una va de exocitosis no constitutiva pasando del complejo de Golgi al transGolgi desde donde, (alfa/beta/Ii)3 se desva a un compartimento de la va endoctica denominado MIIC. La desviacin de los heterodmeros alfa/beta a la va endoctica responde principalmente a una secuencia seal de la cadena invariante, aunque existen evidencias de que tambin las propias cadenas beta de MHC-II tienen secuencias adicionales de desvo hacia los endosomas. En este compartimento (MIIC), correspondiente a la zona intermedia de la va endoctica, entre los endosomas tardos y los lisosomas (Figura 6.4). se inicia la proteolisis parcial de la cadena Ii quedndose slo unido a alfa/beta la porcin de Ii que ocupa la hendidura de unin a pptidos , llamada CLIP (class II-associated invariant chain peptide). CLIP se separa de (alfa/beta/Ii)3 naturalmente, pero el dmero se mantiene estable gracias a la intervencin de una nueva chaperona residente del MIIC, el dmero codificado en el MHC, HLADM (o DM, en otras especies). El dmero se separa de DM si se asocia a un pptido capaz de conferirle suficiente estabilidad. El complejo estable MHC-II/pptido viaja a la superficie celular de la APC por va vesicular, aunque los mecanismos precisos no son conocidos (Figura 6.5)

Fig.:6.5

CADENA INVARIANTE La cadena invariable es una protena de membrana que se une a los dmeros alfa/beta, ocupando el lugar de unin a pptido, impidiendo as la formacin de complejos MHC-II/pptido en el RE. Adems, la cadena invariante es la responsable de la desviacin a la va endoctica del complejo nonamrico (alfa/beta/Ii)3 y de la retencin en la va endoctica de los agregados inestables que se forman. La Ii se ha descrito en humanos, ratones y rata. En humanos se han descrito 4 isoformas de Ii, resultantes del procesamiento alternativo del RNA, aunque la forma predominante es la denominada p33. La cadena invariante tiene estructura lineal, lo que permite que el fragmento de Ii que se une a la cavidad bloquee perfectamente el acceso del pptido. El fragmento de la cadena invariante que queda unido a la molcula de MHC-II se denomina con el nombre genrico de CLIP (class II-associated invariant chain peptide, ver pargrafo anterior) y ocupa la regin correspondiente a los aminocidos 80 al 104, con variaciones de tamao (Figura 6.6).
Fig.:6.6

HLA-DM y HLA-DO El estudio de la regin gnica de clase II en busca de nuevas molculas homlogas a las molculas clsicas MHC-II, condujo al aislamiento de HLA-DMA y HLA-DMB, en humanos, y de H-2Malfa, H-2Mbeta1 y H-2Mbeta2, en ratones. La molcula de DM es un heterodmero integrado en la membrana, formado por una molcula DMalfa y una DMbeta. DM se sintetiza en el RE, viaja por el aparato de Golgi y transGolgi desde donde se desva a la va endoctica, donde permanece por un tiempo. A diferencia de las molculas de clase II, HLA-DM no se expresa en la superficie celular, lo que sugiere que dicha molcula acta preferentemente en la

va endoctica. En 1994, dos estudios independientes demostraron que, en ausencia de HLADM, las molculas de clase II no podan generar el complejo MHC-II/pptido, sugiriendo un papel esencial en el intercambio entre CLIP y los pptidos ubicados en la va endoctica. HLADM se ha definido como catalizador del intercambio de pptidos en la cavidad del MHC-II, aunque parece ser que su principal funcin es de chaperona, mediando la retencin en el MIIC de complejos alfa/beta vacos o asociados a CLIP, hasta que se asocien con un pptido capaz de conferirles alta estabilidad. HLA-DO es otra molcula codificada en la regin de clase II que interviene en la formacin del complejo MHC-II/pptido. HLA-DO es un heterodmero formado por la unin de las cadenas DOalfa y DObeta al que se le ha atribuido un papel regulador de la funcin de DM en algunas clulas, incluyendo el epitelio tmico y las clulas B. INTEGRACION DE LAS DOS VIAS La presentacin de antgeno exgeno se lleva a cabo mayoritariamente por las molculas del MHC de clase II. Los antgenos exgenos entran en la APC por procesos de fagocitosis o de endocitosis, formndose vesculas que se fusionan con endosomas tempranos donde se inicia su degradacin. La generacin de pptidos es ms intensa en los compartimentos ms maduros debido a su contenido en enzimas y por tanto en ellos es ms importante la formacin de complejos MHC-II/pptido. Si despus de este trnsito por todos los compartimentos de la va endoctica, ni el pptido ni la molcula de clase II se han asociado, terminarn degradndose en los lisosomas. Las molculas de membrana una vez expresadas estn sometidas a procesos de internalizacin, formndose unas vesculas denominadas "coated-pits" que se fusionan con endosomas tempranos de reciente formacin. As pues, estas molculas acceden a la va endoctica donde, al igual que cualquier protena extraa exgena incorporada a la clula por endocitosis, se degradan y, por tanto, pueden ser presentadas por molculas MHC-II. Los antgenos endgenos citoplasmticos tanto propios como sintetizados tras infeccin de la APC por un microorganismo, estn sometidos a la maquinaria degradativa del citoplasma y se presentan preferentemente en el contexto de MHC-I. Los pptidos antignicos generados en el citosol son transportados al RE por TAP y aquellos pptidos con afinidad por el alelo de clase I expresado en la clula formarn el complejo MHC-I/pptido que finalmente se expresar en la membrana celular. VAS ALTERNATIVAS Existen excepciones a esta asociacin. Por una parte, protenas citoslicas parcialmente degradadas en el citoplasma pueden acceder a la va endoctica por microfagocitosis o mediante chaperonas citoplsmicas (molculas encargadas de conducir a otras molculas a determinados compartimentos o localizaciones celulares) donde se degradan a pptidos capaces de formar complejos MHC-II/pptido, segn su afinidad por el alelo de clase II expresado. A su vez, los pptidos generados en el citoplasma por degradacin de protenas endgenas, tambin pueden ser presentados por MHC-II aunque el mecanismo de acceso a la va endoctica utilizado por estos pptidos es todava desconocido. Por otra parte, los antgenos exgenos pueden acceder a la va de clase I mediante dos mecanismos distintos: por rotura de la integridad de la membrana de un fagosoma, consecuencia de ello protenas parcialmente fraccionadas escapan al citosol donde se degradan (presentacin cruzada) o por proteolisis extracelular de protenas de superficie por lo que los pptidos generados pueden unirse a un grupo minoritario de molculas de clase I vacas, expresadas en la membrana de APCs profesionales como las clulas dendrticas. Las vas de procesamiento y presentacin de antgeno endgeno y exgeno no son excluyentes. En la clula presentadora de antgeno profesional que expresa tanto molculas de clase I como de clase II, en un estado de infeccin donde existe alta expresin de molculas de MHC y una gran produccin de antgeno extrao, todas las vas de presentacin de antgeno coexistirn en la misma clula para cubrir todas las posibilidades de presentacin de antgeno y combatir ms efectivamente al patgeno.

LAS MOLECULAS DEL MHC COMO RECEPTORES DE PEPTIDOS

Fig.:6.7

Las molculas del MHC son receptores de pptido que unen pptido por defecto, es decir, necesitan formar complejo con un pptido para convertirse en molculas estables y maduras. En estado de reposo celular, las molculas del MHC estn ocupadas por pptidos propios, endgenos o exgenos. Cuando el organismo es atacado por un agente extrao, como por ejemplo un virus, estos pptidos naturales son desplazados por los pptidos vricos que durante la infeccin sern mayoritarios en el interior de la clula presentadora. Debido al polimorfismo de las molculas del MHC, cada molcula de histocompatibilidad presenta una secuencia distinta en el lugar de unin al pptido lo cual implica que existan preferencias en cuanto al patrn de pptidos que se unirn a cada molcula de MHC. Por otra parte, los pptidos que se unen a las molculas de MHC-I y MHC-II presentan caractersticas peculiares que describen a continuacin (Figura 6.7).

Pptidos unidos por MHC-I Las molculas de clase I unen pptidos cortos, de 8-10 aas. En general, cada molcula de clase I puede unir de 2.000 a 10.000 pptidos distintos, pero dichos pptidos presentan restricciones en su secuencia, motivos estructurales especficos de cada alelo. Estas restricciones se limitan principalmente a los aminocidos en posicin 2 y 9 del pptido que son los "puntos de anclaje" a determinados residuos de la hendidura en la molcula de clase I (Tabla 6.1). Los aminocidos de anclaje se unen en sus cadenas laterales a bolsillos especficos de los sitios de unin de cada alelo. El resto del pptido, los aminocidos del 3 al 8, queda en medio de la cavidad de unin sobre una base de molculas de agua, lo cual da gran plasticidad al complejo. Estos residuos estn involucrados en la interaccin con el TCR. NH2 T S K S Y Y Y Y p2 Q F Q I R P A P T E V S R I T A COOH A T T E L H T K V I L I p9

Pptidos unidos por MHC-II Las molculas de clase II, a diferencia que las de clase I, unen pptidos de mayor tamao que oscilan entre 12 y 34 aas, aunque el tamao preferido para todos los alelos estudiados es de 12 a 17 aas. La forma de unin del pptido a la cavidad de unin es tambin distinta. En la hendidura de MHC-II el pptido queda unido por su secuencia central (core), quedando libres los extremos del pptido a cada lado de la hendidura. La variabilidad observada en la secuencia de dichos pptidos tambin se halla sujeta a una cierta restriccin que depende del alelo del MHC-II. Aunque las posiciones de anclaje del pptido a la hendidura no son tan constantes como para MHC-I, los aminocidos en dos o tres posiciones extremas (generalmente, 2 o 4 y 9) de la secuencia central del pptido son las posiciones principales de anclaje al MHC y por lo tanto las que definen el motivo estructural especfico de alelo (Tabla 6.2). Los pptidos que se unen a las molculas MHC-II son mayores que los de MHC-I y varan

en longitud. Debido diferencia de tamao de los pptidos aislados, los residuos de anclaje se hallan en distintas posiciones. No obstante, la secuencia interna del pptido se une a la cavidad presenta rasgos comunes: por ejemplo, en el alelo HLA-DR3, los residuos que ocupan la posicin 4 (P4) estn cargados negativamente como el cido asprtico (D) o el cido glutmico (E) y en la posicin 9 (P9) son residuos hidrofbicos como tirosina (Y), leucina (L), prolina (P) o fenilalanina (F). NH2terminal ISNQLTL IPDNLFKS ATKYGNMT E GKFAIRP VFLLLLA TFD PPEVTVLTNSPV YGYTSY TGHGARTST Posicin D D D D D E E D E 4 SNTK GRIK HVNH KKSN KVPE IASG LREP FSWA PTTD Y Y L P T F N E Y 9 COOH-terminal FHK TLN LQNA IIRTV SLS RQGGASG V L

OTRAS MOLECULAS PRESENTADORAS DE ANTIGENO Se han caracterizado tres genes que codifican molculas que se denominan molculas de HLA de clase I no clsicas: HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan gran homologa con las molculas clsicas de MHC-I (HLA-A, -B y -C) y que tambin se asocian con la beta2m. HLA-E y HLA-F se expresan en la mayora de tejidos fetales y adultos. HLA-G se expresa en los trofoblastos de la interfase materno-fetal donde las molculas clsicas MHC-I y MHC-II estn ausentes. Esta restriccin en la expresin de HLA-G parece ser importante en la tolerancia inmunolgica de la madre frente a los fetos semi-alognicos. Se ha demostrado que HLA-G es capaz de inhibir la actividad NK de los leucocitos de la decdua contra los trofoblastos durante el primer trimestre de gestacin. La funcin de HLA-G en la presentacin de antgeno y reconocimiento por clulas T es desconocida, pero en estudios experimentales se ha descrito que el correceptor CD8 reconoce y se une a la molculas HLAG. La especificidad de HLA-E est restringida por un grupo caracterstico de pptidos que derivan de la secuencia lder de otras molculas de MHC-I. HLA-E es reconocido por NKG2A, un receptor inhibidor expresado en la membrana de las clulas NK, asociado a CD94 que tras dicha interaccin enva una seal de inhibicin que bloquea la activacin de las clulas NK. MICA y MICB son molculas no clsicas de clase I, codificadas en el MHC, que se expresan sobre todo en fibroblastos y clulas epiteliales, en particular, en las clulas del epitelio intestinal. Su papel se ha implicado en los procesos de la inmunidad innata. MICA y MICB son reconocidos por NKG2D, un ligando expresado en clulas NK, clulas T gamma/delta y en algunas clulas T CD8+. La interaccin entre NKG2D y MIC activa la lisis de la clula diana. Las molculas de MICA y MICB pueden expresarse en membrana en ausencia de pptido.

CD1 La familia de los antgenos correspondientes a CD1 son glicoprotenas no polimrficas constitudas por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la beta2-microglobulina (beta2m). Se ha definido como una molcula presentadora de antgeno presente en la mayora de los mamferos. Mientras que en ratones las molculas CD1 pueden

presentar pptidos y molculas no peptdicas como glicolpidos a clulas T, en humanos slo hay evidencia de presentacin de presentan antgenos no peptdicos de origen microbiano, generalmente a clulas T alfa/beta de TCR restringido Las clulas T implicadas en el reconocimiento de antgeno presentado por CD1 son denominadas NKT. En humanos la familia de los genes de CD1 contiene 5 miembros: CD1A, CD1B, CD1C, CD1D y CD1E, que se agrupan en dos grupos en base a la similitud de la secuencia de aas entre ellas y entre especies. En general, las molculas de CD1 se expresan predominantemente en timocitos y en algunas APCs derivadas de mdula sea como las clulas dendrticas. Se ha descrito que las clulas del epitelio intestinal expresan las molculas de CD1d.

BIBLIOGRAFA

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Etapas iniciales en el reconocimiento de patgenos Respuesta Inmune Barreras Invasin e infeccin Piel y membranas mucosas
rpidamente regeneran superficies, movimientos peristticos, elevacin mucociliar, vmitos, flujo urinario, tos

El sistema de defensa de la inmunidad innata reconoce molculas de superficie que son:

Comunes a muchos patgenos Invariables a lo largo de la evolucin No expresadas en los tejidos del husped

Inmunidad Innata

Defensas Celulares y Humorales lisosomas, cidos estomacales, secreciones sebceas/mucosas, organismos comensales, fagocitosis, protenas del complemento

Patrones microbianos
Los patgenos que expresan patrones que pueden ser reconocidos y eliminados por clulas del sistema inmune, sistemas de reconocimiento invariantes. Estos incluyen los receptores de neutrfilos y macrfagos.

Inflamacin
Anticuerpos, citocinas,

Inmunidad Adaptativa

clulas cooperadoras y citotxicas

Patrones microbianos y patrones de receptores de reconocimiento Fallos de la Inmunidad Innata en el reconocimiento de patgenos La Inmunidad Innata puede fallar con patgenos que:
No expresan ninguno de los patrones microbianos comunes Cambian rpidamente sus molculas de superficie Se multiplican tan rpidamente que los mecanismos de la Inmunidad Innata no pueden eliminarlos

El reconocimiento antgeno especfico por el Sistema Inmune Adaptativo supera estos problemas
Patrones microbianos
Lipopolisacridos bacterianos Lipofosfoglicanos leismaniales Hemaglutininas bacterianas y virales -1-3-glucanos fngicos

Receptores de reconocimiento
CD11b/CD18 (CR3, Mac-1) CD11c/CD18 (CR4) CD14 Receptor Scavenger Receptor Manosa

Respuesta celular a sustancias microbianas

Reconocimiento innato del antgeno Reconocimiento adaptativo del antgeno

Teora de la Seleccin Clonal: MacFarlane Burnet 1957

Solo clulas TyB

Cada linfocito tiene un solo tipo de receptor con una nica especificidad La interaccin receptor-antgeno permite la activacin linfocitaria

Se reconocen muchas sustancias microbianas

Cada clula reconoce una sola sustancia microbiana

Las clulas hija tienen idntica especificidad antignica que las clulas parenterales Los receptores antignicos que reconocen antgenos propios pueden ser eliminados del REPERTORIO de receptores antes de su expansin clonal

NO CAMBIA

VARIABLE Y FLEXIBLE

Reconocimiento antignico de las clulas B

El receptor de antgeno de las clulas B es la Inmunoglobulina de membrana

El sitio de unin del antgeno a los anticuerpos

La unin de las zonas CDR de las cadenas VH y VL en la superficie del anticuerpo forma el sitio de unin al antgeno

La forma de la superficie determina que une La forma es dependiente de la secuencia proteica de los CDR Pequeas molculas denominadas HAPTENOS pueden unirse pequeos entrantes en la superficie del anticuerpo Los pptidos pueden unirse a surcos en la membrana

Los anticuerpos solubles y las inmunoglobulinas de membrana unen directamente antgenos nativos

Grandes protenas pueden unirse a la superficie del anticuerpo los CDR y a veces al resto de la zona variable

Determinantes antignicos
La respuesta efectiva, los anticuerpos normalmente bloquean el centro activo de las molculas que estn implicadas en la infeccin. Estos centros activos deben tener la conformacin correcta para unirse a las clulas y raramente mutan.

Eptopes discontinuos o conformacionales

Patgeno

Desnaturalizacin

Determinante antignico

A diferencia de los haptenos, los eptopes de protenas grandes estn compuestos de muchos aminocidos

Los aminocidos que constituyen el eptope pueden estar en diferentes partes de la molcula, unindose mediante los pliegues de la protena

Los anticuerpos no pueden unirse al eptope si la molcula no tiene una correcta CONFORMACIN

Eptopes continuos o lineales Interacciones antgeno-anticuerpo

Fuerzas no-covalentes Fuerzas electrostticas Puentes de hidrgeno

Origen Atraccin entre cargas opuestas Atraccin entre el N, O y el H Nubes de electrones poralizan tomos vecinos Uniones para excluir molculas de agua -NH3 ...OOC+ -

N-H...O=C + -

Los eptopes reconocidos por los linfocitos B no suelen ser lineales o continuos Estos eptopes estn con frecuencia expuestos en bucles o en la zona terminal de la protena y son muy tiles en la investigacin

Fuerzas de Van de Waals Fuerzas hidrofbicas

+ ... H2O H2O -+ +H2O H2O

Activacin de clulas B: mIgs, Ig e Ig

La regin intracitoplsmica de las cadenas pesadas es demasiado corta para transducir seales. Las cadenas Ig e Ig son necesrias para: Expresin en la superficie celular de las mIgs Pasar seales ITAMs Motivos de inmunorreceptor de activacin basado en tirosina en el dominio intracitoplsmico de Ig e Ig. Cuando se fosforilan, inician la cascada de seales citoplsmicas.
Las seales se inican por unin intermolecular de mIgs adyacentes al antgeno La seal es esencial para la proliferacin clonal y posterior diferenciacin a clulas plasmticas secretoras de Igs, pero esto solo es insuficiente para una completa activacin de las clulas B

Amplificacin de la activacin de las clulas B: El complejo co-receptor de la clulas B

Clula B

Clula folicular dendrtica

Las seales a travs del complejo co-receptor inducen la proliferacin (expansin clonal) y la expresin de molculas en las clulas B que les permiten comunicarse con las clulas T cooperadoras

Descubrimiento de las bases moleculares del reconocimiento antignico por los linfocitos T
Para que exista respuesta inmune es necesaria la presencia de clulas T y Macrfagos Cepa 2 Cepa 13 F1(2x13)

Descubrimiento de las bases moleculares del reconocimiento antignico por CTL

Clulas T de ratones de haplotipo MHC A inmunizados con el virus de la coriomeningitis linfoctica (LCMV)

Clulas diana de ratones con haplotipos A, B o C infectadas con LCMV

La repuesta de las clulas T depende del haplotipo MHC de los linfocitos y de los macrfagos RESTRICCIN MHC

Las CTL responden tambin dependiendo del haplotipo MHC de los linfocitos y de las clulas diana. RESTRICCION MHC

Reconocimiento antignico por los linfocitos T

Restriccin MHC

Clula T

Reconocimiento
Es necesaria la compatibilidad entre el TcR y el haplotipo del MHC
Pptido antignico X

TcR para el haplotipo A del MHC

El TcR interacciona con toda la superficie externa del complejo MHC-pptido antignico Por restriccin MHC se entiende el CO-RECONOCIMIENTO del propio MHC y del pptido antignico

Haplotipo A del MHC clase I CPA

El TcR es especfico para el pptido antignico El MHCde la clula presentadora de antgeno (CPA) RESTRINGE el reconocimiento por parte del TcR

Restriccin MHC
Clula T

Restriccin MHC

TcR para el haplotipo A del MHC

No reconocimiento
La incompatibilidad Pptido entre el TcR y el haplotipo del MHC antignico impide el X reconocimiento antignico a pesar de que el TcR pudiera ser especfico para el antgeno CPA

TcR para el haplotipo A del MHC

Pptido antignico Y

No reconocimiento
TcR no puede reconocer el antgeno Y a pesar de la compatibilidad entre el TcR y el haplotipo del MHC

Haplotipo B del MHC clase I

Haplotipo A del MHC clase I

CPA

Antgenos nominales y superantgenos Complejo TcR-MHC-pptido antignico Antgenos nominales

Requieren ser procesados a pptidos
Variabilidad

Superantgenos
No son procesados Solo la cadena del TcR est implicada en el reconocimiento

Los conponentes de las cadenas y del TcR estn implicados en el reconocimiento Ms de 100.000 clulas T reconocen cada pptido de aminocido de la cadena del TcR Son presentados solo por una molcula de MHC clase I o II. RESTRICCIN DEL RECNOCIMIENTO Casi toda protena puede ser antgeno nominal

Ranura de unin del pptido Pptido Clase I

Entre el 2 y el 20% de las clulas T reconocen cada superantgeno Son presentados por casi todas las molculas MHC de claseII Muy pocos antgenos son superantgenos

Sugiere un mecanismo notablemente diferente de presentacin antignica y de reconocimiento

Complejo TcR-CD3
La regin intracitoplsmica de las cadenas del TcR es demasiado corta para transducir seales. Las cadenas , , y son necearias para la expresin en la superficie celular del complejo TcR-CD3 y pasar seales a travs del TcR
ITAMs y TKs

Molculas del co-receptor de las clulas T

La seal es iniciada por agregacin de TcR adyacentes por el complejo pptido antignico-MHC presente en la CPA La seal es esencial para la proliferacin clonal y la diferenciacin de las clulas T efectoras, pero por s sola es insuficiente para una completa activacin de las clulas T

MHC Clase I

MHC Clase II

CD4 y CD8 pueden incrementar, unas 100 veces, la sensibilidad de las clulas T al complejo MHC-pptido antignico

CD4 y CD8 pueden ser utilizados para indicar la funcin y elementos de restriccin de las clulas T

Co-estimulacin del antgeno y el co-receptor en clulas T y B activadas

Patgenos exgenos
Eliminacin indirecta por las clulas Tcooperadoras Determinantes antignicos generados en las vesculas y unidos al MHC de clase II CD4 es el co-receptor para la presentcin antignica restingida a clase II Las clulas T cooperadoras expresan normalmente CD4 en su membrana

Patgenos endgenos
Eliminacin directa por CTL Determinantes antignicos generados en el citoplasma y unidos al MHC de clase I CD8 es el co-receptor para la presentacin antignica restringida a clase I Los CTL expresan normalmente CD8 en su membrana

SEAL 1:
Reconocimiento del antgeno (co-receptores)

La unin del receptor-antgeno y el co-receptor a menudo son insuficientes para la proliferacin y la expresin de las funciones efectoras

Co-estimulacin de clulas B y clulas T coopradoras

SEAL 2:
La interaccin co-estimuladora entre clulas T y B afines para el antgeno induce CD40L

Co-estimulacin de clulas T cooperadoras y CPA

SEAL 2 Interaccin co-estimuladora de CPA y clulas T afines

Unin mediada por el receptor

Procesamiento

Peligro!

SEAL 1:
El reconocimiento del antgeno y la unin del co-receptor induce CD40 en las clulas B
Procesamiento

Co-estimulador T-B soluble

INF-

SEAL 1
El reconocimiento antignico y la unin del co-receptor induce CD28 en las clulas T

Las seales 1 y 2 son necesarias para la prolliferacin clonal de las clulas B y su diferenciacin a clulas plasmticas

Las seales 1 y 2 son necesarias para la proliferacin clonal de las clulas T y su diferenciacin en clulas efectoras

Mecanismos de co-estimulacin en cluls T

Baja afinidad Alta afinidad

Hyptesis del peligro y co-estimulacin

La completa expresin de la funcin de las clulas T depende de la coestimulacin. Qu control existe de las molculas co-estimuladoras?

Cadenas y del Cadenas , y del receptor para IL-2 receptor para IL-2

PELIGRO

Patgenos reconocidos por marcadores bacterianos Clulas no apoptticas muertas (tejidos daados, infecciones virales, etc.)

PELIGRO

Clulas T en reposo

Seal 1 Induccin de IL-2R de alta afinidad

Seal 2 Aumento de la transcripcin de IL-2 y estabilizacin de ARNm para IL-2

SIN PELIGRO

Clulas muertas por aopotosis.

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

Intracelulares

13-Procesamiento y Presentacin de Antgeno

(ruta de clase I, ruta de clase II, superantgenos)

A. Corell UVA

Extracelulares

Indice de contenidos del Tema 13 Procesamiento y presentacin de Antgeno

13.1 La presentacin del antgeno a los linfocitos T: -generalidades Ruta de las molculas MHC de clase I Ruta de las molculas MHC de clase II Superantgenos Preferencias en la unin de pptidos
Calnexina

Presentacin por MHC clase I (1)

13.2 13.3 13.4 13.5

Calreticulina

TAP

Tapasina

Presentacin por MHC clase I (2)

Proteina Proteosoma

Peptidos

Tema 05. Receptor clulas T.

Como se ha indicado en captulos anteriores, los linfocitos T, poseen un mecanismo de reconocimiento antignico distinto de los linfocitos B. En el caso de los linfocitos T, el antgeno es primero degradado y procesado en el interior de las clulas presentadoras de antgeno (APC) y despus los pptidos resultantes son presentados a los linfocitos T que los reconocen a travs del receptor de las clulas T (TCR). As pues el linfocito T, a travs de su receptor, nicamente reconoce al antgeno cuando ste se encuentra presente en la membrana de la clula presentadora de antgeno. El receptor de los linfocitos T es de tipo clonotpico y est formado por la asociacin de dos cadenas polipeptdicas polimrficas (mayoritariamente y o bien a veces por y ) que constituyen las dos variantes de este receptor. Junto a este receptor se encuentra un grupo de molculas monomrficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando as el complejo TCR/CD3 (Figura 7.1). El TCR tiene como misin reconocer al antgeno (pptido) unido a la molcula de histocompatibilidad mientras que las molculas del complejo CD3 junto con otra molcula dimrica conocida como cadena , tienen como funcin la de transmitir las seales de activacin al interior celular. As pues, cuando tiene lugar el reconocimiento antignico entre el TCR y la molcula MHC que porta el antgeno, se desencadena una cascada de reacciones bioqumicas en el citoplasma de la clula T, dando as lugar al inicio del proceso de activacin de estos linfocitos. En este captulo estudiaremos tanto la estructura, como la gentica y funcin de este complejo TCR/CD3 junto con el homodmero .

Estructura TCR/CD3
Mediante la utilizacin de hbridos se determin que el reconocimiento del antgeno y de la molcula MHC se lleva a cabo simultneamente por un mismo TCR/CD3 aunque cada una de las molculas que lo componen tienen diferentes funciones. Componentes del complejo TCR/CD3 El complejo TCR/CD3 consta de dos partes bien diferenciadas, tanto estructural como funcionalmente (Figura 7.2). Estas son: TCR. Heterodmero con dos subunidades proteicas, denominadas y , unidas covalentemente por puentes disulfuro. Es la porcin especfica del receptor, por lo tanto polimrfica, y en ella se da la variacin clonotpica que va a permitir el reconocimiento de los ms de 108 antgenos diferentes. Existe una variante del TCR que se encuentra en unas pocas clulas T, y est formada por cadenas

y en lugar de las cadenas y . Este heterodmero no se asocia covalentemente, y su funcin an no est claramente determinada. CD3. Es la porcin invariante del complejo y est formado por al menos 3 monmeros unidos no covalentemente, denominados , y . El complejo CD3 fue descubierto por anticuerpos monoclonales, OKT3 y Leu4. Tambin forma parte del CD3 un homodmero, conocido como zeta, que posee una gran parte de la molcula en el citoplasma. Todo este complejo, y principalmente las cadenas , son los encargados de transmitir la seal del reconocimiento antignico al interior celular. Todos los componentes del receptor de la clula T son protenas de membrana, y estn formadas por un dominio N-terminal extracelular, un domino transmembrana y otro dominio citoplsmico C-terminal. Estructura bioqumica del TCR Cadena TCR-alfa Es una cadena glicosilada que est divida en los siguientes dominios (Figura 7.3; Figura 7.4), adems del pptido lder: Un dominio extracelular, constituido por una regin variable parecida a la de las inmunoglobulinas y con 2 cistenas implicadas en los puentes disulfuro; una regin de unin y una regin constante que tambin contiene 2 cistenas implicadas en puentes disulfuro intracatenarios. Un dominio transmembranal, donde es particularmente significativo la presencia de dos aminocidos bsicos implicados, probablemente, en el puente de unin de tipo salino con las cadenas del complejo CD3. Un dominio intracelular de tan slo 5 aminocidos.

Cadena TCR-beta. Es una cadena glicosilada con estructura similar a la ya mencionada TCR-. Consta de un pptido leader y tres dominios diferentes extracelular, transmembrana e intracelular (Figura 7.3; Figura 7.4) Estructura bioqumica del complejo CD3 Cadena CD3-. La subunidad CD3-delta es una glicoprotena constituida por tres dominios bien diferenciados: dominio extracelular, que lleva dos oligosacridos unidos; un dominio transmembranal y un dominio intracitoplasmtico (Figura 7.5).

Cadena CD3-. Es una protena no glicosilada. Est constituda por tres dominios: a) extracelular, comprendiendo los residuos 1 al 107; b) transmembranal, de marcado carcter hidrofbico; c) intracelular, constituido por dos porciones claramente diferenciadas.

Cadena CD3-. Es tambin una glicoprotena de estructura similar a las anteriores y su funcin se cree que es fundamentalmente estructural y/o de interaccin con otros correceptores (CD2, CD4, CD8, etc.). Cadena CD-. Tiene una estructura distinta de los otros pptidos del complejo CD3, ya que su dominio extracelular es de mucho menor tamao que el intracelular (Figura 7.6). La subunidad se encuentra asociada al TCR generalmente en forma un homodmero. Dentro del dominio citoplasmtico de todas las cadenas que forman el CD3 (, , y en la cadena ) existen unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activating Motif) que son ricas en tirosinas y susceptibles de ser fosforiladas en el proceso de transduccin de seales de activacin hacia el interior celular. Cada una de las cadenas , , posee uno de estos motivos ITAM, mientras que la cadena posee tres. Los motivos ITAM se caracterizan por poseer dos copias de la secuencia tirosina-X-X-leucina separadas por seis u ocho residuos y tienen como funcin la de poder fosforilarse contribuyendo as al proceso de transmisin de seales en las fases iniciales de la activacin de los linfocitos. Estructura del receptor TCR-- Este tipo de receptor se expresa en una poblacin minoritaria de linfocitos T perifricos que carecen de las molculas de superficie CD4 y CD8 (tambin se encuentran en una pequea proporcin de timocitos, en linfocitos de epitelio intestinal y en algunas clulas dendrticas epidrmicas). La funcin de este tipo celular no est bien caracterizada, aunque se cree que juegan un importante papel en las enfermedades autoinmunes (se aprecia un aumento del nmero de este subtipo celular en sangre perifrica). Sntesis y proceso de acoplamiento del complejo TCR/CD3. Las cadenas peptdicas son sintetizadas en poliribosomas asociados a membrana, y la

formacin del complejo TCR/CD3 se produce mientras estas molculas an residen en el retculo endoplsmico. Las primeras estructuras que se detectan durante este proceso de biosntesis son CD3. Posteriormente se unen las cadenas y . (Se ha comprobado que mutantes que carecen de las subunidades y no son capaces de expresar el complejo TCR/CD3 en la superficie celular). Por ltimo se produce la unin de la subunidad y la glicosilaci n en el extremo N terminal de las cadenas y del TCR y y del complejo CD3 (Figura 3.7). Con estos dos ltimos procesos, el receptor est listo para abandonar el retculo endoplsmico y comenzar el mecanismo de exportacin, a travs del Golgi, a la superficie celular. La maquinaria enzimtica que se encuentra en el interior del complejo de Golgi realiza un procesamiento, tanto de las subunidades proteicas como de las cadenas glucdicas unidas a stas. Este proceso es necesario para que el receptor sea completamente funcional cuando llegue a la membrana celular. Estequiometra del complejo TCR/CD3 Aunque se conocen los componentes del complejo TCR/CD3, no se ha determinado an con precisin en qu proporcin se asocian para constituir un complejo funcional. Segn la hiptesis mas extendida, habra receptores formados por las molculas y del TCR con las molculas , , y del complejo CD3, pero tambin podran existir los receptores con otras isoformas (Figura 3.8). En todos los casos, habra dos sitios de unin al antgeno por complejo, como ocurre con las inmunoglobulinas.

Gentica
Al igual que ocurre en las inmunoglobulinas, los genes que codifican las cadenas alfa y beta del TCR estn formadas a partir de la unin de elementos gnicos separados. El reordenamiento gnico, tanto de las inmunoglobulinas como del TCR, es dependiente de la presencia de secuencias de DNA especficas adyacentes a los segmentos gnicos de reordenamiento. Mediante este proceso se genera una enorme diversidad de receptores. El gen TCR- La organizacin gnica de la cadena alfa se puede dividir en cuatro regiones (Figura 7.9): Una regin constante, que se reparte en cuatro exones, y que codifica para la regin constante de la cadena (C-). Una serie de segmentos de unin (J). Segmentos que codifican para las secuencias variables de la cadena V-.

El gen TCR- Hay dos genes constantes, usados de forma intercambiable en todos los tipos de clulas T, denominados C-1 y C-2, repartidos en cuatro exones que codifican el dominio constante y una porcin del pptido de unin, regin bisagra y la cistena de unin entre las cadenas y , el dominio transmembrana y la fraccin citoplasmtica, respectivamente (Figura 7.9). Los genes TCR y La organizacin gentica de los loci del -TCR est constituida por una serie de varios genes variables, seguido de dos segmentos diferentes de genes J-C. La diversidad de combinaciones generadas es muy limitada. Adems, una de las regiones constantes es defectiva y podra eliminar uno de los genes V-, no pudiendo participar como molcula funcional (una caracterstica de la regin constante es que en el 2 exn se ha perdido el residuo de cistena, implicado en la formacin del puente disulfuro intercatenario). Estructura gentica del complejo CD3 Los genes que codifican para CD3- y CD3- se encuentran muy prximos en las especies analizadas. En humanos, ambos genes estn localizados en el brazo largo del cromosoma 11. El gen CD3- est constitudo por cinco exones, mientras que el gen CD3- tiene 7 y el gen CD3- 9 exones. Las caractersticas ms importantes de estos genes son: su relacin con los genes de la superfamilia de las inmunoglobulinas; su expresin parece estar coordinada y regulada por factores reguladores superpuestos y sus genes son transcritos sin promotores TATA, secuencia caracterstica de eucariotas. Reordenamiento de los genes del TCR Las secuencias adyacentes a la zona 5' de los segmentos J tienen, en homologa a las inmunoglobulinas, determinadas secuencias, formadas por un heptmero y un nonmero, y espaciadores muy conservativas implicados, como seal de reconocimiento, en el reordenamiento somtico. Las regiones D tambin estn rodeadas de estas seales de reconocimiento. Gracias a la existencia de regiones espaciadoras en D y J, es posible la asociacin D-V J-V. El mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas (Figura 7.10): Formacin de loops por secuencias complementarias, lo que origina la recombinacin de los genes D y J. El gen V sigue un mecanismo anlogo, constituyndose segmentos funcionales V-D-J. La regin V podra asociarse tanto con genes de la regin D como con la regin J (esto no ocurre en la cadena pesada de las inmunoglobulinas, donde la regin V slo puede hacerlo con la regin D). Por ltimo, se produce el agrupamiento de un gen L (secuencia lder) y la regin constante, dando lugar al DNA reordenado y completo que habra as creado una especificidad al azar. Generacin de la diversidad en los genes del receptor Hay una serie de factores que intervienen en la generacin de la diversidad:

 germinal

la unin aleatoria de los mltiples segmentos de los genes de la lnea la diversidad de unin que resulta de una fusin imprecisa entre los distintos segmentos genticos, provocando delecciones y adiciones de nucletidos, dando as origen a una diferencia en el nmero de aminocidos la asociacin al azar de las subunidades peptdicas que constituyen el receptor (habra 5.000 tipos distintos de cadenas y m s de 500 de cadenas , que pueden potencialmente formar 2.5 millones de combinaciones TCR V(D) J) y a multiplicidad de los genes variables V. En contraste con las inmunoglobulinas, los genes de TCR no parecen diversificarse mediante mutaciones somticas de los genes reordenados, posiblemente debido a la necesidad de reconocimiento de la molcula MHC.

Funcin del receptor

Las funciones del receptor clonotpico de la clula T son, durante el desarrollo en el timo del linaje T, participar en la seleccin positiva y negativa de estas clulas, y en la periferia el reconocimiento de antgenos (pptidos) exgenos. Seleccin intratmica de los linfocitos T El desarrollo de las clulas T en el timo, tal como se vio en el captulo 2, est controlado por el TCR de los timocitos en dos estadios distintos (Figura 7.11). Primero, un homodmero TCR- asociado al complejo CD3 controla la expansin de los timocitos inmaduros, media la exclusin allica del locus TCR, inicia la expresi n gnica simultanea de CD4 y CD8, e induce la transcripcin del locus TCR . En un segundo estadio, una vez que las clulas tienen el receptor formado por el heterodmero /, la especificidad del TCR intervine controlando el proceso de maduracin de los timoncitos de dos formas: seleccionando estas clulas para la maduracin cuando reconocen las molculas MHC de clase I y II de las clulas del epitelio cortical del timo (seleccin positiva) o entre las seleccionadas positivamente, entran en una muerte celular programada (apoptosis) cuando sus receptores se unen con alta afinidad a un complejo MHC-pptido endgeno (seleccin negativa). En la (Figura 7.12) se esquematiza el proceso de seleccin positiva y seleccin negativa y en la (Figura 7.13) la composicin celular del timo y principales fases de la seleccin de timocitos.

Seleccin positiva de los linfocitos T. En la seleccin positiva los timocitos se unen mediante su TCR con baja afinidad a las molculas HLA clase I y II de las clulas epiteliales del timo en cuyo caso sobreviven mientras que aquellos timocitos que no participan en este tipo de unin mueren por apoptosis. En definitiva estos linfocitos que se seleccionan positivamente son rescatados de su muerte por apoptosis. En este proceso participan tambin los pptidos propios presentados por las molculas de histocompatibilidad tambin propias de cada individuo. En este proceso tambin participan los receptores CD4 y CD8 de estos timocitos que como sabemos son doblemente positivos (CD4+ y CD8+). Incluso experimentos bloqueando con anticuerpos monoclonales tanto los receptores CD4 como CD8 han demostrado que la participacin de uno u otro de estos receptores hace que los timocitos deriven hacia linfocitos T citotxicos o linfocitos T colaboradores, segn que participe el receptor CD8 o CD4 respectivamente. Este tipo de seleccin se efecta principalmente en el cortex del timo. Seleccin negativa de los linfocitos T. Este tipo de seleccin conduce a la muerte por apoptosis de aquellos timocitos que reconocen con gran avidez mediante su TCR a las molculas de histocompatibilidad I o II presentes en clulas dendrticas del timo. En este caso esta demostrado que los pptidos propios presentados por las molculas HLA son de gran importancia. Este tipo de seleccin es especialmente importante eliminando aquellos clonos celulares que al reconocer lo propio (HLA ms pptidos propios) pueden tener capacidad autoreactiva una vez han madurado. Precisamente al eliminar estas clulas se evita esto y la posibilidad de desarrollo de enfermedades autoinmunes en el futuro. Es de destacar, como veremos en el capitulo de activacin de linfocitos T, que cuando este tipo de unin de alta afinidad se produce en clulas maduras, en lugar de muerte por apoptosis, se produce una activacin linfocitaria. Este tipo de seleccin se efecta principalmente en la mdula del timo. En conclusin con estos dos procesos se garantiza: la supervivencia selectiva de los linfocitos T capaces de reconocer pptidos sobre las molculas MHC del individuo en el que tendrn que trabajar (seleccin positiva) y la eliminacin de los linfocitos T autorreactivos (seleccin negativa) Una vez producida la seleccin positiva y negativa, las clulas supervivientes (menos del 2% del total) dejan de expresar uno de los dos correceptores (CD4 o CD8), dando lugar a clulas CD4+CD8- TCR- o CD4-CD8+ TCR- maduras (la regulaci n de la mutua exclusin de los genes CD4 y CD8 no est an esclarecida). Reconocimiento del antgeno por el TCR Los linfocitos T maduros tienen la capacidad de reconocer antgenos (pptidos) exgenos en presencia de molculas de histocompatibilidad. Los pptidos que son reconocidos por las clulas T deben tener una estructura secundaria en -hlice y que todos los pptidos antignicos son anfipticos, con una cara hidroflica y otra hidrofbica, pudiendo interaccionar una de las caras con el complejo TCR/CD3 y la otra con la molcula de MHC, respectivamente. Por esta razn, el reconocimiento de la asociacin

MHC/pptido antignico es un proceso dinmico que incluye un primer paso de complejas interacciones clula-clula, antes de que se produzca un contacto productivo que d lugar a la activacin celular. En el reconocimiento antignico, adems del receptor clonotpico juegan, como veremos en captulos posteriores, un papel fundamental otras molculas de superficie (entre ellas se encuentran CD4, CD8, CD2, CD45). Cuando se produce el reconocimiento del antgeno se inicia la activacin celular, durante la cual se inducen diversos programas funcionales en los linfocitos T: sntesis de factores de crecimiento y de maduracin llamados linfocinas, sntesis de perforinas, seleccin clonal, proliferacin celular, etc. (Ver capitulo sobre activacin de linfocitos T en donde se tratar con detalle la participacin del TCR en la activacin de estas clulas). Reconocimiento de superantgenos Se denominan superantgenos a aquellos antgenos capaces de reaccionar con distintas molculas MHC de clase II y TCR de un mismo individuo. Pueden ser exgenos (como las toxinas de ciertos estafilococos), si provienen del exterior, o endgenos (como el retrovirus MMTV), si se reproducen en la lnea germinal (Figura 7.14). El reconocimiento del superantgeno se distingue del reconocimiento del pptido antignico convencional por tres caractersticas fundamentales: la especificidad de la clula T a los superantgenos est determinada por la regin variable de la cadena siendo independiente de otros componentes del receptor de la clula T; el superantgeno tiene dos sitios de unin, uno para la molcula MHC de clase II, fuera de la hendidura de reconocimiento peptdico, y otro para el TCR, situado en la regin V b fuera del sitio clsico de unin al complejo MHCantgeno (esta caracterstica hace posible que un mismo superantgeno pueda interaccionar con distintas clulas del repertorio T). Como consecuencia del reconocimiento de superantgenos exgenos en periferia, se produce la activacin celular y fuerte expansin de las clulas T implicadas en el reconocimiento. Enfermedades asociadas Alteraciones de diferente ndole del TCR/CD3 pueden dar lugar a enfermedades a veces de difcil diagnstico. Receptor clonotpico: oligoclonalidad y enfermedad Los linfocitos T constituyen, en condiciones normales, una poblacin policlonal en la que estn representados, en proporciones equivalentes, todas las regiones V de las cadenas TCR-a y TCR-. Sin embargo, diferencias en la configuracin de los genes del receptor clonotpico o en la seleccin intratmica pueden afectar al repertorio de linfocitos T, existiendo una reduccin de determinados clones y un aumento de los niveles de otros. Estas alteraciones pueden detectarse analizando la expresin de las regiones V de las cadenas y de estas clulas, y se ha demostrado que se asocian a ciertas enfermedades autoinmunes como la artritis experimental inducida por colgeno. Complejo CD3 y transduccin de la seal Se ha descrito diversas enfermedades causadas por deficiencias que afectan de forma selectiva a una o varias molculas del complejo TCR/CD3 (defectos estructurales), o bien por un defecto en la transmisin de la seal de activacin al interior celular (deficiencias funcionales, ya sean primarios o secundarios).

Estas deficiencias producen alteraciones en el sistema inmune: disminucin del nmero de linfocitos, inhibicin de la proliferacin celular, reduccin de la sntesis de citocinas, etc. Las consecuencias clnicas que se derivan de estos defectos son variadas y ms o menos graves; sobre todo existen infecciones recurrentes y, a veces, enfermedades autoinmunes. Defectos estructurales Hasta el momento se han descrito, en humanos, tres deficiencias que afectan al complejo CD3 o protenas asociadas a l: CD3-, CD3-y la PTK Zap-70. En los enfermos con dficit de las cadenas CD3-, CD3- hay una disminucin del nmero de molculas de membrana del complejo TCR/CD3, el 50% para la deficiencia de CD3- y un 90% para el CD3-; este dato sugiere que la cadena es ms importante para la conformacin del complejo, y que, como comentamos anteriormente, existiran isoformas del complejo donde las cadenas CD3- y , que pueden ser alternativas, y suficientes para que CD3 se transporte a la membrana. Defectos secundarios del reconocimiento a travs del TCR/CD3. Algunos virus pueden producir efectos patognicos directos en el sistema inmune por interferir en la transduccin de seales por el TCR/CD3. Se ha demostrado que algunos virus infectan clulas T humanas: virus de inmunodeficiencia humana (HIV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6), measles virus y otros. Tambin se sabe que algunos tumores inducen inmunodeficiencias secundarias de los linfocitos T, probablemente, entre otros factores alteraciones estructurales en el complejo CD3.

El Receptor de Antgeno del Linfocito T

(Las protenas del TcR; el complejo CD3 y los co-receptores; Otras molculas accesorias; transduccin de seales)

CD3 es una estructura auxiliar para el TCR. Consta de varias subunidades (cadenas , , y ). Cuando el TCR une un {Ag + MHC} apropiado, CD3 es responsable de anunciar esa situacin al interior celular e iniciar la activacin.

CD4+ T Cell
TCR CD4 MHC II CD8

CD8+ T Cell
TCR

MHC I

APC

APC

Generacin de Variabilidad de Receptores Generacin del Repertorio de linfocitos T

(Variabilidad: genes y mecanismos; linfopoyesis y seleccin en el timo; presentacin de antgeno a los linfocitos T) Loci Multiples Reordenamiento cromosmico Diversidad de Unin Mutacin Somtica (en clulas B, pero no en T)

Clulas T

~ 1016 combinaciones diferentes

Clulas T

Cadenas del TCR

genes V 70 - 80 ~ 50 12 70 - 80 genesD -2 -3 genesJ ~ 60 ~ 12 5 3 C 1 2 2 1

V = Variable; D = Diversidad; J = Unin; C = Constante

Qu sucede si al primer intento no se produce una cadena funcional? La clula lo intenta de nuevo. Cuando se produce una cadena productiva el sistema de reordenamiento se para. Si no se consiguen cadenas funcionales con uno de los cromosomas, se comienzan los reordenamientos en el 2. Si finalmente no se producen cadenas productivas la clula muere. Lo mismo suecede la cadena proteica .

Seleccin positiva: aprendizaje de lo propio

Intracelulares

Presentacin por MHC clase I (1)

Extracelulares

Calnexina

Calreticulina

TAP

Tapasina

Presentacin por MHC clase I (2)

Proteina Proteosoma

Peptidos

MHC Class II Bind Peptides Up To 18 or 19 Residues (tolerant of much more variation in size)

Tras la activacin, los linfocitos T modifican la expresin en superficie de diferentes marcadores.

Generacin de Linfocitos T efectores

(Molculas de activacin; Subtipos de linfocitos T cooperadores; Linfocitos T citotxicos)

Ligandos habituales
Clulas T ICAM-3 CD2 LFA-1 LFA-1 APC LFA-1 CD58 (LFA-3) ICAM-1 ICAM-2

El contacto iniciar entre clulas T y APCs no se hace a travs del TCR sino de molculas accesorias

La activacin de linfocitos T CD4+ requiere al menos 2 seales desde la APC:

1 {Ag + MHC} se unen al TCR Seales adicionales (va molculas de superficie o citocinas):destaca CD28.

Ligandos 2s
CD80 y CD86 Presentes en APCs Se unen a CD-28 y CTLA-4 en clulas T CD-28 Presente en clulas T vrgenes y activadas Cuando se une, promueve seales positivas para la clula T CTLA-4 (CD152) Presente slo en clulas T activadas Cuando se une, promueve seales negativas para la clula T

La estimulacin del TCR sin una segunda seal conduce a las clulas T a estados de anergia (inactividad)

Clulas T en reposo Expresan las subunidades y del

receptor para IL-2 (IL-2R): baja-media afinidad

Clulas T activadas Expresan las 3 subunidades: , y del

receptor de IL-2: alta afinidad

La unin de CD80/CD86 de las APCs alternativamente con CD-28 CTLA-4 (en clulas T) determina si la clula recibe seales positivas o negativas.

Clulas T CD4
Th1 Activa a macrfagos y clulas NK Ayuda a algunas clulas B en la produccin de anticuerpos Ayuda a clulas T CD8 Th2 Ayudan mayoritariamente a clulas B en la produccin de anticuerpos Activan a mastocitos y eosinfilos Th1 y Th2 se inhiben recirprocamente

Clulas T CD8
Clulas T citotxicas (CTL)
Identifican clulas infectadas o malignas y las eliminan por contacto directo

Linfocitos T Reguladores
Llamados supresores (Ts) Pueden aminorar la actividad inmune de otras clulas

Las clulas T CD4 co-estimulan a linfocitos T CD8

Activados CD4 IFN- IL-2 B7 y HLA en APC

Activacio n de CD8

Descubrimiento del receptor de antgeno de las clulas R (TcR)

Clulas T policlonales

Descubrimiento del receptor de antgeno de las clulas R (TcR)

Clulas lisadas y adicin de anticuerpos anti-clonotpicos

Clulas T monoclonales

Captura del complejo Ag-Anticuerpo anti-clonotpico en un soporte insoluble INMUNOPRECIPITACIN Elucin del antgeno del complejo ag-ab y anlisis bioqumico de la protena expresada clonotpicamente El principal componente fue una protena de 90 kD reducida a dos protenas de 40 y 50 kD (cadenas y ) Algunas otras protenas co-inmunoprecipitaron

La seleccin clonal asegura que las clulas hijas tengan la misma especificidad antignica que la clula parental Los anticuerpos producidos contra un solo clon de clulas T se denominan CLONOTPICOS La hiptesis fue que los anticuerpos contra un clon reconocan el receptor de antgeno

Descubrimiento del TcR

Digestin con bromuro de ciangeno de las protenas y purificadas utilizando anticuerpos anti-clonotpicos Clula T clon A Clula T clon B Clula T clon C Cadenas polipeptdicas del TcR intacto

Clonaje de los genes TcR

mARN clula B

mARN clula T cADN de una sola clula T

Anlisis bioqumico Productos de digestin Las protenas purificadas mostraron dos partes: una variable dependiente del clon y una constante HYBRIDIZACIN SUSTRACTIVA

Hbrido ADN/ARN Hbridos descartados

Clonacin y secuenciacin de genes aislados de clulas T especficas

Anlisis de genes especficos de clulas T

Sitos de restriccin enzimtica ADN LINEA GERMINAL ADN REORDENADO

Similitudes y diferencias entre el TcR y las Ig

Sitio de combinacin con el antgeno

Carbohidratos Bisagra

Hgado
Sitos de digestin del ADN genmico

T
Dominio citoplsmico Los sitios de unin al antgeno de las regiones V de las dos cadenas unidas por puentes disulfuro Estructura en dominios de los GENES de la SUPERFAMILIA de las Ig El TcR es monovalente y nunca se secreta

Electroforesis en gel

Organizacin de los genes del TcR de ratn

Reordenamiento gnico del TcR por RECOMBINACIN SOMTICA

Lnea germinal TcR Reordenamiento TcR 1 transcrito Unin del mARN TcR

Lnea germinal TcR Divisin de los genes del TcR en V, D, J y C (VARIABLE, DIVERSO, UNIN Y CONSTANTE) similar a los genes de las Ig Reordenamiento TcR 1 transcrito Unin del mARN TcR

Recombinacin seal de secuencia (RSS)

HEPTMERO - siempre contiguo a la secuencia codificante ESPACIADOR - 1-2 vueltas de -hlice, alinea 7 y 9mero en el mismo lado de la hlice

Recombinacin por bucle y deleccin

NONMERO

REGLA 12-23 - Un segmento del flanqueado por 23 nucletidos (RSS) solo puede ser unido a un segmento flanqueado por 12 nucletidos (RSS) Esto evita uniones V-V, V-J, J-J

Bucle y deleccin

Diversidad del TcR

DIVERSIDAD COMBINATORIA
Mltiples segmentos germinales TcR humano: Segmento Variable (V): ~70, 52 Segmento Diversidad (D): 0, 2 (de las 3 formas posibles) Segmento Unin (J): 61, 13

UNIONES DIVERSAS
Adiciones de nucletidos P y N

MUTACIONES SOMTICAS
Rotura y empalme SEAL DE UNIN CODIFICACIN UNIDA NO es un mecanismo importante en la diversidad del TcR

Tres formas de lectura del segmento D

El anlisis de la regin D1 de diferentes clones de clulas T muestra que la regin D se puede traducir de tres formas

Diversidad en la unin de los segmentos Adicin de nucletidos P

Forma 1

Se corta un segmento al final del heptmero por recombinacin de los genes (RAG1/RAG2) de la RECOMBINASA V(D)J

Forma 2

Forma 3 El segundo segmento se corta y adopta la forma de horquilla entra las bases complementarias al final de las regiones V y D

Diversidad en la unin de los segmentos Adicin de nucletidos P

Formacin de la seal de unin

Diversidad en la unin de los segmentos Adicin de nucletidos N

La terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT) aade al azar nucletidos en el extremo 3 del ADN en un fragmento V y D

La endonucleasa rompe un fragmento en los segmentos V y D al azar

Unin de las bases complementarias

Las aperturas de las horquillas son Palindrmicas. GA y AT se llaman nucletidos P Las secuencias de nucletidos P no estn presentes en el ADN germinal

Las exonucleasas y polimerasas reparan, rellenando y uniendo para formar el CODIGO de UNIN GCTATA y AGCTG se llaman nucletidos N (No codificados previamente) Las secuencias de nucletidos N no estn presentes en el ADN germinal

Lugares de unin y diversidad

Cadena TcR Cadena TcR

Localizacin de la diversidad en el TcR

Variabilidad

Unin V-J

Unin V-D

Unin D-J

N de aminocido en la cadena del TcR Monmero TcR V Cadena TcR

Estimacin del nmero de TcR e Ig humanas

Elemento Segmentos Variable Segmentos Diversidad Segmentos D en las 3 posibilidades Segmentos Unin Unin con nucletidos N y P N de pares de genes V Diversidad de unin Diversidad total Inmunoglobulina H 51 ~ 30 Raro 5 2 3519 ~1013 ~1016** y 69 0 5 (1)* 52 2 Frecuente 13 2 3640 ~1013 ~1016 TcR ~70 0 61 1

Por qu el TcR no tiene mutaciones somticas?

Las clulas T especficas contra antgenos propios son fuertemente desechadas Las clulas T pueden colaborar con clulas B contra el antgeno PERO NO contra el antgeno

Antgeno extrao CPA

* Solo la mitad de las cadenas humanas tienen regiones N y P ** N de receptores distintos despus de las mutaciones somticas

Antgeno propio

Las clulas B con anticuerpos contra sufren una seleccin clonal bajo el control de las clulas T especficas contra Estas clulas B sufren mutaciones somticas en su receptor de antgeno Las clulas que mutan su receptor para reconocer antgenos propios no tienen la cooperacin de las clulas T para producir una respuesta contra lo propio

Si el TcR sufriera mutacin somtica

Las clulas T especficas contra antgenos propios son fuertemente desechadas Si las clulas T mutan su TcR, podran ser autoreactivas, podran cooperar con clulas B autoreactivas

Si el TcR sufriera mutacin somtica

Antgeno extrao

Antgeno propio Las clulas B con anticuerpos contra y contra pueden sufrir seleccin clonal bajo el control de las clulas T especficas contra y contra

El TcR interacciona con toda la superfice externa del complejo MHCpptido antignico La mutacin somtica puede hacer contactar los residuos mutados del TcR que interaccionan con el MHC, ello puede suponer la prdida del reconocimiento del complejo MHC-pptido

El TcR alternativo:
El TcR descubierto como un reordenamiento homlogo al de las Ig La cadena TcR se asocia con la cadena TcR

Clulas T
Son un linaje de clulas diferente con funcin desconocida 1-5% de las clulas T de sangre perifrica expresan TcR En el intestino y en la epidermis de los ratones, la mayora de las clulas T expresan Los ligandos de TcR son desconocidos

Locus humano

Posible reconocimiento: Antgenos no implicados con la expresin del MHC Genes de clase IB

El locus est localizado entre la regin V y J El reordenamiento V y J produce la deleccin de D, J y C en la clula TcR

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

4.-Antgenos CD
(Marcadores de linaje; marcadores de diferenciacin; marcadores de activacin; Superfamilias)
A. Corell UVA

CD3+

CD3+ CD3+ CD3+

Indice de contenidos del Tema 5

Antgenos de diferenciacin Leucocitaria (CD) 4.1 Antgenos de diferenciacin de linfocitos T 4.2 Antgenos de diferenciacin de linfocitos B 4.3 Antgenos de diferenciacin de linfocitos NK 4.4 Antgenos de diferenciacin del linaje mieloide 4.5 Clasificacines: * Superfamilias * Funcionalidad de los diferentes CD

CD28

Receptores NKR Receptores KIR

Exclusivos de NK

Compartidos con otros linfocitos

Compartidos con otras cel. mieloides

11

10

12

13

14

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

Generacin de Variabilidad de Receptores

MECANISMO Loci mltiples Recombinacin somtica Diversidad de uniones Maduracin de afinidad Cambio de isotipo B SI SI SI SI SI T SI SI SI NO NO

10.-Generacin del Repertorio de linfocitos T

(Variabilidad: genes y mecanismos; linfopoyesis y seleccin en el timo; presentacin de antgeno a los linfocitos T)
A. Corell UVA

Indice de contenidos del Tema 9 Generacin del Repertorio de Linfocitos T

10.1 Variabilidad en el repertorio de linfocitos T : -Genes y mecanismos de reordenamiento -Variabilidad transcripcional y de unin -Grado de diversidad 10.2 Diferenciacin de los linfocitos T en el timo: -Etapas -Mecanismos de seleccin clonal

~ 1016 combinaciones diferentes

45-60 KD (J) 40-50 KD (G)

Clulas T DE

Chr14

Chr7

Qu sucede si al primer intento no se produce una cadena E funcional? La clula lo intenta de nuevo. Cuando se produce una cadena productiva el sistema de reordenamiento se para. Si no se consiguen cadenas funcionales con uno de los cromosomas, se comienzan los reordenamientos en el 2. Si finalmente no se producen cadenas productivas la clula muere. Lo mismo suecede la cadena proteica D.

Clulas T JG

Chr7

D EJG

JG

Seleccin positiva: aprendizaje de lo propio

Tema08.Activacinlinfocitos

Unavezqueloslinfocitosreconocenmediantesusreceptoresalaestructurassusespecficasy adems se produce la interaccin celular adecuada se inicia el proceso de activacin de los mismos.Enestecaptuloabordaremosyestudiaremostodoloreferentealaactivacindelos

LinfocitosT LinfocitosB ClulasNK

De esta manera despus se podrn estudiar con detalle la respuesta humoral y celular en las que intervienen, entre otras clulas,los linfocitos B y T, as como la respuesta innata en la que intervienenlasclulasNK.

ActivacinlinfocitosT
LaactivacindeloslinfocitosTseiniciacuandoelreceptordeloslinfocitosT(TCR)reconoce la molcula HLA junto al pptido que sta transporta.La uninentre el TCR y el pptido junto conla molcula HLA tanto de clase I como II es especfica. A su vez al HLA clase II y I presentadora se unen los receptores CD4 y CD8 respectivamente con lo cual se fortalece la interaccin entre TCR y HLA ms pptido. El proceso de reconocimiento vara si el receptor de la clula T est formado por el heterodmero alfa/beta (clulas T alfa/beta) o si es del tipo gamma/delta (clulas T gamma/delta), ya que en estas ltimas no participan las molculas accesoriasCD4yCD8. Sin embargo para que la activacin se inicie adecuadamente,se requiere adems, la participacin dediferentes molculas presentes en la membrana de dichos linfocitos.De estas molculasdestacan:

Las molculas CD4, CD8 y CD28 que facilitarn la unin intercelular y adems potenciarn la transmisin de sea lesalinteriorcelular Las molculas del CD3 que tienen por funcin la de trasmitir las seales recep cionadas por el TCR al interior de la clula. Estas molculas junto

conelTCR,formanelcomplejoTCR/CD3y Molculas de adhesin, cuya funcin es fortalecer la unin entre los linfocitos T y las clulaspresentadorasdeantgenos.

Una vez activados los linfocitos T, stos producirn prioritariamente citocinas o factores citotxicos, segn se trate de linfocitos Th o Tc respectivamente. De esta manera se desarrollar la respuesta inmune en la que estn implicados los linfocitos T. As, los linfocitos Th colaborarn en la posterior regulacin de otras clulas, tales como NK,linfocitos By Tc o macrfagos, mientras queloslinfocitos Tc activadosejercern su funcin citotxica destruyendoclulasblanco(Figura10.1). En este captulose estudiar el procesode interaccin celular, la funcin del complejo TCR/CD3 comoinicio de la activacin celular,la cascada de seales intracelulares y la activacindelosdiferentesfactoresdetranscripcincelular. FENOMENOS DE INTERACIN CELUALR Como se ha dicho anteriormente en muchos casos la unin del antgeno con el TCR no es suficiente para dar lugar a una respuesta inmune eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo se requiere la participacin de una serie de molculas conocidas globalmente como accesorias, y cuya funcin es precisamente la de contribuir al desarrollo de una respuesta inmune efectiva facilitando la interaccin entre las distintas clulas. Se forma as lo que se viene en denominar sinapsis entre linfocitos T y clula presentadora de antgeno (Figura 10.2). Las principales molculas que estn implicadas en este fenmeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2, CD45 y CD28 y sus ligandos respectivos. Todas estas molculas de adhesin tambin juegan un importante papel en la transduccin de seales y activacin de la clula T. En la (Figura 10.3) se recoge un esquemadelasdistintasposibilidadesdeactivacindeloslinfocitosTsegnlasmolculasque intervienenenlosprocesosdereconocimientoyadhesinintercelular. En ausencia de estas segundas seales, sobre todo la dependiente delCD28, los linfocitos T pueden energizarse por la primera seal de activacin dependiente TCR/CD3.Sin embargo hoyse conoce que esta segunda seales regulada negativamente por otras molculas. Este es

el caso de lamolcula CTLA4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4) que aparece sobre todo en linfocitosampliamenteactivados,loqueindicalaaccinsupresora/reguladoraatribuidaaesta molcula. Molculas CD4 y CD8. Las molculas CD4 y CD8 son glicoprotenas cuyos ligandos naturales son las molculas del MHC de clase II y de clase I respectivamente. Estructuralmente ambas molculas pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, pero mientras la CD4 est formada por una sola cadena, el CD8 lo est por doscadenas, alfa y beta.Mientras el CD4 se expresa en la mayora de los linfocitos T cooperadores, mientras que elCD8 se presenta, principalmente,enaquelloslinfocitosTconfuncincitotxica. Molculas CD28 y CTL4. La molcula CD28 esde especial importancia incrementando la estabilidad de la interaccincelular. El CD28 se expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los linfocitos CD8, sus ligandos naturales pertenecen a la familia B7 (B71, CD80; B72, CD86). ElCD28, adems de su papel en el proceso de adhesin, tambin participa en el mecanismo de transduccin de seal y activacin de la clula T.Una variante de esta molcula es el CTL4 quea diferencia del CD28, se expresa slo de modo transitoriodespusdelaactivacindelasclulasconfiereunasealinhibidoraallinfocitoa diferenciadelCD28quecomohemosdichoconfierensealesdeactivacin.Estaposibilidadde la presenciade CD28 o CTL4 define que el linfocito se active o se inhiba, lo que tiene gran trascendenciaenelprocesoregulardelaactivacindeloslinfocitosT. Molculas CD2. La molcula CD2 es una glicoprotena quede adhesin que contribuyen a launin del linfocito T a la clula presentadora. Su ligando natural es el CD58 (LFA3)y seexpresanenlasuperficiedetodaslasclulasconfuncindeAPC. CD45.El CD45, es una de las glicoprotenas ms abundantemente expresadas en la superficie de linfocitos y en general en lasclulas hematopoyticas, pudindose detectar hasta un milln de molculas por clula y cuyoligandono se conoce con precisin (Figura 10.4). Pertenece a la familia de protenas con actividad fosfatasas (PTP) y es una familia con varios miembros y con mltiples alelos, como son el CD45Ra y el CD45RB. La parte citoplasmtica de esta molcula es muyampliayposeeaccinfosfatasadetalmaneraquepuedeeliminargruposfosfatoalastirosin kinasasLcTyFyn,talcomoveremosdespusconmasdetalle. TRANSMISIN DE SEALESLINFOCIOTOST Todas las clulas eucariotas incluidos los linfocitos T, B y NK poseen mecanismos a travs de los cuales los estmulos externos son procesados y enviados al ncleo a travs de una serie de cambios bioqumicos que conocemos genricamente como seales de activacin intracelulares o de transduccindeseales.

Estos mecanismos implican la formacin de los denominados segundos mensajeros que son capacesderegularlatranscripcinespecficadeunamplionmerodegenes,loscualesparticipan en los procesos de crecimiento, divisin y diferenciacin celular. En la activacin de esta cadena de segundos mensajeros inter vienen seales procedentes tanto del TCR/CD3 como de las molculas accesorias, de molculasque participan en la interaccin celular y receptores de citocinaspresentesenlamembranadeloslinfocitos(Figura10.5) Un mecanismo fundamental en la regulacin de la actividad y la funcin de numerosas protenas en las clulas eucariticas son los ciclos de fosforilacin y defosforilacin mediados por cinasas y fosfatasas. Bsicamente existen dos tipos de cinasas, dependiendo de su actividad fosfotransferasa la cual se manifiesta fosforilando protenas en aminocidos serina y treonina (serina/treoninacinasas)obienenaminocidostirosina(tirosinacinasas). Igualmente hay fosfatasas que defosforilan especficamente protenas fosforiladas bien en serina/treoninaoentirosina.Unapropiedadgeneraldeloslinfocitoseslanecesidaddegenerar dossealesdistintasparainducirlaproliferacinhaciaclulasefectoras. Comosehacomentadoanteriormente

la primera seal la proporciona la unin del complejo pptidoMHC al TCR (y a los correceptoresCD4yCD8),estasealestpotenciadaporlaparticipacindemolculas deadhesin,talescomoCD2,LFA1,CD26yotrasy lasegundasealessuministradapormolculascoestimuladorasdeltipoCD28,quede alguna manera complementan las seales de activacin inducidas por el TCR permitiendo una activacin celular completa (Figura 10.5) Estas seales coestimuladoras son necesarias para la activacin del linfocito, ya que en su ausencia la seal mediada por el TCR puede conducir al linfocito a la muerte celular o a un estadodeanergia(enlaqueellinfocitonorespondeanuevasestimulaciones).

Despus de la ocupacin de los receptores T por el antgeno, se produce la activacin de los linfocitos y la iniciacin de eventos tempranos de traduccin de seales que finalmente conducen a la reprogramacin gnica y a la adquisicin de funciones efectoras. Para que el linfocitoTpuedallevaracaboestasfuncionesserequiereuncomplejosistemaresponsabledela transmisindesealesdeactivacindesdelasuperficiealinteriordelaclula. En esta ltima dcada se est realizando un gran esfuerzo para identificar los componentes celulares y moleculares que estn involucrados en dicha activacin celular y determinar la secuenciadeeventosbioqumicosqueocurrendespusdelreconocimientodelantgeno. EstmulosiniciadosporelcomplejoTCR/CD3 Uno de los primeros eventos bioqumicos que ocurren en linfocitos T despus de la interaccin AgTCR, es el incremento defosforilacinen tirosina delas cadenaszeta no polimrficas del CD3. Estas cadenas poseen en sus dominios intracitoplasmticos unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosinebased Activation Motifs) que se fosforilan por la accin de las tirosina cinasasclckocfyn. Ello se debe a que existe unagran asociacin fsica y funcional del CD4 y del CD8 con el TCR/CD3,detalmaneraquecuandoseproducelauninTCRHLA,hacequelaclckasociadaa estas molculas se aproxime a la porcin citoplsmica de las protenas del complejo CD3, dondepuedefosforilarentirosinaasusregionesITAM.Asmismotodoelloesposibleporque

la tirosina cinasa clck se encuentra localizada precisamente en la parte intracelular de la membrana plasmtica unida a la bicapa lipdica por un proceso de miristilacin de su regin aminoterminal. Una vez que los ITAM son fosforilados en residuos tirosinas, se convierten en sitios especficos de acoplamiento que se unen a protenas citoplsmicas ZAP70 que se pertenece a la familia de enzimas proteincinasas y se fosforilan. Ejerce as el ZAP70, que se encuentra tanto en clulasT como NK, un papel crtico en el inicio de la cascada de sealizacin intracelular. (Figura 10.6) A su vez ZAP70 actuar sobre ciertos adaptadores con lo cual prosigue la cascada de transmisin de seales. Entre estos adaptadores se encuentran el estabilizador de clulas T activadas (LAT) y la protena especfica de leucocito que contiene SH2 (SLP76). Despus de la activacin de estos adaptadores se producir la activacin de fosforilacin en tirosina de la enzima fosfolipasa C gamma (PLCgamma) que es crucial en todo el proceso de lacascadadetransmisindeseales. Como consecuencialaPLCgamma se activa dentro de los complejos multimoleculares lipdicos de la membrana plasmtica donde induce la hidrlisis de su substrato especfico, el fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), generndose los metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol(DAG)(Figura:Cascadadeactivacin).Deestamaneraescomoseiniciandosvasde transduccindesumaimportancia,lainiciadaporelIP3ylainiciadaporeleDAG,conocidascomo vamediadaporcalcioyvamediadaporlaproteincinasaC(PKC).

Va mediada por calcio. El IP3 se une a un receptor especfico (IP3R) localizado en el retculo endoplsmico facilitando la liberacin del calcio intracelular de sus compartimentos y aumentando la concentracin de estos iones en el espacio libre intracelular. El calcio intracelular puede estimular la enzima calmodulina, que es una serina/treonina cinasa. Posteriormente se induce la formacin decalcineurina que despus activar el factor de transcripcin activador de clulasT(NFAT). VamediadaporlaprotenacinasaC.PorotraparteelDAGformadoactivalaPKCqueterminar activando el factor de transcripcin de clulas B (NFkB).Las PKCs en condiciones de reposo celularseencuentralocalizadaenelcitosoldondeesinactiva,perounavezquerecibeelestmulo del DAG conjuntamente con iones Ca++ (dependiendo del isotipo enzimtico) se transloca a la membrana celular donde en presencia de fosfolpidos (fundamentalmente fosfatidilserina) ejerce sufuncindecinasadeprotenasenaminocidosserinaytreonina. Va mediada por APRAS. Otra va importante de activacin es en laque interviene el Ras quehaceque Rafseactive yacte comouna cinasade MAPc queinterviene en laregulacin por fosforilacindelfactordetranscripcinactivadordeprotena(AP1) Comoconsecuenciadetodaslasvasantesestudiadasseponenenmarchalosdiferentesfactores detranscripcinqueestudiaremosseguidamente. FACTORESDETRANSCRIPCIONENLINFOCITOST. Como consecuencia del desarrollo de la cascada de los mensajeros citoplasmticos analizadosms arriba, se activan ciertos factores que tienen comofuncin la deactivar la transcripcindeungrannmerodegenesimplicadosenlarespuestainmune. Entreestosfactoresdetranscripcindestacan:

ElfactornucleardelacadenaKdeclulasB Elfactoractivadordeprotena1y ElfactornucleardeclulasT

Engeneral,eliniciodelatranscripcininducidoporestosgenesocurreenausenciadesntesisde novo de protenas, lo que indica que estos genes son activados por factores de transcripcin preexistentesenlaclula.Veamoslomassustancialdecadaunodeellos. FactornucleardelacadenaKdeclulasB ElfactornucleardelacadenaKappadeclulasB(NFB),fuecaracterizadoporprimeravezcomo un factor especfico de clulas B(de ah su nombre), pero ahora sabemosque se encuentra en muchos otros tipos celulares, incluyendo los linfocitos T. Este factorest formado por cincocomponentes que presentan una alta homologa entre s y que son las protenas p50, p52, p65,RelBycrel.Estasprotenaspuedenestarformandodistintoscomplejosentreellassiendolos mscomunes:p50/p50yp50/p65. Uno de los componentes prototipo de este factor, esel p50/p65, que sabemos se encuentra retenidoenelcitoplasmapormolculasllamadasinhibidoresdeNFBoIB,bloquendoseassu llegadaalncleo.SerslocuandodespusdelaactivacindePKC,steterminadegradndose ycomoconsecuenciaseliberaelfactorp65activoquepuedeahorapasardelcitoplasmaalncleo legaralncleoendondeejercesufuncin(Figura:Factoresdetranscripcin).

EstefactorpuedeparticiparenlatranscripcindelaIL2ydesureceptorytambinenunamplio nmerodegenesdelinfocitosTcomosonlosgenesdeHLAdeclaseIyclaseII,ciertasmolculas deadhesinyprotooncogenescomoeselcmyc. Factoractivadordeprotena1 A diferencia del NFKB, el factor activador protein 1 (AP1), es un factor de transcripcin exclusivamente nuclear que se activa por fosforilacin mediada por determinadas cinasas que se translocan al ncleo e inducen en este factor una modificacin postranslacional que le hace activo. Este factor est formado por protenas ubicuas pertenecientes a las familias de genes de expresin temprana Jun (cJun, vJun, JunB y JunD) y Fos (cFos, FosB, Fra1 y Fra2) capaces de unirse a una secuencia consenso de ADN y regular la transcripcin de alto nmero de genes,entrelosqueseencuentraeldelaIL2. FactornucleardeclulasTactivadas La familia defactores nucleares de clulasT activadas (NFAT),se encuentran en su estado fosforilado en el citoplasma y pasa al ncleo cuando se desfosforila. En el proceso de desforilizacin interviene directamente la calcineurina que a su vez aparece cuando sobre la calmodulina se une el ion Ca++ como consecuencia desu movilizacintras la activacin del TCR.En gran parte el NFAT necesita de la cooperacin de protenas AP1 para transactivar los genesdondeacta(Figura10.8). INMUNOPATOLOGIA Se han observado alteraciones de muchas de la cinasas que intervienen en la activacin de los linfocitos T, entre ellas la de ZAP70. Los individuoscon dficit de Zap70 tienen en comn valores muy bajos o ausentes de linfocitos T CD8+ en sangre perifrica ysuslinfocitos no proliferaba en respuesta a lectinas, a anticuerpos monoclonales antiCD3, a antgenos o a clulasalognicasyademsdelalgicausenciadeZap70ensuslinfocitosT

02.ActivacinlinfocitosB
LoslinfocitosBsonclulasqueposeenensumembranaIgsqueactancomoreceptoresdelos antgenos de tal manera que cuando se produce su unin a los mismos seactivan, proliferan ydiferencian a clulas plasmticas, productoras de igs, y clulas memoria, listas para una prontaactivacinencasodelaentradadelmismoantgenoenprximoseventos. Las inmunoglobulina, adems de poder actuar como receptor del linfocitos B, cuando se encuentran solubles pueden llevar a cabouna gran variedad de acciones, que van desde la neutralizacin de los antgenos hasta su colaboracin en la eliminacin de antgenos mediante los fenmenos de opsonizacin celular y activacin del complemento. Todo ello es lo que se conoce como respuesta inmune humoral y que es de una gran importancia frente microorganismospatgenosyportantoenladefensadelorganismo. Los linfocitosB maduros son las clulas inmunolgicamente aptas cuando stos se encuentran en los ganglios o en el bazo que es donde se encuentran de manera ms eficaz con los antgenos. Sin embargo para alcanzareste nivel, los linfocitos B, han sufrido un proceso madurativo que en el adulto ocurre en la mdula sea y que es de suma importancia porque ser el responsable no slo de la aparicin de ests clulas sino tambin de la eliminacin de muchasdeellasqueserianenelfuturoautorreactivas. Acontinuacinestudiaremosenprimerlugarlosaspectosmsbsicosdelamaduracindelos linfocitos B y despus la serie de eventos relacionados con la activacin, proliferacin y diferenciacindelosmismos. PROCESOMADURATIVODELINFOCITOSB El proceso madurativo de loslinfocitos B olinfopoyesis ontognica se produce a partirde progenitores linfoides derivados de la clula hematopoytica primordial (HSC). Este esun proceso independiente de estmulo antignico y durante el cual se reordenan los genes de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas. Tambin durante este proceso seproduce la proliferacin de linfocitos inmaduros y la seleccin del repertorio de linfocitos B maduros (Figura11.1)

Durante estos procesos, los progenitores de los linfocitos B ms inmadurosse convertirn en linfocitos B maduros, en un tiempo aproximado de 3 das, pasando a expresaren su membrana molculas de IgM o IgD. Despus estos linfocitos abandonan la mdula seaparapoblarlostejidoslinfticosperifricos.

 EtapasdelprocesomadurativoB A lo largo del proceso madurativolos linfocitos B pasan por una serie de fases caracterizadas por un patrn especfico de expresin de genes de Ig y de otras protenas de superficie. Las clulas ms precoces, en estos procesos, son las clulas proB que se caracterizan por no producir Igs, pero ya expresan molculas de superficie propias de la estirpe B, tales comoCD19. Se produce tambin larecombinacin desegmentos gnicos D con J gracias a la deleccindelADNintermedio. Despus se formarn losclulas preB quees el primer tipo celular que sintetiza un producto delosgenesdelasinmunoglobulinas,queeslacadenapesadacitoplsmicamuquealserslo citoplasmtico no acta como receptor y por consiguiente, estas clulas ni pueden reconocer ni responder a los antgenos. El gen reordenado de la cadena pesada de Ig se transcribe en formadetranscritoprimarioqueincluyeelcomplejoVDJreordenado. El siguiente estado madurativo de los linfocitos B corresponde a los linfocitos B inmaduros, que se caracterizan porreordenar los genes de la cadena ligera Kappa o lambda, y producir cadenas ligeras, que asocindose a la cadena mu ya existente forma laIgM de manera completa. Despus el siguiente estadio madurativo es el de linfocitos B maduros que se caracterizan porexpresarlascadenaspesadasmuydeltaqueenasociacinconunacadenaligera,permite que estas clulascoexpresan en su membrana IgM e IgD que poseen la misma regin V y consecuentementelamismaespecificidadporelantgeno. El proceso madurativo de los linfocitos B en la mdula requiere de la presencia de clulas estromales que interactan con las clulas proB y preB y secretan IL7 de especial relevancia haciendo posible el proceso madurativo. La interaccin entre clula estromal y clula B se lleva a cabo con la participacin de las molculas VLA4 y su ligando VCAM1 presentes en clulas B y estromales, respectivamente. Tambin en este proceso intervienen la molcula c Kit que interacta con otra molcula presente en las clulas estromales, elfactor de clulas madreoSCF.(Figura11.2)

Generacindelrepertoriodeanticuerpos ElhechodequelosgenesVdelasIgsedistribuyenclonalmente,esdecir,quecadalinfocitoB exprese una nica regin VH y una nica regin VL y por tanto una nica especificidad antignica distinta de la ex presada por los otros linfocitos B, constituye el punto esencial de lateoradelaseleccinclonal,segnlacualelAgexgenoseune(selecciona)aloslinfocitosB cuyasIgdemembranaseanespecficas(complementarias)paral. El repertorio o catlogo de especificidades de anticuerpo distribuidas entre los linfocitos B recientemente formados y que no han tenido contacto todava con el Ag exgeno, se denomina repertorio primario o preinmune. Los segmentos de genes VH y VL expresados por lasclulasBprimarias,talcomosehaindicadomsarriba,sehallanenconfiguracingerminal (no han experimentado hipermutaciones somticas, como ocurre tras la respuesta al Ag) y su repertorio surge de los mecanismos recombinatorios de los distintos segmentos gnicos VH DHyJH(cadenapesada)yVLyJL(cadenaligera)usados,ascomodelensamblamientodeuna reginVHconunareginVLparaformarunazonacomndeuninalAg. Esas posibilidades combinatorias pueden determinar un repertorio potencial que parece tender al infinito, calculndose que, en el ratn, pueda ser deaprox.109. Ello garantiza que cualquierAg exgenodelosmltiples (potencialmentemillones)presentesdeformanaturalo artificialmentecreadosporelhombre, queentreen elorganismopuedatener oportunidad de encontrar linfocitos B que lo reconozcan. Sin embargo, por estudios de frecuencia de clulas B especficas contra antgenos definidos (haptenoportador) se infiere que el repertorio realmenteutilizadoparecesermuchomenor(106107). DeleccinlinfocitosBenlamdula Las clulas B inmaduras que unen antgenos propios son eliminadas (deleccin clonal) o son incapaces de diferenciarse a clulas secretoras de inmunoglobulina (anergia). Efectivamente, el desarrollo del sistema inmune necesita compaginar dos fenmenos casi contradictorios; a) generar una enorme diversidad de receptores que reconozcan diferentes antgenos y b) seleccionardetodasestasespecificidadesgeneradasalazarlasnodainasparaelorganismo. De no ser as, los autoanticuerpos generados produciran fenmenos inflamatorios destructivos para rganos y tejidos propios. Las clulas B inmaduras (aquellas clulas B que acaban de reordenarlosgenesdelascadenasligeras)queinteraccionenconantgenospropiosmultivalentes expresados en alta cantidad en la membrana celular (p.e. molculas MHC), mueren por un procesodenominadoapoptosis,enelqueseproducelafragmentacindeDNAylaeliminacinde fragmentos celulares por clulas fagocticas sin liberacin de enzimas citoplasmticas pro inflamatoriasalentorno. De hecho, algunas clulas B autorreactivas vuelven a intentar reordenar la cadena ligera (edicin del receptor) con el fin de no reaccionar contra elementos propios y poder sobrevivir. Cuando el antgeno propio reconocido por las clulas B inmaduras es soluble, el linfocito B autorreactivo no muere, pero tampoco se diferencia a clula secretora de inmunoglobulinas. Esta peculiar forma de respuesta se denomina anergia funcional, y trae como consecuencia la modificacin de la recirculacintisulardeestasclulasyelacortamientodesuvidamedia.

RECONOCIMIENTO DEL ANTIGENO Y ACTIVACIN DE LINFOCITOSB Una vez han madurado los linfocitos B, stospueden reconocer al antgeno tras lo cual experimentan una serie decambios que conducen a su expansin por proliferacin celular y que culminan, por un lado, con la generacin de linfocitos B memoria, y por otro, con su maduracin hasta clula secretora de anticuerpos (ASC), cuyo estado terminal corresponde a la morfologa de clulaplasmtica,unacluladevidamediacorta. ReceptordeclulasB El receptor del Ag de las clulas B (BCR) est formado por Igs de membrana (mIgs) que son las molculas que poseen la capacidad de reconocer a los antgenos pero que dada su escasa proporcin citoplsmtica (Figura 11.3), son otras molculas asociadas, las encargadas de transmitir las seales de activacin al interior celular. Para ello las mIgs que se encuentran asociadas de forma no covalente a un complejo de dos cadenas polipeptdicas unidas entre s porenlacesdisulfuro,llamadasIgalfaeIgbetaqueposeenresiduostirosina(Figura11.4). Los residuos de tirosina de las colas citoplasmticas de los componentes del BCR pueden fosforilarse por enzimas protentirosn cinasas (PTK) que son de importancia capital en la transduccin de seales activadoras al interior de la clula tras la unin del Ag a las mIg. Entre esas PTK se encuentran las molculas lyn, fyn y blk entre otras(Figura11.4). Aunque el receptor de las clulas B (BCR) es suficiente para el inicio del proceso de activacin de estos linfocitos, existe tambin lo que se viene en denominar correceptor de clulas B que pueden actuar funcionalmenteasociadosconlasanterioresformandoungrancomplejodeactivacin. EstecomplejoestformadoporlasmolculasCD21(CR2),CD19yCD81,delascualeslaCD19 posee gran nmero de tirosinas en el tallo citoplasmtico y la CD21 tiene la posibilidad de unirseaC3dqueesunproductodelcatabolismodelcomplementoeimportanteenelproceso de identificacin de clulas y bacterias que se requieren destruir del receptor del Ag de las clulasB(BCR)(Figura11.5)

Teora de seleccin clonal Una vez que los linfocitos B se activan stos se diferencian hasta clulas de memoria y clulas plasmticas. Sin embargo no todos los linfocitos B se activan frente a un antgeno, sino que lo hacen slo aquellos que lo reconocen. Esto es de lo que trata la teora de seleccin clonal de Burnet(Figura11.6). De acuerdo con esta teora,los receptores de los linfocitos B estaran distribuidos clonal mente,estoes,cadaunodelosdiversostiposdelinfocitossloreconocerayenconsecuencia seestimularaporundeterminadotipodeantgeno. De esta manera, tras el contacto con el antgeno, los linfocitos B se activaran y diferencian a clulas secretoras de inmunoglobulinas, las cuales tienen una especificidad casi idntica, a la expresadaenlamembranadelasclulasBqueoriginariamentereconocieronalantgeno.

Activacin B dependiente delinfocitosT Para una adecuada activacindeloslinfocitosB se requiere adems del reconocimiento de un determinado antgenos por el BCR (primera seal), la presencia de linfocitos T, quefacilitaranunasegunda seal necesaria para una ptima activacin de los mismos. Esto es, los linfocitos B, al igual que los linfocitosT,tambinprecisandealmenosdossealesparasuactivacin.Lasdossealesserian: Primera seal: Esta seal es dada por el BCR de los linfocitos B, como consecuencia de su unin al antgeno. Debido a esto se pondr en marcha toda la cascada de segundos mensajeros en estos linfocitos. Sin embargo esta seal por si solo no es suficiente para una activacin de los linfocitosB.Paraellosonnecesariasal menos unasegundaseal proveniente delos linfocitos T (Figura11.7).

Segunda seal: Sabemos que esta segunda seal facilitada por los linfocitos T es mediada por ciertas citocinas que propiciaran la proliferacin y diferenciacin de las clulas B una vez que estos han sido estimulados por un Ag. A su vez hoy sabemos como tambin se requiere la adecuada interaccin entre ambos tipos de linfocitos, T y B, mediante otras molculas originariamente conocidas como molculas accesorias. Efectivamente,tanto loslinfocitosB como las clulas T, que han reconocido antgeno, expresan en su membrana transitoriamente molculasdeactivacin,conligandosrecprocos,cuyainteraccinesnecesariaparalaactivacin deestasclulas.As: Las clulas B expresan las molculas de activacin CD80 y CD86 que interactan con la molcula CD28 de linfocitos T para una buena activacin de los primeros y que es de gran importancia quelas molculasCD40LseunanaCD40presentesenlinfocitos TyBrespectivamente paraque estosltimospuedanactivarseydiferenciarsedemaneraadecuada. RespuestaBindependientedelinfocitosT Por otra parte, sabemos que hay antgenos que en ausencia de clulas T pueden produciruna respuesta de linfocitos B. Este tipo de Ags se denominan antgenos T independientes y pueden ser de dos tipos: Antgenos de paredes bacterianas, como es el LPS,que inducen diferenciacin de clulas B sin llegar a interaccionar con el BCR y antgenos que corresponden con estructuras repetitivas, normalmente hidratos de carbono, que son reconocidos por el BCR provocando el puenteo (unin) de varias molculas de receptor dando lugar a la activacin de clulas B sin necesidaddelainteraccinconlasT(Figura11.8).

 Linfocitos B como clulas presentadorasdeantgenos Por ultimo es de destacar que los linfocitos B pueden actuar como clulas presentadoras de Ags. Efectivamente cuando un linfocito B interacciona a travs de su BCR con un antgeno, ste puede ser endocitado y procesado en suspptidos, que a su vez pueden ser presentados posteriormente unidos a sus molculas MHC de membrana a los linfocitos T. Los linfocitos T, que previamente han podido interaccionar con ese mismo antgeno (pptido) presente en clulas presentadoras de antgenos, pueden reconocer al complejo MHCpptido en la membrana de la clulaBytransmitirsealesparasuactivacinydiferenciacin(Figura11.9). Los linfocitos B que interaccionaran a travs de su Igm con un antgeno, denominado por ejemploX,loprocesaranypresentaranunidosaMHCpptidosdelmismoantgenoX(pptidos X).LoslinfocitosTconespecificidadanti(pptidosX)quehaninteraccionadopreviamenteconel antgeno en clulas accesorias clsicas, reconoceran el complejo MHCpptido en la membrana de la clula B, transmitiendo las segundas seales necesarias para la diferenciacin de clulas B (factoressolublesmsinteraccinmembranamembrana). Es importante destacar que las partes del antgeno X reconocidas por linfocitos T y B pueden ser muy distintas. Las clulas B pueden interaccionar con los hidratos de carbono de la

glicoprotenaX,mientrasqueloslinfocitosTantiXsloreconocenpptidosdeestaprotenaX (Figura11.9) DIFERENCIACIONDELINFOCITOSB Loslinfocitosqueproliferanenrespuestadeundeterminadoantgenosediferencianaclulas plasmticas, productoras de anticuerpos, o bien en clulas memoria. Las clulas plasmticas pueden permanecer aos produciendo un mismo tipo de anticuerpos desde los lugares donde normalmenteseasientanqueeslapulparojadelbazoylamduladelosganglioslinfticos. Durante el proceso madurativo de la respuesta inmune B, se produce un cambio de isotipo de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, de tal forma que los linfocitos que originariamenteexpresanensumembranamIgMomIgD,pasanasintetizarIgG,IgAoIgE. En este proceso intervienen de forma activa ciertas citocinas producidas por los linfocitos T colaboradores, entre las que destacan la Il4, Il5 y IFN. Esta circunstancia es la que explica que este proceso madurativo de los linfocitos B y el cambio de isotipo que va acompaado deun incrementoen la afinidad de los anticuerpos sea ms intenso frente a aquellos antgenos que poseen, por ejemplo, una parte de tipo lipoproteico y otra de tipo proteico que estimularan a los linfocitos B y T respectivamente, con lo que los linfocitos B, obtendran una cooperacinmseficientedelosTenesteproceso. LinfocitosBmemoria Los linfocitos B memoria,se caracterizan por permanecer largo tiempo en el organismo y cuandoseactivansonproductorasdelasinmunoglobulinasIgGoIgAoIgEquecomosabemos son propias dela respuesta secundaria caracterizada porqueante un segundo estmulo con el mismoantgenoestasclulasrespondandemaneramuyrpidayeficiente. La mayora de los linfocitos B memoria adems de haber perdido la mIgD, en virtud de los mecanismos de recombinacin de la parte constante de de los genes de las Igs, comentado ms arriba, han cambiado la regin constante de su mIg, de forma que en lugar de expresar mIgM, expresan mIgG o mIgA o mIgE o combinaciones de mIgM/mIgG omIgM/mIgAoinclusomIgM/mIgG/mIgA. Es de destacar que estasmIg que se producen como consecuencia de la activacin de clulas memoria,siguenexpresandoelmismo tipode cadenasligerasylasmismasregionesVHyVL, que las clulas originarias de las que derivan aunque levemente modificadas por la aparicin de cambios puntuales en ciertos aminocidosdelasregionesdeterminantesde la complementariedad, lo que in vivo causan una mayor afinidad del anticuerpo formado consu Ag. Esos cambios se debena hipermutaciones somticas de los genes que codifican las regiones VH y/o VL y que, como se ha dicho antes,se hacen ms intensos y evidentes si de nuevo aparece un estmulo equivalente al anterior y en consecuencia se desarrolla una respuestainmunesecundaria.

03.ActivacinclulasNK
Las clulas NK participan activamente en la defensa muy temprana, respuesta innata, frente a infecciones gracias a su potente capacidad destructora (citotxicas) de clulas infectadas por microorganismosy su capacidad secretora tanto de citocinas, en especial de interfern gamma, comodeciertasquimiocinas(Figura:funcionesNK). Las clulas NK constituyen la tercera estirpe de clulas de tipo linfoide y se caracterizan por carecer de TCR y de BCR y, en su mayora, expresar en superficie las molculas FcgammaRIII (CD16) y CD56. Se encuentran en sangre, bazo y mdula sea y en muy baja proporcin en ganglioslinfticos(Tabla:fenotipoNK). Los individuos conausencia de las clulas NK, son vulnerables a infecciones principalmente de tipoviral,inclusoenindividuosconrespuestainmunitariaadaptativanormal,loqueindicaquela accinde las clulas NKes complementaria alos linfocitos T citotxicos.Efectivamente existen grandes diferencias funcionales entre las clulas NKyloslinfocitosT(Tabla:NK/CTL). Ademsdelasaccionesdefensivasfrenteaagentes externos, las clulas NK poseen una importante accin vigilante preservando las clulas normales de cada organismo donde asientan pero destruyendo aquellas otras que han perdido el marcadordelopropio,lasmolculasHLAclaseI. TIPOSDECLULASNK La presencia de los marcadores NK puede ser variable, definindose varias subpoblaciones de estas clulas, en funcin de su expresin. As existen clulasNK muy positivas para CD56 (CD56bright),muypocopositivasparaestemarcador(CD56dim),oclulasCD16+CD56+oCD16 CD56+,etc. Se sabe que las clulas NK ms positivas para el CD56 (CD56bright) poseen mayor capacidad para producir citocinas que las clulas ms dbiles para esta molcula (CD56dim). A su vez las clulas NK CD56dim poseen mayor capacidad citotxica que las CD56bright. REGULACIN DE LA FUNCIN DE LAS CLULASNK LafuncindestructoradelasclulasNKfuelaprimeraaccinasignadaaestasclulasyelmotivo desudescubrimiento. Tambin, como se ha comentado antes, las clulas NK poseen accin secretora de citocinas y de quimiocinas.

EnconcretoparaquelasclulasNKejerzansusfuncionescitotxicasserequierelaidentificacin, atravsdereceptoresadecuados,delasclulasadestruir.Entreestosreceptoresdestacan

Receptoresdetipoactivadory Receptoresdetipoinhibidor

Del equilibrio de estmulos activadores/inhibidores resultar la accin final de las clulas NK, bien desarrollando sus funciones citolticas y secretoras o bienbloquendolas. RECEPTORESACTIVADORESDENKYSUFUNCIN Los receptores de tipo activador se caracterizan por iniciar el proceso de activacin de la maquinaria citoltica de clulas NK y tambin en ciertos casos, secretora de estas clulas. Entre estos destacan el CD16, CD80, CD43 y los recin descritos receptores de citotoxicidadnatural(NCKs)(Figura:LisisclulasNK) Cuando participa el CD16, la citotoxicidad que se genera se denomina citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), que implica la presencia de anticuerpos unidos a clulas blanco que a su vez son reconocidos por su extremo Fc por los receptoresCD16presentesenlasclulasNK.(Tabla:Receptoresactivantes) Los receptores de citotoxicidad natural (NCKs), han sido descritos recientemente y son responsables de la citotoxicidad natural de las clulas NK. Entre estos receptores destacan tres conocidoscomo:

NKp46 NKp44

NKp30

RECEPTORESINHIBIDORESDENKYSUFUNCIN Recientemente se han descubierto receptores presentes en clulas NK que reconocen molculas de histocompatibilidad clase I y que tienen funciones inhibidorasysloavecesposeenfuncionesactivadorasde lasclulasNK. Estos datos provienen de las observaciones de Krre y Cols quienes utilizando variantes de una misma lnea celular tumoral encontraron distinto grado de sensibilidad a la lisis NK, que se correlacionabainversamenteconlaexpresindemolculasdeclaseIdelMHC.

Por otra parte, la transfeccin de clulas diana con molculasdel MHCIlesconferaresistencia. Los autores propusieron la teora de prdida de lopropio(missingselftheory)paraexplicarestos fenmenos por los cuales se regulaba la citotoxicidadnatural. En concreto, los receptores con capacidad de reconocer molculas HLApertenecen a distintas familias de glicoprotenas y adems de expresarse en clulas NK, se encuentran presentes tambin en ciertos linfocitos T (Figura y Tabla: Receptores NK). Estos receptores pueden tener accin inhibidora, que es como originariamente se descubrieron, pero pueden poseer tambin accin activante de acuerdo con la estructura de la parte citoplasmtica de sus molculas. Entreestasfamiliasdestacan:

LaprimerafamiliaincluyereceptoresdeantgenosHLAIpertenecientesalasuperfamilia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores se conocieron por su accin inhibidoradelacitotoxicidadysedenominaroncomoKIRs(killercellIglikereceptors). Otro grupo de estos receptores pertenece tambin a la superfamilia de las inmunoglobulinasysonconocidoscomoILTs(immunoglobulinliketranscripts). Unltimogrupodeestosreceptoressecaracterizanporserheterodmerosformadospor laasociacindedosmolculasdiferentescondominiolectinatipoCcomoeselCD94que sepuedeuniramiembrosdelassuperfamiliademolculasNKG2.

ReceptoresNKtipoKIR. Se trata de receptores que pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores fueron descubiertos porque estaban implicados en la inhibicin de la lisis al interaccionar especficamente con determinadas molculas HLA de clase I de la clula blanco. (Figura:ReceptoresKIRseILTs)

 Porotraparte,seobservqueanticuerposmonoclonalesfrenteaestosreceptoresrestablecanla citotoxicidad de los clones NK frente a dianas protegidas especficamente por la expresin de molculas HLA. Segn el nmero de dominios presentes en la molcula del receptor a la palabra KIR,seaadenlossufijos2Dy3Dqueindicanelnmerodelosdominiosdeinmunoglobulinaque poseen y la letra L (long) o S (short) segn la cola citoplasmtica de estas molculas sea larga o cortarespectivamente. Estos receptores pueden ser de tipo inhibidor o de tipo activante. En este ltimo caso estos receptores se asocian de manera covalente con la molcula DAP12. La distribucin de estos receptores en las clulas NK no es homognea y cada clon NK puede expresarunoovariostipos de estos receptores. Se aprecian claras diferencias en la expresin de cada receptor cuando se estudian distintos individuos, y hay indicios en los que el repertorio de receptores est regulado durante el desarrollo por factores genticos, incluyendo presumiblementelainfluenciadelpropioMHC. AestosreceptoresrecientementeseleshadadoladenominacindeCD158seguidodeunaletra (ente a y k) segn el tipo de receptor. Se recoge un modelo de la estructura tridimensional de esta molcula unida a un antgeno de histocompatibilidad (Figura: Receptores KIRs e ITLs). Los genesquecodificanestosreceptoresseencuentranlocalizadosenelcromosoma19enhumanos dondesecodificantambinlosreceptoresILTs,FcayNKp46(Figura:ComplejoNK)

ReceptoresNKtipoILT Otro grupo de receptores, que tambin pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, se conocen como ILTs (immunoglobulin like transcripts) O CD85. Alguno de estos receptores reconocen molculas HLAG y la protena UL18 (LIR1 y LIR2) del citomegalovirus humano y tiene una distribucin muy extensa en diferentes tipos de clulas incluyendo no solo clulas NK sino tambin monocitosyciertasclulasdetipopolimorfonuclear(Tabla:ReceptoresNK). ReceptoresNKtipolectina. La tercera familia de estos receptores de HLA est formada por un grupo heterodmero compuesto por molculas de tipo Clectina que comprende la molcula CD94 unida covalentemente de manera alternativa a diferentes molculas pertenecientes a la familia NKG2 (A, B, C, E y H). La molcula CD94, fue identificada originalmente por M. LpezBotet en el laboratorio del Hospital de la Princesa. Este receptor reconoce molculas de HLAE en asociacin con pptidos derivados de la secuencia lder de otros antgenos HLAI (Figura: CD94/NKG2 y CD94/HLAE).

LasmolculasdelafamiliaNKG2puedenserdedistintotipo:A,B,C,EyH.Resultanasquedela combinacindelreceptorCD94conlosdistintosmiembrosdeNKG2,resultandiferentesdmeros. (Tabla:receptorestipolectina). Consideramos a este receptor de especial importancia en los procesos de regulacin de la accin de clulas NK in vivo, debido a la extensa distribucin de las molculas de histocompatibilidadHLAEquereconoceysobretodoporel hecho de encontrarse presente en un amplio nmero de clulasNK(6080%)yciertoslinfocitosT. Laexpresin deCD94es reguladapor ciertascitocinastales como IL15 IL10 y TGFbeta. Recientemente se ha visto que los receptores de tipo activante poseen adems del

CD94 y un miembro de NKG2 (C, E y H), la molcula DAP12 que posee motivos ITAM, y por tantosecaracterizaporlatransmisindesealesdeactivacin.Enla(Figura:receptoresNKysus ligandos) se recoge un modelo tridimensional de CD94 unido a una molcula de HLAE que es su ligandonatural.LosgenesquecodificantantolosreceptoresCD94comolosdelafamiliaNKG2se encuentran localizados en el cromosoma 12 en humanos en una zona conocida como complejo gnicoNK. ReceptoresNKdemolculasHLAenotrasclulas Estos receptores NK se encuentran tambin en otras estirpes celulares no NK, aunque en una menor proporcin y densidad. Este es el caso de una poblacin especial de clulas NK que se encuentran en la decidua y que son conocidas como clulas NK deciduales, en clulas NKTy en ciertoslinfocitosT. TRANSDUCCINDESEALES Tal como se ha indicado con anterioridad, tanto los receptores KIR, ILT como el homodmero de CD94 con distintos miembros de la familia de NKG2, pueden ejercer acciones inhibidoras como activantes. El que ejerzan una u otra accin depende de la cola citoplasmtica de dichas molculas y de las cinasas conlascualesseasocien. Mecanismos inhibicin de

Los receptores inhibidores se caracterizan por poseer en sus dominios intracitoplasmticos los motivos YxxL26YxxL, denominados ITIM (immunoreceptor tyrosine based inhibitory motives) (Figura:ITAM/ITIM). Estos motivos tienen la propiedad de unirse al dominio SH2 que contiene las tirosnfosfatasas, SHP1 y SHP2, y as producir inhibicin de la citotoxicidad. En la (Figura: Inhibicin/Activacin) se representa un ejemplo de cada uno de los dos tipos de receptores, inhibidoresyactivadores. Es de destacar que esta accin inhibidora, ejercida por los receptores inhibidores despus de reconocerasuligando(HLAclaseI)enlaclulas,tieneunagranimportanciafisiolgica,puesesto evitala destruccin de las clulas normales del husped. Esto se debe a que, como se sabe, la mayora de las clulas del organismo expresan molculas de histocompatibilidad clase I, incluidas lasmolculasHLAE.

De esta manera cuando una clula deja de expresar molculas de histocompatibilidad clase I, por ejemplo como consecuencia de una infeccin viral, entonces puede ser destruida por las clulas NK al no ser frenada su actividad por no actuar los receptores de tipo inhibidor que reconocen a estas molculas(Figura:HLAprdidaproteccin). Mecanismosdeactivacin Estos receptores poseen una parte citoplasmtica muycorta,carecendelasecuenciasITIMsytienenla propiedad de asociarse a las molcula DAP12. Estos receptores son KIRD2S, NKG2C, NKG2E y NKG2H.El DAP12 es un homodmero conocido tambin como KARAP (Killer activating receptor associated protein), gracias al cual se lleva a cabo la transmisin de seales en el citoplasma de la clula. La molcula DAP12 se caracteriza por contener en su parte citoplasmtica un dominio conocido como ITAM (immunoreceptor tyrosinebased activating motive) y tiene la capacidad de unir las cinasasZAP70ySyk. CLULASNKYRESPUESTAINMUNEINNATA Las clulas NK, tal como se ha indicado anteriormente, forman parte de la primera barrera defensiva del individuo junto con macrfagos y polimorfonucleares. Constituyen as parte de la respuestainmuneinnata. Ciertas citocinas que potencian el efecto de estas clulas son producidas precisamente por macrfagos en las primeras fases de la infeccin (Tabla: citocinas y NK) y (Figura: Respuesta inmuneyNK).

INMUNOPATOLOGADELASCLULASNK LasclulasNKsondeespecialimportanciaenlasprimeras fases de la infeccin, especialmente frente a virus, de ah que cuando estas clulas no actan correctamente, el individuosehacemsvulnerablealasinfeccionesvirales. Por ejemplo en individuos infectados por HIV1, se ha podido comprobar que las clulas NK han disminuido su capacidadcitoltica,loquepuedeexplicarqueelvirusHIV 1sedesarrolleconmsfacilidad. RecientementesehavistoquelasclulasNK,puedenser utilizadas en terapia antitumoral. (Figura: NK/Clula tumoral). Para ello despus de su extraccin del individuo y cultivo con Il2, IL12 o IL15, son posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de clulasLAK (citokyne activated lymphocytes). En enfermos con SIDA,tambinse est tratandode potenciar la respuesta inmune innata y en especial estas clulas NK, mediante la administracin deIL2,conresultadosquesonprometedores.

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

Tras la activacin, los linfocitos T modifican la expresin en superficie de diferentes marcadores.

18.-Generacin de Linfocitos T efectores

(Molculas de activacin; Subtipos de linfocitos T cooperadores; Linfocitos T citotxicos)
A. Corell UVA

Indice de contenidos del Tema 18 Generacin de linfocitos T efectores 18.1 Modificaciones fenotpicas: -molculas de activacin 18.2 Activacin de linfocitos T cooperadores: -Th1 -Th2 18.3 Activacin de linfocitos T citotxicos: -mecanismos alternativos de activacin 18.4 Mecanismos de lisis celular: -citolisinas -apoptosis

Clulas T en reposo Expresan las subunidades E y J del

receptor para IL-2 (IL-2R): baja-media afinidad

Clulas T activadas Expresan las 3 subunidades: D, E y J del

receptor de IL-2: alta afinidad

La activacin de linfocitos T CD4+ requiere al menos 2 seales desde la APC:

1 {Ag + MHC} se unen al TCR Seales adicionales (va molculas de superficie o citocinas):destaca CD28.

El contacto inicial entre clulas T y APCs no se hace a travs del TCR sino de molculas accesorias

Ligandos 2s
CD80 y CD86 Presentes en APCs Se unen a CD-28 y CTLA-4 en clulas T CD-28 Presente en clulas T vrgenes y activadas Cuando se une, promueve seales positivas para la clula T CTLA-4 (CD152) Presente slo en clulas T activadas Cuando se une, promueve seales negativas para la clula T

La estimulacin del TCR sin una segunda seal conduce a las clulas T a estados de anergia (inactividad)

La unin de CD80/CD86 de las APCs alternativamente con CD-28 CTLA-4 (en clulas T) determina si la clula recibe seales positivas o negativas.

Clulas T CD4
Th1 Activa a macrfagos y clulas NK Ayuda a algunas clulas B en la produccin de anticuerpos Ayuda a clulas T CD8 Th2 Ayudan mayoritariamente a clulas B en la produccin de anticuerpos Activan a mastocitos y eosinfilos Th1 y Th2 se inhiben recirprocamente

Las clulas T CD4 co-estimulan a linfocitos T CD8

Activados CD4 IFN-J IL-2 B7 y HLA en APC

Activacio n de CD8

Clulas T CD8
Clulas T citotxicas (CTL)
Identifican clulas infectadas o malignas y las eliminan por contacto directo

Linfocitos T Reguladores
Llamados supresores (Ts) Pueden aminorar la actividad inmune de otras clulas

Los receptores tipo Toll activan fagocitos y reacciones inflamatorias.

La protena transmembranal Toll fue identificada por primera vez en la mosca de la fruta Drosophila como una molcula necesaria en la embriognesis. Tambin se observ que las mutantes que carecen de Toll son altamente susceptibles a infecciones por hongos y bacterias grampositivas, lo que sugiere la posible implicacin de esta molcula en la defensa inmunitaria. Posteriormente se identific una serie de receptores tipo Toll (TLR) en mamferos con porciones intracelulares muy semejantes a las del receptor de las moscas. Las vas de sealizacin intracelular activadas por los TLR conducen a la activacin del factor de transcripcin NK-kB. La familia de los TLR comprende ms de diez receptores diferentes, muchos de los cuales son capaces de reconocer diferentes componentes microbianos. Todos los TLR se encuentran en clulas fagocticas, y algunos tambin en clulas dendrticas, mastocitos y clulas B. De hecho, la mayora de los tejidos del organismo expresan al menos un TLR. El TLR5 se encuentra en la superficie basal del epitelio del intestino, pero no en la apical. Qu consecuencia podra tener con relacin a las reacciones inmunitarias a nivel intestinal? Las bacterias presentes en el intestino no estimularan a la clula mientras que cualquier microorganismo que invada la capa intestinal podra hacerlo. Esto puede explicar por qu las bacterias comensales, no patgenas, no desencadenan una reaccin inflamatoria, mientras que las patgenas que invaden el tejido s lo hacen. La expresin de muchos TLR est elevada por citocinas inflamatorias lo que se observa en dolencias como la enfermedad intestinal inflamatoria. La trascendencia funcional de los I'LR ha sido demostrada en cepas de ratones defectivos que carecen de receptores especficos. Dependiendo del TLR implicado, esos animales no podrn secretar citocinas inflamatorias en respuesta a patgenos sin que se estimule la actividad microbicida de los fagocitos. Estos resultados demuestran que los TLR son fundamentales para la activacin de los fagocitos, adems del papel que puedan desempear en la endocitosis. Los TLR constituyen un nexo importante entre los sistemas inniunitarios innato y adaptativo, ya que su activacin da lugar a la expresin de molculas coestimuladoras en los fagocitos, las cuales convierten a estas clulas en eficaces presentadoras de antgeno. La fijacin de los componentes microbianos a los TLR acta como una seal de peligro que aumenta la actividad microbicida de los fagocitos y les permite activar a las clulas T.

LAS PROTENAS MICROBICIDAS FORMAN PARTE DEL SISTEMA INMUNITARIO INNATO Una vez que un microorganismo ha sido endocitado se enfrenta a diversos mecanismos microbicidas. En las moscas de la fruta Drosophila, la infeccin estimula la liberacin de varias protenas microbicidas desde el cuerpo graso hacia la hemolinfa. En mamferos, las protenas relacionadas pertenecientes a las familias de las defensinas y de las catelicidinas restringen la diseminacin de los microbios al destruir sus membranas externas. Por ejemplo, la membrana externa de las bacterias gram negativas contiene una cantidad de fosfolpidos con carga elctrica negativa superior a la de la membrana plasmtica de los mamferos. Las defensinas, con carga positiva, se insertan, en la membrana bacteriana, especialmente si la concentracin de sal es baja. Las defensinas constituyen uno de los principales mecanismos microbicidas de neutrfilos y eosinfilos. Sin embarao, algunas defensinas tambin son producidas por otros tipos celulares, especialmente en las superficies epiteliales del pulmn, intestino y vejiga. Algunos de estos pptidos microbicidas provocan tambin la desgranulacin de los mastocitos, con la liberacin de quimiocinas, y/o poseen actividad quimiotctica directa. Por consiguiente, pueden atraer a los leucocitos hacia los sitios de infeccin. Se ha demostrado la importancia de estas primitivas defensas antimicrobianas en animales genticamente defectivos, que a menudo presentan una mayor susceptibilidad a ciertos tipos de infeccin. Existe, sin embargo, poca informacin acerca de la deficiencia natural de tales molculas en el ser humano.

Receptores

Ligandos

Patgenos

TLR1 TLR2

lipopptidos cido lipoteicoico, lipoarabinomanano, zimosn ARNbc

bacterias gramnegativas, micobacterias bacterias grampositivas, micobacterias, hongos

TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR9

virus

lipopolisacrido bacterias gramnegativas flagelina diacil-lipopptidos ADN-CpG bacterias micobacterias bacterias

La duplicacin gnica del precursor TLR y la divergencia funcional han dado lugar a una familia de molculas capaces de reconocer diferentes tipos de patgenos.

Tema 07. Citocinas y quimiocinas

En este capitulo se tratar sobre las citocinas y quimiocinas, incluyendo tambin conceptos bsicos sobre sus receptores. Las citocinas comprenden un amplio grupo de glicoprotenas que poseen la capacidad de regular la actividad funcional de clulas y de tejidos, tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas. Las quimiocinas son un grupo de pequeas molculas proteicas (8-14 kDa) con caractersticas bioqumicas comunes y que estn producidas por muchos tipos celulares en respuesta a estmulos exgenos o endgenos y que tienen funciones esencialmente de dirigir el movimiento de clulas.

Citocinas
Son molculas de bajo peso molecular, normalmente entre 15-30 KDa, constituidas por 120-180 aminocidos con funciones muy variadas pero que predominan aquellas orientadas a regular los distintos componentes celulares de la respuesta inmune. Aunque en general estn producidas por leucocitos, determinadas citocinas pueden tambin ser secretadas por otros muchos tipos celulares. Originariamente se estableci el trmino linfocina para denominar productos biolgicos producidos por linfocitos en respuesta al antgeno, sin embargo posteriormente se ampli a molculas de caractersticas similares secretadas por otros tipos celulares, por lo que se propuso un trmino ms amplio, citocina. Por otra parte, el trmino interleucina (IL) se aplic en concreto a aquellas molculas que servan como seales de comunicacin entre distintos tipos de leucocitos, numerndose correlativamente a medida que se descubran (IL-1, IL-2, etc.). No obstante, algunas de ellas se detectaron inicialmente en ensayos funcionales in vitro y an conservan su denominacin original de acuerdo con la funcin biolgica que permiti su identificacin, como es el caso del TNF (factor de necrosis tumoral) y el TGF (factor transformador de tejidos). La expresin de la mayora de las citocinas est estrictamente regulada. En general, no se detecta una produccin constitutiva significativa de estas molculas, siendo necesaria la activacin celular para que se produzcan citocinas en cantidades suficientes para ejercer sus efectos biolgicos. La mayora de las citocinas son secretadas al espacio extracelular, muchas de ellas en forma glicosilada que incrementa su estabilidad y solubilidad. No obstante, algunas citocinas se pueden acumular en el interior de la clula, o bien, permanecer ancladas a la membrana o en la matriz extracelular. En general, son molculas que poseen una vida media muy corta y actan a muy bajas concentraciones, del orden de picogramos, mediante la unin a receptores de alta afinidad presentes en la superficie de la propia clula productora o en otros muy variados tipos celulares. Las citocinas ejercen un efecto autocrino cuando se unen a receptores presentes en la propia clula productora. Tambin pueden tener un efecto paracrino, actuando sobre diferentes tipos celulares que se encuentran en su vecindad. En algunos casos pueden liberarse a la circulacin sangunea o linftica, ejerciendo su efecto en otros rganos y tejidos,

actuando as como las hormonas, de forma endocrina (Figura 9.1). Dos importantes caractersticas funcionales de las citocinas son su pleiotropismo, de tal manera que una misma citocina es capaz de ejercer efectos biolgicos diferentes al actuar sobre distintos tipos celulares, y su redundancia, es decir, que varias citocinas pueden contribuir al desarrollo de la misma funcin en un determinado tipo celular. Una consecuencia de estas propiedades es que, en ausencia de una determinada citocina, sus funciones pueden ser reemplazadas total o parcialmente por otras. Muchas de estas caractersticas biolgicas de las citocinas se pueden explicar por la estructura y amplia distribucin celular de sus receptores, como se ver ms adelante. Las acciones de las citocinas se engloban dentro de un sistema o red funcional, donde el efecto de una molcula est estrechamente regulado, positiva o negativamente, por otras molculas del sistema. As, la secrecin de una citocina puede estar inducida, potenciada o inhibida por otra citocina que, a su vez, puede incrementar o inhibir la expresin de sus receptores. Los efectos biolgicos de las citocinas pueden ser muy variados, ya que, no solamente desempean un papel esencial en las respuestas inmunes, sino que algunas de ellas estn tambin implicadas en la embriognesis y en el desarrollo de rganos (por ejemplo, en la angiognesis), otras juegan un papel clave en procesos neuroinmunes y neuroendocrinos, y muchas son importantes reguladores, tanto positivos como negativos, de acontecimientos celulares como la mitosis, la diferenciacin, la migracin, la supervivencia, la muerte celular, e, incluso, de su transformacin maligna. La actividad biolgica de las citocinas se puede medir con distintas modalidades de bioensayos, utilizando, por ejemplo, lneas celulares cuya funcin depende de la presencia del factor que se quiere estudiar. En la actualidad, se utilizan como tcnica ms habitual inmunoensayos en fase slida, como el ELISA para cuantificar la concentracin de citocinas en fluidos biolgicos, y el ELISPOT para conocer el nmero de clulas productoras. Tambin es posible cuantificar y caracterizar las clulas productoras identificando las citocinas intracelulares mediante citometra de flujo. (Tabla 9.1) Otra posibilidad es la utilizacin de tcnicas de RT-PCR cuantitativa que permiten detectar y medir los niveles de RNAm que codifican una determinada citocina.

Tipos de citocinas La mayora de las citocinas se pueden agrupar en seis familias (tabla 9.1b) no poseen ninguna homologa secuencial entre s, algunas de ellas se han agrupado en familias en base a su estructura tridimensional. De acuerdo con la estructura secundaria de la molcula se han agrupado las citocinas segn posean una conformacin estructural. Para facilitar el estudio de las citocinas se presentan en estas tablas (9.2a y 9.2b) las ms importantes donde se describe su origen y funcin. Para mejorar su estudio describimos las citocinas englobadas, de acuerdo con su funcin ms relevante, dentro de las siguientes secciones: Implicadas en el desarrollo hematopoytico las respuestas inmunes innatas, generadas durante las respuestas inmunes adaptativas y con propiedades proinflamatorias e inmunosupresoras. Algunas de las citocinas sern mencionadas en ms de una seccin, si bien su descripcin completa se har solamente en el apartado en que se cite originalmente.

Citocinas implicadas en el crecimiento y la diferenciacin hematopoytico Comprenden un grupo amplio de citocinas que promueven el crecimiento y diferenciacin de las clulas sanguneas maduras a partir de clulas madre hematopoyticas.

Son producidas por clulas del estroma de la mdula sea o por linfocitos maduros activados. Algunas de estas citocinas reciben el nombre genrico de factores estimuladores de la formacin de colonias (CSF) por su capacidad para estimular la formacin de colonias celulares en los cultivos de mdula sea (Tabla 9.1). A continuacin describimos las citocinas ms relevantes de este grupo: IL-3. Es producida mayoritariamente por los linfocitos T activados y tambin por mastocitos. Induce la proliferacin y diferenciacin de progenitores hematopoyticos tempranos de todas las series sanguneas, por lo que tambin es conocida como multi-CSF. Induce fundamentalmente la hematopoyesis en situaciones de stress que requieren una res puesta rpida, siendo menos claro su papel en la hematopoyesis constitutiva. IL-5. Es secretada en forma glicosilada por LT CD4+ activados del tipo Th2. Es esencial en la proliferacin y diferenciacin de las clulas precursoras de los eosinfilos, as como en el mantenimiento de la actividad de los eosinfilos maduros siendo la responsable de la eosinofilia en infecciones parasitarias. Sobre los linfocitos B acta incrementando su proliferacin y estimulando la produccin de IgA. IL-7. Es producida por clulas estromales de la mdula sea. Promueve la maduracin de progenitores pro- y pre-B hacia linfocitos B maduros en la mdula sea y de linfocitos T inmaduros en el timo fetal y adulto. Tambin acta como factor de crecimiento para linfocitos T y B. IL-9. Es producida por linfocitos T activados. Tiene un amplio espectro de actividades no muy bien definidas entre las que se incluye la proliferacin de precursores eritroides. Al igual que la IL-7, tambin induce la proliferacin de LT y estimula la produccin de inmunoglobulinas en clulas B. IL-11. Es producida por fibroblastos del estroma de la mdula sea y otros tipos celulares. Estimula la megacariocitopoyesis y sinergiza con otras citocinas para estimular el crecimiento de otros precursores hemticos. Comparte algunas funciones con la IL-6, como la induccin de protenas de fase aguda en el hgado. Tambin se ha descrito su capacidad como estimuladora de la secrecin de inmunoglobulinas por clulas B en respuestas T-independientes. GM-CSF. Es producido por linfocitos T activados y por otras clulas como fibroblastos, clulas endoteliales y monocitos. Es un polipptido con varios posibles lugares de glicosilacin. Induce la proliferacin de los progenitores de granulocitos y macrfagos, producindose en respuesta a estmulos especficos en situaciones que requieren una elevada produccin de stas clulas. Tambin puede actuar sobre granulocitos y macrfagos maduros. G-CSF. Es producido por fibroblastos, clulas endoteliales y monocitos en respuesta a estmulos especficos. Acta sobre los precursores hematopoyticos de los granulocitos y sobre los granulocitos maduros. La granulocitosis asociada a ciertas infecciones se debe a que el LPS de las paredes bacterianas es un potente inductor de la produccin de esta citocina. Se han descrito otras funciones de este factor, como la estimulacin de la fagocitosis y de la citotoxicidad mediada por Ac.

M-CSF. Es producido por monocitos y macrfagos maduros activados y est implicado en el desarrollo de las clulas progenitoras de los macrfagos. Tambin se ha visto que facilita el desarrollo de la placenta, siendo producido por clulas del epitelio uterino en respuesta a los estrgenos. Citocinas producidas en las respuestas inmunes innatas Estas citocinas se producen de forma inmediata tras el contacto de las clulas implicadas en las respuestas inmunes innatas con un agente extrao. Los monocitos y macrfagos activados son la principal fuente de estas molculas aunque tambin pueden ser producidas por linfocitos activados y otras clulas no pertenecientes al sistema inmune, como clulas endoteliales y fibroblastos (Tabla 9.2) IL-1. Es producida funda- mentalmente por monocitos y macrfagos, pero tambin por clulas dendrticas, endoteliales, NK y otros tipos celulares. Existen dos formas, IL-1alfa e IL-1beta que, aunque solamente tienen un 25 % de homologa en su secuencia aminoacdica, comparten el mismo receptor y ejercen efectos biolgicos similares. Parte de sus efectos pro- inflamatorios se debe a que induce la liberacin de histamina en los mastocitos, generando vaso- dilatacin y aumento de la permeabilidad vascular en el lugar de la inflamacin. Es el principal pirgeno endgeno, induciendo fiebre a travs de la produccin de prostaglandinas. Tambin promueve la sntesis de protenas de fase aguda por los hepatocitos y acta sobre el SNC induciendo sueo y anorexia, tpicamente asociados con los procesos infecciosos (Figura 9.2). IL-6. Es producida fundamentalmente por monocitos/macrfagos, fibroblastos, clulas endoteliales, linfocitos T y clulas del estroma de la mdula sea. Junto con la IL-1 es la principal inductora de la sntesis de protenas de fase aguda, sobre todo de fibringeno. Adems de su efecto en la inflamacin, se ha observado que promueve la diferenciacin de linfocitos B hacia clulas plasmticas, induciendo la produccin de inmunoglobulinas. Tambin puede aumentar la produccin de IL-2 y el desarrollo de los precursores hematopoyticos dependientes de la IL-3 (Figura 9.3). TNF. Los factores de necrosis tumoral fueron descritos inicialmente por su capacidad de causar necrosis en algunos tumores. Con posterioridad, sin embargo, ganaron protagonismo por las numerosas funciones que ejercen sobre las respuestas inmunes. Se han descrito dos molculas estrechamente relacionadas, el TNF-alfa y el TNFbeta, con elevada homologa en su secuencia aminoacdica. El TNFalfa es producido fundamentalmente por monocitos y

macrfagos en respuesta a antgenos bacterianos, tales como el LPS, siendo esta citocina el principal responsable del shock sptico asociado a bacteriemias. Tambin puede ser producido por linfocitos T y B, NK, fibroblastos y mastocitos. Junto con la IL-1 est implicado en los procesos inflamatorios derivados de los procesos infecciosos, elevando la temperatura corporal y produciendo caquexia y sueo al actuar sobre el SNC. Por otra parte, induce la expresin de molculas de adhesin y estimula la produccin de IL-8 por clulas del endotelio vascular, lo que contribuye a la extravasacin de linfocitos, neutrfilos y monocitos. El TNF -beta o linfotoxina, es producido exclusivamente por linfocitos T activados, aunque se une a los mismos receptores que el TNFalfa e induce funciones similares. IL-10. Es producida por linfocitos del tipo Th2, as como tambin por monocitos/macrfagos, linfocitos B, queratinocitos y otros varios tipos celulares. Es la citocina inmunosupresora por excelencia, inhibiendo la sntesis de muchas otras citocinas, entre las que podemos citar IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-12, y la expresin de MHC-II y molculas de adhesin en monocitos. Tambin tiene efectos antiproliferativos sobre muchos tipos celulares. La IL-10 ejerce adems mltiples actividades inmunomoduladoras. Se ha visto que es un cofactor para el crecimiento de lneas y colonias de clulas mastocticas in vitro. Regula las funciones mediadas por linfocitos B induciendo la sntesis de IgG, y por linfocitos T, influyendo en el desarrollo de timocitos y clulas T. Tambin ejerce efectos reguladores sobre la angiognesis. El virus de Epstein Barr secreta una protena que posee una gran homologa estructural con la IL-10 humana (vIL-10), y que tras unirse con baja afinidad al propio receptor de la IL-10, ejecuta actividades biolgicas similares. Relacionadas estructural y funcionalmente con la IL-10 se han descrito recientemente nuevas molculas tales como la IL-19, IL-20 e IL-22, cuyas funciones son todava poco conocidas (Figura 9.4) IL-12. Es producida mayoritariamente por monocitos/macrfagos, aunque su produccin puede ser tambin inducida en clulas dendrticas y linfocitos B. Inicialmente se describi como el factor estimulador de las clulas asesinas naturales (NK), pero la actual importancia de esta citocina deriva de su capacidad de dirigir la diferenciacin de los linfocitos Th hacia clulas efectoras tipo Th1 de la hipersensibilidad retardada. La forma madura de esta molcula (p75) est compuesta de dos subunidades, p35 y p40. La sntesis de ambas subunidades est regulada diferencialmente, siendo ambas necesarias para la actividad funcional del heterodmero. Esta citocina incrementa la actividad citotxica de las clulas NK e induce clulas LAK (linfocitos asesinos activados por linfocinas) por linfocitos T y clulas NK. Incrementa la produccin de IFN- linfocitos T citotxicos. Recientemente se ha descrito un factor proteico denominado p19, sin actividad biolgica por s mismo, que se combina con la subunidad p40 de la IL-12 para dar lugar a una nueva citocina biolgicamente activa denominada IL-23. Esta citocina es producida por clulas dendrticas activadas, se une al receptor de la IL-12 y comparte algunas de las funciones biolgicas con ella.

IL-18. Esta citocina est estrechamente relacionada en sus funciones biolgicas con la IL-12, ya que posee la misma capacidad de induccin de IFN-gamma en linfocitos T y clulas NK. Sin embargo, es producida por diferentes tipos celulares que la IL-12, siendo las clulas adrenales y de Kupffer las principales fuentes de produccin de la IL-18.Interferones tipo I. Los interferones fueron inicialmente descritos como agentes producidos por clulas infectadas por virus. Posteriormente se descubri que adems de su capacidad antiviral ejercan efectos reguladores sobre la proliferacin y la diferenciacin de varios tipos celulares y tenan capacidad de modular el sistema inmune. Se clasificaron en dos grupos. Los interferones tipo I, que incluyen el IFN-alfa y el IFN-beta, con capacidad principalmente antiviral y antiproliferativa, y el IFN-gamma (tipo II), al que nos referiremos posteriormente, con un mayor efecto inmunomodulador. El IFN-gamma es producido fundamentalmente por monocitos y macrfagos, mientras que el IFN-alfa es secretado por fibroblastos y algunas clulas epiteliales. Ambos incrementan la expresin de molculas de MHC de clase I. En algunos casos se ha observado que poseen actividad antitumoral, posiblemente debido a su efecto antiproliferativo sobre las clulas tumorales, y modulador sobre el sistema inmune. Citocinas producidas en las respuestas inmunes adaptativas

En respuesta a una estimulacin antignica, los linfocitos T se activan, proliferan y se diferencian hacia clulas efectoras especficas. Estas clulas ejercen sus funciones produciendo una serie de molculas solubles, verdaderas artfices de los mecanismos efectores de la respuesta inmune adaptativa (Tabla 9.3). Los linfocitos T CD4+, como consecuencia de una estimulacin antignica, pueden diferenciarse hacia linfocitos T coopera- dores de tipo Th1 o Th2, estando esta diferenciacin en parte condi- cionada por las citocinas que se encuentran en el medio. As, la presencia de IL-12 promueve la diferenciacin hacia Th1, mientras que la IL-4 condiciona el desarrollo Th2. Los linfo- citos Th1, en colaboracin con los macrfagos, estn implicados en la respuesta inmune celular, mi- entras que los Th2 promueven la respuesta inmune humoral. Para llevar a cabo su funcin los linfocitos Th1 secretan IL-2, IFN-gamma y TNF, mientras que los Th2 producen IL4, IL-5, IL-10 e IL-13. Se han descrito otras subpoblaciones de linfocitos T CD4+ efectores que secretan un perfil de citocinas diferente y llevan a cabo funciones especficas. Este es el caso de los linfocitos T reguladores de los que se han descrito varios tipos. Los linfocitos T CD8+ se diferencian hacia linfocitos T citotxicos como respuesta a la estimulacin antignica y a la presencia de citocinas secretadas por otras clulas. Ejercen su funcin efectora mediante la secrecin fundamentalmente de IL-2, IL-16, IFN-gamma y TNF. Finalmente hay una serie de citocinas que pueden ser producidas por ambos tipos de linfocitos T, CD4+ y CD8+, tales como IL-2, GM-CSF y TGF-beta. IL-2. Es secretada por linfocitos T CD4+ y CD8+ activados en respuesta a un estmulo antignico. Inicialmente se describi como factor de crecimiento de clulas T, ya que es el principal agente que

controla su proliferacin. Ejerce otros muchos efectos sobre el sistema inmune, teniendo un papel esencial en el desarrollo de las respuestas inflamatorias crnicas, tanto humorales como celulares. Es un factor estimulador del crecimiento de linfocitos T , B y NK. Promueve la actividad citotxica mediada por linfocitos T y clulas NK, as como el desarrollo de clulas LAK (clulas asesinas activadas por citocinas). Tras unirse a su receptor en linfocitos T, activa la secrecin de IFN-alfa, linfotoxina, IL-4, IL-3, IL-5 y GM-CSF. Sobre los linfocitos B estimula su crecimiento y diferenciacin e incrementa la expresin de molculas de MHC de clase II. IL-15. Es secretada por una amplia variedad de clulas, entre las que se incluyen clulas epiteliales, monocitos, msculo esqueltico, hgado, pulmn y placenta. Aunque no es una citocina producida por linfocitos Th1 se incluye en este apartado por su similitud funcional con la IL-2, con la que comparte la mayora de sus actividades biolgicas, como la estimulacin de clulas NK, y la proliferacin y diferenciacin linfocitaria. IFN. Es producido por linfocitos Th1, LTC y por clulas NK. Adems de su efecto antiviral posee una importante actividad inmunomoduladora. Incrementa la expresin de antgenos de HLA de clase I y II en varios tipos celulares, lo que facilita su funcin presentadora de Ag y activa a los macrfagos, incrementando su capacidad tumoricida y de defensa contra las infecciones. Acta de forma autocrina sobre las propias clulas NK que lo producen, aumentando su actividad citoltica y, como consecuencia, incrementando su efecto antitumoral. Sobre los linfocitos Th2 inhibe la proliferacin, de manera que su presencia durante la estimulacin antignica induce la diferenciacin de linfocitos T hacia clulas efectoras tipo Th1 favoreciendo, por lo tanto, el desarrollo de las respuestas inflamatorias IL-4. Es producida por linfocitos Th2, mastocitos, basfilos, clulas del estroma de la mdula sea y, posiblemente, por determinadas subpoblaciones de clulas NK. Es una citocina muy pleiotrpica, ya que ejerce numerosos efectos en diferentes tipos celulares. Promueve la diferenciacin de linfocitos T vrgenes hacia clulas de tipo Th2, inhibiendo la generacin de clulas Th1. Posee efectos inmunosupresores, ya que inhibe la produccin de determinados mediadores inflamatorios de los macrfagos e induce la produccin de IL-1Ra, que bloquea la accin de la IL-1. Por otra parte, promueve el desarrollo de las respuestas inmunes humorales a travs de la induccin del crecimiento y diferenciacin de linfocitos B, produciendo el cambio isotpico hacia IgG4 e IgE e incrementando la expresin de molculas CD23 en linfocitos B, basfilos y eosinfilos. Por todo ello, los efectos de esta citocina se han relacionado con el desarrollo de los procesos alrgicos y con el incremento de IgE en las infecciones parasitarias IL-13. Es producida por linfocitos T activados del tipo Th2, compartiendo muchas de sus funciones con la IL-4 con la que se encuentra genticamente relacionada. Es una citocina con actividad inmunosupresora ya que inhibe, junto con la IL-4 y la IL-10, la produccin de citocinas inflamatorias por los monocitos (IL1beta, TNF-alfa, IL-8, IL-6). Por otra parte, esta citocina incrementa la proliferacin y diferenciacin de monocitos y clulas B, incrementa la expresin de CD23 y promueve el cambio de clase de inmunoglobulinas hacia la produccin de IgE IL-16. Est producida por los linfocitos T CD8+ donde se acumula y se secreta en respuesta a la estimulacin con serotonina o histamina. Originariamente se identific como factor quimiotctico de linfocitos, recibiendo el nombre de linfotactina, debido a su efecto atrayente sobre los linfocitos T CD4+. En la actualidad es el nico miembro de la familia C de quimiocinas (vase ms adelante).

TGF. Hay dos tipos de factores transformadores del crecimiento, el TGF-alfa y el TGF-beta, que no poseen ninguna similitud estructural ni comparten los mismos efectos. Solamente el TGF-beta tiene efectos inmunomoduladores. Es producido por linfocitos T, plaquetas y otros muchos tipos celulares. Su nombre responde a la observacin inicial de que induca cambios fenotpicos en los fibroblastos de rata. Incrementa la proliferacin de fibroblastos, osteoblastos y clulas musculares lisas e incrementa la sntesis de protenas de la matriz extracelular, lo que favorece la curacin de las heridas. Esta citocina tiene tambin efectos inmunosupresores ya que se observ que inhiba el crecimiento y la funcin de muchos tipos celulares. En el sistema inmune inhibe la sntesis y/o el efecto del IFN-gamma, TNF-alfa, TNFbeta, IL-1, IL-2 e IL-3, as como la citotoxicidad natural y especfica. Citocinas proinflamatorias e inmunosupresoras En relacin con la respuesta inflamatoria algunas citocinas favorecen el desarrollo de la misma (citocinas proinflamatorias) mientras que otras ejercen un efecto supresor de la inflamacin (citocinas inmunosupresoras). Las citocinas con actividad antiinflamatoria e inmunosupresora inhiben el crecimiento celular o suprimen la secrecin de otras citocinas. Entre ellas se encuentran la IL-4, IL-13 e IL-10, que activan las acciones de los linfocitos B a la vez que inhiben las respuestas inflamatorias. Como ya comentamos, la IL-10 es la citocina inmunosupresora por excelencia. Tambin se incluye en este apartado el TGF-beta que, como se ha dicho anteriormente, inhibe el crecimiento y la funcin de muchos tipos celulares, la sntesis de determinadas citocinas y la actividad citotxica natural y especfica. Finalmente, los interferones tipo I (alfa y beta), tambin se pueden considerar citocinas supresoras debido a su capacidad antiproliferativa y a su efecto regulador de la produccin de citocinas pro- inflamatorias. En el grupo de las citocinas con actividad proinflamatoria se incluyen las producidas por los monocitos y macrfagos activados durante las respuestas inmunes innatas, aunque tambin pueden ser producidas por linfocitos activados (Th1 o citotxicos), y otras clulas no pertenecientes al sistema inmune.

Las principales citocinas que participan en los acontecimientos celulares y moleculares asociados con los fenmenos inflamatorios son la IL-1, IL-6, TNF-alfa y algunos miembros de la familia de las quimiocinas, que describimos a continuacin. Otra importante citocina pro- inflamatoria es el IFNgamma, producido por linfocitos Th1 en las respuestas inmunes especficas y por clulas NK activadas.

En la (Figura 9.5), se presenta un esquema general de la respuesta inmune en donde se incluye la mayora de la citocinas conocidas. Tambin se incluye un esquema donde se especifican las principales citocinas que intervienen sobre los linfocitos T, B y macrfagos su orden de aparicin (Figura 9.6) en infecciones de tipo agudo.

Receptores Citocinas
Las citocinas ejercen su efecto biolgico a travs de su unin con receptores especficos expresados en la superficie celular. Los receptores de citocinas son protenas de membrana glicosiladas que constan de una regin extracitoplasmtica de unin con la citocina, una regin transmembranal y una regin citoplasmtica que interviene en la transmisin de seales al interior de la clula. La clonacin de muchos de estos receptores y el anlisis de su estructura ha permitido clasificarlos en 4 familias segn regiones comunes de homologa dentro de los miembros de una misma familia (Tabla 9.4). Los receptores funcionales son de alta afinidad, es decir, nicamente son necesarias bajas concentraciones de citocinas para una unin efectiva con su receptor y para desencadenar su correspondiente efecto biolgico. Adems, estos receptores se expresan en un nmero bajo en la superficie celular generalmente de unos pocos cientos a unos pocos miles de receptores por clula. La distribucin de algunos de ellos, como por ejemplo los de la IL-2 y de la IL-5, est restringida a unos pocos tipos celulares mientras que otros, entre los que se pueden citar los de la IL-1, IL-4 e IL-6, se encuentran distribuidos en una amplia variedad de tipos celulares. La expresin de los receptores de citocinas en la superficie celular puede ser constitutiva, es decir, tiene lugar sin necesidad de ningn estmulo fisiolgico o, por el contrario, puede requerir que la clula sea activada previamente. En general, la activacin celular incrementa el nmero de receptores por clula. Muchos de los receptores de citocinas son complejos multicatenarios compuestos de una cadena que se une especficamente a la citocina (cadena especfica) y de una cadena que transduce las seales al interior de la clula y que es compartida por otros receptores de citocinas (cadena comn). Para la transduccin de seales se requiere, en general, de la unin de varias cadenas especficas (homodmeros) o de la cadena especfica con la comn (heterodmeros). En algunos casos, es necesaria la interaccin de tres cadenas para la formacin de receptores de alta afinidad. La transduccin de seales puede tener lugar por mecanismos comunes a todas las familias de receptores o por mecanismos especficos de cada una de ellas. Como comentaremos en este captulo, muchas de las caractersticas funcionales de las citocinas, como la redundancia y el pleiotropismo, pueden ser explicadas ahora por los

conocimientos actuales sobre la composicin y mecanismos de sealizacin de sus receptores. Tipos Segn su estructura, los receptores de citocinas se pueden agrupar en 4 familias diferentes (Figura 9.7): la superfamilia de las inmunoglobulinas, la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), la familia del receptor del factor de crecimiento hematopoytico (HGFR) que incluye la mayora de los receptores de citocinas por lo que tambin se denomina superfamilia de los receptores de citocinas y, por ltimo, la familia de los receptores de quimiocinas. Dentro de cada familia la homologa entre sus diferentes miembros es aproximadamente del 15 al 25%. Existen receptores que no pueden ser agrupados en ninguna de estas familias como, por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGF), la cadena a del receptor de la IL-2 y el receptor del factor b de crecimiento transformante (TGFbeta). Superfamilia de las inmunoglobulinas Se incluyen dentro de esta familia un grupo de receptores que presentan en la regin extracitoplasmtica un nmero variable de dominios que son similares a los de las inmunoglobulinas y que intervienen en la unin con el ligando. La regin citoplasmtica contiene secuencias tirosina cinasa mediante las cuales tiene lugar la transduccin de seales al interior de la clula como consecuencia de la unin del ligando con su receptor. A esta familia pertenecen los receptores de la IL-1 y de otras citocinas implicadas en el crecimiento celular como son el factor estimulante de colonias de macrfagos (M-CSFR), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y el factor de clulas pluripotentes (SCFR). Familia del TNFR La caracterstica principal de los receptores que se incluyen dentro de esta familia es la presencia en el dominio extracelular de 3 a 4 secuencias conservadas, ricas en cistena e implicadas en la unin con el ligando. Dentro de esta familia se incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) y los 3 tipos de receptores para el TNFa y las linfotoxinas (LT) (TNFRI, TNFRII y TNFRIII) (Tabla 9.1). Superfamilia de los receptores de citocinas Los receptores que pertenecen a esta familia se pueden subdividir a su vez en dos clases relacionadas evolutivamente. La clase 1 est compuesta por la mayora de los receptores de citocinas mientras que en la clase 2 se incluyen los receptores para los IFNs. Se pueden establecer diferentes modelos de receptores, de los cuales el ms sencillo es el formado nicamente por homodimerizacin de su cadena especfica como es el caso del G-CSFR, EPOR y TPOR. Otro modelo consiste en la heterodimerizacin de la cadena especfica y alguna de las cadenas comunes de transduccin de seales. De este modo, los receptores para la IL-6, IL-11, LIF, OSM y CNTF se forman por heterodimerizacin de su cadena especfica de unin con el ligando y de una o dos cadenas gp130.

Los receptores para la IL-3, IL-5 y GM-CSF son, en cambio, heterodmeros que constan de su cadena especfica y de una nica cadena comn bc. Varios

receptores de interleucinas, el IL-2R, IL-4R, IL-7R e IL-9R, estn formados por su cadena especfica y la cadena gc . El receptor de la IL-2 ha sido ampliamente estudiado y se ha comprobado que la transduccin de seales tiene lugar por receptores con distinta afinidad que resultan de la unin de dos o de tres cadenas. El receptor de afinidad intermedia (10-9 M) est compuesto por la cadena especfica b (IL-2Rb) y por la cadena comn, gc, implicada en la transduccin de seales mientras que el receptor de alta afinidad (10-11 M) es un complejo trimolecular que consta de las dos cadenas anteriores ms la cadena especfica a (IL2Ra). Mecanismos de transduccin de seales. La unin de una citocina a su receptor en la superficie de la clula diana produce su efecto biolgico mediante la fosforilacin de protenas celulares, incluido el propio receptor. Estas protenas fosforiladas activan factores de transcripcin producindose, en ltimo trmino, la transcripcin de determinados genes cuyos productos proteicos son los que, en ltimo trmino, van a ejercer el efecto biolgico correspondiente. En la mayora de los receptores, el primer paso en la sealizacin consiste en la oligomerizacin de varias cadenas de receptores inducida por la unin con el ligando. Esta asociacin permite el contacto de las regiones citoplasmticas de los receptores a partir del cual se van a activar mecanismos de sealizacin especficos de cada familia de receptores de citocinas. Adems, las citocinas tambin transducen seales mediante mecanismos comunes a otros ligandos (Figura 9.9). Superfamilia de inmunoglobulinas: sealizacin por receptores con actividad tirosina cinasa. En los receptores de la familia de las inmunoglobulinas, la sealizacin est mediada por secuencias con actividad tirosina cinasa presentes en su regin citoplasmtica que fosforilan residuos de tirosinas en protenas citoplasmticas. Este dominio est altamente conservado y funciona como un sitio de unin para el ATP implicado en la reaccin de fosforilacin. Sealizacin en la familia del TNFR La regin citoplasmtica de los receptores de la familia del TNFR no presenta secuencias con actividad cataltica pero se ha comprobado que para la transduccin de seales por varios de ellos son necesarias unas protenas citoplasmticas, pertenecientes a una nueva familia, denominadas factores asociados al receptor del TNF (TRAF). Superfamilia de los receptores de citocinas: sealizacin por Jaks y Stats En la superfamilia de receptores de citocinas tampoco existen dominios con actividad cataltica en su regin citoplasmtica. A pesar de ello, la unin de una citocina con su receptor produce una rpida fosforilacin de tirosinas en protenas celulares incluido el propio receptor. Esta sealizacin est mediada principalmente por una nueva familia de tirosina cinasas denominadas Janus cinasas (Jaks) y por factores de transcripcin de una nueva familia denominada Stat (transductores de seal y activadores de la transcripcin).

Vas comunes de transduccin de seales Adems de los mecanismos de sealizacin especficos de cada familia de receptores, las citocinas pueden activar mecanismos comunes a las distintas familias e incluso a otros sistemas de receptores. Los primeros candidatos para la fosforilacin en tirosinas producida inmediatamente despus de la unin de una citocina con su receptor fueron cinasas de la familia src. Estas tirosina cinasas han sido implicadas en la respuesta a muchos ligandos y adems se requieren en la activacin celular a travs del TCR. Otra va de sealizacin utilizada tambin por los receptores de citocinas es la Ras-GTP que, adems, forma parte del crecimiento normal en respuesta a muchos factores de crecimiento y de la proliferacin maligna inducida por oncogenes. La estimulacin de esta va, en ltimo trmino, produce la activacin de la cascada de cinasas de protena activadas por mitgenos (MAPK). Implicaciones funcionales de los receptores de citocinas. Determinadas caractersticas funcionales de las citocinas pueden ser explicadas ahora por los recientes conocimientos adquiridos sobre la composicin y los mecanismos de activacin de sus receptores. Las citocinas son redundantes, es decir, varias citocinas ejercen efectos biolgicos similares sobre un mismo tipo celular. El que algunos receptores de citocinas sean complejos oligomricos que comparten una misma cadena de transduccin de seales puede explicar este hecho. En estos receptores, la sealizacin tendra lugar por vas comunes producindose la transcripcin de los mismos genes. Este fenmeno ha sido mejor observado en las citocinas que utilizan receptores que son miembros de la superfamilia de los receptores de citocinas. Por ejemplo, la IL-3 y el GM-CSF que utilizan receptores que comparten la cadena beta como transductora de seales tienen funciones muy parecidas en el sistema hematopoytico. En el caso de las citocinas que utilizan la cadena gp130 (IL-6, LIF, CNTF, OSM, e IL-11), todas ellas son capaces de inducir la produccin de protenas de fase aguda en el hgado. Respecto a las citocinas cuyos receptores comparten la cadena gamma como transductora de seales (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15), todas son factores de crecimiento de clulas T. Este hecho es de gran importancia en la inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (XSCID) en la que no se produce un desarrollo normal de clulas T debido a la falta de una cadena transductora funcional por mutaciones en la cadena gamma. Otro mecanismo que explicara la redundancia de las citocinas es el hecho de que no exista una elevada especificidad de unin entre una citocina y su receptor como es el caso de las quimiocinas y sus receptores. Muchas de ellas tienen efecto quimiotctico sobre un mismo tipo celular lo que puede ser explicado porque comparten un mismo receptor. La pleiotropa es otra caracterstica funcional de las citocinas ya que algunas realizan mltiples funciones diferentes en distintos tipos celulares. El empleo de varias rutas de sealizacin as como la activacin de mltiples cinasas y factores de transcripcin que tiene lugar como consecuencia de la unin de las citocinas a sus receptores puede explicar la diversidad funcional de las mismas. RECEPTORES SOLUBLES Adems de existir como protenas de membrana, muchos receptores de citocinas son sintetizados como protenas solubles. La existencia de estos receptores ha modificado en gran manera el conocimiento sobre la interaccin citocina-receptor y la regulacin de las distintas funciones de las citocinas. A nivel molecular, los mecanismos ms comunes de generacin de las formas solubles de los receptores son la rotura proteoltica del receptor expresado en la membrana y el procesamiento alternativo del ARNm.

El receptor soluble del CNTF (sCNTFR) se forma por un mecanismo de rotura lipdica y en el caso de la forma soluble del receptor de la IL-6 (sIL-6R), no se conoce su mecanismo de generacin. Los receptores solubles pueden ejercer varios efectos biolgicos (Figura 9.10) si bien el ms comn es el de antagonistas de su receptor equivalente en la membrana mediante competicin por la unin con el ligando para prevenir la sealizacin al interior de la clula. Receptores solubles de este tipo son, por ejemplo, los de la IL-1, IL-4 y TNF-alfa ya que producen una inhibicin dosis dependiente de la funcin del receptor de membrana. Cuando los receptores solubles se generan por protelisis de los receptores de membrana, disminuye el nmero de receptores funcionales a los que se puede unir la citocina en la superficie celular y por tanto, tambin se produce una inhibicin en la sealizacin al interior de la clula.

Quimiocinas y sus receptores

Su nombre proviene de citocinas quimiotcticas debido a que muchas de ellas poseen propiedades quimioatrayentes, regulando el trasvase de leucocitos hacia rganos y tejidos. Las quimiocinas secretadas se unen a proteoglicanos y a protenas de la matriz extracelular donde se cree permanecen inmovilizadas sin pasar a la circulacin. Esta capacidad de unin a la matriz extracelular favorece la permanencia de las quimiocinas en su lugar de produccin y apoya el concepto de que la migracin de los leucocitos se realiza a travs de un gradiente slido. La caracterstica bioqumica comn de estas molculas es la conservacin de 4 residuos de cistena que se unen formando dos puentes disulfuro, esenciales para la actividad de la molcula. Dependiendo de si las dos primeras cistenas estn o no separadas por otro aminocido se han clasificado en quimiocinas CXC (cis-X-cis), y quimiocinas CC (cis-cis). Algunas quimiocinas CC son tambin potentes atrayentes de eosinfilos y basfilos e incluso, de clulas T de memoria, de tal forma que puede iniciar una respuesta inflamatoria como consecuencia de una respuesta inmune especfica. Hasta el momento actual se han descrito ms de 40 molculas de quimiocinas, que agrupadas en las dos grandes familias, CXC y CC. Hay otras 2 quimiocinas, la linfotactina y la fractalkina, que pertenecen a otras subfamilias por tener caractersticas bioqumicas diferentes. La molcula ms representativa de la familia CXC es la IL-8 (CXCL8). Es sintetizada por todos los tipos de leucocitos, as como por otros muchos tipos celulares. La primera actividad biolgica descrita fue la activacin de neutrfilos, en los que induca degranulacin, cambios morfolgicos y quimiotaxis En general, las quimiocinas CXC son potentes quimioatrayentes para neutrfilos mientras que las CC atraen ms eficientemente a los monocitos. En resumen podemos decir que las quimiocinas: -Son "como" citocinas quimiotcticas, pequeas -Favorecen el movimiento celular atrayendo clulas -Poseen cistenas y pueden ser de dos familias:

* Familia CXC como la IL-8 que atrae a neutrfilos, linfocitos y otros (CXCL1, CXCL2 y otras) * Familia CC que atrae monocitos y otros. (CCL1, CCL2, etc.) Estas molculas ejercen su funcin unindose a receptores celulares que, a diferencia de la citocinas, no son especficos para cada molcula, pudiendo el mismo receptor unir diferentes quimiocinas. Receptores de quimiocinas Actualmente se han clonado muchos de los receptores de quimiocinas, habindose comprobado que presentan una estructura similar a los receptores de la familia de la rodopsina. Dentro de esta familia de receptores, se pueden distinguir los receptores especficos y los compartidos segn su especificidad de unin con el ligando. Los especficos unen un ligando en concreto siendo el ejemplo ms representativo el IL-8RA o CXCR1 que nicamente une a IL-8. Por el contrario, los receptores compartidos pueden unir a ms de una quimiocina del tipo CXC o a ms de una quimiocina del tipo CC. La sealizacin de los receptores de quimiocinas est mediada por protenas G asociadas a su extremo carboxiterminal. Estas protenas se encuentran localizadas en la cara interna de la membrana citoplasmtica y catalizan el intercambio de GDP por GTP producindose la activacin de muchas enzimas citoplasmticas y, en ltimo trmino, la activacin de factores de transcripcin.

INMUNOLOGA GENERAL 2 Medicina

Comunicacin Intercelular
Citocinas y Receptores
Promueven proliferacin Promueven activacin y diferenciacin Regulan respuestas

16.-Molculas implicadas en la comunicacin inter-celular

(Citocinas y Receptores)

Molculas adhesin
Promueven adhesin estable Sealizacin

A. Corell UVA

Indice de contenidos del Tema 16 Molculas implicadas en la comunicacin intercelular: Citocinas y sus receptores
16.1 16.2 Citocinas: estructura bsica, propiedades y nomenclatura Los receptores de citocinas: -familias Principales funciones de las citocinas: -accin autocrina, paracrina y endocrina -mediadores de la inmunidad innata y de la inflamacin -quimiotaxis -activacin, proliferacin, diferenciacin, y muerte de linfocitos -hematopoyesis La Red de Citocinas

Citocinas y Receptores
Las complejas interacciones entre clulas inmunocompetentes, clulas inflamatorias y clulas hematopoyticas son posibles gracias a un grupo de protenas denominadas colectivamente como CITOCINAS (debido a su papel en la comunicacin clula a clula). CITOCINA: cualquier protena o glicoprotena secretada por las clulas inmunocompetentes, de bajo peso molecular (normalmente menos de 30 Kd) que a travs de su interaccin con receptores de superficie celular, regula el desarrollo o la funcin de otra clula. El trmino citocina agrupa a aquellas molculas secretadas por linfocitos (linfocinas) o a las secretadas por monocitos y macrfagos (monocinas). Muchas citocinas se denominan interleucinas (IL) haciendo referencia a que son secretadas por leucocitos y actan sobre otros leucocitos. Se han identificado al menos las IL-1 a IL-25. Algunas citocinas se denominan atendiendo a su funcin como interferones (cuando interfieren en las infecciones virales), hematopoyetinas (si intervienen en pasos de la hematopoyesis), factores de crecimiento y transformacin o quimiocinas (si tienen propiedades quimiotcticas) El trmino citocina es no obstante el ms general, y el preferido para denominarlas en su conjunto.

16.3

16.4

Propiedades de las Citocinas

Las citocinas se unen a receptores especficos en las clulas diana e inician cascadas de transduccin de seales que inducen cambios en la expresin gnica de dichas clulas. En general, las citocinas y sus receptores tienen gran afinidad el uno por el otro, con constantes de disociacin que oscilan entre 10-10 y 10-12 M. Por lo tanto, las citocinas pueden mediar su efecto biolgico a concentraciones picomolares.

Efectos de las Citocinas

Las citocinas tienen los siguientes efectos: pleiotropismo, redundancia, sinergia, antagonismo e induccin en cascada. Estas caractersticas les permiten regular la actividad celular de modo coordinado e interactivo. Pleiotropismo: una determinada citocina tiene diferentes efectos biolgicos en diferentes clulas diana Redundancia: Dos o ms citocinas tienen efectos / funciones similares. Esto hace dificil asignar un determinado efecto a una sla citocina. Esto es particularmente cierto con las quimiocinas.

Propiedades de las Citocinas

Las citocinas pueden tener funcin autocrina (cuando actan sobre la misma clula que las secret, como sucede con IL-2). Las citocinas pueden tener funcin paracrina (la clula diana esta en la proximidad de la clula que la secret). Pero tambin las citocinas pueden tener accin endocrina (cuando actan sobre clulas a distancia) Las citocinas siempre interaccionan con sus clulas diana a travs de receptores de superficie especficos.

Efectos de las Citocinas

Efecto aditivo: el efecto de 2 determinadas citocinas juntas es igual a la suma de los efectos individuales de cada una de ellas. Sinergia: el efecto de 2 determinadas citocinas juntas excede el efecto aditivo de los efectos individuales. Antagonismo: el efecto de una segunda citocina, anula o revierte el efecto de la primera.

Efectos de las Citocinas

INDUCCIN EN CASCADA: algunas citocinas importantes inducen un efecto en pirmide, una cascada de secreccin de distintas citocinas. As, la accin de una citocina en su clula diana, hace que esta clula secrete una o ms citocinas, que de nuevo al actuar en sus clulas diana, inducen la secrecin de nuevas citocinas. 2 ejemplos de esta induccin en cascada son el Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y la interleucina 1, que si se producen de modo sistmico provocan la ruptura de la homeostasis y conducen al shock sptico.

Regulacin de los efectos de las Citocinas

Hay principalmente 3 factores que regulan la accin de las citocinas durante la respuesta inmune y que los efectos no tengan repercusiones inespecficas: La expresin de los receptores en las clulas diana slo se produce tras la activacin por el antgeno. Hay un requerimiento de interaccin directa en algunos casos entre la clula productora de la citocina y su clula diana. As se asegura que el gradiente efectivo de concentracin slo se d en el microentorno local. La vida media de estas molculas en los fluidos corporales, es habitualmente muy corta.

Familias de Receptores de Citocinas

Las citocinas se deben unir a sus receptores especficos para ejercer su funcin biolgica. Hay 6 familias de recetores de citocinas: 1. Receptores de la familia de las hematopoyetinas (o receptores de citocinas tipo I) 2. Receptores de la familia de los interferones (o receptores de citocinas tipo II) 3. Receptores de la superfamilia de las Inmunoglobulinas 4. Receptores de la familia del TNF 5. Receptores de la familia del TGF 6. Receptores de la familia de quimiocinas En general (especialmente los receptores de citocinas tipo I y II), los receptores de citocinas constan de mltiples dominios o mltiples subunidades (de las cuales una confiere la especificidad del receptor por su ligando y otras son responsables de la transduccin de seales al interior celular.

Sin motivo WSXWS

Multiples miembros de la subfamilia de receptores de IL2, comparten una cadena J de transduccin de seales (cadena gamma comn). Los receptores de IL-2 e IL-15 son heterotrmeros donde las cadenas de transduccin son E y J.

Las combinaciones de diferentes cadenas de los receptores regulan la afinidad del receptor por su ligando, como ocurre con el receptor de IL-2. El receptor de IL2 (IL-2R) existe en 3 formas que exhiben diferente afinidad por la IL2. La cadena alfa solo se expresa en las clulas T activadas, y el heterotrmero D EJ es la forma de mxima afinidad.

Los receptores de citocinas tipo I y II se asocian a protenas kinasas Jak para transducir seales al interior celular, y finalmente activan a los factores de transcripcin STAT.

CUL ES EL PAPEL DE LAS CITOCINAS EN LA ENDOMETRIOSIS? El sistema inmune est constituido por una serie de lneas celulares relacionadas entre s y comunicadas directamente mediante contacto clula-clula, y de forma indirecta a travs de molculas, factores solubles, que se liberan y funcionan como hormonas actuando de transmisores intercelulares. Estas molculas reciben el nombre de linfocinas, interleucinas o citocinas, y son los que producen la expansin y la diferenciacin de las clulas estimuladas por el antgeno. Se entiende por citocina a cualquier mensajero de tipo hormonal intercelular. Linfocina es una citocina producida por una clula del sistema inmune. Tanto stas como las anteriores reciben el nombre en funcin de la actividad que desarrollan. El trmino interleucina se reserva a aquellas linfocinas cuya secuencia de aminocidos es conocida. Las citocinas son protenas o glicoprotenas secretadas por linfocitos (linfocinas) o monocitos (monocinas), que afectan a la divisin celular, diferenciacin, metabolismo, motilidad y a las funciones efectoras del sistema inmune. Las citocinas ejercen sus funciones biolgicas a travs de receptores especficos y a muy corta distancia del lugar de la secrecin. Ejercen un efecto paracrino sobre las clulas vecinas de la clula secretora, y muchas veces ejercen un efecto autocrino sobre la propia clula secretora. Tambin se han observado funciones de retrocontrol sobre su propia produccin. Su funcin es pleiotrpica pues sus receptores estn presentes mltiples tipos celulares y cada clula puede interpretar la seal de forma diferente, dando lugar a la gran variedad de funciones. Por ello muchas citocinas tienen efectos redundantes actuando a travs de diferentes receptores y al mismo tiempo algunas citocinas pueden sinergizar o antagonizar sus actividades. IL-1 La IL-1 fue descrita en 1972 por Gery (1) como un factor soluble que promova la proliferacin de los timocitos. Est producida esencialmente por macrfagos, clulas dendrticas, clulas de Langerhans, pero tambin la producen mltiples tipos celulares tanto normales como cancerosos. Su sntesis se produce en respuesta a una amplia variedad de estmulos: lipopolisacridos bacterianos, inmunocomplejos, linfocitos T activados, levaduras, virus, lectinas. Es el prototipo de citocina multifuncional, acta sobre casi todos los tipos celulares y con frecuencia junto con otras citocinas o con pequeos mediadores. Es altamente inflamatoria, y hay un margen estrecho entre el beneficio clnico de su uso en humanos y la posibilidad de toxicidad. Los agentes que reducen su produccin y su actividad son ampliamente utilizados en la clnica. Es un regulador de los procesos de diferenciacin celular ralentizando sus procesos de envejecimiento (2). As mismo, en el epitelio tmico induce la expresin de CD25 y la maduracin de los timocitos. Su internalizacin se correlaciona con el incremento de las seales de transduccin (3). Estimula la proliferacin de timocitos, la sntesis de otras citocinas, el crecimiento de clulas TH2, que producen sobre todo IL-4, IL-5 e IL-6. Su combinacin con TNF- aumenta la actividad citotxica de los macrfagos. Induce fiebre, somnolencia, liberacin de ACTH, sntesis heptica de protenas de fase aguda. Es un neuromodulador de secreciones endocrinas. Aumenta la adherencia de clulas endoteliales a leucocitos. Induce la liberacin de prostaglandinas y PDGF. Es un cofactor del Factor estimulador de colonias y un factor de reabsorcin sea por los osteoclastos. Estimula la expresin de ARNm de IL-8.

Se ha observado la presencia de IL-1 en el tejido endometritico (4) y en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis (5), implicndola en el crecimiento del implante, ya que estimula la proliferacin de las clulas endometriales. El tratamiento in vitro con Il-1, de clulas de pacientes con endometriosis, aumenta la adhesin de clulas endometriales a laminina y fibronectina de la membrana basal (6).

IL-2 La IL-2 fue denominada como Factor de crecimiento de los linfocitos T humanos (TCGF). Es secretada principalmente por linfocitos T CD4+ tras estimulacin con antgenos y por linfocitos T CD8+ tras la estimulacin mitognica o con aloantgenos. Los timocitos medulares y los linfocitos grandes granulares tambin son capaces de sintetizarla. El receptor para IL-2 est implicado en la proliferacin celular neoplsica por autoestimulacin. Los macrfagos secretan IL-1 e IL-6 y presentan determinantes antignicos asociados a las molculas de HLA. Los linfocitos T especficos para el antgeno reciben el estmulo antignico y el estmulo de la IL-1 y/o IL-6 (7), como respuesta sintetizan IL-2 y el receptor para IL-2, estimulndose de forma autocrina y entrando en proliferacin. La seal antignica induce al linfocito T a pasar de la fase G0 a G1 del ciclo celular y el estmulo de la IL-2 sobre su propio receptor induce el paso de la fase G1 a la fase S. La interaccin de la IL-2 con su receptor en los linfocitos B induce la sntesis de ARNm de la cadena y del fragmento J de la IgM. La sntesis de IL-2 es inhibida por ciclosporina y glucocorticoides. Si bien algunos autores han descrito un aumento de IL-2 en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis (8), otros autores descartan su implicacin en esta patologa al no hallar cambios en la expresin de ARNm ni de la protena, tanto en suero como en lquido peritoneal (4, 9).

IL-4 La IL-4 fue denominada BSF-1 (Factor estimulador de linfocitos B 1) o BCGF-1 (Factor de crecimiento de clulas B 1). Es producida por linfocitos CD4 tipo Th2 tras la activacin por antgenos. Igualmente es producida por mastocitos tras la unin a IgE. Incrementa la densidad de molcula HLA de clase II, de receptores para el Fc de la IgE. Promueve el paso de clulas pre-B a clulas B maduras y posteriormente activa a stas (10). Si bien est implicada en el cambio de IgM a IgG1 o IgE, se necesitan otras seales como IL-5 o interacciones B-T para que el cambio sea efectivo. Inhibe muchos de los efectos del INF-, y ste inhibe a su vez los efectos de la IL-4. Induce la proliferacin de clulas T (11). Sinergiza con la IL-3 en el crecimiento de los mastocitos y de las stem cell (12). Aumenta la fagocitosis de los neutrfilos y disminuye la produccin de IL-1 y TNF. Aumenta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Juega un papel importante en la induccin de la tolerancia. En la endometriosis hay una reducida respuesta inmune celular, dada la relativa inactividad de las citocinas tipo Th1 (IL-2 e IFN-) y Th2 (IL-4 e IL-6) (4). No se observa presencia de ARNm para IL-4 en lquido peritoneal (13) ni en tejido endometitico (4). Sin embargo se ha descrito que las clulas obtenidas de lquido peritoneal, son capaces de producir IL-4 in vitro (9).

IL-6 La IL-6 est producida por linfocitos T, linfocitos B, macrfagos y muchos otros tipos celulares (14). Su produccin est estimulada por mltiples mecanismos, como: infecciones virales, productos

bacterianos, polinucletidos sintticos, IL-1 y TNF (15). Juega un papel importante en la respuesta inmune y en la respuesta inflamatoria y en la osteoporosis postmenopusica (16). Es un potente promotor del crecimiento y diferenciacin de los linfocitos B. En ausencia de IL-6 las clulas permanecen en la fase G1 del ciclo celular. La mayora de los mielomas crecen debido a la presencia de IL-6 (17). Sinergiza con la IL-1 en la proliferacin de timocitos inmaduros y en la activacin y proliferacin de linfocitos T maduros. Aumenta la citotoxicidad al aumentar la sensibilidad a IL-2. Sinergiza con la IL-3 y GM-CSF en la diferenciacin de las clulas hematopoyticas inmaduras. Sola o en conjuncin con IL-1 y/o TNF induce protenas de fase aguda, ello va acompaado de leucocitosis, fiebre, incremento de la permeabilidad vascular y concentraciones alteradas de metales y hormonas esteroideas en suero. Se han descrito niveles elevados en suero en la enfermedad de Castleman. En la artritis reumatoide hay niveles elevados de IL-6 en el lquido sinovial. En la glomerulonefritis proliferativa mesangial se produce IL-6 en el mesangio renal y se excretan elevadas cantidades de IL-6 por orina (18). As mismo, se hay niveles elevados de IL-6 en el adenocarcinoma renal (19) y en la enfermedad de Behet. Tanto las clulas estromales del endometrio normal como del tejido endometritico producen expresan ARNm para IL-6, si bien en las primeras su expresin gnica est alterada (20). Su actividad es dependiente de la presencia de IL-1 (21, 22). Se ha descrito la presencia de IL-6 en el suero y en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis y se ha relacionado esta presencia con la infertilidad de stas mujeres (23). Puesto que la IL-6 es un factor angiognico, se le ha implicado en el crecimiento del implante endometritico (24, 25, 26). Se ha observado una produccin espontnea elevada por monocitos, que puede estar relacionada con la activacin policlonal de linfocitos B productores de autoanticuerpos en la endometriosis (27).

IL-8 La IL-8 fue descrita como un producto liberado por monocito/macrfagos (28). Los monocito/macrfagos producen IL-8 en respuesta a mltiples estmulos como son IL-1, TNF-, lipopolisacridos bacterianos, steres de forbol y ARN. Pero hoy se sabe que la IL-8 est tambin producida por linfocitos T, macrfagos alveolares, neutrfilos, linfocitos grandes granulares, clulas endoteliales y queratinocitos. Forma parte de la familia de las intercrinas- (29). La IL-8 es un potente factor quimiotctico para los neutrfilos incluso a concentraciones muy bajas (30). Comparativamente es tan activo como el C5a y ms potente que el factor de activacin de las plaquetas o los leucotrienos. La IL-8 tambin es quimiotctica para linfocitos T y basfilos, pero no acta sobre monocitos ni sobre eosinfilos. Adems de su capacidad quimiotctica, estimula la liberacin de histamina por los basfilos, favorece la adhesin de los neutrfilos a las clulas endoteliales, es un promotor de la angiognesis, y logra vascularizar tejidos normalmente avasculares como la crnea. La IL++ 8 al unirse a su receptor induce un rpido aumento de la concentracin de Ca intracelular y activa a la protein quinasa C. Tiene un papel central en las inflamaciones agudas, habindose observado altas concentraciones de esta citocina en la dermatitis atpica, en las lesiones psorisicas (31), en el lquido sinovial de las artritis reumatoides (32) y en el lavado broncoalveolar de las fibrosis pulmonares idiopticas. La adhesin de clulas estromales a la matriz extracelular induce la expresin de IL-8 y a su vez la IL-8 estimula la adhesin de las clulas estromales endometriticas (33, 34) y endometriticas (35), actuando como un factor autocrino, favoreciendo el crecimiento del implante (35, 36), especialmente en las endometriosis avanzadas (25, 37) y se la relaciona con el tamao y la actividad de la lesin (35,38), si bien tambin existe IL-8 en el tejido ovrico normal (4). Los macrfagos peritoneales, de

mujeres con endometriosis, estimulados in vitro liberan elevadas cantidades de IL-8, lo que puede contribuir a la movilizacin y reclutamiento de clulas inflamatorias de la circulacin sangunea hacia la cavidad peritoneal (27, 39). La presencia de esta citocina en los fluidos csticos se relaciona con la angiognesis, favoreciendo la progresin y el mantenimiento de los quistes (40).

IL-10 La IL-10 est producida por linfocitos T, linfocitos B activados, linfomas B, algunas clulas del linfoma de Burkitt, monocito/macrfagos y queratinocitos (41). Se describi como un factor inhibidor de la sntesis de citocinas (42). Inhibe la proliferacin de linfocitos T ante estmulos mitognicos. Acta como un factor quimiotctico para los linfocitos CD8 (43). Aumenta la proliferacin de los linfocitos B e induce la diferenciacin de stos a clulas plasmticas productoras de IgG o IgA (44). Reduce la expresin de las molculas de histocompatibilidad de clase II en las clulas presentadoras de antgeno (45), y tambin reduce la expresin de molculas accesorias necesarias para la activacin de los linfocitos T. Est aumentada en infecciones por Schistosoma, Leishmania, Toxoplasma y Lepra lepromatosa. La IL-10 se halla elevada en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis (46) ya que los monocitos peritoneales son capaces de producirla (47). La presencia de ARNm de IL-10 en el tejido endometritico (4) se relaciona con la capacidad de ste para crecer y diferenciarse y al mismo tiempo regula la sntesis de citocinas limitando la reaccin inflamatoria peritoneal (47).

IL-12 La IL-12 fue descrita como un factor estimulador de las clulas NK. Est producida por linfocitos B activados (48) y por linfocitos estimulados con S. aureus Cowan I o transformados por el virus de Epstein Barr. Induce la proliferacin de los linfocitos T estimulados con lectinas o con CD3. Estimula la proliferacin, citotoxicidad y liberacin de INF- por clulas NK (49) y linfocitos T citotxicos (50). Es un antagonista de la IL-4 en la induccin de la produccin de IgE (51). Mediante la induccin de la secrecin de IL-4 inhibe la funcin de las clulas Th2 (52). En combinacin con otras citocinas promueve el crecimiento y supervivencia de las clulas progenitoras hematopoyticas (53). Se ha descrito un aumento de esta citocina en el lquido peritoneal de las mujeres con endometriosis (46, 47), si bien hay cierta controversia. Aunque la IL-2 estimula la actividad NK, esta actividad est disminuida en el lquido peritoneal de las endometriosis (54) probablemente por liberacin de la subunidad p40 de la IL-12, permitiendo migrar a las clulas endometriticas hacia lugares ectpicos (55). Cuando a ratones se les inyecta IL-12 completa (subunidades p35 y p40) de forma intraperitoneal se consigue una disminucin del tamao y rea de las lesiones (56).

IL-13 La IL-13 es similar a la IL-4 (57), est producida por linfocitos T estimulados. Inhibe la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Promueve la diferenciacin B y el cambio de isotipo a IgG4 e IgE (58). Aumenta la expresin los antgenos de histocompatibilidad. Aumenta la capacidad presentadora de antgenos por parte de los monocitos. Suprime la sntesis de IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF, G-CSF y GM-CSF (57, 59). Est disminuida en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis, si bien las clulas del endometrio ectpico son capaces de producirla (60) inhibiendo la sntesis de citocinas proinflamatorias.

IL-17 Se ha definido como una citocina reguladora de la produccin de xido ntrico (61), est producida por linfocitos T que estimulan a clulas estromales y macrfagos para producir citocinas proinflamatorias (62). Promueve la diferenciacin de clulas dendrticas. Estimula a muchos tejidos para liberar IL-6, IL-8 (63, 64) y aumenta la expresin de molculas de adhesin (65). La IL-4 e IL-13 inhiben a esta citocina (66).

Endometriosis La endometriosis es un conjunto de enfermedades que afectan a la mujer durante sus poca reproductiva. En la endometriosis existe tejido similar al endometrio fuera del tero, localizado en otras reas corporales, siendo la ms frecuente, el abdomen. Este forma adhesiones, sangrado intestinal u obstruccin. El sntoma ms frecuente es un dolor intenso, anterior y durante el perodo, sin relacin con el tamao o el estado de la enfermedad. Alrededor del 30-40% de las mujeres con endometriosis son infrtiles (67). El origen de la endometriosis es desconocido, habindose establecido diversas teoras (68,69). Muchos autores, han sugerido que el sistema inmune est implicado en su origen y/o en el progreso del proceso (70,71).

Citocinas y endometriosis Los macrfagos de la cavidad peritoneal estn encargados de eliminar las clulas viejas o daadas. Los macrfagos presentes en el lquido peritoneal de mujeres con endometriosis secretan una mayor cantidad de los de las mujeres sanas de IL-1 y TNF- (5,72). Estas citocinas proinflamatorias que, adems de activar leucocitos, inducen la secrecin de IL-6 que estimula el crecimiento y diferenciacin de clulas inmunocompetentes. Tanto en sangre perifrica como en lquido peritoneal de mujeres con endometriosis, se ha observado un aumento de IL-10 y una disminucin de IL-2 (9,46) indicando que el aumento de clulas Th2 induce una disminucin de clulas Th1, si bien estos resultados no han sido confirmados por otros autores (60). Curiosamente se ha descrito la disminucin de la produccin de IL-13 en lquido peritoneal, citocina producida por linfocitos Th2 y que inhibe la capacidad de los macrfagos para sintetizar citocinas proinflamatorias. Estn descritos aumentos en la produccin de IL-8, IL-1 e IL-6, tanto in vitro como in vivo por parte de los macrfagos de estas pacientes. La primera induce la proliferacin de clulas del estroma endometrial (38,73) y las dos ltimas la inhiben (74,75). Se ha descrito que anticuerpos anti-IL8 podran eliminar la IL-8 libre en sangre, y esta eliminacin de la IL-8 tericamente sobrante, podra ser til en enfermedades inflamatorias en las que se observa un aumento de esta citocina (76,77). Las quimiocinas, entre las que se incluye la IL-8, tienen actividades muy selectivas por lo que su uso a nivel teraputico (78) puede ser interesante, sin embargo su inhibicin podra producir efectos secundarios indeseados. Algunos autores han propuesto que protenas solubles liberadas por clulas endometriticas son capaces de inhibir la proliferacin de clulas linfoides (79). Los pacientes con endometriosis tienen una disminucin de la actividad NK, especialmente en estadios avanzados. Esta actividad se restaura, in vitro, tratando estas clulas con IL-2, por lo que se plantea si el tratamiento de pacientes con IL-2 junto con la terapia convencional puede restablecer la

actividad inmune normal o, cuando menos, hacer desaparecer las condiciones inmunes que permiten el mantenimiento y/o la progresin de la enfermedad (80).

Tema 06. Trfico de leucocitos

En condiciones fisiolgicas, los leucocitos que se encuentran en el torrente sanguneo, el tejido linfoide secundario y otros tejidos no permanecen en esos sitios indefinidamente sino que en forma constante migran hacia otros lugares y rganos. El patrn de migracin de los leucocitos no es aleatorio sino que est condicionado por el tipo de clulas leucocitarias. Los linfocitos suelen recircular contantemente mientras que los neutrfilos no presentan el fenmeno de recirculacin, sino que una vez que son liberados desde la mdula sea emigran generalmente al bazo. Sin embargo la dinmica del trfico de neutrfilos, monocitos y linfocitos es distinta cuando aparece un foco inflamatorio local como consecuencia de una invasin bacteriana o incluso como consecuencia de una agresin fsica. En este caso la movilidad celular se centra en abastecer de leucocitos al tejido donde est ocurriendo dicho proceso inflamatorio lo que implica una nueva situacin en lo que a las molculas de adhesin y quimiocinas, se refiere. Estudiaremos el trfico de leucocitos en dos situaciones distintas. Una es la fisiolgica o lo que lo mismo en circunstancias normales y la otra el trafico de estos leucocitos tras la aparicin de un foco inflamatorio local con lo cual se redirige el trafico de leucocitos hacia ese foco. Tanto en un caso como en el otro intervienen una serie de elementos entre los que participan las molculas de adherencia, quimiocinas y opsoninas y otros factores. Para ello en primer lugar analizaremos las molculas de adhesin mientras que las quimiocinas ya fueron estudiadas en captulos anteriores.

Molculas adhesin
El fenmeno de la adhesin de unas clulas con otras y de clulas con componentes de la matriz extracelular son fenmenos que tienen un papel clave en la organizacin de los componentes del sistema inmune y en general de los seres vivos multicelulares. La interaccin funcional de unos linfocitos con otros y su migracin dependen de molculas que se expresan en la membrana celular y que permiten la adhesin reversible y selectiva de los diversos elementos celulares entre s y de stos con los componentes de la matriz extracelular. En concreto, las molculas de adhesin celular tienen un papel esencial en la fisiologa de las clulas inmunes permitiendo la interaccin de unos leucocitos con:

Otros leucocitos, haciendo posible la comunicacin intercelular, fenmeno indispensable en la generacin de la respuesta inmune y en los fenmenos de citotoxicidad y que no trataremos este captulo por haber sido extensamente tratados en captulos anteriores. Con endotelios vasculares, fenmeno indispensable para la extravasacin de estas clulas y Con la matriz extracelular que es un fenmeno esencial en la migracin a travs de los tejidos de leucocitos hacia los sitios de inflamacin. En la (Figura 8.1) se muestra una imagen de linfocitos adheridos a endotelio vascular y en la (Figura 8.2) un esquema de las tres

situaciones arriba indicadas de adherencia intercelular, leucocito unido a endotelios y leucocitos unido a fibrolectina en un tejido.

Las molculas de adhesin celular son muy variadas y se agrupan en cuatro familias principales. Estas son: Familia de las selectinas Familia de las integrinas Superfamilia de las inmunoglobulinas y Mucinas

Selectinas. Estas molculas son necesarias para la migracin de los linfocitos a los ndulos linfoides perifricos durante la circulacin linfocitaria y median la adhesin de leucocitos a las clulas endoteliales activadas durante los procesos inflamatorios (Figura 8.3) Las selectinas poseen una un dominio tipo lectina en su extremo distal, que le permite unirse a carbohidratos tales como ciertas mucinas (Tabla 8.1) Hay tres tipos con una distribucin muy caracterstica: Selectina L (CD62L), presentes en leucocitos Selectina P (CD62P), presentes en plaquetas activadas y Selectina E (CD62E), presentes en endotelios activados

Integrinas Esta familia comprende a un grupo amplio de molculas heterodimricas constituidas por dos subunidades polipeptdicas transmembranales, alfa y beta (Figura 8.4) Las diferentes subfamilias de integrinas se forman de acuerdo a la cadena beta que poseen, la cual puede asociarse con diferentes cadenas alfa. Las principales son: 1Las integrinas beta-1, que se expresan en la mayor parte de las clulas del organismo, con excepcin de los granulocitos. Incrementan su expresin das despus de que estas clulas se han activado; por esta razn, se les conoce como pro antgenos de activacin tarda de linfocitos (VLA) (Tabla 8.2) 2Las integrinas beta-2 se denominan tambin integrinas leucocitarias debido a que se expresan en granulocitos y monocitos y a veces en linfocitos como es el caso de las molculas LFA-1 (Tabla 8.3)

3- Las integrinas beta-7 se expresan principalmente en linfocitos que se localizan en las placas de Peyer, lmina propia y el epitelio intestinal. La activacin de las integrinas est asociada a su gran movilidad sobre la membrana celular, lo que le permite formar agrupamientos que facilitan su funcin adhesiva y su capacidad transmisora de seales al interior celular. Las integrinas interaccionan a nivel intracelular con protenas del citoesqueleto (como la actina y talina) para integrar la informacin del medio extracelular con la actividad de la clula, accin de la cual se deriva su nombre.

Superfamilia de inmunoglobulinas. Algunos miembros de la superfamilia de las Igs, tales como ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y PECAM, estn implicados en fenmenos de adhesin de leucocitos a clulas endoteliales y su migracin (Tabla 8.4). El receptor de adhesin ICAM-1 inter- viene adems en fenmenos de coestimulacin de clulas inmunes y de adhesin entre leucocitos y entre stos y clulas diana en fenmenos de citotoxicidad (Figura 8.5)

Trfico en normalidad
El patrn de migracin de Los leucocitos en situacin normal esto es en ausencia de proceso inflamatorio est muy bien estudiado. Se sabe que es un proceso no aleatorio sino que est condicionado por mltiples factores y circunstancias. Entre estos hay que considerar el tipo de clulas leucocitarias, los estmulos antignicos recibidos en cada momento y el grado de activacin. En general los linfocitos maduros que abandonan el timo (linfocitos T) o la mdula (linfocitos B) migran hacia los ganglios linfticos y bazo en donde se almacena transitoriamente. Sin embargo pronto retornan al torrente circulatorio y retornan a l en forma repetida. Este fenmeno se conoce como recirculacin (homing) de linfocitos y es consecuencia, principalmente, de la expresin diferencial de molculas de adhesin en los linfocitos y el endotelio de los vasos sanguneos de los diferentes rganos en donde ocurre este fenmeno, as como de la presencia de quimiocinas y ciertas citocinas Contrariamente a los linfocitos, los neutrfilos no presentan el fenmeno de recirculacin, sino que una vez que son liberados desde la mdula sea emigran hacia focos inflamatorios en donde finalmente mueren. En condiciones de no inflamacin, generalmente los neutrfilos tienen como destino final el bazo, rgano en donde la circulacin sangunea es abierta y donde abundan los macrfagos que pueden eliminar sin los restos celulares como consecuencia de su muerte. Recirculacin de linfocitos vrgenes. Como se ha comentado anteriormente, los linfocitos memoria y los que no han sido estimulados previamente por el correspondiente antgeno (linfocitos vrgenes o naive) presentan un patrn de recirculacin diferente, as como una distinta expresin de molculas de adhesin. Los linfocitos de memoria muestran una expresin dos a tres veces mayores de LFA-1, integrinas 1 y CD44 en comparacin con los linfocitos vrgenes (Figura 8.6).

Los linfocitos vrgenes suelen fijarse en los ganglios en donde reciben el estmulo antignico y se trasformarn en linfocitos activados y despus en linfocito memoria. Este proceso de fijacin se hace a travs del endotelio que recubre las vnulas de los rganos linfoides secundarios. Este tejidos es ms alto (cuboidal) que el correspondiente a otros rganos con una diferencia que no solo es morfolgica, sino tambin funcional debido a que el endotelio cuboidal expresa algunas molculas de adhesin propias, que participan de forma importante en el fenmeno de autodireccin de linfocitos y que por esta razn se han denominado directinas o adresinas (addressins). Las principales directinas corresponden a ligandos de la selectina E (por ej. CLA) y a mucinas (CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1) que interaccionan con la selectina L y con la integrina alfa4/beta7. Una vez que han ocurrido las primeras fases de la interaccin linfocito-endotelio, la adhesin firme de estas clulas y extravasacin sigue una mecnica similar a la observada en condiciones de inflamacin, con la participacin preponderante de integrinas (LFA-1, 4/7) y sus ligandos (ICAM-1, ICAM-2, MadCAM-1) Recirculacin de linfocitos memoria. Los linfocitos memoria recirculan desde los rganos linfoides secundarios a tejidos no linfoides tales como la piel o la lmina propia intestinal. Los linfocitos que recirculan preferencialmente hacia la piel corresponden a clulas CD45Rpositivo, CD45RAnegativo que expresan el carbohidrato CLA, y muestran una densidad grande de la integrina VLA-4. Las clulas que migran en forma preferencial a la piel no permanecen ah largo tiempo, sino que, a travs de los vasos linfticos, migran de nuevo hacia los ganglios linfticos regionales y de ah, a travs del conducto torcico, alcanzan nuevamente el torrente sanguneo, completndose as un ciclo que se puede repetir en mltiples ocasiones.

Al igual que los linfocitos que recirculan a la piel, los linfocitos de memoria que migran selectivamente al intestino no permanecen en ese sitio indefinidamente sino que una proporcin importante de stos migran a los ganglios linfticos regionales y de ah el torrente sanguneo. En la (Figura 8.7) se muestra un esquema donde se representa la circulacin general linfoide y se hace especial mencin a la circulacin a travs de un ganglio y tambin a la microcirculacin.

Trfico en inflamacin
Ante un proceso inflamatorio el trfico de leucocitos es distinto al que se presenta en circunstancias normales. Bsicamente un gran contingente de estas clulas migra al foco inflamatorio a travs de un proceso preciso pero complejo. La inflamacin local consiste precisamente en la extravasacin de lquido y clulas hacia el lugar de la inflamacin, en donde ocurre, en mayor o menor grado, una lisis de clulas y destruccin de componentes de la matriz extracelular. La inflamacin puede ser aguda o crnica; en la primera, el infiltrado inflamatorio es a base principalmente de leucocitos neutrfilos, en tanto que en la segunda son principalmente linfocitos y monocitos. La extravasacin de leucocitos es un proceso en el que participan en forma concertada y secuencial diversas molculas de adhesin y citocinas que hacen posible el desarrollo de las siguientes fases: Interaccin y adhesin inicial de los leucocitos con el endotelio Rodamiento de leucocitos sobre el endotelio Activacin de los leucocitos Adhesin firme al endotelio y Extravasacin y migracin transendotelial a tejidos.

Como consecuencia, los leucocitos migran hacia otros tejidos y rganos abandonando el torrente sanguneo y/o retornan a l desde la periferia. En general el proceso es equivalente para neutrfilos, monocitos o linfocitos aunque es de destacar que las clulas que primero llegan al foco inflamatorio son lo neutrfilos.

Adhesin celular inicial. En condiciones fisiolgicas los leucocitos del torrente sanguneo pueden tener contacto con las clulas endoteliales, pero estos contactos son aleatorios, fugaces y no son consecuencia de la interaccin entre molculas de adhesin. En una condicin no fisiolgica, cuando se genera un foco inflamatorio en el intersticio, se producen diversas substancias (C5a, TNF, IL-1 entre otros) en ese sitio que inducen activacin de las clulas endoteliales de los vasos sanguneos regionales. Esta activacin endotelial resulta en la produccin de substancias quimiotcticas (por ej., IL-8), as como en la induccin de la expresin de molculas de adhesin, tales como las selectinas P y E, la molcula de adhesin intercelular-1 y el receptor de integrinas VCAM-1. La expresin de estas molculas, tiene como consecuencia que se incrementa la adherencia de las los leucocitos a las clulas endoteliales. De este modo, el contacto inicial entre ambas clulas no es ya aleatorio ni transitorio y resulta, por virtud de la energa cintica del leucocito circulante, en la segunda fase de la interaccin leucocito-endotelio, el rodamiento del leucocito sobre la clula endotelial (Figura 8.8). Rodamiento de leucocitos. El rodamiento de leucocitos sobre el endotelio activado es consecuencia de interacciones entre molculas de adhesin celular que son fcilmente reversibles y de una avidez tal que permiten que los leucocitos se desplacen sobre la superficie endotelial permaneciendo adheridos a la misma (Figura 8.9). Las molculas que permiten este tipo de interacciones son las mismas que intervienen en la interaccin inicial leucocito endotelio, principalmente las selectinas y sus ligandos. Activacin leucocitaria. En el foco inflamatorio se generan diversas substancias que poseen la capacidad de activar a leucocitos; estas substancias pueden ser exgenas (por ej. pptidos bacterianos formilados) o endgenos (por ejemplo. C5a, factor activador de plaquetas o leucotrieno B4). Tambin es esencial en esta fase la participacin de quimiocinas producidas por el endotelio que actuaran sobre los leucocitos ya en fase de rodamiento sobre el mismo endotelio.

Adhesin firme. El fenmeno de activacin leucocitaria es aparentemente muy rpido y resulta en la generacin de seales que inducen la activacin de las integrinas de la membrana (integrinas -2 en el caso de los neutrfilos e integrinas -1, -2 y -7 en el caso de los linfocitos); como ya se ha expuesto, la activacin de integrinas en la membrana resulta en un incremento significativo en su afinidad por sus ligandos, VCAM-1. Extravasacin y migracin en tejidos. La extravasacin de leucocitos y posterior migracin a travs del tejido implican que ocurran fenmenos de adhesin dinmicos que permitan simultneamente el movimiento de la clula y su adherencia. No se conoce con precisin el mecanismo de la extravasacin y migracin de leucocitos, pero las integrinas 4/1, 5/1 y LFA-1, as como las molculas CD44 y CD31 parecen estar involucradas. La migracin de los leucocitos en el intersticio de los tejidos est dirigida por la presencia de quimiocinas y la densidad de los ligandos de receptores de adhesin en el mismo; la direccin de migracin de los leucocitos est as determinada tanto por el gradiente de concentracin de la substancia que induce atraccin de las clulas (quimiotaxis) como por la regin del tejido que sea ms adhesiva para el leucocito (haptotaxis). Lo anterior resulta en la eficiente y rpida migracin de los leucocitos hacia el foco inflamatorio. Una vez que han ocurrido la extravasacin, los leucocitos inician un proceso de migracin con la participacin preponderante de integrinas (LFA-1, 4/7) y sus ligandos (ICAM-1, ICAM-2, MadCAM-1) (Figura 8.10). De lo anteriormente expuesto, se hace evidente que la migracin de clulas del torrente sanguneo hacia focos de inflamacin es un fenmeno en el que participan mltiples molculas, de adhesin, de atraccin y de activacin celular, las cuales participan en forma secuencial y concertada. En apariencia el sistema es redundante ya que, por ejemplo, existen varias selectinas o mltiples quimiocinas involucradas, pero es posible que sea necesaria la participacin de muchas molculas para que un organismo pueda regular tanto la calidad como la magnitud de un fenmeno inflamatorio, de tal modo que ste sea lo ms ventajoso posible desde el punto vista biolgico. Por todo lo anteriormente expuesto, se puede decir que la migracin de leucocitos del torrente sanguneo hacia diversos tejidos es un fenmeno que est finamente regulado por tres factores fundamentales: las molculas de adhesin expresadas por el leucocito, las expresadas por las clulas endoteliales y el tipo de factor activador/quimiotctico que se est produciendo en ese tejido. La conjuncin de estos tres factores determina el tipo de leucocito que hace la interaccin inicial y posteriormente el rodamiento, la activacin, la adhesin firme y la migracin transendotelial. La ausencia de uno de estos factores, por ej. la substancia quimiotctica, conducira a que fuese posible la

interaccin inicial y el rodamiento, pero no la adhesin firme, con la consecuente desunin del leucocito del endotelio. Asimismo, la ausencia de molculas que median la migracin transendotelial conducira a que fuesen posibles las cuatro primeras fases de la interaccin leucocito-endotelio, pero el resultado final de lo anterior sera tambin el desprendimiento del leucocito, an cuando hubiese ocurrido su firme adhesin al endotelio La ausencia o dficit de determinadas molculas de adhesin puede tener consecuencias patolgicas importantes relacionadas con defectos en el trfico de leucocitos y/o el proceso inflamatorio que puede conducir a predisposicin a padecer ciertas enfermedades infecciosas. Este es el caso del sndrome de deficiencia de adhesin leucocitaria tipo 2 (LAD tipo2).

INMUNOLOGA GENERAL 2006-2007

Tema 17. Molculas implicadas en la comunicacin intercelular: molculas de adhesin y sus ligandos
1. Las molculas de adhesin Estructura Familias: a) selectinas b) integrinas c) inmunoglobulinas d) diriginas (mucinas) 2. Funcin de las molculas de adhesin Adhesin a epitelios vasculares (modelo en 3 fases) Extravasacin y diapdesis Trfico leucocitario

Las molculas de adhesin son protenas de membrana que se expresan en leucocitos, clulas endoteliales, y matriz extracelular. Intervienen en el trfico (migracin selectiva), maduracin, activacin y funcin efectora de los leucocitos.

Bazo

Ganglios linfticos

Sangre

Mdula ses

Tejidos extralinfoides

rganos linfoides.

Trfico leucocitario.

Vas de recirculacin de linfocitos. Porcentaje de la reserva de linfocitos que circula hacia los distintos lugares; y tiempos de trnsito promedio

Rodamiento

Fase 1 Activacin

Fase 2 Adhesin firme

Fase 3 Migracin (extravasacin)

Migracin Subendotelial (diapdesis)

Familias de las molculas de adhesin y sus ligandos ms probables.

Diriginas/mucinas

Integrinas

Miembros de la superfamilia de las Integrinas -LFA-1 (Lymphocyte Function Associated Antigen) -Distintas subunidades D y E: E1 (CD29) VLAs E2 (CD18) o Integrinas leucocitarias

Miembros de la superfamilia de las Inmunoglobulinas -ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecules) -ICAM-2, ICAM-3 (CD58) -VCAM, NCAM, PECAM

Selectinas

Inmunoglobulinas

Adhesin a epitelios vasculares: modelo en 3 fases

Linfocito T inmaduro
neutrfilo

(a)

mucinas

Extravasacin de neutrfilos

Mucosa

Linfocitos T Efectores (maduros)

(b)

Piel

Perfiles de extravasacin distintos en tejidos linfoides secundarios (a) y terciarios (b) LFA-1

LFA-1

Tejido extralinfoide terciario

Extravasacin celular

Linfocitos atravesando la pared

Endotelio alto

Endotelio alto

Foco inflamatorio

Dao vascular
Mecanismos de lisis celular mediada por las clulas Tc efectoras.

Las integrinas favorecen la migracin a travs de la matriz extracelular

Activacin de linfocitos T y avidez de las molculas de adhesin por sus ligandos (que aumenta tras la activacin)

Tema 10. Sistema efector

Como parte del sistema inmune efector participan una serie de clulas con capacidad destructora bien de productos fagocitados o bien de otras clulas. Esencialmente este tipo de respuesta va dirigida a la destruccin de de grmenes o bien a la destruccin de las clulas del propio organismo invadidas por bacterias intracelulares o virus anulando as su ciclo vital y en consecuencia interfiriendo con la progresin de la infeccin. Esta es una de las manera de como el sistema inmune interviene eliminando el patgeno ya desde el inicio de su invasin al organismo con la intervencin de macrfagos, neutrfilos y clulas NK como parte de la respuesta efectora innata o mediante linfocitos T citotxicos y otras clulas como los linfocitos NKT. De estas clulas ya se han estudiado sus caractersticas bsicas y sus sistemas de reconocimiento y en su caso de activacin. En consecuencia en este capitulo nos limitaremos a estudiar los mecanismos que intervienen en la funcin ltica de las mismas. Ests son: Macrfagos y neutrfilos Linfocitos T citotxicos (CTL ), Clulas asesinas naturales (NK) y

Lisis por linfocitos y NK

Los linfocitos con capacidad citotxica ms destacada son los linfocitos T CD8+, tambin conocidos como linfocitos T citotxicos o CTL. El proceso citoltico de estas clulas se realiza por fases en las cuales intervienen diversos tipos de receptores y de factores citolticos, todo ello regulado de una manera muy precisa. Esta accin es de suma importancia destruyendo ciertas bacterias y virus una vez que estos se interiorizan en las propias clulas del organismo. Por ello, las principales etapas en las que se desarrolla el proceso de citolisis son: Fase de reconocimiento y activacin de las clulas a destruir. Para ello se produce interaccin entre clula efectora y blanco a travs de diferentes receptores de superficie con estructuras en la membrana de la diana al objeto de hacer posible su aproximacin o/y adhesin. As mismo, se produce tambin la interaccin de los receptores de superficie de tipo activador con sus ligandos lo que determina la transduccin de seales a la clula y activacin de la misma como fase preparatoria del proceso ltico que se desarrollar despus.

Fase ltica propiamente. Esta etapa que consiste en el proceso de lisis propiamente dicho de destruccin de la clula blanco. Como consecuencia de todo ello la clula diana experimenta una serie de cambios complejos

que conducen a su destruccin. Adems, se suele considerar una fase final de disociacin del contacto intercelular en el que la clula efectora se recuperara para iniciar un nuevo ciclo ltico, a la par que prosigue la destruccin de la clula diana (Figura 14.1). FASE DE RECONOCIMIENTO Y ACTIVACIN El proceso de reconocimiento y activacin es sustancial en la clulas T citotxicas de tal manera que hoy sabemos que estas clulas no poseen capacidad citotxica si previamente no se han activado adecuadamente. Es pues esencial que se produzca el reconocimiento de la clula efectora y de la diana y que se inicie el proceso de activacin para lo cual es necesario que intervengan diferentes molculas tanto en la clula efectora como en la clula dina (Figura 14.2). Este proceso ha sido extensamente estudiado en capitulo anteriores, pero a modo de resumen a continuacin se indican las molculas que intervienen y entre las que destacan, En primer lugar es necesario la participacin del complejo TCR/CD3 en la CTL y sus ligandos HLA clase I junto con el pptido correspondiente en la clula diana que propiciarn la seal de especificidad. Tambin es necesario la presencia de la molcula CD28 y su ligando CD80, en las clulas efectoras y diana respectivamente. Estas molculas proporcionarn el coestmulo necesario para el inicio de la transduccin de seales a la clula, complementando el efecto central de los receptores especficos Conjuntamente con las molculas anteriores, deben participar diferentes molculas de adhesin, tales como el LFA-1 y su ligando. Estas molculas se encargan de estabilizar el contacto intercelular al unirse a sus ligandos en la superficie de la clula diana, aumentando la avidez de la interaccin As mismo es necesario un incremento del nmero de receptores de citocinas, esencialmente de la IL-2 que propiciar las seales necesarias para la proliferacin celular. La mayora de los CTL se encuentran in vivo quiescentes, por lo que algunos autores los denominan como pre-CTL, y nicamente despliegan su capacidad funcional tras la activacin, en la que tiene un papel central la interleucina 2. As pues, el pleno desarrollo de la respuesta citotxica especfica requiere la participacin de linfocitos Th, que actuara como fuente de esta citocina. Una subpoblacin minoritaria de clulas T que expresa en su membrana receptores especficos para el Fc de la IgG de tipo III (FcgammaR-III), tambin conocidos como CD16, pueden aumentar en nmero como consecuencia del proceso de activacin. En aquellas situaciones en las que la IgG se halla unida especficamente al antgeno sobre la superficie de otra clula, el FcgammaR-III desencadena el proceso citoltico con la misma eficacia que el CD3/TCR, denominndose a este mecanismo citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC)

Como consecuencia de todas las interacciones celulares arriba indicadas, se producirn una serie de seales conducentes a la generacin de los segundos mensajeros, encargados de trasmitir al ncleo celular los cambios eventos ocurridos en la periferia del CTL. Estas seales han sido estudiadas en el captulo dedicado a activacin de los linfocitos y no se expondrn de nuevo en este apartado. Tras la interaccin con las clulas CTL y diana y la subsiguiente activacin de la primera, se evidencian en sta una serie de cambios que anteceden de manera inmediata al proceso de lisis que se desarrollar finalmente. Entre stos destacan:

la reorganizacin del citoesqueleto con localizacin del centro organizador de microtbulos (MTOC) y de los centriolos prximos a la zona de contacto intercelular, la polarizacin del aparato de Golgi y de los grnulos de secrecin en la misma zona y fusin de los grnulos con la membrana plasmtica y la subsiguiente exocitosis de su contenido al espacio intercelular. la secrecin de ciertas citocinas, particularmente IFN-gamma y TNF-alfa que son importantes mediadores de la citotoxicidad (Figura 14.3) al mismo tiempo se facilitar el aumento de expresin de la molcula Fas ligando (FasL) en las clulas efectoras. Esto permitir que despus sea posible su unin con las molculas Fas presentes en las clulas diana, lo que colaborar de manera esencial en el desarrollo del proceso ltico que estudiaremos a continuacin.

FASE LTICA DE CTLs Se entiende por fase ltica, el proceso de lisis propiamente dicha de la clula diana por parte del CTL. Esta accin es compleja y pueden intervenir diferentes mecanismos, todos ellos de suma importancia y sometidos a un estricto control. Entre estos mecanismos destacan, entre otros, la liberacin de los factores citotxicos principales tales como perforina y granzimas que mediante el proceso de liberacin de los grnulos donde se encuentran almacenados en los CTLs... La consecuencia de este proceso es la muerte de la clula blanco por un mecanismo que implica generalmente ruptura de la membrana celular con aparicin de poros y subsiguiente des- equilibrio electroltico. A este proceso se le ha venido denominando como de muerte celular por necrosis. Sin embargo hoy sabemos que el proceso ltico tambin depende de la intervencin del ligando Fas (FasL) que unido a la membrana de la clula efectora puede interactuar con las molculas Fas presente en la clula blanco iniciado una va ltica de gran importancia. Esta va ltica que conduce a la muerte celular por un mecanismo conociendo como muerte celular por apoptosis que se caracteriza porque la lisis celular aparece como consecuencia de la ruptura del DNA de la clulas blanco en mltiples fragmentos. (Figura 14.5) Hoy sabemos que estos procesos en los que participan la granzimas y el ligando Fas, se desarrollan normalmente de manera conjunta y que la clula blanco muere como consecuencia de la destruccin de sus mitocondrias y del DNA nuclear. Accin de la granzima y perforina La forma de accin de la perforina, produciendo poros en la membrana de la clula blanco, es similar a lo que se produce como consecuencia de la accin del sistema del complemento a travs del complejo de ataque a membrana (MAC). Estos poros posibilitan la entrada en la clula blanco de la gran enzima y otros muchos componentes moleculares. El fenmeno puede apreciarse in vitro por la liberacin del istopo 51Cr, con el que previamente se marcan las clulas diana en el laboratorio, constituyendo el fundamento tcnico del ensayo convencional para estudiar estos procesos.

Mltiples observaciones sealan que el proceso citoltico resulta de la accin lesiva sobre la membrana de la clula diana as como por su accin sobre las mitocondrias celulares e incluso activando la cascada de acontecimientos derivados de la interaccin del ligando Fas y el Fas. (Figura 14.4). Tanto las molculas de perforina como de granzima, antes de su liberacin, se encuentra almacenados en grnulos azurfilos, caractersticos de las clulas cito- txicas. Son estructuras con un ncleo electrodenso rodeado de cuerpos vesiculares y poseen pH cido. Dado que comparten propiedades con los lisosomas y los grnulos de secrecin, se ha propuesto el trmino descriptivo granulosoma para designarlos. Cuando se produce la activacin de los CTL, estos grnulos salen del linfocito y vierten en la membrana de la clula diana su contenido, tanto de granzima como de perforina. Como Granzima, se conocen ciertos componentes todos ellos con actividad serina esterasa y que se encuentran especficamente en los grnulos de los linfocitos citotxicos. Como perforina o protena formadora de poros (PFP) se conoce una molcula que est constituida por monmeros de 68-70 kDa que se localizan en los grnulos, y que presenta la propiedad de interaccionar con fosfolpidos de la membrana plasmtica. Cuando se produce, como consecuencia de la activacin celular, la liberacin del contenido de los grnulos en la membrana plasmtica de la clula diana, al ponerse en contacto la perforina con el calcio intercelular polimeriza. La polimerizacin de varias subunidades de perforina forma estructuras tubulares (aprox. 16 nm de dimetro), identificables por microscopa electrnica, que constituyen canales y permeabilizan la membrana plasmtica. Los canales de perforina, podran hacer que la clula diana sea incapaz de regular los niveles de iones, y que esto produjese un desequilibrio osmtico y su lisis. Por estos poros penetra tambin la granzima en las clulas diana ejerciendo as su efecto citotxico sobre sta. Esta no es la nica forma de entrada de la granzima pues tambin puede intervenir en la entrada de perforina catin independiente manosa 6-P- receptor (CI-MPR). Accin del Fas y FasL La demostracin de un nivel adicional de complejidad del proceso citotxico provino de los estudios de Russell, al observar que se produca en las clulas diana una degradacin del ADN en mltiples fragmentos de las subunidades nucleosomales. Este fenmeno poda apreciarse por anlisis electrofortico, en algunos casos antes incluso de que se objetivara la permeabilizacin de la membrana plasmtica. En funcin de estos datos se propuso que, como consecuencia del proceso citotxico, se produce la activacin de endonucleasas de la propia clula diana, por un mecanismo denominado apoptosis. La interaccin del ligando fisiolgico (Fas-L) presente en los CTLs con la molcula Fas, presente en las clulas diana pone en marcha la cascada de acontecimientos de lisis celular. El proceso de apoptosis consta de dos fases:

Una fase primera en la que la clula se programa para morir, activndose las enzimas proteolticas encargadas del proceso, denominadas caspasas. La protena transmembrana, Fas, una vez se ha unido su ligando FasL, interacta con un factor intermedio denominado FADD (factor associated death domain) activando el complejo cisteinil-aspartato proteasas (caspasas). Se han descrito 11 caspasas en clulas humanas que provocan una degradacin proteica bien definida hasta llegar a los cuerpos apoptticos. Algunas caspasas son "iniciadoras" y otras son "efectoras" del proceso cataltico, actuando sobre otras protenas directamente responsables de la fragmentacin del ADN, las endonucleasas. Mientras Fas no est unido a su ligando, esta va permanece apagada y las caspasas inactivas. La muerte celular se produce despus de grandes alteraciones nucleares, de la membrana plasmtica y de las mitocondrias. En el ncleo se degrada el ADN y se hace visible condensaciones de cromatina nuclear formndose aglomeraciones que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear. Segunda fase, conocida como degradativa en la que las clulas muertas son reconocidas y fagocitadas por los macrfagos. En conjunto se puede decir que los CTL producen lisis celular por dos mecanismos que a su vez actan de manera complementaria, aunque en ciertos casos pueden ser suficiente por si mismo de manera independiente. Estos son: Intervencin de los componentes citotxicos, perforina y granzimas, que se liberan de los CTL y despus de de entrar en clulas blanco producen lo que se ha venido en denominar muerte por necrosis o la Intervencin del ligando Fas presente en la membrana de los CTL que cuando se una a la molcula Fas en la superficie de clulas diana, pone en marcha la va de las caspasas, que culminan con el fraccionamiento del DNA y muerte celular en un proceso que se ha venido en denominar muerte por apoptosis. (Figura 14.6)

Intervencin del TNF e IFN en la citolisis Adems de los componentes arriba indicados, en este tipo de muerte celular tiene tambin especial importancia el factor TNF que tras su induccin como consecuencia de todo el proceso de activacin de los CTL, puede ser liberado y despus reconocido por ciertos receptores presentes en las clulas diana y actuar desencadenando la citolisis de stas clulas. De igual manera, esta demostrado que ocurre con el IFNgamma que puede intervenir de manera eficaz en la muerte celular. LISIS POR CLULAS NK Si se compara la citotoxicidad mediada por clulas NK con la producida por los CTL, se observa que son similares en lo que se refiere al proceso en s de lisis pero hay ciertas diferencias en lo que a los procesos de reconocimiento y activacin se refiere Efectivamente la lisis mediada por las clulas NK puede ser de dos formas en cuanto al sistema utilizado de reconocimiento. Una es en la que la clula blanco es reconocida de manera indirecta por receptores Fc y de complemento que a su vez son las estructuras que identifican la clula blanco, La otra forma es por reconocimiento no directo en el que participan receptores especializados que pueden ser de tipo activador o inhibidor.

.Aunque, las clulas NK no expresan receptores de clula T especficos de antgeno (TCR) s poseen otro tipo de rectores no especficos de HLA. Las clulas NK utilizan diversos receptores para reconocer a las clulas blanco, tal y como hemos visto en el captulo dedicado a las clulas NK. Entre estos receptores destacan los receptores FcR (CD16) presentes en su membrana celular y que reconocen la fraccin constante (Fc) de las inmunoglobulinas y por ciertos receptores de activacin o inhibicin, especficos de las clulas NK que tienen como ligando molculas de histocompatibilidad clase I pero de manera inespecfica. En cualquier caso, el reconocimiento de las clulas blanco por las clulas NK, no est restringido por las molculas HLA. Por otra parte tambin es de destacar que a diferencia de las CTL, las clulas NK no guardan recuerdo de acontecimientos anteriores y por tanto no se generan clulas memoria de tipo NK. Sin embargo, las clulas NK destruyen clulas tumorales e infectadas por virus mediante procesos similares a los que ejercen los linfocitos T citotxicos. Las clulas NK poseen mltiples grnulos que incluyen perforina y granzimas y adems poseen FasL en su superficie e inducen con facilitad la muerte en clulas blanco que poseen Fas. A diferencia de los CTL, que requieren activarse antes de la aparicin de grnulos, las clulas NK siempre tienen grnulos en su citoplasma aunque stos aparecen y poseen mayor actividad cuando estas clulas son activadas con IL2, en cuyo caso aparecen lo que se viene en denominar clulas activada por Il-2 (LAK). Lisis por clulas NKT Las clulas NKT aunque expresan TCR, ste no reconoce pptidos sino que reconoce glucolpidos presentados por las molculas CD1, que como se sabe son unas molculas de histocompatibilidad no clsica. Estas clulas expresan ciertos marcadores propios de NK, entre ellos el conocido como CD161. En definitiva, estas clulas, aunque se encuentran en muy bajas cantidades en el organismo parece que su maquinaria citoltica es muy eficiente.

Lisis por macrfagos

Los macrfagos poseen capacidad de lisis de microorganismos, de otras clulas e incluso restos celulares una vez fagocitados o bien, en ciertas circunstancias, de manera externa al macrfago a travs de factores solubles liberados. Estas acciones son especialmente importantes en la respuesta inmune innata en la que adems, los macrfagos, como se ha tratado con anterioridad poseen importantes funciones presentando pptidos y produciendo citocinas esenciales para el inicio de la respuesta inmune. Para desarrollar sus efectos lticos, los macrfagos poseen receptores especializados en el reconocimiento del material a destruir y una maquinaria especializada en su destruccin. A continuacin veremos como se llevan a cabo los procesos de reconocimiento y activacin de macrfagos, as como los componentes implicados en el proceso de lisis propiamente dicho. Hemos de destacar que una maquinaria equivalente en lo que se refiere al reconocimiento, activacin y lisis, se produce tambin en los neutrfilos, que al igual que lo macrfagos poseen una potente accin de fagocittica y destructora (Figura 14.7). PROCESO DE RECONOCIMIENTO Los macrfagos proceden al reconocimiento de las estructuras, microorganismo o clulas, a destruir mediante una gran variabilidad de receptores. Entre estos receptores destacan ciertas molculas que poseen capacidad de identificar patrones moleculares conservados presentes en los microorganismos

patgenos pero no en los tejidos propios, a las que se denominan Patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs). Estos receptores que estn codificados en la lnea germinal, no estn sometidos a los procesos de reordenamiento de segmentos gnicos como ocurre con las inmunoglobulinas y el TCR. De esta manera todos los macrfagos exhiben los mismos receptores, los cuales median el reconocimiento de unas pocas estructuras moleculares, PAMPs, conservadas en grupos muy extensos de microorganismos. Esto permite a los macrfagos, al tener la posibilidad de reconocer de manera universal a los microorganismos, poner en marcha un sistema muy eficiente y rpido de defensa. Sin embargo, los macrfagos carecen de memoria inmunolgica y no pueden mejorar su respuesta tras un segundo contacto con el mismo patgeno. Es de destacar que generalmente este sistema de reconocimiento, adems de conducir al proceso de fagocitosis de microorganismos, hace que estas clulas secreten factores inflamatorios igualmente de gran utilidad en la erradicacin de la infeccin. Entre estos receptores destacan los: Receptores tipo TOLL Receptores depuradores o scavenger y Receptores lectina tipo C Adems los macrfagos poseen otros receptores de gran importancia, que se caracterizan por reconocer ciertas estructuras especficas, tales como el extremo Fc de las inmunoglobulinas o ciertos componentes derivados de la activacin del complemento. Todo ello permite el inicio del proceso conocido como opsonizacin que conduce en ltimo extremo la destruccin por fagocitosis de los microorganismos invasores. Entre estos receptores destacan los: Receptores Fc alta afinidad (FcRI y FcRIII ) y Receptores de factores del complemento Veremos la funcin de estos receptores en las diferentes etapas del proceso de activacin y lisis en macrfagos Receptores tipo Toll Los receptores Tipo Toll, se describieron por primera vez en Drosophila (mosca del vinagre) y posteriormente se encontraron en monocitos, neutrfilos y clulas dendrticas denominndose receptores tipo Toll o TLR (Tolllike Receptors). (Figura 14.8) Estos receptores poseen la capacidad de reconocer patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs) presentes, como su nombre indica, en la mayora de los patgenos. Debido a esta propiedad hacen que lo monocitos puedan reconocer a la mayora de los microorganismos e iniciar as la activacin de los monocitos y despus conducir a su destruccin.

Los TLRs son protenas en las que los dominios extracelulares poseen repeticiones ricas en leucina y el dominio intracelular tiene homologa con el de los receptores para IL-1 y se denomina TIR (Toll-IL-1R). Este dominio TIR se asocia a protenas adaptadoras con un elevado grado de homologa como es la protena MyD88. Los diferentes TLRs identificados hasta el momento difieren en los ligandos que reconocen, en el patrn de expresin y probablemente los genes que inducen. En mamferos se han identificado hasta el momento diez receptores tipo Toll. Los TLR se pueden asociar a otras molculas o correceptores para el reconocimiento de microorganismos. As, TLR4 reconoce LPS tanto en macrfagos como en linfocitos B y requiere la asociacin con CD14 y otras protenas como MD2 en macrfagos o MD1 y RP105 en linfocitos B. La activacin del TLR, tras reconocer a su ligando especfico, induce una cascada de seales intracelulares. Los TLRs interaccionan a travs de su dominio TIR con la protena adaptadora MyD88. Adems, pueden inducir la sntesis de pptidos antimicrobianos con capacidad de lisar microorganismos. La activacin de los TLRs en las clulas dendrticas induce su maduracin, produciendo cambios en la expresin de receptores de quimiocinas que van a favorecer su movilizacin a los ganglios linfticos, produccin de citocinas proinflamatorias (IL12, TNF-alfa) y aumento de la expresin de molculas coestimuladoras (CD40, CD80, CD86). Receptores depuradores o scavenger Entre los principales receptores implicados en el proceso de endocitosis destacan los receptores depuradores (scavenger receptors) presentes principalmente en macrfagos y que participan en la eliminacin de microorganismos y de lipoprotenas modificadas (oxidadas o acetiladas). Estos receptores poseen la capacidad de reconocer estructuras PAMPs, entre las que destacan lipopolisacaridos y ciertos polirribonucletidos presentes en una gran variabilidad de bacterias. Estos receptores tienen la propiedad de inducir la activacin de macrfagos y el propio proceso de fagocitosis (Figura 14.9). Receptores de lectina tipo C Estos receptores se caracterizan por el reconocimiento de hidratos de carbono presentes en la superficie de una gran mayora de microorganismos. Especficamente reconocen residuos de manosa, galactosa y otros. Entre estos receptores destacan: el CD-SIGN (DC209) y los receptores MR (CD206). Inducen activacin y fagocitosis en los macrfagos. Receptores del fragmento Fc Estos receptores tienen de comn el reconocer el extremo Fc de las inmunoglobulinas pero forman una familia muy heterognea de miembros, algunos de los cuales tienen actividad inhibidora y otros tienen capacidad de activacin. (Tabla). Funcionalmente todos ellos tiene en comn la capacidad de ser responsable cuando se activan, de iniciar el proceso de fagocitosis de las clulas que lo poseen, ,macrfagos o neutrfilos, lo cual es de gran importancia en la eliminacin de los patgenos que a su vez han sido identificados por inmunoglobulinas. Receptores de factores del complemento Estos receptores pueden ser de cuatro clases que se denominan CR1, CR2, CR3 y CR4 y se caracterizan por reconocer fragmentos activados del sistema del complemento. Entre estos fragmentos se encuentran el

C3 (C3b) y sus productos de escisin proteolticos, C3b1, C3d y C3dg. Todo ello conduce a la opsonizacin de los microorganismos o clulas en cuya superficie se encuentran estos productos como consecuencia de la activacin del sistema complemento que como se sabe conduce a la protelisis del componente C3. Tambin puede ser reconocido la fraccin C4b aunque su capacidad opsonizante es mucho menor que la expresada por el C3b. ACTIVACIN DE MACRFAGOS Cuando los receptores de los macrfagos arriba estudiado en este captulo se unen a sus ligandos se inicia un proceso de activacin de los mimos. Este proceso arranca de la fosforilacin de la cola citoplasmtica de algunos de ellos o en la mayora de la fosforilacin de protenas anexas en la membrana que ejercen esa funcin. En el caso por ejemplo de los receptores tipo Toll, la va de transduccin de seales utiliza predominantemente el enzima MyD88 que se une a la cola del receptor Toll. Despus de una cadena de segundos me sajeros se producir la activacin predominante de NF-kB que como se sabe participa en la activacin de genes controladores de la sntesis de Il1, IL-12 y TNF (Figura 14.10). De igual manera, por ejemplo ocurre con los receptores Fc de los macrfagos que por s mismo, como es el caso del recepto FcgammaRII, o asociados a otras cadenas polipeptdicas adicionales transmiten las seales de activacin. En este sentido juegan un papel importante las molculas de sealizacin denominada alfa o gamma. Hay que considerar tambin que alguno de los receptores Fc transmitirn seales de inhibicin, como es el caso del FcgammaRIIB. En definitiva como consecuencia de estos procesos de activacin, se van a activar genes de citosinas, receptores de citocinas, molculas de histocompatibilidad, y la mayora de los elementos que participaran en la lisis de los grmenes responsables del proceso de activacin. Es de destacar que este proceso de activacin generalmente ocurre en un foco inflamatorio formando parte de la respuesta innata y que adems sirve de estmulo para el inicio de la respuesta adaptativa, no olvidemos que por ejemplo los macrfagos son unos excelentes presentadores de antgenos a los linfocitos T. PROCESO LTICO DE MACRFAGOS El proceso ltico se macrfagos se inicia cuando los distintos tipos de receptores han reconocido las estructuras en los microorganismos o clulas que sern destruidas posteriormente bien intracelularmente, para lo cual es necesario su fagocitosis previa, o bien de manera externa en cuyo caso es necesario la liberacin de los factores necesarios para ello. Opsonizacin El proceso por el cual los receptores Fc como los del complemento presentes en los macrfagos reconocen respectivamente a las inmunoglobulinas o partcula de complemento respectivamente, en la membrana de otras clulas o microorganismos se denomina opsonizacin. Mediante este proceso no solo

se reconoce a la sustancia extraa sino que tambin los receptores implicados inician un proceso de activacin del macrfago. Este proceso puede dar lugar al paso siguiente que es la fagocitosis. Fagocitosis La fagocitosis, es un tipo de endocitosis por el cual en los macrfagos despus de su unin a microorganismos se produce la polarizacin de actina de la zona subyacente al sitio de contacto lo que conduce a la aparicin de seudpodos que envuelven al microorganismo y se forma una vacuola fagoctica o fagosoma ya en el interior celular. Posteriormente estos fagosomas se fusionarn con los lisosomas presentes en el interior celular y se formarn los fagolisosomas en donde los componentes citolticos de los lisosomas son vertidos sobre la sustancia extraa para su destruccin. Estos mediadores de la citolisis pueden ser muy variados y sern estudiados a continuacin Mediadores de lisis en macrfagos Dentro de los fagosomas los patgenos son sometidos a la accin de dos sistemas citotxicos de distinta naturaleza: Uno dependiente de la produccin de sustancias oxidantes derivadas del oxgeno (intermediarios reactivos del oxgeno, IRO) y el otro, independiente del oxgeno en las que intervienen diversas enzimas y sustancias con capacidad bactericida. Mediadores dependientes de oxgeno. Estos derivan del anin superxido e incluyen: el anin superxido, perxido de hidrgeno, anin hipoclorito, radical hidroxilo entre otros. Estos productos se forman en la explosin respiratoria que sigue a la activacin de la NADPH oxidasa de membrana tras la fagocitosis. En los fagosomas y en la superficie celular el anin superxido se convierte mediante la superxido dismutasa en H2O2. El anin superxido y el H2O2 son agentes con gran poder bactericida y pueden causar dao celular si salen de los fagosomas. En estos casos el H2O2 es destruido por un enzima citoplasmtica llamada glutatin peroxidasa. En la actividad bactericida del H2O2 est implicada la mieloperoxidasa, enzima que en presencia de iones haluro convierte el H2O2 en cido hipohalrico. Como el cloruro es el haluro ms abundante en los sistemas biolgicos, se produce cido hipoclrico, que es un agente bactericida muy potente. El H2O2 se puede reducir mediante la reaccin de Haber-Weiss y formar el radical hidroxilo (OH-), altamente txico. Finalmente se expone (Figura 14.11) una visin general donde se observa que los macrfagos forman parte de la respuesta inmune innata y la respuesta adaptativa en sus dos vas, humoral y celular.

Las mutaciones en cualquiera de los genes que codifican a los componentes de NADPH oxidasa dan origen a una patologa conocida como enfermedad granulomatosa crnica, caracterizada por la incapacidad de

los fagocitos para producir anin xido. Ello se asocia con infecciones bacterianas y micticas recurrentes, que pueden causar la muerte del paciente, si o se instaura a tiempo el tratamiento adecuado. Mediadores independiente del oxigeno. De entre estos mediadores destacan diversos componentes, todas ellas con gran capacidad de ataque a componentes de microorganismos. Entre ellos destacan ciertas metaloprotenas, lisozima, lactoferritina y otras. Tanto los macrfagos como los neutrfilos, pueden producir y secretar tambin TNF-alfa de gran capacidad ltica. En suma, son numerosos y muy variados los mecanismos microbicidas utilizados por los macrfagos y por los neutrfilos. Bsicamente, al llegar los microbios al medio interno tras sobrepasar la epidermis, se encuentran a los macrfagos y se forma un foco inflamatorio, pero en definitiva los macrfagos o los neutrfilos reconocen al microorganismo invasor mediante los receptores inespecficos tipo toll o aquellos receptores que reconocen fracciones del complemento o los que reconoce el extremo Fc de la IgG .Como consecuencia por una u otra va, los grmenes son fagocitados y destruidos bien por los mediadores dependiente o independiente del oxgeno.

14 CITOTOXICIDAD
J.M.Lozano,R.Tarazona y J.pea La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de determinadas poblaciones celulares especializadas del sistema inmunitario, consistente en la capacidad para interaccionar con otras clulas y destruirlas. Cualquier tipo celular, normal o patolgico, puede ser potencialmente susceptible a las clulas citotxicas, y se emplea grficamente el trmino "clulas diana" (target cells) para su designacin. Este mecanismo de respuesta interviene en la defensa frente a infecciones vricas y clulas neoplsicas, as como en la destruccin de clulas alognicas en transplante de rganos. Se consideran como prototipos de las clulas especializadas en dicha funcin a una subpoblacin de linfocitos T (Tc, CTL o cytotoxic T lymphocyte) y a las clulas natural killer (NK). Otras clulas como los macrfagos ejercen tambin una importante funcin citoltica y sern tratados al final del capitulo. Desde que se defini el fenmeno de citolsis, es sabido que la funcin citotxica exige de una actividad metablica activa de la clula a temperatura fisiolgica, no implica la sntesis "de novo" de protenas, y requiere tanto la presencia de cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+) como la integridad del citoesqueleto. Las diferentes fases del proceso ltico estn reguladas por diversos tipos de receptores con acciones a veces contrapuestas, y el efecto final es la consecuencia del equilibrio que en cada momento se alcance. El proceso ltico es una accin que se desarrolla en fases sucesivas que se inicia con el reconocimiento de las clulas implicadas en el proceso y termina con la lisis de la clula diana. Las principales etapas en las que se desarrolla el proceso de citolisis son las siguientes: 1 Fase de reconocimiento y adhesin intercelular. Las clulas efectoras interaccionan a travs de diferentes receptores de superficie con estructuras en la membrana de la diana. Esta fase es dependiente de Mg2+, no requiere Ca2+ y puede producirse por debajo de la temperatura fisiolgica (Figura 14.1).
Fig.:14.1

Fase de activacin de la clula efectora. La interaccin de los receptores de superficie con sus ligandos determina la transduccin de seales a la clula que conllevan la generacin de segundos mensajeros, la aparicin de cambios estructurales y la exocitosis del contenido de los grnulos de secrecin al espacio intercelular, tras la fusin de los mismos con la membrana plasmtica. Fase ltica. Esta etapa viene determinada por la accin de diferentes componentes de la clula efectora sobre la diana, la cual experimenta una serie de complejas alteraciones que inician su desestructuracin. Tanto esta fase como la anterior son dependientes de Ca2+. 4 Fase de disociacin del contacto intercelular. Permitiendo que la clula efectora inicie potencialmente un nuevo ciclo ltico, a la par que prosigue la destruccin de la clula diana. En la figura 14.2, se observa una clula NK unida a una clula tumoral en lo que puede ser un proceso de citolisis mediado por este tipo de clulas.

Fig14.2

Existen muchas formas de citotoxicidad mediada por clulas segn la clula que intervine, principalmente participan clula NK o CTL (Figura 14. 3).
Fig.:14.3

FASE DE INTERCELULAR.

ADHESIN

De forma esquemtica, se admite que la fase de contacto y adhesin intercelular implica la participacin coordinada de dos tipos de receptores, el primero determina la especificidad/selectividad de la interaccin, mientras que el segundo grupo desempea un papel complementario, no menos especfico.

Reconocimiento por linfocitos Tc Como se ha visto en captulos anteriores, la estructura implicada en el reconocimiento especfico por las clulas Tc es el receptor para antgeno (TCR). La mayora de las clulas citotxicas alfa/beta estn incluidas en la subpoblacin CD8+ y, en consecuencia, reconocen los pptidos antignicos presentados por las molculas del MHC de clase I.

La mayora de los linfocitos Tc se encuentran in vivo quiescentes, por lo que algunos autores los denominan en la literatura pre-CTL, y nicamente despliegan su capacidad funcional tras la activacin, en la que tiene un papel central la interleucina 2 (IL-2), citocina que tambin estimula la divisin mittica de los CTL. As pues, el pleno desarrollo de la respuesta citotxica especfica requiere la participacin de linfocitos Th. Una subpoblacin minoritaria de clulas T expresa en su membrana receptores especficos para el Fc de la IgG de tipo III (FcgammaR-III), tambin conocidos como CD16. Dichas estructuras presentan baja afinidad por la IgG monomrica, pero interaccionan eficazmente con inmunocomplejos. En aquellas situaciones en las que la IgG se halla unida especficamente al antgeno sobre la superficie de otra clula, el FcgammaR-III CD 16 desencadena el proceso citoltico con la misma eficacia que el CD3/TCR, denominndose a este mecanismo citotoxicidad dependiente de anticuerpos (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity o ADCC) (Tabla 14.1). TABLA 14.1 Clulas responsables de citotoxicidad y su regulacin por MHC Citotoxicidad mediada por clulas dependiente de acs (ADCC) Clulas implicadas CTL NK NK, CTLy M Regulacin por MHC Si No* No

*En ciertos casos su accin es regulada por MHC El segundo grupo de receptores que intervienen en la regulacin del proceso citoltico incluye diferentes molculas de adhesin, ya tratadas ms extensamente en captulos anteriores. Estas estabilizan el contacto intercelular al unirse a sus ligandos en la superficie de la clula diana, aumentando la avidez de la interaccin; por otra parte, tambin participan activamente en la transduccin de seales a la clula, complementando el efecto central de los receptores especficos. Reconocimiento por clulas NK Las clulas NK utilizan diversos receptores para reconocer a las clulas blanco, tal y como hemos visto en el captulo dedicado a las clulas NK. Entre estos receptores destacan el CD16, ciertos receptores de activacin y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando molculas de histocompatibilidad clase I (Tabla 14.1). FASE DE ACTIVACIN DE CELULAS EFECTORAS. Los estudios ultra estructurales de las clulas citotxicas, tras la interaccin con la clula diana, demuestran una serie de cambios que se relacionan directamente con la actividad ltica, muchos de ellos ya han sido estudiados en captulos anteriores. Sin embargo hemos de considerar de manera especfica que la preparacin de las clulas efectoras para la lisis de una clula diana, implica al menos tres aspectos de especial importancia. Estos son: reorganizacin del citoesqueleto con localizacin del centro organizador de microtbulos (MTOC) y de los centriolos prximos a la zona de contacto intercelular, polarizacin del aparato de Golgi y de los grnulos de secrecin en la misma zona y fusin de los grnulos con la membrana plasmtica y la subsiguiente exocitosis de su contenido al espacio intercelular.

Por otra parte, la activacin celular pude inducir la biosntesis y secrecin de citocinas, particularmente IFN-gamma y TNF-alfa.

TABLA 14 .2 Factores citolticos liberados por los linfocitos Tc Factor Perforina Granzyme TNF- FASE LTICA. Los linfocitos T citotxicos y las clulas NK destruyen las clulas dianas a travs de la liberacin de los factores citotxicos tales como perforina y granzymes mediante el proceso de exocitosis de los grnulos donde se encuentran almacenados (Tabla 14.2). La consecuencia es la muerte celular de la clula blanco por necrosis. Sin embargo existe otra va de lisis celular, conocida como apoptosis e implica la participacin del receptor de superficie FasL de la clula efectora que tras su unin al receptor Fas de la clula diana induce su muerte por fragmentacin de su DNA (Figura 14. 4).
Fig14.4

Efecto Formacin de poros Accin de serina proteasa Induccin de apoptosis

Citotoxicidad por necrosis. Como consecuencia de la interaccin con las clulas citotxicas, se aprecian una serie de cambios en la clula diana que conducen a su destruccin. Por una parte, se objetiva una permeabilizacin de la membrana plasmtica, que altera el intercambio inico y permite la salida de macromolculas al exterior, perturbando el equilibrio osmtico/onctico. Este mecanismo es similar al que se produce como consecuencia de la accin del sistema de C' a travs del complejo de ataque a membrana (MAC). El fenmeno puede apreciarse in vitro por la liberacin del istopo 51Cr, con el que previamente se marcan las clulas diana en el laboratorio, constituyendo el fundamento tcnico del ensayo convencional para estudiar estos procesos. Mltiples observaciones sealan que el proceso citoltico resulta de la accin lesiva sobre la membrana de la clula diana, ejercida por elementos moleculares presentes en los grnulos de secrecin, cuando son liberados al espacio intercelular. De hecho, los grnulos aislados presentan cierta capacidad ltica frente a eritrocitos, indicando que al menos algunos de sus componentes estn implicados como mediadores moleculares en el proceso (Figura 14.5). Estos grnulos azurfilos, caractersticos de las clulas citotxicas, son estructuras con

un ncleo electrodenso rodeado de cuerpos vesiculares y poseen pH cido. Dado que comparten propiedades con los lisosomas y los grnulos de secrecin, se ha propuesto el trmino descriptivo granulosoma para designarlos. El contenido de estos grnulos ha sido parcialmente definido, y entre ellos destacan ciertos enzimas y las molculas de perforinas.
Fig.:14.5

Enzimas granulares. Se ha demostrado que dentro de los grnulos se encuentran ciertos componentes como son varias serina esterasas, denominadas descriptivamente granzymes o fragmentinas, que se expresan especficamente en linfocitos. Otras enzimas detectadas en los grnulos son: carboxipeptidasas, catepsina D, aril-sulfatasa y beta-glucuronidasa. Tambin se han identificado proteoglicanos, y dos proteinas denominadas TIA-1 o nucleolisina y TIAR (TIA-related), que unen poliadenilato. Perforinas. Adems en estos grnulos se encuentran la protena, denominada perforina o protena formadora de poros (PFP). Esta molcula est constituida por monmeros de 68-70 kDa que se localizan en los grnulos, y presenta la propiedad de interaccionar con fosfolpidos de la membrana plasmtica. El resultado es la exocitosis del contenido de los grnulos en la membrana plasmtica de la clula diana. Al ponerse en contacto la perforina con el calcio intercelular polimeriza. La polimerizacin de varias subunidades de perforina forma estructuras tubulares (aprox. 16 nm de dimetro), identificables por microscopa electrnica, que constituyen canales y permeabilizan la membrana plasmtica. Los canales de perforina, hacen que la clula diana sea incapaz de regular los niveles de agua e iones, producindose un desequilibrio osmtico y su lisis. Las propiedades funcionales de la perforina son similares a las del componente C9 del sistema de C,' que forma parte del MAC y, de hecho, se aprecia al comparar la estructura de ambos genes cierta homologa estructural en una parte de la secuencia. Por estos poros penetra tambin la granzyme en las clulas diana ejerciendo as su efecto citotxico sobre esta. Esta no es la nica forma de entrada de la granzyme pues tambin puede intervenir en la entrada de perforina catin independiente manosa 6-P- receptor (CI-MPR). Adems de estos componentes en este tipo de muerte celular tiene especial importancia el factor TNF que puede ser reconocido por ciertos receptores y actuar desencadenando la citolisis de las clulas blanco.

Citotoxicidad por apoptosis. La demostracin de un nivel adicional de complejidad del proceso citotxico provino de los estudios de Russell, al observar que se produca en las clulas diana una degradacin del ADN en mltiples fragmentos de las subunidades nucleosomales. Este fenmeno poda apreciarse por anlisis electrofortico, en algunos casos antes incluso de que se objetivara la permeabilizacin de la membrana plasmtica. En funcin de estos datos se propuso que, como consecuencia del proceso citotxico, se produce la activacin de endonucleasas de la propia clula diana, por un mecanismo denominado muerte celular programada o apoptosis, diferente de la muerte por necrosis (Tabla 14.3). TABLA 14.3 Principales diferencias entre los procesos de necrosis y apoptosis. Fase Iniciacin Necrosis Clula inflamada Orgnulos daados Cromatina alterada Alteracin membrana plasmtica Prdida homeostasis mitocondrial Lisis celular Orgnulos destruidos Cromatina destruida Liberacin del contenido Fagocitosis con inflamacin Apoptosis Clula arrugada, con burbujas Prdida de uniones intercelulares Orgnulos intactos Cromatina marginal Fallos en mecanismos reparacin y homeostasis Cromatina condensada Activacin endonucleasas, fragmentacin ADN. Cuerpos apotticos (restos de cromatina rodeados de membrana) Orgnulos intactos Contenido no liberado Fagocitosis sin inflamacin

Efectora

Degradativa

Se considera que la apoptosis es un proceso bsico de regulacin fisiolgica del desarrollo en diferentes sistemas celulares y puede desencadenarse por la accin de mediadores fisiolgicos o farmacolgicos, as como por la carencia de factores de crecimiento. La interaccin del ligando fisiolgico (Fas-L) con la molcula Fas pone en marcha la cascada de acontecimientos de lisis celular (Fig.14.6). El proceso de apoptosis consta de tres fases: 1 Fase de iniciacin, que se inicia con una induccin dependiente del estmulo de muerte y seguida por la fase de transduccin de seales correspondiente. El estmulo inductor es muy variado incluyendo agentes qumicos y fsicos, activadores fisiolgicos, asociados a terapias, y toxinas, tambin puede iniciarse por unin de Fas a su ligando. En cualquier caso, se entra en una ruta de transduccin de seales activada tras el dao que el estmulo produce en las macromolculas biolgicas, o por accin sobre receptores especficos (CD95/Fas/TNF-R). Fase efectora, en la que la clula est programada para morir, activndose las enzimas proteolticas encargadas del proceso, denominadas caspasas. Este punto aparece claramente modulado por la familia de protenas bcl-2, las cuales regulan la fase efectora de la apoptosis La protena Bcl-2 se encuentra asociada a membranas intracelulares, (mitocondria, retculo endoplsmico y envoltura nuclear. En realidad bcl-2 son un gran grupo de protenas que dimerizan unas con otras determinando la supervivencia o la

muerte, el dmero Bcl-2/Bcl-x inhibe la apoptosis mientras que el dmero bcl-2/Bax la favorece.

Fig.:14.6

Fase degradativa, en la que las clulas muertas son reconocidas y fagocitadas por los macrfagos. La muerte celular se produce despus de grandes alteraciones nucleares, de la membrana plasmtica y de las mitocondrias. En el ncleo se degrada el ADN y se hace visible condensaciones de cromatina nuclear formndose aglomeraciones que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear.

LISIS MEDIADA POR MACRFAGOS Del mismo modo que las clulas NK y linfocitos T CD8+, los macrfagos poseen capacidad citoltica de otras clulas o incluso detritos celulares o clulas en proceso de muerte. Especialmente los macrfagos poseen capacidad de destruir microorganismos una vez fagocitados o bien de manera extracelular (Figura 14.7).

Fig.:14.7

Para desarrollar este efecto los macrfagos poseen receptores especializados en el reconocimiento del material a fagocitar y una maquinaria especialmente desarrollada para la lisis ya sea
Fig.:14.8

intracelular como extracelular (Figura 14.8.). Receptores de Macrfagos Los macrfagos poseen receptores de diferente tipo que hacen posible el fenmeno de reconocimiento, entre ellos destacan: 1. Receptores Fc (FcRI y FcRIII de alta afinidad) y as pueden ser dirigidos contra clulas recubiertas de anticuerpos, participando en las reacciones lticas por ADCC. 2. Receptores depuradores o scavenger y 3. Receptores tipo TOLL 4. Receptores inhibidores (ILT y otros) Receptores tipo Toll El reconocimiento de los patgenos por los macrfagos y otras clulas de la respuesta inmune innata, es mediado por un grupo de receptores que estn codificados en la lnea germinal

y a los que se ha denominado receptores de reconocimiento de patrn (Pattern-recognition receptors, PRRs). Estos receptores reconocen patrones moleculares conservados presentes en los microorganismos patgenos pero no en los tejidos propios, a los que se denomina Patrones moleculares asociados a patgenos (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Estos patrones moleculares son esenciales para la supervivencia y patogenicidad del microorganismo y son capaces de inducir una fuerte respuesta del sistema inmune innato. Este mecanismo de reconocimiento permite a las clulas fagocticas poner en marcha un sistema rpido de defensa, sin embargo, carecen de memoria inmunolgica y no pueden mejorar su respuesta tras un segundo contacto con el mismo patgeno. TABLA 14.4 Receptores scavenger o depuradores Reconocen Lipoprotenas de densidad LPS Polisacridos Oligonucletidos. Fospolipidos Funcin baja Eliminar microorganismos, tejido envejecidas. Eliminar bacterias Adhesin a tejidos. Reconocimiento tejidos daados. Activacin inmunidad adaptativa daado, clulas

Entre los receptores de membrana que participan en la respuesta inmune innata implicados en reconocimiento de patgenos se pueden distinguir los receptores endocticos que participan en el proceso de fagocitosis y los receptores activadores que inducen otras respuestas inmunes como la secrecin de citocinas y quimioquinas. TABLA 14.5 Principales receptores endocticos Receptores endocticos Ligandos Receptores depuradores (scavenger) LPS, acido lipoteicoico, dsRNA LPS Receptor de manosa Manosa en bacterias Gram+/- y hongos Receptor de glucano b1,3 glucano CD14 LPS, peptidoglicano La activacin de los receptores endocticos pone en marcha las diferentes fases del proceso de fagocitosis, que resulta en la ingestin y destruccin de las partculas o microorganismos fagocitados. Entre los principales receptores implicados en el proceso de endocitosis destacan los receptores depuradores (scavenger receptors) presentes principalmente en macrfagos y que participan en la eliminacin de microorganismos y de lipoproteinas modificadas (oxidadas o acetiladas) (Tabla 14.4), los receptores de manosa y los receptores de glucano presentes tambin en clulas dendrticas. Los principales receptores endocticos as como sus ligandos estn representados en la Tabla 14.5 y Figura 14.9.

Fig.:14.9

Entre los receptores activadores destacan el receptor de LPS (CD14) y los receptores Tipo Toll (Toll-like Receptors, TLR). Los receptores Toll se describieron por primera vez en Drosophila (mosca del vinagre) y participan en la respuesta inmune frente a hongos induciendo la sntesis de pptidos antimicrobianos. Posteriormente se describieron sus homlogos en mamferos denominndose receptores tipo Toll (Toll-like Receptors, TLR). Poseen especificidad en el reconocimiento de Patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs) y se ha demostrado que juegan un papel importante en la iniciacin de la respuesta inmune. En mamferos, los TLRs se expresan en diferentes clulas del sistema inmune como neutrfilos, macrfagos y clulas dendrticas, adems se ha detectado su presencia en algunas subpoblaciones de linfocitos. Se localizan en la membrana de las clulas de la respuesta inmune innata y tras la fagocitosis de microorganismos los TLR pueden movilizarse y encontrarse en fagosomas (Figura 14.10). Los TLRs son protenas transmembrana tipo I. Los dominios extracelulares poseen repeticiones ricas en leucina y presentan una estructura muy conservada entre insectos y humanos. El dominio intracelular tiene homologa con el de los receptores para IL-1 y se denomina TIR (Toll-IL-1R). Este dominio TIR se asocia a protenas adaptadoras con un elevado grado de homologa como es la protena MyD88.

Fig.:14.10

Los diferentes TLRs identificados hasta el momento difieren en los ligandos que reconocen, en el patrn de expresin y probablemente los genes que inducen. Los TLRs estn implicados en el reconocimiento de una gran variedad de PAMPs. En mamferos se han identificado diez receptores tipo Toll si bien algunos de los ligandos no han sido aun identificados (Tabla

14.6). Los TLR se pueden asociar a otras molculas o co-receptores para el reconocimiento de microorganismos. As, TLR4 reconoce LPS tanto en macrfagos como en linfocitos B y requiere la asociacin con CD14 y otras protenas como MD2 en macrfagos o MD1 y RP105 en linfocitos B.

TABLA 14. 6 Receptores tipo toll (TLR) en mamferos Tipo TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Ligandos Lipoprotenas peptidoglicano, lipoprotenas dsRNA LPS, cido lipoteicoico flagelina bacteriana Peptidoglicano Desconocido Desconocido CpG DNA Desconocido

La activacin del TLR, tras reconocer a su ligando especfico, induce una cascada de seales intracelulares. Los TLRs interaccionan a travs de su dominio TIR con la protena adaptadora MyD88. MyD88 se une por su dominio de muerte a IRAK, una serin treonin kinasa, que se autofosforila. Tras la unin de IRAK con TRAF6 se inicia la cascada TRAF6-IkK. IkK activado fosforila IkB e induce su degradacin y la liberacin de NFkB que se transloca al ncleo e inicia la transcripcin y sntesis de genes. La activacin de los TLR estimula la produccin de citoquinas y quimioquinas, as como inducen la expresin de molculas co-estimuladoras. Adems, pueden inducir la sntesis de pptidos antimicrobianos con capacidad de lisar microorganismos (Fig.14.11). La activacin de los TLRs en las clulas dendrticas induce su maduracin, produciendo cambios en la expresin de receptores de quimioquinas que van a favorecer su movilizacin a los ganglios linfticos, produccin de citoquinas proinflamatorias (IL12, TNF-alfa) y aumento de la expresin de molculas co-estimuladoras (CD40, CD80, CD86) Las clulas dendrticas maduras poseen mayor capacidad de actuar como APC y estimulan a los linfocitos T e inician la respuesta inmune adaptativa. Por tanto, la activacin de los TLRs sirve de enlace entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa
Fig.:14.11

En la regulacin de la respuesta inmune innata mediada por macrfagos intervienen tambin receptores inhibidores. Entre ellos, los macrfagos expresan receptores ILT (Ig-like transcripts) as como el receptor recientemente identificado SIRPa (signal regulatory protein a) que poseen dominios ITIM (Immune receptor tyrosine-based inhibitory motif). El ligando de SIRPa es CD47 (IAP, integrin associated protein) que constituye una protena de membrana ampliamente expresada. La interaccin de CD47 con SIRPa bloquea la activacin celular va

PRRs (Figura 14.12). Estos receptores inhibidores expresados en las clulas de la respuesta inmune innata son capaces de inhibir la destruccin de componentes propios del organismo.
Fig.:14.12

Opsonizacin. La fagocitosis es el proceso de ingestin e internalizacin mediado por clulas especializadas de material que incluye microrganismos vivos, clulas alteradas y trozos de tejidos. La fagocitosis se incrementa si el material est recubierto por ciertas protenas plasmticas llamadas opsoninas, llamndose en este caso a este proceso de opsonizacin. Las opsoninas ms importantes son: anticuerpos especficos de clase IgG y fragmentos activado del sistema del complemento C3 (C3b) y su forma inactiva (iC3b) y la fibronectina plasmtica que acta como coopsonina potenciando el efecto del complemento

Las opsoninas son ligandos para receptores especficos de la membrana leucocitaria: la IgG se une a los receptores Fc, y el C3b, el iC3b y la fibronectina a sus respectivos

receptores. Una vez unidas a la membrana, las partculas son ingeridas mediante pseudpodos e incluidas en una vescula ligada a la membrana llamada vacuola fagocitaria o fagosoma. Posteriormente los fagosomas y lisosomas se unen dando lugar a los fagolisosomas y as la partcula ingerida se expone al efecto degradativo de los enzimas lisosomales, cuya actividad es ptima a un pH de alrededor de 5.0 Mediadores citolticos en macrfagos Los principales mecanismos por los que los macrfagos desarrollan finalmente su capacidad citoltica son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Liberacin de enzimas lisosmicas Metabolitos reactivos de oxgeno La formacin de xido ntrico (NO) Produccin de TNFalfa Produccin de pptidos anti-microbianos Produccin de lactoferrina

La lisis bacteriana se efecta mediante mecanismos dependientes o independientes de oxgeno. Los mecanismos dependientes de oxgeno se deben al H2O2, a radicales libres como el anin superxido O2- y el radical hidroxilo OH. Estos productos se forman en la explosin respiratoria (Figura 14.13.) que sigue a la activacin de la NADPH oxidasa de membrana tras la fagocitosis.
Fig.:14.13

En los fagosomas y en la superficie celular el anin superxido se convierte mediante la superxido dismutasa en H2O2. El anin superxido y el H2O2 son agentes con gran poder bactericida y pueden causar dao celular si salen de los fagosomas. En estos casos el H2O2 es destruido por un enzima citoplasmtico llamado glutatin peroxidasa. En la actividad bactericida del H2O2 est implicada la mieloperoxidasa, enzima que en presencia de iones haluro convierte el H2O2 en cido hipohalrico. Como el cloruro es el haluro ms abundante en los sistemas biolgicos, se produce cido hipoclrico, que es un agente bactericida muy potente. El H2O2 se puede reducir mediante la reaccin de Haber-Weiss y formar el radical hidroxilo (OH-), altamente txico. Finalmente se expone (Figura 14.14.) una visin general donde se observa que los macrfagos forman parte de la respuesta inmune innata y la respuesta adaptativa en sus dos vas, humoral y celular.

Fig:14.14

BIBLIOGRAFA

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Tema 09. Complemento

El complemento fue descubierto a finales del siglo XIX por Bordet como algo presente en el suero inmune que ayudaba o "complementaba" el efecto de los anticuerpos del suero. El complemento es termolbil de forma que si el suero es calentado al 56 o ms grados el efecto no se produce. Parte de los factores del complemento potencian la inflamacin y la fagocitosis y actan produciendo la lisis de microorganismos, lo cual es de una gran importancia en la defensa del organismo, esencialmente como parte de la respuesta innata. El complemento es especialmente importante frente a grmenes gram negativos que pueden ser directamente lisados por anticuerpos y complemento. La mayor parte de los factores del complemento son protenas plasmticas y una pequea parte de ellos son protenas de membrana. La mayora de los factores del complemento se nombran con una letra seguida de un nmero (C1, C2, C3 entre otros) y otros poseen nombres propios (factor B, properdina, etc.). Desgraciadamente los factores no se han descubierto en el mismo orden que indica su numeracin y este es uno de los elementos ms incmodos a la hora de estudiar el complemento. Por ejemplo, a la activacin de C1 sigue la de C4 y C2. Muchos de los componentes del complemento (C2, C3, C4, C6, C7, C8, Factor B y Factor I) son polimrficos. Es decir, que aunque estas molculas se encuentran en todos los individuos, no son idnticas en todos ellos existiendo diferencias allicas de unos a otros. Estas diferencias se acentan entre poblaciones y razas distintas. El hepatocito es el principal productor de factores del complemento. Tambin los macrfagos activados producen la mayora de los factores del complemento en el foco inflamatorio, lo que es de gran importancia porque as se garantiza la presencia de factores del complemento en el foco inflamatorio. Las citocinas inflamatorias (IL1, IL6 y TNF) e IFN- incrementan la ntesis s de algunos factores del complemento en el hgado. ACTIVACIN DEL COMPLEMENTO En la activacin se ponen en marcha reacciones en cascada, de forma que en cada reaccin se genera un producto activo, que adems de determinar que la cadena prosiga hasta la reaccin siguiente, pude tener acciones biolgicas importantes en la defensa del organismo. (Figura 13.1). Algunos de los factores del complemento son enzimas con carcter proteoltico. Cuando uno de estos enzimas acta sobre su sustrato este se escinde en dos fragmentos. Estos fragmentos se nombran igual que al sustrato pero agregndoles una letra minscula. Por ejemplo C3 se escinde en dos fragmentos, al mayor se le llama C3b y al menor C3a. Habitualmente los dos fragmentos resultantes de reacciones de este tipo tienen actividad biolgica, si bien dichas acciones son distintas para cada uno de ellos. La activacin del complemento puede iniciarse de tres formas distintas dando lugar a lo que se viene en denominar las tres vas del complemento. Estas son: la va clsica, la va alternativa y la va de las lectinas.

La va clsica se inicia por la unin antgeno/anticuerpo, la va alternativa por las membranas bacterianas directamente y la va de las lectinas por manosa de polisacridos presentes generalmente en la superficie de bacterias. En todos estos procesos de activacin se llega a un paso en el que C3 se escinde en C3a y C3b. Despus el C5 se escinde en C5a y C5b. El C5b es el primer factor de la llamada va terminal o ltica, en la que confluyen las tres vas del complemento mencionadas (Figura 13.2) . El complemento es un sistema muy eficiente para luchar contra las infecciones. Una vez iniciado se produce una amplificacin progresiva de las reacciones que lo convierte en un fenmeno imparable hasta que consigue el objetivo de aniquilar al microorganismo que lo puso en marcha. La iniciacin por error de esta cadena de reacciones acarreara serias consecuencias para la salud. Por este motivo no es de extraar que existan tantas factores encaminados a controlar el sistema como factores tiene el propio complemento. A pesar de ello el complemento entra a veces en un crculo vicioso de activacin que puede terminar con la vida del individuo. Este es el caso de la coagulacin intravascular diseminada, aunque como indica su nombre estn involucrados otros sistemas, como el de la coagulacin, de las kininas y el fibrinoltico. (Figura 13.3). Algunos animales de presa cusan la muerte de sus vctimas inyectndoles productos que activan el sistema del complemento. El factor de veneno de cobra no es ms un anlogo del factor del complemento C3b que provoca una activacin masiva del complemento que termina causando la muerte en pocos minutos.

Va alternativa
Esta va se inicia en presencia de grmenes y no necesita la presencia de anticuerpos para activarse por lo que representa un mecanismo de defensa importante en los estadios iniciales de la infeccin, cuando an no se ha hecho efectiva la respuesta inmune humoral. El primer factor de esta va, es el C3, se est activando permanentemente pero a una tasa muy moderada. Esta baja tasa de activacin de C3, junto con otros factores de control hace que la va no se dispare y se amplifique indebidamente. La activacin y amplificacin ocurren solamente en presencia de ciertos agentes, principalmente bacterias. Por ello distinguimos dos situaciones en esta va: en estado de reposo y en estado de activacin. La va alternativa en estado de reposo En el plasma existen enzimas naturales que escinden lentamente a C3 en un proceso denominado "marcapasos de C3". Como consecuencia de esta lisis queda un pequeo fragmento C3a y otro mayor C3b. En este queda un enlace tioster expuesto. En ausencia de infeccin el C3b permanece en la fase fluida y se combina con una molcula de agua, quedando as el enlace tioster hidrolizado y el C3b inactivado (Figura 13.4) .

Va alternativa en estado de amplificacin C3b, como todos los factores del complemento, se encuentra tanto en la sangre como en todos los tejidos del organismo. En cualquier parte del organismo, por tanto, est efectundose permanentemente la escisin lenta de C3 descrita en el apartado anterior. La aparicin en la escena de un microorganismo apropiado cambia el destino de C3b pues en vez de entrar en una va de catabolismo forma un enlace covalente con la superficie del germen que amplifica la va alternativa (Figura 13.5) . Adems, otro factor del complemento, el factor B, se une a C3b, bloqueando la unin del factor H. Se forma as sobre la bacteria el complejo C3bB, significando este paso el inicio de la cascada de reacciones de la va alternativa C3bB tiene una vida media de milisegundos y esto representa un efectivo

mecanismo de control del sistema dado que si C3bB no queda adherido sobre la superficie del germen se inactivar rpidamente, disminuyendo el riesgo de que se adhiera a un componente de nuestro propio organismo. Sobre el factor C3bB acta el factor D del suero, que tienen actividad serinesterasa sobre B. La escisin de un pequeo fragmento de B (Ba) deja sobre la superficie del germen el complejo C3bBb, que ahora tiene vida media de 1 minuto (Figura 13.4). Este complejo C3bBb se denomina convertasa de C3 de la va alternativa porque posee poder hidroltico sobre C3, el factor ms abundante del complemento. La accin sucesiva de C3bBb sobre muchas molculas de C3 del entorno produce gran cantidad de fragmentos de C3b que quedan adheridos a la superficie del germen. El germen termina siendo opsonizado por cientos o miles de molculas de C3b, es decir, es "marcado" para que sea fcilmente reconocido y fagocitado por clulas fagocitarias, que poseen receptores para este C3b. En paralelo a la liberacin de C3b se producen fragmentos de C3a de gran importancia funcional como veremos despus. Existe todava otro factor, la properdina, que se une a C3bBb para dar el complejo C3bBb properdina (C3bBbP), que adquiere ahora una vida media de 5 minutos. Antiguamente a esta va se le llamaba de la properdina. Como se puede observar, los factores del complemento se van estabilizando progresivamente sobre la superficie del germen adquiriendo cada vez vida media ms larga. La fagocitosis de microorganismos opsonizados por C3b es el mecanismo de muerte ms importante de esta va alternativa. No obstante existe un mecanismo de muerte de reserva por el que esta va alternativa puede dar muerte a los grmenes incluso en ausencia de fagocitos. Cuando C3bBb se acopla con otra molcula de C3b se forma el complejo C3bBb3b que posee actividad enzimtica sobre el factor C5. La escisin de C5 es el primer paso de la va ltica que concluye con la formacin del complejo de ataque y perforacin de la membrana como se ver ms adelante.

Va clsica
Se inicia en la superficie de una clula o bacteria cuando a ella se unen anticuerpos (unin Ag-Ac) y en consecuencia se active la fraccin C1. y siempre que el anticuerpo que participe en ello sea del tipo IgM o IgG de las clases IgG1, IgG2 o IgG3. En el caso de la IgG (monomrica) se necesitan al menos dos complejos Ag-Ac cercano para que las fracciones Fc de la IgG unan y activen el factor C1. En el caso de la IgM (pentamrica) solo es necesario un complejo Ag-Ac. La unin de la Ig al antgeno, induce un cambio conformacional en los dominios de la regin Fc que permite la unin del factor C1 Activacin del factor C1 El factor C1 est compuesto por tres subunidades proteicas, C1q, C1r y C1s. El C1q est formado por cadenas polipeptdicas idnticas, cada una de las cuales posee un extremo fibroso y otro globular por donde reconoce a la regin constante de los anticuerpos (Figura 13.6). Los C1r y C1s son serinproteasas. El complejo C1 esta formado por una molcula de C1q, dos de C1s y dos de C1r. La subunidad C1q es por donde se fija al extremo Fc del anticuerpo. Este fenmeno pone en marcha la cascada de reacciones. C1q va a activar a dos subunidades C1r, que actuar sobre dos C1s que, adquieren actividad de esterasa de tipo serina, responsable de iniciar las fases siguientes. Para que se

produzca la activacin de C1q, ste debe estar unido por su regin globular al menos a dos molculas de IgG mientras que en el caso de la IgM pentamrica una sola molcula es suficiente (Figura 13.7).

Un aspecto importante para entender algunas patologas en las que se activa el complemento de forma anmala es que C1 solamente se activa cuando las regiones constantes de las inmunoglobulinas a las que ha de unirse se encuentran a una distancia apropiada sobre una superficie estable. Esto explica por qu el complemento no se activa por complejos antgeno-anticuerpo solubles en la sangre y en los lquidos biolgicos. Por el contrario, en algunas enfermedades autoinmunes los complejos antgenoanticuerpo van depositndose lentamente a lo largo de los aos en los filtros biolgicos hasta que el factor C1 acaba por encontrar las condiciones idneas para depositarse sobre dichos complejos y activarse. Estos rganos terminan siendo daados por el complemento, sin tener nada que ver con la reaccin inmune que ha dado lugar a los complejos. La activacin de C1q provoca que una molcula de C1r del complejo C1qr2s2 pierda por autocatlisis un fragmento de bajo peso molecular, quedando activada. Esta molcula activa a la otra molcula de C1r. Las dos molculas de C1r atacan a las dos molculas de C1s liberando sendos fragmentos de bajo peso ++ molecular, dejando expuestos sus dominios catalticos. La activacin de C1 es Ca dependiente. De esta forma C1s se convierte en un enzima del tipo serin-proteasa cuyo substrato son los factores C4 y C2. Activacin de C4 y C2 C1s (del complejo C1q2r2s) acta sobre la cadena de C4 produciendo su escisin en dos fragmentos, uno pequeo C4a que es una anafilotoxina de baja actividad y otro mayor C4b, que se une por enlace covalente de tipo ster o amida a la superficie celular. La vida media de C4b es tan solo de milisegundos y esto representa un mecanismo de seguridad para que la reaccin solamente progrese si se realiza sobre la superficie de un germen y otra clula. C1s tambin acta sobre C2, provocando la escisin de esta molcula en dos fragmentos, uno pequeo C2b, sin actividad de anafilotoxina, y otro mayor C2a. Este ltimo se une al C4b para formar sobre la superficie del germen el complejo C4b2a. Este complejo tiene actividad estersica y su substrato es el C3 por lo que a C4b2a se le llama convertasa C3 de la va clsica (Figura 13.8)

La unin de C2a a C4b da estabilidad al complejo C4b2a que pasa a tener una vida media de 5 minutos. De esta manera se observa como tanto en la va alternativa como en la clsica a medida que progresan las reacciones no solamente se amplifica el fenmeno sino que sus componentes se van haciendo ms estables sobre la superficie celular. El complejo C4b2a, con centro activo en C2a, acta sobre la cadena alfa del factor C3 que se transforma por protelisis en dos fragmentos, uno pequeo la anafilotoxina C3a, que pasa al medio lquido, y C3b que se une a la membrana celular mediante enlace de tipo ster o amida. El germen se ve progresivamente rodeado por cientos o miles de fragmentos C3b para el cual tienen receptores los fagocitos. El germen es as opsonizado, o lo que es igual, "marcado" para ser reconocido, interiorizado y destruido por lo fagocitos, siendo este el mecanismo de muerte ms importante del complemento. La fagocitosis de clulas mediada por C3b ilustra mejor que ningn otro fenmeno el paralelismo de las vas alternativa y clsica del complemento. Convertasa de C5 de la va clsica En un ambiente en el que se generan grandes cantidades de C3b uno de estos fragmentos se acopla con el ya existente en la membrana, C4b2a, para dar el complejo C4b2a3b, que tiene actividad enzimtica sobre C5 y se llama por eso convertasa de C5 de la va clsica. Como consecuencia de la accin de este enzima se escinden muchas molculas de C5 en un fragmento grande C5b, que queda anclado sobre la superficie de la clula y otro menor, C5a, que es la anafilotoxina con mayor actividad biolgica. La escisin de C5 en sus dos componentes es la ltima reaccin del complemento que implica hidrlisis de fragmentos y la unin de C5b a la membrana es el primer paso de la va ltica del complemento que culminar en la formacin del complejo de ataque a la membrana como veremos ms abajo.

Va de la lectina
La funcin que C1q cumple en la va clsica es reemplazada en esta va de la lectina por una protena srica de origen heptico de la familia de las colectinas llamada protena fijadora de manosa (MBP, mannose-binding protein) que puede reconocer restos de manosa en los polisacridos de membrana de una gran variedad de grmenes (bacterias, hongos, protozoos y virus). Por tanto esta va puede activarse en ausencia de anticuerpos y por tanto se puede poner en marcha incluso en individuos que no han sido previamente inmunizados.

La estructura bsica de la MBP se puede polimerizar en grado variable pero su actividad biolgica requiere al menos el grado de complejidad del tetrmero. El extremo lectina reconoce la manosa en la superficie de los grmenes y el extremo colgeno activa la cascada del complemento, si bien puede llevar a cabo otras funciones efectoras. La MBP es por tanto estructural y funcionalmente muy parecida a C1q.

La MBP se encuentra en suero asociada a una protena con actividad enzimtica parecida a C1s denominada MASP (MBP-associated binding protein, protena asociada a MBP). MASP adquiere actividad enzimtica cuando el extremo lectina de la MBP reconoce a la manosa sobre la superficie de grmenes. MASP activada escinde a C2 y C4 de forma similar a como lo hace C1s, progresando entonces la cascada del complemento de forma idntica a cmo lo hace en la va clsica. MASP existe en cuatro formas (MAS-1, 2, 3 y Map), si bien la ms importante funcionalmente es la MASP-2. La MBP, adems de su funcin en la activacin de C2 y C4, se comporta como un factor opsonizante para los grmenes, facilitando as su fagocitosis y destruccin por parte de clulas del sistema fagoctico mononuclear. (Figura 13.3)

Va ltica complemento

del

La va alterna, la va clsica y la va de la lectina confluyen en una va comn denominada va ltica por la cual se formar el complejo final con capacidad citoltica propia del final de esta cascada del complemento. Las reacciones de esta va se encuentran esquematizadas en la (Figura 13.9). El primer paso de esta va es la escisin de C5 en dos componentes, C5b y C5a. Esta escisin la pueden llevar a cabo dos enzimas, una generada en la va alterna, llamada C3bBb3b, y otra en la va clsica y en la va de la lectina, llamada C4b2a3b. Por el efecto de estas enzimas cientos o miles de fragmentos de C5b se une a la membrana y cada uno de ellos capta desde la fase fluida circundante los fragmentos C6 y C7 que ya adquieren actividad quimiotxica y de fijacin a membranas. Si al complejo C5b67 se une la fraccin C8 el complejo C5b678 adquiere capacidad citoltica gracias a que C8 modifica su configuracin espacial para ofrecer zonas hidrofbicas que facilitan su insercin en la membrana. Este complejo adquiere capacidad para interactuar con el factor C9 formando el complejo C5b6789 (Figura 13.10).

Las molculas de C9 (en nmero de 1 a 18) sufren cambios y presentan ms zonas hidrofbicas que aceleran la penetracin de este complejo en la membrana. El complejo C5b6789 recibe el nombre de complejo de ataque a la membrana. La polimerizacin de C9 crea cientos o miles de poros que ponen en contacto directo el medio intra y extracelular (Figura 13.11). Estos poros permiten el intercambio masivo de sales, iones y agua a una tasa tal que las bombas biolgicas son incapaces de mantener los gradientes de concentracin trans- membrana y por tanto tambin las diferencias de potencial. Esto significa el derrumbe osmtico y la lisis de la clula. Los linfocitos T citotxicos y las clulas NK producen una protena llamada perforina muy similar a C9 y que al igual que sta se polimeriza sobre la superficie de las clulas diana atacadas por estos linfocitos. Codificacin gentica de las fracciones del complemento. Las molculas C2, C4 y el factor B (Bf) son codificadas por genes ubicados en el cromosoma 6, entre los loci HLA-B y HLA-DR. Los factores B y C2 son codificados por un solo locus y existen dos loci para C4, C4a y C4b. En el brazo corto del cromosoma 1 del hombre se localizan los genes que codifican las cadenas alfa y beta de C8 y de C1q. Los genes C6 y C7 (originados por duplicacin) se encuentran en el cromosoma 5. En el brazo largo del cromosoma 1 se encuentra la regin RCA, que contiene genes ligados que codifican protenas reguladoras como: CR1, CR2, DAF, H, C4BP y MCP. Receptores para del complemento factores

Muchas de las funciones del complemento se llevan a cabo tras la unin de fragmentos de algunos factores del

complemento a receptores presentes en la superficie de algunas clulas. En la (Tabla 13.1) se describen muchos de estos receptores.

FUNCIONES DEL COMPLEMENTO

El complemento posee una extensa variedad de funciones, esencialmente dirigidas a la eliminacin de microorganismos y que actan como parte de la respuesta inmune innata o potenciando la accin de los anticuerpos en la respuesta inmune humoral. Entre ellas destacan las siguiente acciones Citoltica, Anafilotxica, Quimiotxica y Facilitadora de la fagocitosis (opsonizacin)

A estas acciones se pueden unir otras tales como como funciones de aclaramiento de inmunocomplejos y apoyo a la activacin de linfocitos B. En suma, todas estas acciones hacen que el complemento sea un factor fundamental potenciando la inflamacin por diferentes mecanismos, fenmeno bsico en la defensa frente a infecciones. A continuacin se analizan cada una de estas funciones. Accin citoltica del complemento La lisis directa de un gran nmero de bacterias, tales como bacteridium, salmonella, shigella, escherichia, vibrio, treponema y otras, se desarrollan por los cambios electrolticos y osmticos que producen cientos o miles de poros formados por el complejo de ataque a la membrana C5b6789 (MAC) que ha sido analizado en apartados anteriores cuando ha sido estudiada la va ltica del complemento. Este proceso de destruccin directo mediada por el complejo de ataque a la membrana se denomina citotoxicidad dependiente del complemento. Accin facilitadora de la fagocitosis Como hemos vistos a lo largo de las vas del complemento algunos factores tras su activacin se asientan de forma estable sobre la superficie de los grmenes. Los grmenes quedan as opsonizados, un trmino que etimolgicamente significa marcado para ser comido. Los factores del complemento que llevan a cabo este marcaje se llaman opsoninas y entre ellas se encuentran factores del complemento propiamente dichos como C1q, C3b, C5b67, C5b6789, o productos de degradacin del complemento que quedan igualmente unidos a la superficie celular y sirven tambin de marcadores, como iC3b, C3d y C3dg. El reconocimiento, fagocitos y destruccin intracelular de los grmenes portadores de opsoninas en su superficie lo llevan a cabo distintos tipos de clulas que poseen receptores para dichas opsoninas (Figura 13.12). Los receptores involucrados en el reconocimiento de opsoninas son CR1, CR3, CR4 y C1qR (CR, complemento receptor). CR2 no est involucrado en este proceso porque se expresa en clulas que no son fagocitarias profesionales. Tampoco estn involucrados C3aR ni C5aR porque sus ligando no quedan en ningn momento fijados sobre la superficie celular. No obstante C3a y C5a juegan un papel importante en la inflamacin porque las clulas en las que se expresan sus receptores estn muy relacionadas con este proceso.

Accin anafilotxica del complemento En algunos de los pasos de las vas del complemento se liberan pequeos fragmentos, como son C3b, C4b y C5b, con importantes funciones inductoras de inflamacin por su accin estimulante de clulas cebadas, con lo que estas liberan mediadores responsables de reacciones anafilcticas. De esta manera se provoca la contraccin del msculo liso de la parte venosa de los vasos sanguneos de la zona infectada con lo se produce una vasodilatacin y por consiguiente aumento de la permeabilidad del vaso. Esto facilita la llegada de ms fagocitos y ms factores del complemento desde la sangre (Tabla 13.2). En su conjunto, la accin de las anafilotoxinas, junto con la de las citocinas de inflamacin (IL-1 y TNF), pueden explicar de forma lgica los signos locales de la inflamacin tales como enrojecimiento, aumento de tamao, aumento de temperatura y dolor. Accin quimiotctica del complemento Tambin ciertos factores liberados en las reacciones del complemento poseen acciones quimiotcticas, atrayendo clulas al foco inflamatorio donde se estn produciendo. Entre ellos destaca el fragmento C5a frene al cual las clulas fagocitarias poseen receptores de forma que cuando en un foco de infeccin se liberan y se difunden se movilizan los fagocitos hacia ese lugar. Aclaramiento de inmunocomplejos Los eritrocitos, mediante su receptor CR1 y a travs del factor C3b unido a inmunocomplejos circulantes, hacen que stos sean eliminados desapareciendo su peligrosidad para el organismo. Este proceso ocurre en el hgado o bazo donde los inmunocomplejos son liberados por los eritrocitos. As a su paso por por el hgado o el bazo, los macrfagos de estos rganos, mediante sus receptores CR1, CR3 o CR4, unen los inmunocomplejos a travs de C3b (o mediante receptores para Fc a travs de IgG) y los fagocitan quedando libres los eritrocitos para captar nuevos inmunocomplejos. Siendo el hemate la partcula celular ms abundante de la sangre es fcil entender la eficiencia de este mecanismo (Figura 13.13). Estimulacin de la respuesta inmune humoral

Los linfocitos B poseen un receptor (CR2) para varios subproductos del complemento, entre ellos C3d. Cuando una bacteria opsonizada por C3d es reconocida por los anticuerpos de superficie de un linfocito B esta clula recibe las dos seales que necesita para activarse, una seal por sus anticuerpos de membrana y otra por el receptor para C3d. Esto hace que el linfocito experimente una expansin clonal que ir seguida de transformacin en clulas plasmticas secretoras de anticuerpos dirigidos contra el germen que inici la reaccin. MECANISMOS DE REGULACIN DEL COMPLEMENTO Dado el gran potencial lesivo del sistema del complemento, ste debe de encontrarse estrechamente regulado por diversos mecanismos y molculas (Tabla 13.2), al objeto de es evitar la lisis de las clulas autlogas del individuo donde asienta. El mecanismo ms simple de regulacin es la baja concentracin y labilidad de muchos de sus factores, sin embargo existen factores que actan regulando la cascada de l complemento en distintos puntos estratgicos. Los principales puntos de accin de estos factores se encuentran inhibiendo el C1, el C4, el C3 o inhibiendo el MAC. Inhibicin de C1. En este fenmeno interviene el inhibidor de la C1 esterasa (C1inh) que bloquea la formacin de C3b convertasa de la va clsica por su capacidad de unin y neutralizacin de los fragmentos C1r y C1s. En los casos de deficiencia en C1inh aparece el edema angioneurtico hereditario, porque el C1 activado degrada elevadas cantidades de C2 produciendo un acumulo de C2b. Este factor es degradado anormalmente por plasmina lo que da lugar a C2-Kinina que es un potente vasodilatador y aumenta la permeabilidad vascular produciendo los edemas caractersticos del cuadro clnico mencionado. Inhibicin de C4. El C4 puede ser inhibido por el factor C4BP (C4-binding protein) tiene la capacidad de captar C4b facilitando su disociacin del complejo C4b2a e inhibiendo, por tanto, la actividad de convertasa de C3.El factor I (FI) es una esterasa de tipo serina que circula en forma activada. El C4b disociado es susceptible de ser atacado por el factor I y ser degradado en C4c y C4d.Los receptores de membrana DAF (factor acelerador de la degradacin) y la MPC (cofactor protenico de membrana) se encuentran ampliamente distribuidos en clulas inmunes y no inmunes. Tienen la capacidad de inhibir la unin, facilitar la disociacin de C4b y C2a (DAF) o favorecer que el factor C4b pueda ser degradado por el FI (MCP). Estos receptores son de gran importancia en los mecanismos de prevencin de lisis de las clulas autlogas. Inhibicin de C3. La regulacin de C3, al ser ste el factor central en la activacin del complemento, es probablemente el mecanismo de regulacin ms importante. En este sentido interviene: El factor H (FH) es una protena plasmtica homloga que tiene la capacidad de unir C3b en la fase fluida. Otro regulador importante es el Factor I que ataca entonces C3b liberando una pequea fraccin C3f y convirtindolo en iC3b. Un defecto en este tipo de regulacin acontece en un tipo de glomerulonefritis (membranosa tipo II), en la que aparecen autoanticuerpos (factores nefrticos) que se une al complejo C3bBb, estabilizndolo y hacindolo resistente a la accin de FH. Los receptores de membrana CR1, DAF y MCP actan sobre el C3b de forma semejante a su actuacin sobre C4b: inhiben la unin o facilitan la disociacin C3bBb (CR1, DAF) o actan como cofactores del factor I en la degradacin de C3b unido a la membrana (CR1, MCP). En este caso C3b tambin se degrada a iC3b, sobre el que el factor I puede seguir ejerciendo su actividad cataltica originando las fracciones C3c y C3dg.Todos estos mecanismos inhiben la capacidad de C3b de formar convertasa de C5, as como de que C3b medie la adherencia celular. Sin embargo iC3b s mantiene la capacidad de adherencia a clulas fagocticas por los receptores de estas clulas para iC3b (CR1, CR3 y CR4) Inhibicin del MAC. En este sentido actan o La protena S (vitronectina) es una glucoprotena plasmtica con capacidad para unirse

o o

al complejo C5b67 impidiendo que ste se una a la membrana celular. El CD59 que es una protena ampliamente distribuida en las membranas celulares que inhibe la insercin de C9 en el complejo C5b-8. El factor de restriccin homloga (Homologous Restriction Factor, HRF) tambin est ampliamente distribuido en la membrana de las distintas clulas y presenta una funcin equivalente al CD59.L

Proteccin de lo propio, lisis de lo extrao Se piensa que los factores reguladores DAF, HRF y CD59actan exclusivamente en la inhibicin de la lisis de las clulas del propio organismo donde asientan. Estas protenas de membrana se detectan fundamentalmente en eritrocitos y clulas endoteliales que son las clulas que se encuentran en mayor peligro de autolisis por el complemento. En la enfermedad hemoglobinuria paroxstica nocturna hay un defecto congnito de DAF, HRF y CD59 producindose una anemia debido a la lisis de los hemates, lo cual ocurre frecuentemente durante la noche. Lgicamente los grmenes no presentan en sus membranas molculas reguladoras de la autolisis por lo que no pueden protegerse de los efectos lticos del complemento. Esto determina, por tanto, un mecanismo rudimentario de discriminacin entre lo propio y lo no propio. En algunos grmenes la simple presencia de una cpsula puede ser un mecanismo de resistencia al complemento. Otros grmenes presentan protenas de membrana que impiden el desarrollo del MAC o enzimas que degradan los factores del complemento o liberan factores proteicos que inactivan las convertasas de C3, etc.

BIBLIOGRAFA
o o o o o Epstein, J., Eichbaum, Q., Sheriff, S., and Ezekowitz, R.A.B.:The collectins in innate immunity. Current Opinion in Immunology,1997. 8:29-35. Carroll MC. The complement system in regulation of adaptive immunity. Nat Immunol. 2004, 5: 981-6. Carroll MC. The complement system in B cell regulation. Mol Immunol. 2004, 41: 141-6. Fujita T, Endo Y, Nonaka M. Primitive complement system--recognition and activation. Mol Immunol. 2004,4 1: 103-11. Fremeaux-Bacchi V, Dragon-Durey MA, Blouin J, Mouthon L, Fridman WH. Investigation of the complement system in clinical practice, Ann Med Interne (Paris). 2003, 154: 52940. Nonaka M, Yoshizaki F. Evolution of the complement system. Mol Immunol. 2004, 40: 897-902

Al unirse a la accin, muchos factores del complemento son escindidos proteolticamente en dos fragmentos a y b. Los fragmentos b, normalmente ms grandes se unen al complejo molecular en formacin. Al unirse adquieren capacidad enzimtica para actuar sobre el siguiente componente. Los fragmentos a, ms pequeos migran y sirven como agente quimiotcticos para clulas de la inflamacin.

El Sistema de Complemento y sus Receptores.

(Factores; Vas de activacin; Protenas reguladoras; Receptores)

a etc

Las 3 vas de activacin del Complemento

La va Clsica de activacin
Comprende 4 componentes ( C1 {q,r,s}, C2, C3, C4 ) Se inicia por unin de C1q a complejos Ag-Ab. La unin de Ab al Ag causa cambios conformacionales en su porcin Fc del Ab unido, permitiendo la unin de C1q. C1q no se une a anticuerpos libres. Los dems componentes se aaden en serie. Los isotipos IgG e IgM (en menor medida IgA) son capaces de unir C1q.

Resultados de la va Clasica
Elevada produccin de C3b y unin de C3b a superficies bacterianas Produccin de C4b2b3b, que funciona como convertasa de C5 capaz de activar a C5 y comenzar la va ltica.

La va de las Lectinas
C1q se une al Ag-Ab. C1(rs) hidroliza C4 en C4a + C4b C4b se une a la superficie bacteriana C2b se une a C4b y forman C4b2b convertasa de C3 C4b une C2 y C1s lo hidroliza en C2a + C2b C4b2b hidroliza C3 en C3a + C3b Produccin amplificada de C3b y unin a superficies. Comprende 4 componente: MBL MPB (lectina unidora de manosas), MASP (sern proteasa activada por la anterior), C2 y C4 Iniciada por la unin de MBL a manosa de superficies microbianas. C4 y C2 se unen, de modo similar a lo que ocurre en la va clsica. Produciendo la misma convertasa de C3: C4b2b que induce produccin de C3b.

Algunos C3b se unen a C4b2b y forman C4b2b3b

C4b2b3b es la convertasa de C5
7 8

La va Alternativa
Comprende 4 componentes: ( C3, factor B, factor D, factor P ) Iniciada por la unin de C3b a superficies bacterianas (va clsica) o de modo espontneo. El resto de los componentes se aaden en serie.

Resultados de la va Alternativa
Elevada produccin de C3b y unin de C3b a superficies microbianas. Produccin de C3Bb3b, que funciona como convertasa de C5 capaz de activar C5 e iniciar la va ltica.

C3b se une a superficies microbianas

C3b une el factor B para formar C3bB

El Factor D hidroliza al factor B en Ba + Bb C3bBb es convertasa de C3 Forman C3bBb3b convertasa de C5

Produccin de C3b amplificada. Unin de C3b a superficies amplificada. Algunos C3b se unen a C3bBb.
10

El Complejo de Ataque a Membranas (MAC)

Comprende 5 componentes ( C5, C6, C7, C8, C9 ) Iniciado por activacin del componente C5 por las convertasas de C5 producidas en las
vas clsica y lectinas va alternativa (C4b2b3b) (C3bBb3b)

Los otros componentes se aaden en serie.

Ambas convertasas de C5 hidrolizan C5 en C5a + C5b C5b forma un complejo con C6 y C7 que se une a la superficie microbiana. C8 y mltiples C9s se unen y forman un poro que atraviesa la pared microbiana (ver figura siguiente).

11

12

Fragmentos pequeos del Complemento actan como Anafilotoxinas

Mediadores solubles de la inflamacin C5a > C3a > C4a Inducen liberacin de Histamina por los mastocitos C5a Atrae y activa granulocitos

Numerosas Clulas tienen Receptores para fragmentos del Complemento

Para fragmentos b: estimulan la captura y fagocitosis de microbios con C3b o C4b en su superficie Para fragmentos a: inducen degranulacin de mastocitos; atraen y activan neutrfilos.

Clulas con receptores de complemento ( CR )

Macrfagos y monocitos Granulocitos (Neutrfilos, Basfilos y Eosinfilos) y Mastocitos Eritrocitos Linfocitos B Plaquetas Clulas endoteliales

13

14

Regulacin del sistema de Complemento

Su capacidad destructiva, hace que los componentes activados de complemento puedan construir peligro para la vida. Las clulas de mamferos tienen en superficie numerosas molculas que pueden inactivar o destruir los componentes del complemento 16 que se les unen.

La fagocitosis es especialmente efectiva cuando las clulas fagocticas pueden utilizar ambos, un receptor para Fc y un receptor para complemento (CR1, CR3, CR4) pues el patgeno a destruir est doblemente sealizado.

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17

Factores que dirigen la respuesta inmune

INMUNOLOGA GENERAL 2006-2007

Tema 21. La Respuesta Inmune (I)
1. Primera barrera de defensa: epitelios 2. Mecanismos innatos en la respuesta inmune Complemento Macrfagos 3. Consecuencias de los mecanismos innatos 1.-Inflamacin aguda 2.-Efectos sistmicos 3.-Protenas de fase aguda 4.-Activacin de clulas NK

* Naturaleza de patgeno:

-Ruta de infeccin -Tejido diana -Intracelular vs. extracelular -Estructura de la pared celular -Ciclo vital / reproductivo

* Componente inmune que inicia la respuesta * Gentica (MHC, etc.) del individuo:
* Azar
-Repertorio inmune (Igs, TcR), etc.

Comparacin entre Inmunidad innata y adaptativa

Innata
Tiempo de respuesta Especificidad Respuesta a la Infeccin repetida Horas Limitada y fija Idntica respuesta primaria

Adaptativa
Das Muy diversa, mejora en el curso de la respuesta inmune Mucho ms rpida que la respuesta primaria

Barreras no especficas a la infeccin por microorganismos patgenos

Los epitelios que recubren la piel y las mucosas (digestiva, respiratoria y genito-urinaria) constituyen la primera barrera de defensa del organismo frente a los microorganismos Mecnicas o fsicas: pared sin fisuras, arrastre por cilios (o peristaltismo) Qumicas: lisozima, jugos gstricos, defensinas, colectinas, pH bajo Biolgicas: flora normal (compite con patgenos por los sitios de unin y por nutrientes)

Inmunidad Innata: humoral y celular

Colaboracin y especializacin en el sistema inmune.

Mecanismos de la Inmunidad innata

Las molculas LPS de los microorganismos son reconocidas por molculas plasmticas (MBL), que pueden activar el complemento. Los fagocitos reconocen LPS de pared microbiana (diferentes en clulas de mamferos) mediante receptores de superficie tipo TLR, dando lugar a la activacin y secrecin de citocinas. Las clulas infectadas por virus, reconocen la presencia del DNA viral, y responden produciendo IFND e IFNE Las clulas NK reconocen la expresin reducida de molculas MHCclase I y responden eliminando dichas clulas.

Factores vasoactivos y quimiotcticos aumentan el flujo sanguneo y la permeabilidad capilar (exudado y clulas migran al sitio de inflamacin)

Lesin endotelial

Activacin factor de Hageman Cascada Sistema de de coagulacin fibrina Trombina Fibrinopptidos +cogulo fibrina Plasmina

Precalicrena

Calicrena

Macrfagos presentan antgeno a linfocitos T

Bradicinina

Ciningeno

Degradacin de fibrina
Permeabilidad vascular Quimiotaxis Activacin complemento

LPS LPSR

PCR Reconocimiento por sistema inmune innato

Permeabilidad vascular Vasodilatacin Dolor Contraccin m. liso

CR MR TNFD, IL-1, IL-6

La lesin tisular induce formacin de mediadores enzimticos plasmticos producidos por los sistemas de las cininas, de la coagulacin, fibrinoltico, y del complemento

Sangre
Macrfago

-Rubor -Calor -Tumor -Dolor -Prdida funcin

Fosfolpidos de membrana
Fosfolipasa Acido araquidnico Vas de la ciclooxigenasa Prostaglandina
G2

Va de la lipooxigenasa Leucotrieno
A4

Patgeno

Complemento

Tromboxano
Macrfago
Vasoconstriccin Agregacin de plaquetas Otros efectos

Prostaglandinas
Permeabilidad Dilatacin vasos Quimiotaxis neutrfilo Otros efectos

Leucotrienos
C4, D4, E4 SRS-A Contraccin de Msculo liso bronquial

Leucotrieno
B4 Quimiotaxis de neutrfilos Agregacin plaquetas Quimiotaxis eosinfilo Activacin neutrfilo

Barreras no-especficas Piel y mucosas

La desintegracin de fosfolpidos de membrana genera mediadores de la inflamacin, como tromboxano, prostaglandinas, leucotrienos y factor activador de plaquetas (PAF)
Inflamacin innata e inicio de la respuesta adaptativa (mastocitos se degranulan mejor en presencia de IgE)

SANGRE

TEJIDOS

Efectos de las citocinas de la inmunidad innata

-IL-1 -IL-6 -IL-12 -IL-15 Fiebre y protenas de fase aguda Fiebre y protenas de fase aguda Estimulacin de clulas NK Proliferacin de clulas NK -IL-1, IL-6 y TNFD sobre hipotlamo, alteran metabolismo de los depsitos grasos y msculo. -Elevacin de temperatura corporal. -El aumento de temperatura inhibe el crecimiento y la reproduccin de organismos infecciosos.

Fiebre (temperatura elevada)

-IFND,E Resistencia a infeccin viral -TNFD Vasodilatacin y permeabilidad endotelial, reclutamiento y activacin de leucocitos. Mediador primario, respuestas a Gram negativos

Revisin general de clulas y mediadores de la inflamacin aguda local: la lesin tisular induce la formacin de productos del complemento, que actan de opsoninas, anafilotoxinas y quimiotaxinas

Citocinas Secretadas por macrfagos: Efectos locales y sistmicos

IL-1E CXCL8

Protenas de Fase Aguda

IL-6 es muy importante en la produccin de estas protenas Secretadas por higado tras la induccin por citocinas de macrfagos activados: sus niveles aumentan rpidamente tras la infeccin. Protena C-reactiva: se une a fosforilcolina de paredes microbianas y puede activar el C por unin de C1q. Tambin acta como opsonina. Lectina de unin a Manosa (MBL): une manosa en superficies microbianas y activa el C por va de las lectinas. Fibringeno

Fiebre Hipotlamo

Reaccin Inflamatoria Aguda local Higado

Protenas de Fase aguda

Leucocitosis Mdula sea

Revisin general de los rganos y mediadores implicados en una reaccin sistmica de fase aguda Los principales mediadores son IL-1, IL-6 y TNFD producidos localmente por los macrfagos.

IFN-D/E de clulas infectadas: -inhiben la replicacin viral -aumentan la expresin MHC-I -activan los linfocitos NK -aumentan la capacidad fagoctica de macrfagos

das

Mecanismos inmunes que se activan tras una infeccin o contacto viral

Actividad citotxica de clulas NK (restringida a clulas propias alteradas)

INMUNOLOGA GENERAL 2006-2007

Tema 22. La Respuesta Inmune (II)

Segn clula presentadora de antgeno, tipo de patgeno, y citocinas de inmunidad innata

IL-4

IL-12 IFNJ

1. La respuesta inmune adaptativa: Linfocitos T cooperadores Linfocitos B y centros germinales 1. Fases de la respuesta inmune 3. Aprovechamiento de la respuesta inmune especfica 1.-Vacunacin: principios 2.-Pautas de vacunacin

Respuestas Th1 o inflamatorias, mediadas por clulas (MO, NK, CTL), y respuestas Th2 o humorales, productoras de anticuerpos. Aunque la mayor parte de las respuestas inmunes implican a ambas.

clula B

clula T

rganos Linfoides secundarios

TH2 y clulas plasmticas permanecen en rganos L 2

Reconocimiento, activacin y efectos de la inmunidad celular.

Tras el encuentro con el antgeno, los linfocitos T necesitan 5-7 das para generar clulas efectoras. Subtipos y principales funciones biolgicas.

Salida de poblacin de clulas B (afinidad =Ka2>Ka1)

Las clulas B estimuladas por antgeno abandonan la sangre hacia los centros germinales de los ganglios: 1) Reducen la expresin de Ig de superficie y sufren hiper-mutacin somtica (divisin celular) 2) Interactan con clulas dendrticas foliculares. Los centrocitos de alta afinidad compiten por la unin a complejos Ag-Ac. 3) Las clulas seleccionadas reciben 2 seal de clulas TH2, que inducen cambio de clase, y diferenciacin a clulas B de memoria, o clulas plasmticas (que migran a la mdula sea).
11.17

centrocito

Centro germinal

Las respuestas inmunitarias adaptativas dependen del tipo de patgeno y del linfocito T activado

Ingreso a la poblacin de clulas B (afinidad =Ka1)

La respuesta inmune humoral, mediada por anticuerpos, se desarrolla en los rganos linfoides secundarios

Citocinas necesarias para la proliferacin y el cambio de clase durante diferenciacin de clulas B en clulas plasmticas.

Clula B plasmtica Clula B proliferante (centrocito)

Diagrama esquemtico de ganglio linftico perifrico indicando sitios anatmicos donde ocurre la activacin, proliferacin y diferenciacin de las clulas B

Clula B activada (centroblasto)

Caractersticas de la Respuesta Inmune

1) Especificidad: 2) Diversidad: 3) Memoria:
garantiza que microorganismos

Mdula sea
Maduracin y seleccin clonal de linfocitos B

Tejido linfoide perifrico

Clula memoria

distintos estimulen respuestas inmunes especficas gran repertorio de linfocitos/receptores

respuestas ms rpidas e intensas frente a

Clula madre

exposiciones repetidas al mismo microorganismo

4) Especializacin: 5) Autolimitacin:

optimiza la eficacia/respuesta

frente de los microorganismos distintos (adaptacin) mecs de homeostasis (regulacin) impide la

Maduracin a clulas B comprometidas con antgeno Proliferacin y diferenciacin dep. de antgeno en clulas plasmticas y de memoria

6) Ausencia de autorreactividad:

produccin de lesiones durante respuestas (tolerancia)

Fases de la Respuesta Inmune

1) Reconocimiento del antgeno
Hiptesis de la seleccin clonal

2) Activacin de linfocitos: dos seales/danger

Sntesis de nuevas protenas (citocinas, etc.) Proliferacin celular (expansin clonal) Diferenciacin de clulas efectoras y memoria Homeostasis (disminucin de las respuestas)
Diferencias entre una respuesta humoral primaria (baja magnitud y corta duracin) y secundaria (ms intensa, dura meses o aos) frente a un antgeno inyectado

3) Efectora efectora: eliminacin de antgenos

Clulas T (CD4+TH1 y TH2, CD8+), anticuerpos

15 TOLERANCIA INMUNOLOGICA
R.Pujol-Borrel, F.Garca-Cozar, J.Pea y M.Santamara
Una caracterstica fundamental del sistema inmune es la de no reaccionar frente a los componentes propios del individuo, an cuando posee la cualidad de responder frente a cualquier antgeno extrao al mismo. Esta capacidad de reconocimiento y aceptacin de los componentes propios del organismo se debe al fenmeno de tolerancia inmunolgica. Gracias a este fenmeno, de entre los receptores especficos de antgeno producidos al azar, se produce una inactivacin fsica o funcional de todos aquellos que reconozcan antgenos propios. Hoy se entiende por tolerancia inmunolgica la ausencia especfica de respuesta del sistema inmune frente a un antgeno, ya sea propio (autoantgeno) o extrao.
Fig.:15.1

En condiciones fisiolgica la tolerancia inmunolgica a los componentes propios se adquiere en edades tempranas de la vida Por ejemplo un injerto de piel entre ratones que expresan distintas molculas de histocompatibilidad es rechazado de manera sistemticas, pero cuando el injerto es realizado en ratones recin nacidos (Ffigura 15.1), el injerto no es rechazado, lo que se interpreta como que ha habido una tolerancia al mismo. La naturaleza inmunolgica de la tolerancia qued demostrada mediante experimentos en los que linfocitos de ratones sensibilizados frente a un injerto se transfieren a otro ratn de la misma cepa al tiempo que se le practica un injerto. En este caso, el rechazo se produce de una forma mucho mas rpida que en el primer transplante, lo que demuestra que los linfocitos estn implicados en este fenmeno (Figura 15.2). Mediante estos experimentos realizados por Medawar en los aos 40, pudo demostrarse que el fenmeno de aceptacin y en consecuencia el de rechazo de injertos de piel esta regido por el sistema inmune.

Fig15.2

Las caractersticas de la tolerancia son, en consecuencia es: 1. 2. 3. 4. Un fenmeno de naturaleza inmunolgica Especfica frente a cada antgeno Adquirida y es Inducida ms fcilmente en linfocitos inmaduros.

Originariamente se pensaba que la tolerancia se produca exclusivamente a nivel de rganos linfoides centrales, por la deleccin de los clones autoreactivos en el timo y en la mdula sea (clones T y B respectivamente) y que el adulto no posea clones con capacidad autorreactiva, por lo que en circunstancias normales no haba reacciones del sistema inmune propio con componentes del mismo individuo, salvo en situaciones de enfermedades autoinmunes. Sin embargo hoy sabemos que en el adulto hay clones con capacidad de reconocer a los componentes propios, lo que quiere decir, en primer lugar que en el timo y en la mdula sea no se ha producido una eliminacin completa de todos ellos y segundo que en el adulto, de alguna manera, los clones autorreactivos que persisten tienen que estar controlados (regulados) a nivel perifrico para evita una autodestruccin masiva del organismos donde asientan. Efectivamente hoy sabemos que el individuo desarrolla tolerancia frente a lo propio mediante deleccin de los clones autorreactivos a nivel central y tambin que para aquellos clones que escapan a sta deleccin, existen mecanismos perifricos de control mediante ignorancia clonal, anergia u otras formas de bloqueo funcional de los mismos. As los principales mecanismos de adquisicin y mantenimiento de la tolerancia son: deleccin, anergia e ignorancia clonal. Cada uno de ellos puede intervenir a nivel central (timo o mdula sea para las clulas T y B respectivamente) o perifrico (rganos linfticos secundarios y otros tejidos). Existiran adems otros mecanismos: supresin e interacciones idiotpicas, que si bien tendran un papel en la regulacin de la respuesta inmune, se ha propuesto que puedan tambin intervenir en el mantenimiento de la tolerancia (Tabla 15.I). TABLA 15.1 Tipos de tolerancia y mecanismos que la producen Linfocitos Linfocitos T Tipo Central Perifrica Central Perifrica Mecanismo Deleccin clonal Indiferencia clonal Anergia clonal Deleccin clonal Anergia clonal

Linfocitos B

TOLERANCIA T Tolerancia central Como se ha estudiado previamente en captulos anteriores, en el timo tienen lugar dos procesos aparentemente contradictorios: la seleccin positiva de aquellos linfocitos cuyo receptor es capaz de reconocer las molculas propias del MHC y la seleccin negativa que consiste en la eliminacin de las clulas T autorreactivas (Ffigura 15.3). La muerte de los timocitos en todas estas circunstancias se consigue por apoptosis. El mecanismo predominante en la adquisicin de tolerancia a nivel central -aunque no el nico- es la deleccin clonal. Las evidencias que apoyan este hecho, son: 1. 2. 3. La gran proporcin de timocitos que mueren en el timo sin pasar a la periferia. La aparicin de enfermedades autoinmunes en animales timectomizados. La demostracin de muerte intratmica de aquellos timocitos que reconocen determinados autoantgenos. Esto pudo demostrarse en ratones transgnicos que expresan de forma predominante TCR autorreactivos, los timocitos portadores de

estos TCR no pasan a la perifrica sino que mueren en el timo. Efectivamente, cuando se inyectan linfocitos de ratones machos (expresan los antgenos H-Y) a hembras (no expresan los antgenos H-Y), estas ltimas generan clulas T con actividad anti H-Y. Esto se debe a que en las hembras al no poseer el antigeno HY no se realiza la deleccin correspondiente de los timocitos que reconocen ste antgeno en el timo. Por otra parte, utilizando animales transgnicos, para el TCR anti H-Y en animales machos, no se expresan clulas T con el receptor TCR anti H-Y porque al expresarse el antgeno H-Y en el timo, se deleccionan los timocitos que reconcen el antgeno H-Y. Por el contrario en las hembras transgnicas, se observa que estas expresan clulas T con el TCR anti H-Y porque no se deleccionan en el timo al no expresar este animal los antgenos H-Y.
Fig.:15.3

4. La implantacin temprana en el timo de clulas que expresan aloantgenos (antgenos propios de un individuo pero distintos de la misma especie) determina la tolerancia hacia dichos aloantgenos. En el timo se produce tambin tolerancia mediante otros mecanismos como la generacin de clulas reguladoras y el establecimiento de anergia clonal, si bien este ltimo mecanismo, es ms importante a nivel perifrico. En la ffigura 15.4 se recoge un esquema de las diferentes formas de induccin de tolerancia.

Fig.:15.4

Tolerancia perifrica En el timo el proceso de deleccin de clones autorreactivas no puede ser exhaustivo so pena de reducir dramticamente el repertorio de linfocitos T disponible para responder a los antgenos ajenos, por lo que se mantienen en circulacin clones capaces de reconocer antgenos propios de los tejidos "perifricos". Se ha demostrado por ejemplo la existencia en animales normales de clones capaces de reconocer colgeno tipo II y protena bsica de la mielina, as como receptores de acetil colina y antgenos de los islotes de Langerhans. Normalmente estos clones autorreactivos no responden a los antgenos perifricos. Los mecanismos que subyacen a esta no respuesta especfica son muy variados y entre ellos se incluyen ignorancia clonal, anergia, deleccin, inhibicin y supresin. Ignorancia clonal Se entiende por ignorancia clonal el mecanismo por el cual los linfocitos T no detectan la presencia de clulas propias de manera adecuada. Esto podra ser por la presencia de barreras anatmicas interpuestas entre las propias clulas autorreativas los organismos y los linfocitos T o por otras causas. Entre estas causas se podran destacar que una mayor parte de las clulas parenquimatosas de los tejidos perifricos -desde las clulas musculares a las neuronas- no expresan molculas de MHC de clase II, un requerimiento esencial para el reconocimiento de los antgenos por parte de los linfocitos CD4+ de tipo colaborador. Estas clulas perifricas no expresan tampoco normalmente molculas de adhesin (por ejemplo ICAM-1) que faciliten el contacto con ellas de linfocitos o APC, ni las clulas endoteliales de los capilares que las rodean expresan niveles elevados de molculas de adhesin o de receptores de homing (receptores que participan en el anidamiento de la clula en un lugar determinado). La circulacin de linfocitos a travs de estos tejidos perifricos es, en situacin normal, muy reducida y por tanto la probabilidad de encuentro con su autoantgeno en forma inmunognica, es remota. El resultado es que los clones autorreactivos se mantendrn indiferentes frente a clulas perifricas que si bien contienen antgenos reconocibles por ellos, los mantienen en forma inmunolgicamente irreconocibles. El mecanismo de ignorancia clonal fue puesto de manifiesto cruzando una lnea de ratones transgnicos que expresaban un antgeno viral en un tejido perifrico (las clulas beta del pncreas) con otra lnea que expresaba el transgen para las cadenas alfa y beta del TCR capaz de reconocer dicho antgeno viral (de hecho un pptido) en ese contexto de MHC. A pesar de que se daban todas las condiciones para que algunos linfocitos pudieran encontrar a su antgeno "perifrico", los ratones doblemente transgnicos no reaccionaron ni mediante el establecimiento de tolerancia ni mediante una respuesta inmune a la expresin en el pncreas de la protena viral, de ah el trmino ignorancia. Slo cuando se les inocul virus a estos ratones y en el curso de la

respuesta anti-vrica, se constat una respuesta contra la protena viral de los islotes, que fueron destruidos (Figura 15.5). En la figura se expresa como un ratn transgnico para RIP-GP expresa la glicoprotena vrica exclusivamente en las clulas beta de los islotes de Langerhans (gracias al uso de un promotor que solo se transcribe en dichas clulas). El ratn transgnico TCR-GP tiene clulas T que expresan el TCR (cadenas alfa y beta) que reconoce un pptido de la glicoprotena del LCMV. Al cruzar ambas lneas de ratones transgnicos se favorece el reconocimiento de GP aunque se exprese slo en islotes pancreticos por la alta frecuencia de clulas T especficas. Sin embargo y paradjicamente, las clulas T ni se activan, ni se anergizan, ni ven su fenotipo modificado (ignorancia clonal). Con la inoculacin de virus vivo se produce una respuesta inmune contra GP y la infiltracin por linfocitos del pncreas con la consiguiente destruccin de los islotes de Langerhan (suspensin de la ignorancia clonal). En el caso particular de los animales transgnicos para el TCR (como es el caso del TCR que reconoce el antgeno GP en el ejemplo inmediatamente anterior o aquel que reconoce el antgeno H-Y al hablar de tolerancia central), hay que hacer notar que dado que este transgen codifica para las cadenas ya reordenados del TCR, aquel reordenamiento que corresponde con el TCR que reconoce a un antgeno determinado, la expresin del TcR en el estadio de timocito, evitar cualquier otro reordenamiento y por tanto prcticamente todos los linfocitos T reconocern a ese antgeno. El uso de ratones transgnicos para un determinado TcR, nos permitir estudiar lo que ocurre cuando se produce la estimulacin antignica, cosa que resulta imposible en individuos no transgnicos puesto que al estimular con un antgeno, solamente estaremos afectando a unos pocos linfocitos que en condiciones normales forman parte del clon que reconoce a cada antgeno y por tanto no podremos objetivarlo fcilmente.
Fig.:15.5

Anergia clonal Se ha demostrado que algunas clulas T circulantes autorreactivas no proliferan en respuesta a la presentacin del autoantgeno en el contexto apropiado. Se ha considerado que dichas clulas estn en una situacin de no respuesta denominada anergia, que a veces se consigue revertir experimentalmente mediante tratamiento con concentraciones altas de IL-2. Se cree que la induccin de este estado de anergia es debido a una activacin incompleta del linfocito. Este concepto se basa en la necesidad para la plena activacin de la clula T de una segunda seal al mismo tiempo que la primera seal, derivada del reconocimiento del antgeno: Los linfocitos para su completa activacin requieren, adems de reconocer el

complejo MHC-pptido apropiado (primera seal), otras seales de activacin que se han denominado seales coestimuladoras (seal 2) y que normalmente son proporcionadas por las clulas presentadoras de antgeno profesionales (es decir macrfagos y clulas dendrticas). Esta segunda seal solo se produce cuando las clulas presentadoras de antgenos entran en contacto con determinadas molculas presentes en agentes patgenos, de modo que si esto no sucede y estn presentando exclusivamente antgenos propios (procedentes por ejemplo de la fagocitosis de tejidos daados), no expresarn molculas coestimuladoras y los linfocitos que reconozcan los pptidos propios en ausencia de molculas coestimuladoras no solo no respondern sino que quedarn en una situacin de no respuesta ante ulteriores estmulos denominada anergia que en muchos casos es fundamental para prevenir la respuesta frente a antgenos propios. El factor determinante para el desarrollo de anergia parece estar relacionado con la activacin del linfocito sin que se produzca una subsiguiente proliferacin al no recibir suficiente coestimulacin para producir la IL2 necesaria (Figura 15.6). Experimentos in vitro han demostrado que la presentacin incompleta (ausencia de seal 2) mediada por clulas que carecen de dicha actividad coestimuladora o mediante el bloqueo de alguna molcula coestimuladora durante el reconocimiento antgenico, induce en los linfocitos el llamado estado de "anergia". La actividad coestimuladora mejor estudiada es la generada por la ocupacin del receptor CD28 por sus ligandos CD80/CD86 que estn presentes en la membrana de las clulas presentadoras de antgenos. Otras molculas tales como citocinas e incluso ciertas molculas de adhesin y los co-receptores CD4 y CD8, probablemente contribuyan a la segunda seal que puede variar segn el estadio madurativo de los linfocitos. Dado que en la periferia las clulas parenquimatosas, incluso cuando expresan MHC de clase II, no poseen, que se sepa, actividad coestimuladora, al interaccionar con los linfocitos autorreactivos los anergizarn. Este mecanismo se ha propuesto en base a experimentos en ratones transgnicos en los que se expresaba MHC de clase II en clulas de tejidos perifricos.
Fig.:15.6

Inhibicin clonal En el momento de la estimulacin se ponen en marcha una serie de mecanismos reguladores que terminaran por inhibir la proliferacin del clon correspondiente. De entre estos mecanismo inhibidores el mas conocido es el que implica a la molcula de superficie CTLA-4 (cytotoxic-T-lymphocyte associated protein 4) tambin denominado CD152 y del que hablaremos en el apartado dedicado a la regulacin del sistema inmune.

Supresin clonal El descubrimiento por Gershon en 1974 de que en el curso de la respuesta inmune se generaba actividad supresora, es decir, mediadores capaces de inhibir la reaccin inmunolgica en marcha, llev a la especulacin sobre la existencia de clulas T con actividad supresora de la respuesta inmune. De acuerdo con esta hiptesis existir un repertorio de clulas T supresoras (que inicialmente se pens seran de fenotipo CD8+) inhibiendo constantemente a clulas T helper autorreactivas. Las dificultades para clonar clulas T con actividad supresora, la ambivalencia de actividades supresora-colaboradora de algunos clones obtenidos- y la falta de caracterizacin a nivel molecular del fenmeno de supresin, mantiene un interrogante sobre este aspecto de la regulacin de la respuesta inmune. Siguen existiendo datos experimentales que indican que la

supresin existe, como es el hecho de que cuando a ratones con el TCR transgnico para la protena bsica de mielina se le inyecta esta protena, junto a adyuvante, se produce una encefalitis que remite espontneamente, sin embargo esta remisin no se produce si se eliminan algunas subclases de linfocitos T. Como veremos en el apartado de regulacin del sistema inmune el concepto de supresin sigue en candelero, si bien las clulas implicadas actualmente en esta forma de regulacin del sistema inmune son bien distintas centrndose ms en determinadas subclases de linfocitos CD4. TOLERANCIA B Tal como se ha demostrado repetidamente en estudios del repertorio B, entre los linfocitos B circulantes son muy numerosas las clulas capaces de reconocer autoantgenos. Afortunadamente estos linfocitos B autorreactivos no se activan por si solos ya que para la mayor parte de las respuestas, los linfocitos B requieren seales (citocinas y contacto directo) de las clulas T cooperadoras (lo que denominamos ayuda T) cuyo repertorio es mucho menos autorreactivo y est mucho mas regulado. Esta limitacin no es absoluta y de hecho falla cuando el sistema se enfrenta a un autoantgeno que contiene (en la misma molcula o en molculas fsicamente asociadas) determinantes antignicos B asociados a determinantes T no propios (el caso de un frmaco unido a una protena propia); la clula B autorreactiva puede entonces recibir ayuda para producir autoanticuerpos de una clula T que reconoce un eptopo ajeno. La alta frecuencia de linfocitos B autorreactivos se explica porque stos no sufren un proceso de seleccin negativa tan riguroso como el de los linfocitos T en el timo y de hecho se ha postulado que la autorreactividad B -de baja afinidad- es normal. Adems la generacin de diversidad de los receptores (Ig) de los linfocitos B incluye un mecanismo, la hiperrmutacin somtica, que acta en el curso de la respuesta inmune y que expandiendo de nuevo el repertorio puede generar autoanticuerpos de alta afinidad. Probablemente es por esta tendencia de las clulas B a la autorreactividad, por lo que son necesarios mecanismos de deleccin clonal y de anergia clonal de clulas B para asegurar un grado de tolerancia B. Al igual que en el caso de las clulas T, la deleccin clonal parece ser el principal mecanismo de la tolerancia central (es decir en la mdula sea) y la anergia el de tolerancia perifrica. Deleccin clonal En ratones que transgnicamente expresan anticuerpos contra antgenos de membrana celular de amplia distribucin, tales como protenas eritrocitarias y antgenos de histocompatibilidad, no se detectan en la periferia las clulas B portadoras de la Igs autorreactivas. Este hecho, junto con la dificultad para romper la tolerancia B hacia este tipo de autoantgenos sugiere la existencia de un mecanismo de deleccin clonal a nivel central. La propiedad esencial de un autoantgeno para inducir la deleccin de las clulas B parece ser su expresin abundante en la membrana celular lo que determinara la multimerizacin del receptor de la clula B, seal que en ausencia de una segunda seal (probablemente ocupacin de CD40 mediante contacto con una clula T colaboradora) determinar la apoptosis de las clulas B. Anergia clonal La intervencin de este mecanismo en el mantenimiento de la tolerancia B se ha demostrado en dos tipos de experimentos: Experimentos en cepas de ratones afectos de ciertas inmunodeficiencias y recurriendo al uso de ratones transgnicos. En el segundo caso se gener una lnea de ratones que producen transgenicamente altos niveles de lisozima de huevo de gallina (HEL, hen egg lysozyme) frente a la que resultaron ser perfectamente tolerantes. Una segunda lnea de ratones expresaban los genes reordenados codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-lisozima. Estos ratones tenan

un repertorio B prcticamente reducido a la expresin del anticuerpo anti-lisozima en todos sus linfocitos B. Al cruzar ambas lneas se mantuvo la tolerancia ante la lisozima (no haba anticuerpos anti-HEL circulantes) y aunque el repertorio B segua dominado por los linfocitos que expresaban anti-HEL, el receptor para el antgeno (BCR) de stas clulas, era incapaz de transmitir determinadas seales estimuladoras al interior de la clula. Este es el fenotipo caracterstico de las clulas B anrgicas. Sin embargo, cuando en un experimento continuacin de ste, HEL se expres como protena de membrana indujo deleccin clonal en vez de anergia. MECANISMOS DE ESCAPE DE LA TOLERANCIA A pesar de los mltiples mecanismos tanto centrales como perifricos encargados de inducir y mantener un estado de tolerancia inmunolgica, en muchos casos fallan y se producen enfermedades autoinmunes. Existen diversas circunstancias que explican que se produzca una ruptura de la tolerancia: Grado de expresin del autoantgeno en el timo, apoyado por el hecho de que un gen que modula la expresin intratmica de insulina se ha encontrado asociado con el desarrollo de diabetes autoinmune. Contacto del sistema inmune con autoantgenos que normalmente no son accesibles, como ocurre en situaciones de dao tisular. Activacin de un gran nmero de clones mediante superantgenos. Antigenos en muchos casos procedentes de componentes bacterianos capaces de activar a un gran nmero de clones de linfocitos T. Induccin de citoquinas activadoras y molculas coestimuladoras por infecciones intercurrentes. Similitud estructural de antgenos de patgenos y autoantgenos (mimetismo molecular) lo que hara que la respuesta inmune generada por los patgenos durante una infeccin atacara posteriormente a antgeno propios.

Los tres ltimos factores mencionados como responsables de la ruptura de tolerancia estn relacionados con el desarrollo de infecciones, que incluso se han considerado elementos causantes de enfermedades autoinmunes como la esclerosis mltiple o la diabetes tipo I. Sin embargo, es importante resaltar que el desarrollo de infecciones en algunos casos puede dar lugar al desarrollo de poblaciones reguladoras, como se desprende del hecho de que mltiples infecciones en el primer ao de vida, se asocien con una disminucin significativa del riesgo de padecer determinadas enfermedades autoinmunes. El caso especifico de las clulas B, como veamos anteriormente, necesitan para su completa activacin la ayuda de los linfocitos T, por lo que aunque existan mas clones autorreactivos de clulas B, basta con que no lo sean los clones de linfocitos T que reconocen el mismo antgeno (aunque distintos eptopos), para que stas se vuelvan anrgicas. Sin embargo, en algunos casos se producen mecanismos de escape de la tolerancia (T cell bypass). Esto se debe a que las clulas B autorreactivas pueden reconocer eptopos de un antigeno que contiene otros epitopos reconocidos por las clulas T, con lo que al procesar y presentar esos eptopos a las clulas T stas se activan y mandan segundas seales a los linfocitos B suficientemente intensas que hagan que salgan de su estado de reposo y pasen a una nueva situacin de autorectovidad.

INDUCCIN DE TOLERANCIA EN EL ADULTO En mltiples circunstancias es necesario inducir un estado de tolerancia como medio teraputico ideal para evitar especficamente la destruccin de ciertos antgenos en casos de

enfermedades autoinmunes y o para evitar el rechazo de rganos transplantados. Hasta ahora el nico tratamiento disponible para estas situaciones era la Inmunosupresin, que aunque mejoraba la supervivencia del rgano transplantado o la enfermedad autoinmune, al no ser especfica, dejaba al individuo en una situacin de inmunodeficiencia yatrognica. El estado de tolerancia, no as el de inmunosupresin, permite la persistencia de antgenos tiles, mientras que el sistema inmune conserva la capacidad de luchar contra las infecciones. Si bien la tolerancia a los antgenos propios es el aspecto fisiolgico ms importante de la tolerancia y se establece fundamentalmente en el sistema inmune inmaduro del feto o del animal recin nacido, se ha demostrado que es posible inducir experimentalmente tolerancia en el animal adulto. Esta posibilidad ha despertado obviamente un gran inters para su aplicacin prctica en el trasplante de rganos. Los experimentos pioneros fueron los de Mitchinson que demostr que la inyeccin endovenosa previa durante varios das de un antgeno soluble, poda inducir segn la dosis administrada, tolerancia o inmunidad a la inyeccin ulterior -al cabo de al menos una semana- del mismo antgeno con adyuvante de Freund. Mientras que la inyeccin de 10-9g de protenas induca tolerancia, la administracin de 10-6 a 10-3g induca inmunidad (memoria) y dosis superiores a 10-2g inducan de nuevo tolerancia. Este experimento es adems revelador de muchos de los factores que influyen en la induccin de la respuesta inmune: 1. La va de administracin, la va endovenosa -raramente observada en la naturaleza- es muy poco inmunognica mientras que la va subcutnea es muy inmunognica y mas si se reclutan macrfagos mediante un adyuvante y se les hace expresar molculas coestimuladoras gracias a la presencia de componentes bacterianos en el adyuvante completo. 2. La cantidad de antgeno. En la figura 15.7 se puede apreciar como dosis muy bajas o muy altas de antgenos inducen tolerancia mientras que existe una dosis media que dependen de cada uno de los antgenos que son capaces de inducir una respuesta inmue optima. 3. Las caractersticas fsico-qumicas del antgeno, siendo los antgenos apolares y solubles los menos inmunognicos. Tambin cabe recordar que antgenos de peso molecular inferior a 6000 Daltons no suelen ser por s mismos inmunognicos (probablemente porque difcilmente atraen a las clulas presentadoras de antgenos). 4. La necesidad de un intervalo de varios das para establecer la memoria (de respuesta o de tolerancia) lo que probablemente indica que cualquier tipo de respuesta incluyendo la tolerancia precisa de cierto grado de expansin clonal. 5. La dependencia de la memoria inmune de la persistencia de antgeno.

Fig.:15.7

Otra situacin de mayor inters prctico es la demostracin de tolerancia que se consigue en el trasplante de rganos mediante la administracin de algunas terapias inmunosupresoras. Este estado de tolerancia, demostrado en el animal de experimentacin por la aceptacin de trasplantes de piel del mismo donante pero no de terceros individuos (es decir no estamos ante una situacin de inmunosupresin) es atribuible al efecto inhibidor de la produccin de IL-2 que puede originar situaciones de activacin incompleta (sin segunda seal) en el tejido trasplantado, generando anergia hacia sus antgenos de histocompatibilidad. Existen grandes esperanzas en la actualidad de que el mejor conocimiento de los mecanismos de anergia perifrica en el animal adulto pueda conducir al diseo de protocolos de alo y xenotrasplante que no requieran el uso prolongado de inmunosupresores. Sin embargo en la mayora de los ensayos realizados hasta ahora, mientras que la induccin de tolerancia puede prevenir en mucho casos la aparicin de enefermedades autoinmunes o el rechazo de injertos, en muy pocos casos existen estrategias que permitan revertir enfermedades autoinmunes ya establecidas.

Mecanismos de induccin de tolerancia Con la intencin de aprovechar las ventajas clnicas que se derivan del estado de tolerancia, se estn desarrollando diversos mtodos que aprovechan los factores que antes veamos que influan en el desarrollo de la respuesta inmune. Administracin endovenosa Permite la induccin de tolerancia a factor VIII en pacientes hemoflicos que estaban siendo tratados con este factor y haban desarrollado anticuerpos contra l. En otros casos la administracin endovenosa del antgeno tambin ha permitido la induccin de tolerancia, previniendo el desarrollo de encefalitis autoinmune experimental (modelo para la esclerosis mltiple), diabetes y algunos tipos de alergias. Tolerancia oral La administracin oral del antgeno ha permitido en muchos casos prevenir el desarrollo de artritis, anafilaxia, diabetes y encefalitis autoinmunes en diversos modelos experimentales, sin embargo en otros casos ha dado lugar a una exacerbacin de los sntomas. Administracin intranasal Tambin se ha ensayado con xito la administracin oral e intranasal del ADN que codifica para pptidos de algunos autoantgenos como mtodo para inducir tolerancia. Administracin de pptidos antagonistas Estos pptidos uniran el mismo receptor que el autoantgeno pero en vez de estimularlo lo bloquearan.

Bloqueo de coestimulacin En la actualidad se estn ensayando con xito diversos mecanismo para bloquear las molculas coestimuladoras durante la presentacin de los antgenos que queremos proteger, entre ellas cabe destacar el cultivo de mdula sea de donante con clulas del receptor en presencia de CTLA4 recombinante fusionado a un dominio de Inmunoglobulina (CTLA-4Ig) o el tratamiento con CTLA-4Ig junto con anticuerpos bloqueantes de la interaccin de CD40 y CD40L necesario para la coestimulacin de las clulas B. El bloque de la coestimulacin asociado a determinadas terapias inmunosupresoras esta abriendo la posibilidad de inducir tolerancia duradera en pacientes transplantados, lo cual permitir disminuir e incluso interrumpir a medio plazo las terapias inmunosupresoras, evitando los efector indeseables asociados a las mismas. No debemos entender que en los diferentes mtodos de induccin de tolerancia hay implicados mecanismos moleculares dispares sino que por el contrario parece que se trata de formas distintas de inducir la expresin de los mismos genes, como lo demuestran resultados recientes de uno de los autores en los que se evidencia que los genes activados en mtodos tan dispares como la tolerancia oral y la estimulacin en ausencia de coestimulacin, son los mismos. MECANISMOS REGULADORES DE LA RESPUESTA INMUNE La intensidad y calidad de una respuesta inmune viene determinada por factores inherentes al antgeno, a la dosis, la va de administracin y el fondo gentico del animal, especialmente de sus genes MHC. Una vez establecida una respuesta adaptativa, su grado y persistencia depende fundamentalmente de la dinmica del aumento de concentracin y de la eliminacin del antgeno. Un antgeno cuya concentracin aumenta rpidamente -como ocurre con un microorganismo invasor- evocar una respuesta progresivamente ms intensa hasta que la cantidad de antgeno resulte masiva en cuyo caso se produce una respuesta de parlisis inmunolgica. Los antgenos persistentes evocan una respuesta crnica muchas veces con tendencia a ser de baja intensidad. Por otra parte a medida que la cantidad de antgeno libre disminuye y es enmascarado por el anticuerpo ya formado, disminuye la respuesta. Finalmente, parece que un proceso de apoptosis reduce las poblaciones de linfocitos expandidas antgeno especificas una vez estas clulas ya no son necesarias. Los mecanismos de regulacin de estos perfiles de respuestas son conocidos de forma incompleta. Papel regulador de los anticuerpos La presencia de anticuerpos en exceso se sabe que frena la respuesta probablemente porque bloquea el contacto del antgeno con la clula B correspondiente, evitando la activacin y diferenciacin de nuevas clulas B. Los complejos Ag-Ac favorecen la presentacin de antgenos por las clulas presentadoras de antgeno ya que estas clulas tienen receptores Fc y receptores para algunos componentes del sistema del complemento. De hecho se ha observado que existe una poblacin de clulas especializadas en captar inmunocomplejos situadas en el centro de los centros germinales de los ganglios linfticos (las clulas foliculares dendrticas). Papel regulador de las linfocinas Las linfocinas especialmente la IL-10 y el TGF-beta ejercen una funcin inhibidora sobre las respuestas inmune, sobre todo la de tipo celular. Como es sabido, existen dos tipos funcionales de clulas T CD4+, conocidas como Th1 y Th2 que producen un perfil de citoquinas con funciones mutuamente inhibidoras. Las clulas Th1 producen sobre todo IL-2 e IFN-gamma y favorecen el desarrollo de una respuesta de tipo celular con expansin de las

correspondientes clulas citotxicas CD8+ y atraccin de numerosos macrfagos. Las clulas Th2 producen sobre todo IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10 y favorecen el reclutamiento de clulas B que desarrollen una respuesta humoral intensa. Estos tipos de respuesta son mutuamente excluyentes pero en humanos pueden evolucionar de la una a la otra (esto se observa en ciertas infecciones como la lepra). El tipo de respuesta es fundamental para su eficacia, la regulacin del paso de una forma a otra es de gran importancia y parece depender de la citocinas y del contexto de la presentacin. Papel regulador de los linfocitos T reguladores (CD25+) Durante la expansin de la respuesta autoinmune actan varios mecanismos reguladores cuya importancia fisiolgica es an poco conocida. Como comentbamos al hablar de la supresin, la existencia de clulas T con esta actividad ha estado en entredicho durante algunos aos, sin embargo en la actualidad con la identificacin de diversas poblaciones CD4+ con actividad supresora est cobrando un renovado papel. Entre estas poblaciones destacan las clulas Tr1 resultantes de cultivar clulas CD4 en presencia de IL-10 y las clulas Th3 aisladas en ratones tras la administracin oral de antgeno. A stas clulas con actividad supresora se les ha dado en llamar clulas reguladoras y aunque aun no se ha identificado un marcador inequvoco que las identifique, parece que la expresin mantenida de CD25 es un rasgo comn en todas ellas. El mecanismo de supresin de estas clulas reguladoras, no solo implica la expresin de citocinas con efecto inhibidor:(IL-10 y TGF-beta), sino que en muchos casos participan molcula de superficie an no identificadas, por cunto se conoce que es necesaria la interaccin de la clula respondedora con la clula reguladora para que se produzca supresin. Papel regulador de los receptores CTLA-4 Cuando un linfocito se activa, entre otras cosas, expresa en su superficie la molcula CTLA-4. CTLA-4 se une a los receptores B7 (CD80/CD86) de las clulas presentadoras de antgeno del mismo modo que CD28, pero en este caso, va a trasnmitir seales inhibidoras. Por otro lado al tener CTLA-4 mucha mayor afinidad por B7 que CD28, compite con ste evitando su estimulacin y dejando a la clula sin la segunda seal y por tanto contribuyendo probablemente a los fenmenos de anergia observados tras la inyeccin continuada de antgeno. Papel regulador de los receptores inhibidores NK Estos receptores ejercen una funcin inhibidora fundamental en las clulas NK pero tambin en muchas subpoblaciones de linfocitos T en donde se encuentran presentes.

Teora de la red de idiotipo-antidiotipo. Otro mecanismo de regulacin inmune es el que propuso en 1974 Jerne (Figura 15.8), quien llam la atencin sobre el hecho de que los determinantes antignicos configurados por las partes variables de las cadenas H y L de las inmunoglobulinas (idiotipos) constituan en s un amplio repertorio de autoantgenos. Estos autoantgenos estn en muy pequea cantidad para ser destruidos por el sistema inmune, pero cuando un determinado clon es estimulado por su antgeno, el sistema inmune ya no podra ignorarlo y originara unas respuestas contra ellos en forma de segundos anticuerpos (anti-idiotipos) que encajaran con los primeros y tendran adems un efecto modulador que puede ser positivo o negativo. A este proceso se le denomin "teora de la red de anticuerpos". Es posible que una interaccin similar entre linfocitos T ejerza un papel regulador pues hemos de considerar que el receptor T posee, al igual que las inmunglobulinas, idiotipos, esto es estructuras por donde se acopla el receptor a los eptopos y las molculas de histocompatibilidad que reconocen. Se ha propuesto que una desregulacin de estos mecanismos dara lugar a la prdida de tolerancia y en consecuencia al desarrollo de respuestas autoinmunes. Aunque todos estos conceptos resultan atractivos no se han validado plenamente en el sistema inmune humano. Control gentico de la respuesta inmune
Fig.:15.8

Es conocido como cada individuo responde de una manera diferente a cada uno de los antgenos. Esto ha podio ser estudiado de manera precisa en animales, especialmente en ratones, aprovechando la existencia de cepas congnicas (idnticas genticamente entre s pero distintas unas de otras) y se ha comparado la capacidad de respuesta con la existencia de ciertos caracteres genticos. De estos estudios ha resultado que existe cierta relacin (Figura 15.9) entre la intensidad de respuesta a ciertos antgenos y el haplotipo de molculas de histocompatibilidad que presenta el animal. As a ciertos antgenos sintticos responden de manera mas intensa los ratones C57L que los BALB/c/ o los CBA.

Fig.:15.9

A pesar del gran avance en el conocimiento de los procesos moleculares subyacentes a la generacin de la diversidad de los anticuerpos y del TCR, del reconocimiento celular y de las funciones de las citocinas, es preciso indicar que an nos hallamos lejos de comprender con cierto detalle como se regula la respuesta inmune y mas lejos an de entender el funcionamiento global del sistema inmune. Muestra de ello es la gran cantidad cuestiones que quedan por resolver y entre las que en relacin con el tema que nos ha ocupado, podemos enunciar las siguientes:

Cual es el mecanismo y cules las clulas responsables de la seleccin negativa en el timo? Existe expresin de antgenos perifricos en el timo? Son diferentes los repertorios tolerizados de clulas CD4+ y CD8+? Cmo evoluciona la funcin del timo a lo largo de la vida del individuo? Intervienen las clulas B1 (autorreactivas) en la configuracin del repertorio T y de las clulas B2? Recirculan las clulas T sensibilizadas en la periferia por el timo para ser preseleccionadas? Cmo se mantiene la memoria de la tolerancia?

BIBLIOGRAFIA 1. Karim M, Bushell AR Wood KJ. (2002) Current. Opin. Immunol.; 14: 584 2. Macin F & Garca-Czar F, Im SH, Horton HF, Byrne MC, Rao A. (2002). Transcriptional mechanisms underlying lymphocyte tolerance. Cell, 109:719 3. Kamradt T, Mitchison NA. Tolerance and autoimmunity. (2001) N Engl J Med. 344: 655 4. Li Y, Li XC, Zheng XX, Wells AD, Turka LA, Strom TB. (1999) Blocking both signal 1 and signal 2 of T-cell activation prevents apoptosis of alloreactive T cells and induction of peripheral allograft tolerance. Nat Med. Nov; 5: 1298. 5. Benoist C, Mathis D (1993). Transgenes and knock-outs in autoimmunity. Current. Opin. Immunol.; 5: 900. 6. Fowlkes BJ, Ramsdell F (1993). T cell tolerance. Current. Opin. Immunol.; 5: 873. 7. Hartley SB, Crosbie J, Brink R, Kantor AB, Sinha A, Lopez M,. Mcdevitt H., (1990). Autoimmune diseases the failure of self tolerance. Science; 248: 1380. 8. Sprent J, Gao EK, Webb SR (1990). T cell reactivity to MHC molecules: immunity versus tolerance. Science; 248: 1357.

Diferentes mecanismos de rotura de la Tolerancia

Tolerancia Inmunolgica y AutoInmunidad

(Concepto de Tolerancia; Tipos de Enfermedades Autoinmunes; Asociacin a HLA; Asociacin a infecciones; Rotura de la Tolerancia; Aproximaciones terapeticas)

Mimetismo Molecular:
Propio Patgeno No lo hagas!

Prdida de la Supresin:

Hazlo!

Ts Tc Clula Matar o no matar?

Th

Antgenos Secuestrados

Oftalmia simptica

Antgenos Secuestrados
Tubo seminifero

Vasos sanguneos Las enfermedades autoinmunes pueden resultar por dao en sitios inmunolgicamente privilegiados tras la liberacin de antgenos secuestrados

Formacin de respuestas anti-esperma ( 2 - 5 % de esterilidad en varones )

Criterios que definen las enfermedades Autoinmunes:

1. Presencia en suero de auto-anticuerpos reactivos frente a autoantgenos (tejido-especficos o sistmicos) 2. Presencia de auto-anticuerpos unidos a la clula diana 3. Demostracin del papel patognico de dichos auto-anticuerpos. 4. Presencia de infiltrados linfocitarios crnicos en los tejidos afectados. 5. Demostracin de que los linfocitos T infiltrantes pueden ser activados in vitro por un auto-antgeno. 6. Existencia de modelos animales experimentales que imitan la enfermedad en humanos: demostracin de la participacin del sistema inmune en la enfermedad.

Espectro de Enfermedades Autoinmunes:

rgano-especficas
SISTEMA ENDOCRINO Tiroiditis de Hashimoto (tiroides) Atrofia tiroidea (tiroides) Enfermedad de Graves (tiroides) Enfermedad de Addison (suprarrenales) Menopausia prematura (gnadas) Hipoglucemia autoinmune (pncreas) Diabetes mellitus (pncreas) Orquitis autoinmune (gnadas) SISTEMA HEMATOPOYTICO Anemia perniciosa Anemia hemoltica autoinmune Prpura trombocitopnica autoinmune Neutropenia idioptica SISTEMA NEUROMUSCULAR Miastenia Grave Esclerosis mltiple PIEL Pnfigo vulgar Penfigoide SISTEMA CARDIOPULMONAR: Sndrome de Goodpasture

No rgano-especficas
Sndrome de Sjgren (artritis, parotiditis, queratitis) Artritis Reumatoide Dermatomiositis Esclerodermia Enfermedad mixta del tejido conectivo Lupus eritematoso discoide Lupues eritematoso sistmico Atrofia tiroidea (tiroides) Enfermedad de Graves (tiroides)

Mecanismos de dao Tisular en la Autoinmunidad:

ENFERMEDAD AUTOANTGENO Mediadas por Anticuerpo (Tipo II) Anemia hemoltica autoinmune Prpura Trombopnica autoinmune Sndrome de Goodpasture Pnfigo vulgar Fiebre reumtica aguda postestretococos Enfermedad de Graves Miastenia Grave Grupo sanguneo Rh Integrina de plaquetas (CD41a) Fibras de colgeno tipo IV Cadherina epidrmica Msculo cardiaco, por reaccin cruzada Receptor de TSH Receptor de acetil-colina Destruccin de eritrocitos por el complemento y fagocitos. Anemia Coagulacin anmala, plaquetopenia Vasculitis, fallo renal y pulmonar Ampollas epidrmicas Poliartritis, miocarditis, deterioro de vlvulas cardiacas Hipertiroidismo Fatiga muscular CONSECUENCIA

Factores de Predisposicin en la Autoinmunidad:

FACTORES GENTICOS
Herencia de marcadores HLA de enfermedad y De otros genes

ALTERACIONES EN LINFOCITOS
Fallo de la tolerancia a lo propio, por: Seleccin anormal del repertorio de linfocitos Activacin policlonal de linfocitos autoreactivos Estimulacin por antgenos extraos con reactividad cruzada con antgenos

ALTERACIONES LOCALES
Inflamacin o dao tisular que conduce a: Liberacin de autoantgenos secuestrados Alteraciones estructurales de auto-antgenos Aumento de coestimuladores en APCs tisulares

Mediadas por Inmuno-Complejos (Tipo III) Lupus eritematoso sistmico DNA, histonas, ribosomas Desconocido (clulas pncreas) Antgeno sinovial desconocido Protena bsica de la mielina Glomerulonefritis, vasculitis, artritis

Mediadas por Clulas T (Tipo IV) Diabetes mellitus insulinodependiente Artritis Reumatoide Esclerosis mltiple Destruccin clulas pancreticas Inflamacin y destruccin articulaciones Invasin cerebral por clulas T CD4, parlisis

Linfocitos auto-antgeno especficos funcionales AUTOINMUNIDAD

Auto-antgeno Inmunognico + APCs Tisulares competentes

OTROS FACTORES
Edad (envejecimiento) Sexo (hormonales)

Asociacin HLA - Enfermedades Autoinmunes:

ENFERMEDAD Espondilitis anquilosante Uvetis anterior aguda Enfermedad de Goodpasture Esclerosis mltiple Enfermedad de Graves Miastenia grave Lupus eritematoso sistmico Diabetes mellitus insulinodependiente Artritis Reumatoide Pnfigo vulgar Tiroiditis de Hashimoto Alelo HLA B27 B27 DR2 DR2 DR3 DR3 DR3 DR3 y/o DR4 DR4 y DR1 DR4 DR5 Riesgo Relativo 87 10 16 5 4 3 6 10 5 15 3 Proporcin 0.3 0.4 1.0 10 8 2 15 5 3 1.0 4.5

Asociacin Infeccin - Enfermedades Autoinmunes:

INFECCIN Streptococcus grupo A Chlamydia trachomatis Shigella flexneri Salmonella (typhimurioum y enteritidis) Yersinia enterocoltica Campylobacter jejuni Kelbsiella pneumoniae Borrelia burgdorferi EBV, HTLV-1 HTLV-1, HIV-1 HTLV-1 HHV-6 Cocksackie Paperas Rubola Retrovirus ENFERMEDAD Fiebre reumtica (miocarditis, poliartritis) Sndrome de Reiter (artritis) Artritis reactiva Espondilitis anquilosante

Artitis crnica en la enfermedad de Lyme Artitis reumatoide Lupus eritematoso sistmico Sndrome de Sjgren Esclerosis mltiple Diabetes mellitus insulinodependiente

Protenas Humanas con semajanza estructural con patgenos (mimetismo)

Enfermedad Protena Patgeno Klebsiella Klebsiella Epstein-Barr virus Polio virus Adenovirus tipo 12 Papilloma virus Cytomegalovirus IDDM

Sndrome de Reiter HLA-B27 Espondilitis HLA-B27 anquilosante Artritis Reumatoide HLA-DR4 Ach receptor Miastenia grave Enfermedad Celiaca Gliadina-A Insulin receptor IDDM IDDM HLA-DR

La miastenia grave resulta de la presencia de anticuerpos antiReceptor de acetil-colina que bloquean al receptor, e impiden la sealizacin va acetl-colina.

Tratamiento de enfermedades Autoinmunes:

Trasplante de mdula sea Drogas inmunosupresoras: esteroides Drogas anti-inflamatorias Plasmafresis (para retirar los auto-anticuerpos) Anticuerpos monoclonales contra subpoblaciones especficas de linfocitos T: CD4 Induccin de tolerancia especfica a auto-antgenos (cuando el auto-antgeno es conocido)

20 Hipersensibilidad
N. Ballesteros, y R. Solana
INTRODUCCIN Los procesos inmunitarios son utilizados por el organismo para defenderse de las agresiones por agentes infecciosos. No obstante, en ciertos casos, el organismo reacciona de una forma inapropiada o excesiva de manera que se pueden ocasionar diversos tipos de dao tisular. Estas situaciones, que conocemos como hipersensibilidad, pueden tener aspectos positivos o negativos al poder causar ellos mismos la enfermedad. La respuesta del organismo para producir una reaccin de hipersensibilidad depende del agente patgeno y del terreno gentico del hospedador que responder de una u otra forma al agente causal. Segn la clasificacin de Coombs y Gell de 1963, existen cuatro tipos de reacciones de hipersensibilidad: Tipos I-IV (Tabla20.1). La hipersensibilidad tipo I se trata en el prximo captulo. Tambin ha sido definido un Tipo V denominado hipersensibilidad estimuladora, mediada por anticuerpos anti-receptor que en lugar de destruir la clula produce su estimulacin. En cada uno de los tipos de hipersensibilidad participan de forma secuencial diferentes tipos de clulas y mediadores solubles. Las caractersticas ms relevantes de cada tipo de hipersensibilidad se resumen a continuacin y se esquematizan en la Tabla 20-1.

TABLA 20.1 Reacciones de hipersensibilidad Tipo I II III IVA IVB Nombre Inmediata Citotxica Inmunocomplejos Retardada ----

Mecanismo
IgE IgG o IgM IgG Linfocitos T Linfocitos Tc

Latencia 15 min ---4-6 h >24 h ----

Mediadores Histamina, LTC4 C o ADCC C5a, proteasas Linfocinas (IFNg y otros) Citotoxicidad

Hipersensibilidad tipo II. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II son mediadas por anticuerpos tipo IgG o IgM. Estos anticuerpos pueden haberse producido como consecuencia de una respuesta inmunitaria normal y reconocer elementos no propios (como en el caso de inmunizacin reiterada con antgenos extraos o en enfermedades infecciosas agudas o crnicas), o por el contrario pueden ser autoanticuerpos que reconozcan componentes propios del organismo. Las reacciones de tipo II son reacciones mediadas por la interaccin de antgenos presentes en la superficie de diferentes clulas con anticuerpos de tipo IgG e IgM preformados y que reconocen el tejido en cuestin. El dao celular resulta de la posterior activacin de la cascada del sistema complemento o su interaccin con clulas efectoras a travs de su fraccin Fc. Los receptores para la fraccin Fc de la IgG se encuentran presentes en clulas fagocticas (neutrfilos, macrfagos), clulas NK y plaquetas. La activacin de estos receptores causa la liberacin de proteasas y radicales libres de las clulas fagocticas, el proceso de citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) mediado por los linfocitos NK y la liberacin de histamina y sustancias vasoactivas por las plaquetas. Adems la activacin del sistema del complemento origina el depsito de las fracciones C3b y C3bi en la membrana celular. Tanto las clulas fagocticas como las NK poseen receptores para estos fragmentos (CR1 y CR3) lo que favorecer su unin a la clula diana y su subsecuente destruccin. Los ejemplos ms claros de hipersensibilidad de tipo II lo constituyen las reacciones hemolticas. En determinadas circunstancias existen anticuerpos preformados que pueden reaccionar con antgenos de membrana del eritrocito y ocasionar su destruccin. Tal es el caso de las reacciones contra antgenos de grupos sanguneos y que pueden dar lugar a dos cuadros clnicos de gran importancia:

Las reacciones post-transfu-sionales y la eritroblastosis fetal. Entre los diferentes sistemas de grupos sanguneos existentes, los sistemas AB0 y Rh son los ms importantes. Casi todos los individuos poseen anticuerpos tipo IgM contra los antgenos del sistema de grupos sanguneos AB0 que ese individuo no posee. En el caso de la eritroblastosis fetal son los anticuerpos contra determinantes del sistema Rh los responsables del dao ocasionado. Estos anticuerpos anti-Rh (D) no existen de forma espontnea en los individuos Rh (-), pero se sintetizan en los casos en los que haya habido un contacto previo (Figura 20.1)
Figura 20.1

En el momento del parto suelen pasar glbulos rojos portadores de antgenos Rh (+) del feto a la madre. Como consecuencia, en sta se puede producir una sensibilizacin de sus linfocitos que en un contacto subsiguiente sintetizarn anticuerpos tipo IgG. En un embarazo posterior, al permanecer las clulas sensibilizadas en la madre, se estn produciendo anticuerpos anti Rh D (+) que pasan de la madre al feto y reaccionan frente a los glbulos rojos de ste, llegando a la destruccin de los mismos. Esto produce una bilirrubinemia muy intensa que si no es tratada pronto, puede costar la vida al feto. Para prevenir este fenmeno, actualmente existe un tratamiento especfico que consiste en inyectar a la madre, despus del parto, inmunoglobulinas IgG anti Rh D (+) que reaccionan con los determinantes Rh D (+) de los glbulos rojos fetales que han pasado a la circulacin materna, con lo cual se evita la inmunizacin de la madre por algn mecanismo no muy bien conocido todava, pero en el cual podra intervenir la accin supresora especfica de la IgG inyectada. Hipersensibilidad tipo III Las reacciones de hipersensibilidad tipo III se producen por la existencia de inmunocomplejos circulantes que al depositarse en los tejidos causan la activacin de los fagocitos y el subsecuente dao tisular. Los inmunocomplejos formados por la unin del anticuerpo y el antgeno pueden ser patgenos segn sus caractersticas fsico-qumicas (Figura 20.2). As dependiendo de su tamao sern eliminados por la orina si son de pequeo tamao o captados por los fagocitos si son de gran tamao. Por el contrario los de tamao intermedio pueden depositarse en los tejidos y causar lesiones. Otros factores como la carga tambin son determinantes para su efecto patolgico. Los inmunocomplejos circularn por la sangre y se podrn localizar en diferentes tejidos del organismo, como articulaciones, vasos sanguneos, rin, etc. En la mayora de los casos los inmunocomplejos se forman como consecuencia de: 1. 2. Post-estreptoccica, o persistentes como la hepatitis vrica tipo B o C. Exposicin e inhalacin persistente de agentes ambientales como hongos (pulmn del granjero) o protenas animales (enfermedad del cuidador de aves)

3.

O bien como consecuencia de la presencia mantenida de altos niveles de autoanticuerpos en algunas enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistmico o artritis reumatoide. La

unin de los anticuerpos tipo IgG a los enfermedades infecciosas agudas como la glomerulonefritis antgenos solubles en el organismo causa el dao tisular por diferentes mecanismos. En primer lugar pueden inducir la activacin de la cascada del complemento y la produccin de C3a y C5a que atrae PMN al sitio inflamatorio lo que ocasiona un rico infiltrado de neutrfilos. La activacin de estos y la liberacin de enzimas lisosomales causa dao tisular. Asimismo son atrados al foco inflamatorio mastocitos y clulas cebadas que liberan histamina incrementando la permeabilidad vascular.
Figura 20.2

Hipersensibilidad de tipo IV La reaccin de hipersensibilidad retardada juega un papel importante contra agentes patgenos intracelulares (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Brucella mellitensis, Candida albicans, Pneumocytis carinii). Sin embargo, tambin tiene aspectos nocivos y a veces las lesiones tisulares causadas por la hipersensibilidad retardada son tan extensas que comprometen gravemente al organismo. La reaccin de hipersensibilidad tipo IV se caracteriza por la llegada al foco inflamatorio de un gran nmero de clulas no especficas de antgeno con predominio de los fagocitos mononucleares. El desarrollo de una reaccin de hipersensibilidad retardada requiere un perodo de sensibilizacin de 1 a 2 semanas tras el primer contacto con el antgeno. Durante este perodo, los linfocitos Th1 son activados por el antgeno presentado junto con las molculas de clase II del MHC en una clula presentadora de antgeno y se expanden clonalmente. Tras un segundo contacto con el antgeno, se inicia la fase efectora de la respuesta. En general requiere unas 24 horas para que la reaccin sea evidente y el mximo se produce entre 48 y 72 horas. Al cabo de unas horas de la inyeccin del antgeno, alrededor de las venas post-capilares se acumulan los neutrfilos. Al cabo de 12 horas, el lugar de inyeccin del antgeno aparece infiltrado por linfocitos T y monocitos con una distribucin perivascular. Las clulas endoteliales se hinchan y dejan pasar macromolculas del plasma. El fibringeno presente en el espacio intersticial se deposita en forma de fibrina y junto con los monocitos y linfocitos T extravasados causan la hinchazn y endurecimiento del tejido (granuloma). Las clulas que actan como presentadoras de antgeno son clulas de Langerhans, macrfagos y clulas endoteliales. En la hipersensibilidad retardada, al contrario de los que sucede en la hipersensibilidad inmediata, intervienen las citocinas segregadas por los linfocitos Th1 (Figura20.3).La IL-2 actuando de forma autocrina aumenta la poblacin de clulas Th1. Adems, se produce IFN-g que acta sobre los fagocitos mononucleares activndolos y atrayndolos al lugar de la inflamacin. La IL-3 y el GM CSF pueden inducir a nivel local una proliferacin de los macrfagos. Adems, los macrfagos activados producen a su vez M CSF, GM CSF y TGF-b que estimulan de forma autocrina su propia proliferacin. Sobre las clulas endoteliales vasculares actan el IFN-g y la linfotoxina, as como el TNF-a y la IL-1,

ambas producidas por macrfagos, induciendo una serie de modificaciones que facilitan la salida del lecho vascular de los neutrfilos y monocitos.
Figura 20.3

BIBLIOGRAFA

1. Sell S., Hsu P.L. (1993). Delayed hypersensitivity, immune deviation, antigen processing
and T cell subset selection in syphilis pathogenesis and vaccine design. Immunol. Today 12: 576 581.

2. Sher A., Coffman R.L. (1992). Regulation of immunity to parasites by T cells and T cel
derived cytokines. Annu. Rev. Immunol. 10: 385 409.

La terminologa es confusa

Hipersensibilidad

Refiere a una reaccin exagerada contra antgenos inocuos (alergia). Refiere a una reaccin muy eficiente normal, que es consecuencia de otra patologa (reaccin autoinmune, formacin de inmunocomplejos, etc.)

Hiperreactividad

Hipersensibilidad

En todos los casos existe dao tisular y riesgo de vida, sin embargo la reaccin hiperreactiva puede ser beneficiosa (sfilis, tuberculosis).

Hipersensibilidad - 4 Tipos
Clasificacin de Gell y Coombs
Hipersensibilidad inmediata Reaccin mediada por IgE.
Conjutivits alrgica, asma, etc.

-Tipo I

Tipo I Hipersensibilidad Inmediata (Alergia) IgE Tipo II Lisis mediada por Anticuerpos IgG y complemento IgG, clulas NK y eosinfilos Tipo III Enfermedad por Inmunocomplejos IgG, IgM y complemento Tipo IV Mediada por Clulas (Retardada) Clulas CD4 - Th 1; Clulas CD8 T

Dependientes de anticuerpos

Citotxica.

-Tipo II

Anemia hemoltica del recin nacido Transplantes - Autoinmunidad

Por inmunocomplejos

-Tipo III
Dependiente de clulas T

Autoinmunidad, Infecciones

Hipersensibilidad retardada.

- Tipo IV

Dermatitis por contacto

Hipersensibilidad de Tipo I
Mediada por IgE Respuesta Secundria Tambin llamada anafilaxia Liberacin de mediadores de inflamacin por los mastocitos y basfilos Local o sistmica Inicio muy rpido (Hipersensibilidad inmediata)

Alergias mediadas por IgE Enfermedad Tipo de alergeno

Anafilaxis sistmica

Va de entrada

Respuesta
Edema, vasodilatacin, oclusin traqueal, colapso circulatorio, muerte Vasodilatacin local, edema local Edema e irritacin de la mucosa nasal y/o bronquial Vmitos, diarrea, prurito, urticaria

Medicamentos, Intravenosa venenos de insectos, antibiticos, contraste radiolgico Picaduras de insectos, pruebas cutneas de alergia Polen, restos de insectos o animales de compaa, caros Leche, huevos, pescado, etc... Subcutnea

Inflamacin local

Rinitis alrgica, asma bronquial

Respiratoria

Alergia alimentaria

Digestiva

Tipo I

Alergia
Desarrollo en 2 30 minutos

Alergia
IgE

Alergeno

Degranulacin
IgE

Activacin
Mastocito

Mastocitos, basfilos y eosinfilos

RFc I
De muy alta afinidad

Los grnulos contienen heparina, histamina y enzimas

Mediadores de inflamacin

Receptores para IgE

RFc II
De afinidad media- baja

-Peso molecular 190 kDa

IgE -No activa complemento

-No traspasa placenta. - En suero est en concentraciones por debajo de 01 g/mL.
Las concentraciones sricas aumentan con la edad, a los 10 15 aos se estabiliza. Los individuos con predisposicin a la alergia muestran un incremento ms temprano en la concentracin.

IgE, sntesis
Clula B IgM

Clula T IL-4 IL-13 CD40-CD40L 1 2

Cambio de clase a IgE

Seal 1- activa la transcripcin en un sitio

particular del locus de la inmunoglobulina Seal 2- La unin de CD40 en las B activa el cambio de clase a nivel de ADN.

Mastocitos y basfilos

Se generan en mdula sea inducidos por IL-4 y GM-CSF

Las IgE sobre mastocitos o basfilos estn firmemente ancladas por el receptor, hecho que no est relacionado con la especificidad de la inmunogloblulina.

grnulos citoplsmicos similares que son exocitados en la activacin

Los eosinfillos presentan bajos niveles de RFc

La clulas se activan:
-Por entrecruzamieno de las IgE unidas a receptores RFc I. -Por unin de fragmentos del Sistema de complemento (C3a y C5a)

Sobre las clulas habr IgE de diferente especificidad.

Entrecruzamiento de receptores de IgE

mastocito

Entrecruzamiento de receptores de IgE

Ag

Receptor de IgE

Dos molculas de IgE de diferente especificidad yuxtapuestas por azar, reconocen epitopos sobre el mismo antgeno. Dos molculas de IgE de igual especificidad reconocen epitopos repetidos sobre el antgeno. (P ej.: haptenos fijados sobre una protena portadora o alergenos de epitopos repetidos)

Ag

Cada IgE reconoce un epitopo nico en el alergeno, el entrecruzamiento lo realiza otra molcula (un anticuerpo, una lectina)

Anti RFc I

Ag

Independientemente de las IgE, unin por anti receptor

Anti idiotipo

Unin por anti isotipo IgE o antiidiotipo

El mastocito
Molculas liberadas por mastocitos activados:
Histamina y heparina
Incremento de la contraccin muscular lisa Incremento de permeabilidad vascular Txicas para parsitos

IL-4 e IL-13
Activacin de clulas Th2; inhibicin de respuestas Th1 y aumento de sntesis de IgE

Los grnulos: (preformados, no inducidos) Histamina -Proteoglicanos: heparina y condroitin sulfato -TNF- - Enzimas Se fija sobre receptores en terminales nerviosos induciendo: -contraccin de msculo liso de bronquios, intestino, tero -aumento de permeabilidad vascular (edema) -urticaria en piel -hipersecrecin de mucus en bronquios.

IL-3 e IL-5
Activacin de Eosinfilos

TNF-
- Activacin de endotelios vasculares y otros tipos ceulares

Factor activador de plaquetas (PAF)

Atractor y activador de neutrfilos y eosinfilos

Factor inhibidor de macrfagos (MIP):

Quimiotctico para neutrfilos

Leucotrienos:
Contraccin de msculo liso Aumento de permeabilidad vascular Secreccin de moco

El mastocito En los grnulos, la histamina se encuentra asociada a los proteoglicanos (polianiones que la estabilizan). Liberado el complejo a tejidos, la histamina adquiere la forma activa por intercambio con in sodio.

Activacin de mastocitos y eosinfilos .

Secrecin de grnulos preformados

Sntesis y secrecin de mediadores lipdicos -PGD2 -LTC4 -PAF

Sntesis y secrecin de citocinas -TNF -IL-1 -IL-4 -IL-5 -IFN -

inmediato

Antgeno

Anticuerpo IgE

Reaccin inmediata
Liberacin del contenido de grnulos (productos preformados) Histamina TNF Enzimas (proteasas neutras) Proteoglicanos

RFcI

Mastocito

El mastocito y basfilo -mastocito - residente en tejido conectivo en

todo el cuerpo prxima a vasos y particularmente en el sub-epitelio de las mucosas respiratoria, del aparato urogenital y gastrointestinal. -El basfilo es un tipo celular semejante, circulante. nicos tipos celulares que presentan receptor para IgE de alta afinidad (RFc I).

Degranulacin
(minutos)

Reaccin tarda
Entre los productos inducidos por la activacin del mastocito, son importantes los eicosanoides : PGD2. Es una prostaglandina caracterstica de mastocito Los Leucotrienos LTA4 - LTB4, son lipdicos, los derivados de stos LTC4, LTD4 y LTE4 son complejos con glutiatin o modificaciones de ste, como grupo se denominan SRS-A. Tambin se induce TNF; IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, GM-CSF, MIP-1 En la fase tarda de la reaccin de hipersensibilidad tipo I, se produce un infiltrado inflamatorio, primero de neutrfilos y luego de de eosinfilos, macrfagos cl T CD4,atradas por los eicosanoides y quimiotaxinas liberadas por el mastocito. En particular el eosinfilo tiene un rol agresivo sobre tejidos (citotoxicidad por radicales libres, MBP sobre epitelio) La reaccin tarda no es afectada por los frmacos antihistamnicos, pero es sensible a los efecto antiiflamatorios de los corticoides.

Liberacin de mediadores de la reaccin tarda

SRS-A Slow reactive substance of anaphylaxis.

El mastocito
-Existen dos grandes categoras de mastocito, uno ubicuo en tejido conectivo (mastocito de tejido conectivo) y otro presente en mucosas (mastocito de mucosas) con gran cantidad de receptores para IgE y produccin de PGD2.

Alergia algunos trminos

Atopia.- Predisposicin gentica a la produccin de IgE contra antgenos ambientales inocuos. (viene de
inusual) Sin embargo en EEUU afecta al 20 % de la poblacin.

La prostaglandina D2 deriva de la va de la 5-ciclooxigenasa de los mediadores lipdicos. Es sintetizada particularmente por mastocitos y basfilos y es un fuerte inductor de la permeabilidad capilar y contraccin del msculo liso.

Anafilaxis reaccin sistmica extrema los mediadores de mastocitos y eosinfilos congestionan las vas respiratorias produciendo asfixia, colapso cardiovascular que lleva a la muerte. CHOQUE ANAFILCTICO

El shock anafilctico es el accidente ms grave que puede desencadenar un antgeno extrnseco (sueros de animales, ruptura de un quiste hidtico, venenos de insectos, medicamentos, alimentos, etc.) Es un reaccin cuya evolucin inmediata puede ser mortal. La causa es la disminucin generalizada del tono vascular
Por ser una reaccin inmediata la gravedad est en poder resolver la situacin en pocos minutos, por lo que los frmacos (generalmente adrenalina y corticoides) deben estar accesibles para estas urgencias.

Las causas ms comunes de anafilaxis -Picadura de abejas y avispas -Alimentos -Goma de ltex -Drogas

El antgeno entra de forma sistmica (picadura) o en la sangre (drogas), absorbido a travs de la piel o mucosas (ltex).

Alergias
Descripcin clnica de la anafilaxis. -Sistema cardiovascular: colapso -Sistema respiratorio: broncoespasmo, edema de laringe -Piel: eritema, angioedema, urticaria -Sistema gastrointestinal: vmitos, diarrea.
Alergenos, polen, esporas, polvo de la casa, gatos, perros, etc

-Conjuntivitis alrgica (mastocitos de conjuntiva)

estacional afecta a nios y jvenes - enrojecimiento e hinchazn de conjuntiva, excesiva produccin de lgrimas.

-Rinitis alrgica. Es de gran prevalencia. La rinitis estacional se denomina fiebre del heno

Rinitis asma y alveolitis se superponen, el rgano de choque es diferente y depende del tamao del alergeno

Alergias
Tamao del antgeno >15 m 5 15 m rgano de choque nariz bronquios Enfermedad asociada rinitis asma alveolitis

En el tratamiento de las alergias hay varias estrategias: -En uso: hiperinmunizacin con el alergeno. Se produce IgG anti- alergeno que compite con la IgE, anulando la reaccin de sta -En estudio: anticuerpo monoclonal (humanizado) contra el receptor de IgE, impidiendo la fijacin de sta sobre los mastocitos. -En estudio: anticuerpo monoclonal contra el sitio de unin en fragmento Fc de las IgE a su receptor en mastocitos.

<5 m

alvolo

La IL-4 induce cambio de isotipo hacia IgE

Los mastocitos activados secretan IL-4, que aumenta la produccin de IgE

Los mastocitos son la fuente inicial de mediadores inflamatorios, fundamentalmente Histamina.

Tracto gastrointestinal
Aumento secrecin fluidos Aumento de peristalsis

Activacin de mastocitos Y liberacin de grnulos

Aproximaciones Teraputicas
Diana
Activacin de clulas Th2 Activacin de clulas B para producir IgE

Mecanismo
Invertir la proporcin Th2/Th1

Aproximacin
Pptidos especficos de antgeno Citocinas: IFN, IL-12 Inhibir CD40L Inhibir IL-4 e IL-13 Bloqueo del FcR para IgE

Bloquear la co-estimulacin Inhibir las citocinas Th2 Inhibir los efectos de la unin de IgE al FcR del mastocito Inhibir el efecto de los mediadores en respuestas especficas Inhibir la sntesis de mediadores especficos Bloquear los receptores de citocinas o quimiocinas que median el reclutamiento y activacin de Eosinfilos

Vas respiratorias
Disminucin de dimetro Aumento secreccin mucosa

Vasos sanguneos
Aumento flujo sanguneo Aumento permeabilidad vascular

Activacin de mastocitos Accin de los mediadores

Drogas anti-histamnicas

Expulsin del contenido Gastro-intestinal (diarrea, vmitos)

Expulsin del contenido De vas respiratorias (flemas, estornudos+)

Aumento de fludos en tejidos, y de flujo linfoide en ndulos linfticos Aumento de clulas y protenas en tejidos Aumento de respuestas efectoras en tejidos

Inhibidores de lipo-oxigenasa Inhibir la IL-5 Bloquear el CCR3

Inflamacin dependiente de Eosinfilos

Hipersensibilidad Tipo II
Mediada por IgG Antgenos unidos a membranas celulares bien por que se encuentren en ellas naturalmente o porque se depositen en ellas. Va clsica de activacin del complemento involucrada Clulas fagocticas involucradas: va FcR y va CR Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC): por clulas NK y eosinfilos

Eritrocitos y anticuerpos antieritrocitarios

Los autoanticuerpos pueden producir hipersensibilidad tipo II

Clulas con receptor para Fc (FcR)M

Activacin del complemento y clulas con receptores para complemento (CR)

Fagocitosis y lisis de eritrocitos

Fagocitosis y lisis de eritrocitos

Tipo II
Clula no propia

Citotxica Desarrollo en 5 8 horas

Lisis por complemento

Tipo II
Primer embarazo, la madre origina una respuesta anti RhD contra hemates del feto. En el parto puede estar en contacto con hemates del primer hijo. Tambin puede sensibilizarse por transfusiones

Madre RhD -

En embarazos posteriores, los anticuerpos IgG maternos atraviesan placenta y destruyen los hemates RhD+ del recin nacido o feto.

Transfusiones
Anticuerpos normales

Ig M Ig G

Feto RhD +
Fagocitosis

Clula propia

Enfermedad hemoltica del recin nacido

Autoanticuerpos

Anemia hemoltca autoimune

La eliminacin de clulas de sangre opsonizadas (C3b) ocurre en el bazo, donde son fagocitadas por macrfagos.

Si a la madre se le inyectan anticuerpos anti RhD despus del nacimiento de cada nio RhD+ , se eliminan (ocultan) hemates RhD + del nio, impidiendo que el sistema inmune desarrolle una respuesta en anticuerpos.

Tipo II
Algunos autores la denominan hipersensibilidad mediada por IgG e IgM

Anemia hemoltica inducida por Drogas

penicilina Anticuerpos frente al neoantigeno

En resumen, se producen daos tisulares en casos tales como:

eritrocit o

- Incompatibilidad Rhesus - Reacciones en las transfusiones - Autoantgenos. Gran variedad de autoanticuerpos contra antgenos propios tales como la membrana basal del glomrulo (sndrome de Goodpasture) el receptor de acetilcolina (Myastenia gravis). -Drogas. La penicilina se puede unir a eritrocitos y causar hemlisis.

complemento

Lisis de eritrocitos mediada por MAC Opsonizacin por anticuerpos Opsonizacin por complemento

Hipersensibilidad Tipo III

Enfermedad por Inmuno-Complejos Producida por antgeno soluble (local o sistmico) Mediada por IgG, IgM Requiere alto ttulo tanto de Ag como de Ab Va clsica de activacin del complemento involucrada Clulas fagocticas involucradas

Condiciones de Predisposicin
Inyeccin, Ingestin o Inhalacin repetida del antgeno Infecciones persistentes Autoinmunidad Cancer Presencia de Inmunoglobulinas sensibles a la temperatura (crioglobulinas)

Tipo III
Efecto fisiolgico

Por Inmunocomplejos Eliminacin en bazo (fagocitosis)

Tipo III

Por Inmunocomplejos

Reaccin de Arthus
C3b C3b
Neutrfilos

Necrosis
Neutrfilos

Vasculitis, glomrulo renal, piel, pulmn articulaciones, corazn, etc.

Reaccin experimental. Si a un animal hiperinmunizado, se le inocula intradrmicamente el antgeno, se induce una reaccin semi retardada (aprox. 6 horas) caracterizada macroscpicamente por un prpura necrtico y petequias. Histolgicamente aparece una trombosis vascular y acumulacin local de neutrfilos. En inmunofluorescencia se ve acumulacin de C3b e IgG.

Depsito fuera de los vasos. Reaccin tipo Arthus

Depsito en de los vasos. Enfermedad del suero

Enfermedad del suero

En la inoculacin de protenas no propias por va intravenosa (por ej. en la inmunizacin pasiva: antiveneno de ofidios, anti suero antitetnico), el individuo produce anticuerpos. Si hay un segundo encuentro con el antgeno (inoculacin del mismo antisuero ), se produce la precipitacin de inmunocomplejos en vasos. Como consecuencia aparecen lesiones renales, articulares, cardacas, en vasos por depsito de IgG y fragmentos de C3 en la pared de vasos en esos rganos.

Tipo III

Por Inmunocomplejos

Tipo III

Por Inmunocomplejos

Los inmunocomplejos circulantes - Infecciones

Los complejos inmunes circulantes pueden formarse de forma transitoria, p. ej. en una infeccin sin haber efecto patolgico.

Los inmunocomplejos circulantes - Autoinmunidad En las enfermedades autoinmunes el antgeno est permanentemente presente. Los inmunocomplejos con los autoanticuerpos, producen lesin en las paredes de los vasos.

Si la multiplicacin del agente infeccioso no es eficientemente controlada por el Sistema Inmune o el tratamiento antibitico.

Formacin de inmunocomplejos circulantes

- Anginas estreptoccicas complicadas con glomerulonefritis - Endocarditis bacterianas - Forma lepromatosa de la lepra - Infecciones virales prolongadas (hepatitis B y especialmente hepatitis C) -Gran nmero de parasitosis (paludismo, esquistosomiasis, tripanosomiasis, leishmaniasis, etc)

Lupus eritematoso sistmico

(complejos antgenos nucleares - autoanticuerpos anti antgenos nucleares)

Tipo III
Fisiologa de los inmunocomplejos

Por Inmunocomplejos

Tipo III

Por Inmunocomplejos

La lesin por inmunocomplejos sobre la pared vascular implica varias etapas -Depsito de los inmunocomplejos sobre la pared vascular y activacin del Sistema de Complemento -La liberacin de anafilotoxinas quimiotcticas C3a y C5a, implica la atraccin y activacin de neutrfilos, degranulacin de plaquetas, inicio de la coagulacin. En el tejido conectivo prximo estos fragmentos activan mastocitos, con la consiguiente liberacin de sus grnulos. - Aumenta la expresin de molculas de adhesin en el endotelio, inmovilizacin de plaquetas y neutrfilos, activacin de neutrfilos (reaccin oxidativa, liberacin de enzimas lisosomales). -Adhesin de monocitos y luego de linfocitos T. Liberacin de citocinas (IL-1 TNF-). Migracin de monocitos y neutrfilos a travs de la membrana basal.

Los inmunocomplejos circulantes (ICC), pueden incluir varios tipos de molculas: ANTGENO ANTICUERPO, ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPO, FACTOR REUMATOIDEO, PROTENAS DEL COMPLEMENTO

Mecanismos de solubilizacin y transporte de los ICC.

-El complemento juega un rol importante en estos mecanismos. El C3b sobre el antgeno, posibilita el transporte por los hemates de los IC anclndolos por su receptor CR1, luego se produce la eliminacin por fagocitosis por macrfagos de bazo e hgado. -Los complejos inmune de gran tamao son eliminados ms rpida y fcilmente que los pequeos, que son los que tiene tendencia a depositarse en vasos.

Mecanismos de depsito de los inmunocomplejos.

La principal causa del depsito son factores hemodinmicos. La sangre normalmente fluye de forma laminar, por lo que las partculas circulan por el centro separadas por una pequea lmina de plasma. En las zonas fisiolgicas de filtracin se aumenta el contacto con el endotelio (glomrulo renal, capilares de la sinovial), favoreciendo el depsito.

Tipo III
Sitio de accin Antgenos

Hipersensibilidad tipo III

Enfermedad
Pulmn de granjero Enfermedad del criador de palomas Nefritis estreptoccica.

Alergias por deposicin de Inmuno-Complejos

Enfermedad
Vasculitis Arteritis Glomerulonefritis

Ruta de entrada del Ag

Intravenosa

Deposicin del Inmuno-Complejo

Vasos sanguneos (venosos, arteriales) Glomrulos renales

Esporas de bacterias Localizado (por inhalacin) Esporas de hongos

Intravenosa

Heces de paloma Estreptococos Hepatitis B Virus de Epstein Barr

Artritis

Intravenosa

Membrana sinovial (articulaciones) Area epidrmica perivascular Alveolos pulmonares

Sistmico

Malaria Autoantgenos (ej. ADN) Drogas penicilina. Sulfamidas Lupus eritematoso sistmico Alergia a drogas

Reaccin de Arthus Rash cutneo Pulmn de Granjero

Subcutnea

Respiratoria

Daos Tisulares por depsito de IC

Bloqueo circulatorio, conducente a necrosis tisular Daos enzimticos y fagocticos inducidos por fijacin del complemento Vasodilatacin y edema (si se produce de modo sistmico puede conducir a shock) Inflamacin

Enfermedad del suero (sistmica):

Hipersensibilidad transitoria por I C

Injeccin de un suero extrao

Fiebre, vasculitis, artritis, nefritis

Hipersensibilidad Tipo IV
Mediada por clulas; no participan anticuerpos Tambin llamada Hipersensibilidad Retardada

Tipo IV
Hapteno, agente infeccsioso

Mediada por clulas. (clulas T) Hipersensibilidad de tipo retardado.

Macrfagos persistentemente infectados o estimulados

Cl T

Clulas gigantes

macrfaos

Linfocitos

Participan clulas Th1 y Th2 (menos frecuentemente T citotxicas)

Presentadora en piel

granuloma

Tipo IV

Tipo IV
Dermatitis por contacto
Hora 0

tuberculina

48-72 horas

Fase de sensibilizacin
Molculas pequeas (Haptenos)

Fase efectora
Reencuentro con el antgeno

piel

clula dendrtica

dermis Vaso sanguneo

Clulas T, macrfagos, fluido (edema)

Clula Th1
Clua de Langerhans

Clula Th1
citocinas

presentacin

Clula T
citocinas

citocinas proliferacin proliferacin

Tipo IV
Dermatitis por contacto

Diferentes reacciones de Hipersensibilidad Tipo IV

Las reacciones de hipersensibilidad tipo IV estn mediadas por clulas T especficas de antgeno

Agentes que causan dermatitis por contacto

Productos qumicos: nquel, trementina, algunos cosmticos, formaldehdo, resinas epoxi, resinas acrlicas

Enfermedad
Hipersensibilidad Retardada (Tuberculnica) (24-72 horas) Hipersensibilidad por Contacto (10-14 das) Hipersensibilidad con Granulomas (semanas)

Antgeno
Protenas: veneno de insectos, protenas de micobacterias (ruberculina, lepronina) Haptenos (hiedra venenosa) Metales pequeos: cromo, niquel Metales inhalados: berilio, silicio, asbesto, talco Patgenos intra-celulares Sustancias qumicas solubles en lpidos que atraviesan la membrana y modifican protenas Gliadina

Consecuencias
Hinchazn drmica local: eritema, induracin, infiltrado celular y dermatitis Reaccin epidrmica local: eritema, infiltrado celular, eczema

Plantas: hiedra venenosa, caucho, etc.

Hipersensibilidad por clulas Tc

Macrfagos activados fagocitan los Ags, pero no los pueden destruir. Forman clulas grandes (epiteloides) que encierran el Ag sin lisar... GRANULOMAS Citolisis de clulas propias que han recibido la sustancia modificadora.

Enteropata sensible al Gluten (Enf. Celiaca)

Atrofia de vellosidades en el intestino delgado, malabsorcin intestinal

El Ag se inocula subcutneaMente y es procesado por Clulas presentadoras De Ag locales

Etapas en la Hipersensibilidad Tipo IV

El Ag es procesado por macrfagos Tisulares y estimula clulas Th1

Clulas Th1 efectoras El reclutamiento de clulas T, Reconocen el Ag y liberan fagocitos, fludo y protenas Citocinas que actan sobre al sitio de entrada del Ag El endotelio vascular Ocasionan la lesin visible

Quimiocinas Reclutamiento de macrfagos al sitio del Ag

Interfern-
Activacin de macrfagos y liberacin de mediadores inflamatorios

TNF- y TNF-
Necrosis tisular local. Aumento de expresin de molculas de adhesin en vasos locales

IL-3 y GM-CSF
Produccin de monocitos por clulas stem de la mdula sea

Ejemplos de enfermedades causadas por los diferentes tipos de hipersensibilidad

Mecanismo de Hipersensibilid ad
Tipo I (IgE/mastocitos) Inmediata Tipo II (IgG)

Alergenos

Patgenos

Aloantgen os

Autoantgeno s

Rinitis alrgica (polen) Anemia hemoltica (penicilina) Pulmn del granjero (hongo de la paja) Dermatitis por contacto (niquel) Glomerulonefriti s (postestreptococos) Lepratuberculoide (micobacterias) Rechazo agudo posttrasplante (HLA) Reaccin posttransfusional (AB0, Rh) Miastenia grave (receptor de acetil colina) Lupus Eritematoso Sistmico (antiDNA) Diabetes mellitus insulino dependiente (clulas pncreas)

Tipo III (IgG en inmunocomplejos) Tipo IV (linfocitos T) Retardada

Las enfermedades alrgicas no son nuevas

1698 Floyer - Tratadon del Asma 1796 Jenner - Exposicin al Cox pox para protegerse de la viruela 1800 Koch - Los microorganismos causan enfermedades especficas 1819 Bostock - Una afeccin peridica de los ojos y trax. Catarro de verano 1869 Blackley - Asoci el catarro de verano con la cantidad de polen mediante examen microscpico 1906 Von Pirquet - Acu el trmino ALERGIA: Alos = diferente, ergos = accin 1923 Coca y Cooke - Defini ATPICO y ATOPIA como individuos con una peculiar capacidad de ser sensibles a ciertas protenas del ambiente y hbitos de exposicin a ellos

Los sntomas de la alergia se transfieren por la sangre

Paciente previamente sano que sufre un ataque grave de asma en un carruaje tirado por caballos

Dos semanas antes del ataque de asma, el paciente haba recibido sangre de un donante alrgico a los caballos La sangre del donante sensibiliz al receptor contra los antgenos del caballo

1919 Ramrez

La alergia puede ser transferida por el suero Alergia

bacalao t= 0 horas t= 16 horas Respuesta inadecuada a sustancias que son: NO infecciosas NO invasivas Inocuas Solo ocurre en individuos que son inmunolgicamente sensibles a estas sustancias Por qu se produce una respuesta inmune a sustancias inocuas?

suero

Alrgico al bacalao en cualquier sitio de inyeccin

No alrgico

Alrgico al bacalao solo en el sitio de la inyeccin del suero

1919 - Primera indicacin que la alergia era debida a un factor srico 1921 - Prausnitz y Kustner, anafilaxis cutnea pasiva 1923 - Factor srico denominado reagina 1968- Ishizaka identific la reagina como IgE

Alergenos y reacciones alrgicas

Alergenos inhalados y alergias asociadas
caros del polvo de la casa, alergenos ocupacionales, pelos de animales Asma bronquial: Constriccin bronquial, produccin excesiva de moco, inflamacin de las vas areas Rinitis: Edema de la mucosa nasal, rinorrea, estornudo Conjuntivitis y dermatitis atpica: Causada en parte por la sensibilizacin a alergenos inhalados

Propiedades de los alergenos inhalados que pueden afectar a la alergenicidad

No propio, protenas biolgicamente activas

Las protenas inducen eficientemente la respuesta de las clulas T, alteran la actividad enzimtica, alteran la integridad de las membranas, pueden tener propiedades inmunoreguladoras

Introducidas intramuscularmente a bajas dosis

Favorecen el desarrollo de clulas Th2

De bajo peso molecular Alergenos ingeridos y alergias asociadas

Marisco, leche, huevos, pescado, trigo Vmitos, diarrrea, urticaria Difunden rpidamente

De alta solubilidad
Se eluyen rpidamente de otras partculas

Alergenos subcutneos e intravenosos

Picaduras de insectos, drogas, venenos, suero Enrojecimiento, anafilaxis sistmica, dermatitis atpica

Estables
Sobreviven a la desecacin

Particuladas y fcilmente inhaladas

Se sitan en el tracto respiratorio

Asma alrgico
2000 muertes al ao en U.K. 12% de la poblacin de U.K. afectada La incidencia aumenta en nios Factor Odds ratio Alergenos de interior 4-20 Fumador pasivo <2 aos 4.7 Fumador pasivo >2 aos 0.6 Polucin externa 1-4 La calidad del aire interior es ms importante que la polucin externa a la hora de determinar el riesgo de convertirse en asmtico La polucin externa probablemente no causa asma pero exacerba la enfermedad existente

Qu son los alergenos?

Carbohidrasas Protenas reguladoras Inhibidores enzimticos Protenas tansportadoras Glutation transferasa Lectinas Proteinasas Protenas del tracto reproductivo Ribonucleasas La realizacin de las funciones bioqumicas de los alergenos afecta su inmunogenicidad y alergenicidad?

Respuesta inmune alrgica

Sensibilizacin e interacciones simuladores

CPA CPA polarizacin

Perturbacin de la red de IgE

19 Autoinmunidad
J. L. Rodrguez
INTRODUCCIN La Autoinmunidad patolgica viene definida por reacciones de base inmunolgica, habitualmente persistentes y de larga duracin, en las que intervienen antgenos propios (autoantgenos). Su expresin clnica es la consecuencia de la alteracin orgnica o funcional de las clulas, u rgano donde reside el antgeno que interviene en la reaccin (enfermedades autoinmunes rgano-especficas). Cuando complejos de autoantgeno-autoanticuerpos, circulan por la sangre y se depositan en diversos lugares del organismo, dan lugar a patologa a nivel de diversos rganos, y constituyen la base de las denominadas enfermedades autoinmunes sistmicas o no rgano especificas. La idea de Autoinmunidad patolgica lleva implcita, la de autoinmunidad fisiolgica o natural. En efecto todos los individuos, tenemos linfocitos T y linfocitos B con potencialidad autorreactiva. Sin embargo como ha quedado dicho en el capitulo anterior, existen una serie de mecanismos que permiten que aquellos linfocitos autorreactivos potencialmente peligrosos sean eliminados fsica o funcionalmente. Criterios que definen las enfermedades autoinmunes No existen unos criterios definidos y aceptados internacionalmente que permitan incluir como autoinmune una determinada enfermedad. Sin embargo muchas de las que actualmente se aceptan como autoinmunes lo son por combinar algunos o todos de los criterios que apuntamos a continuacin:

1. Presencia en el suero del enfermo de autoanticuerpos reactivos con

autoantgenos, presentes especficamente en el rgano o en algunas clulas del rgano diana de la enfermedad; o autoanticuerpos contra autoantgenos distribuidos de forma ms general en el organismo.

2. Presencia de autoanticuerpos fijados en las clulas o estructuras que

sufren el proceso patolgico.

3. Demostracin de que dichos autoanticuerpos juegan un papel

patognico en la enfermedad correspondiente.

4. Presencia de infiltrados linfocitarios de forma crnica en los tejidos

afectados.

5. Demostracin de que los linfocitos T aislados del rgano que sufre el

proceso autoinmune, pueden ser activados in vitro por el autoantgeno putativo presentado adecuadamente.

6. Existencia de modelos experimentales espontneos o inducidos que

remeden la enfermedad correspondiente en el hombre, y en los que se demuestre que el sistema inmunlogico juega el papel fundamental en su instauracin.

7. Asociacin en un mismo paciente de alguna otra enfermedad

considerada de base autoinmune

8. Mejora del cuadro clnico con tratamientos inmunosupresores. 9. La observacin de que un rgano o tejido transplantado de un individuo
idntico, es rechazado de forma acelerada por el receptor, confirma el origen autoinmune del proceso que llev a la necesidad de dicho transplante. (Este hecho se ha visto en pacientes diabticos transplantados con pncreas de gemelos idnticos).

Factores genticos y enfermedades autoinmunes Hoy sabemos que existen factores genticos que imprimen susceptibilidad para el desarrollo de enfermedades autoinmunes y en muchos casos el genotipo del complejo principal de histocompatibilidad influye en la susceptibilidad a desarrollar determinadas enfermedades autoinmunes como se trata en el capitulo HLA y enfermedad. Sin embargo, el mecanismo que relaciona la asociacin de determinados alelos del complejo principal de histocompatibilidad con susceptibilidad a enfermedades autoinmunes no esta aclarado y hay que dejar constancia del carcter incompleto de dichas asociaciones. Solamente una pequea fraccin de los individuos que presentan un determinado alelo HLA desarrollar la enfermedad con que dicho alelo se asocia. Factores ambientales y enfermedades autoinmunes La concordancia de gemelos monocigotos para una enfermedad autoinmune no supera en ningn caso el 60%. En consecuencia debe haber factores no controlados genticamente que intervienen en la expresin de las enfermedades autoinmunes. A dichos factores en general les denominamos factores ambientales. Entre ellos destacan los: Agentes infecciosos Es frecuente que una enfermedad autoinmune venga precedida de forma ms o menos prxima de una enfermedad infecciosa. Los agentes infecciosos pueden poner en marcha una enfermedad autoinmune actuando de diversas maneras, por ejemplo:

1. Actuando como superantgenos, pueden mediar la activacin policlonal

de linfocitos T y/o B y macrfagos y liberar gran cantidad de citocinas que rescataran clulas anergizadas autorreactivas.

2. Pueden causar la modificacin de un autoantgeno, crendose un

neoantgeno capaz de desencadenar una respuesta que actuara sobre el autoantgeno.

3. Virus infectando las propias clulas linfocitarias podran destruir o alterar

la funcin de determinadas poblaciones con capacidad reguladora de la respuesta.

4. Los anticuerpos y/o linfocitos T generados en una respuesta inmune

contra componentes de un agente infeccioso, pueden reaccionar en forma cruzada con ciertos componentes del propio husped, al presentar estos ltimos ciertos eptopos compartidos con el componente microbiano. Este fenmeno de reactividad cruzada entre componentes de un husped y componentes de un agente infeccioso suele designarse como mimetismo molecular. El mimetismo molecular como mecanismo de enfermedad autoinmune, fue descrito por primera vez, al demostrarse que pacientes con fiebre reumtica presentaban anticuerpos que reaccionaban con antgenos del estreptococo y con el tejido cardiaco.

El mecanismo de mimetismo molecular, es uno de los que en la actualidad tiene ms predicamento para explicar la iniciacin del fenmeno autoinmune. En esta direccin se han buscado molculas en agentes infecciosos con eptopos reconocidos por linfocitos B y que se encuentren tambin en molculas propias, y aun ms importante molculas conteniendo secuencias con los motivos requeridos para poder ser presentados por determinados alelos de antgenos de histocompatibilidad y que mimeticen pptidos propios. Eptopos con estas caractersticas se han encontrado en molculas altamente conservadas en la filognia, de todas ellas las ms analizadas han sido las proteinas de estrs o de choque trmico (HSP heat shock proteins). Las protenas de estrs, son producidas por todas las clulas procariotas y eucaritas. Existen varias familias de estas protenas cuya produccin se incrementa rpidamente, en situaciones de estrs o estmulos adversos para la clula (incremento de la temperatura, desecacin, falta de glucosa en el medio, falta de otros nutrientes, irradiacin ultravioleta, radiaciones ionizantes, estmulos inductores de apostosis en general). Entre las protenas de estrs equivalentes de distintos orgenes existe una alta similitud. La denominada HSP 70 de la E. coli y del hombre tienen un 50% de homologias. Por otra parte

dichas protenas juegan un papel fundamental en el correcto plegamiento de determinadas protenas a las que a veces acompaan temporalmente para translocarlas de un compartimento de la clula a otro. En cualquier caso una respuesta inmunolgica montada en principio contra eptopos o pptidos de la protena de estrs del microorganismo podra reaccionar cruzadamente con protenas de estrs propias y colaborar a que se establezca por un mecanismo de spreading (diseminacin) respuesta contra antgenos propios, preferentemente contra la protenas que acompaadas por las protenas de estrs forman con ellas complejos moleculares. Anticuerpos contra varias protenas de estrs se encuentran en diversas enfermedades autoinmunes como diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, lupus eritematoso. Intervienen en el desarrollo de enfermedades autoinmunes experimentales, como en la artritis por adyuvante, y posiblemente en aquellas que se consiguen por la inmunizacin de animales con extractos proteicos emulsionados con adyuvante completo. Sustancias qumicas. Ciertas drogas como hidralazina y procainamida, pueden inducir la aparicin de LES y de determinados anticuerpos antinucleares. Otras como la alfa metil dopa pueden inducir anemia hemolitica por anticuerpos de la clase IgG. El halotane y cido tienlico anticuerpos contra el citocromo P450 y hepatopatia. Por otra parte la administracin de cloruro de mercurio a animales de experimentacin les induce cuadro de LES con neuropata y anticuerpos antinucleares. En este momento no se conoce con certeza el mecanismo de actuacin de dichas sustancias en el desarrollo del fenmeno, pero una posibilidad es que modifiquen determinadas protenas creando neoantgenos y que estos intervengan en la rotura de la tolerancia para los antgenos propios. Factores hormonales Las hormonas sexuales femeninas intervienen de forma aun no aclarada en favorecer la aparicin de enfermedades autoinmunes. De hecho las enfermedades autoinmunes son en general mucho ms frecuentes en mujeres que en varones. La relacin mujer varn va desde 4:1 para la diabetes tipo I y para la artritis reumatoide, hasta 50:1 para la tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar primaria y hepatitis autoinmune clsica. Tipos de enfermedades autoinmunes Las enfermedades autoinmunes se clasifican clsicamente en: sintmicas o no especficas de rgano y especficas de rgano. Entre las primeras se incluyen las que afectan a gran nmero de rganos y se asocian a menudo a hiperactividad de linfocitos B y a un nmero amplio y variado de autoanticuerpos. En este grupo destacan: Lupus eritematoso sistmico, Artrtitis reumatoide, Esclerodermia, Dermatomiositis y Polimiositis. De todas ellas la verdaderamente sistmica y que sin duda presenta ms alteraciones inmunologicas es el LES. Ademas la existencia de diversas cepas de ratones (NZBxNZW, MRL lpr/lpr n/n, BXSB, SWRxSJL), que de forma espontanea presentan un cuadro clnico y hallazgos inmunolgicos muy similares a los del lupus del hombre, ha permitido conocer ms a fondo diversos aspectos inmunolgicos y genticos de dicha enfermedad.(Tabla 19.1).

En las enfermedades autoinmunes especficas de rgano, como la miastenia gravis, el pnfigo o la tiroiditis de Hashimoto, los autoanticuerpos se dirigen especficamente contra un rgano o un tipo celular concreto de un rgano determinado. Existe un grupo de enfermedades autoinmunes dificilmente incluibles en las dos anteriores clasificaciones, por compartir caractersticas de ambos grupos, esto es, afectar un rgano solo o preferentemente, pero tener autoanticuerpos contra estructuras antignicas diversas sobre todo nucleares. Entre ellas destacan: la cirrosis biliar primaria, la hepatitis autoinmune, y el sndrome de Sjgren.

TABLA 19.1 Autoanticuerpos ms significativos segn la enfermedad autoinmune correspondiente Tipo Mitocondriales Anti Actina Anti LKM1 Gliadina Endomisio Clula parietal gstrica A-ANCA ICA Memb, basal glomerular Desmogreina 3 Receptor de acetilcolina Tiroglobulina Peroxidasa tiroidea Jo-1 Ro y La DNAds Sm Scl-70 PM-Scl P-ANCA b 2 glicoproteina I Enfermedad Cirrosis biliar primaria Hepatitis autoinmune tipo 1 Hepatitis autoinmune tipo 2 Enf. Celiaca Enf. Celiaca Atrofia gstrica. y Anemia perniciosa. Colitis ulcerosa. Diabetes tipo I S. de Goodpasture Penfigo vulgar. Miastenia grave T.Hashimoto. Enf. Graves. T. Hashimoto. Enf. Graves Polimiositis. Sndrome de Sjgren L.E.S L.E.S. Esclerodermia Polimiosistis/esclerodermia Poliangeitis microscopica Sndrome antifosfolpido

Autoanticuerpos y enfermedades autoinmunes sistemicas Una caracterstica de las enfermedades autoinmunes sistmicas, es la presencia de autoanticuerpos frente a antgenos de localizacin intracelular y no rgano ni especie especficos. En generico suelen denominarse anticuerpos antinucleares. El nucleoplasma, la matriz nuclear y el nucleolo, son los compartimentos en que dichos antgenos suelen estar localizados, aunque con la misma denominacin de antinucleares se definen con frecuencia a algunos que reconocen antgenos de localizacin citoplsmica. Los antgenos diana suelen ser molculas muy conservadas a lo largo de la evolucin, como el DNA, las histonas y ciertas enzimas intranucleares. Algunos de los anticuerpos antinucleares (ANA), se han asociado especficamente a una determinada enfermedad, (e incluso a la prevalencia de determinados signos o sintomas), y se utilizan como marcadores para su diagnstico. Esto ocurre con los anticuerpos anti DNA nativo y anti Sm en el LES, los anti Scl-70 en la esclerodermia difusa, el anti-centrmero en el sindrome de CREST (calcinosis, Raynaud, dismotilidad esofgica,esclerodactilia y telangiectasias), anti sintetasas de RNA de transferencia en la dermatomiositis-polimiositis. Otros autoanticuerpos se encuentran en diversas entidades como los anti-histonas en el LES y en el lupus inducido por drogas, el anti U1 RNP en el lupus eritematoso sistmico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, y algunos casos de esclerodermia, anti La y anti Ro en LES y en el sindrome de Sjgren y otros muchos de menor significacin. Enfermedades autoinmunes especficas de rgano Aunque algunos autores como McDevitt, preconizan que todas las enfermedades autoinmunes son especficas de rgano y que la nica diferencia con las enfermedades autoinmunes sistmicas (como el LES), radicara en que en estas ltimas el rgano diana de la autoinmunidad es el ncleo de las clulas, lo cierto es que existen claras diferencias entre ambos tipos de enfermedades. En primer lugar la diversidad de autoanticuerpos que se encuentra en el suero de los pacientes con enfermedades

autoinmunes sistmicas es mucho ms amplia y variada que en las enfermedades de rgano, en las cuales los autoanticuerpos, y en conjunto la clula diana de la enfermedad, se limitan con frecuencia a un solo rgano, e incluso a antgenos concretos de algn tipo celular de dicho rgano. Por otra parte en las enfermedades especficas de rgano, los autoanticuerpos o son especie especficos o reaccionan con ms alta afinidad con antgenos de la propia especie. Adems, en las enfermedades autoinmunes especficas de rgano solo se afecta el rgano diana, mientras que en las sistmicas, la repercusin del fenmeno autoinmune, alcanza diversas estructuras del organismo. Desde el punto de vista de la instauracin de la respuesta autoinmune (y sin descartar alteraciones de la regulacin inmunolgica comunes a ambos tipos de enfermedades autoinmunes), todo hace pensar que en las enfermedades especficas de rgano existiran alteraciones cuantitativas o cualitativas relacionadas con alguno o algunos antgenos del rgano diana, mientras que en las sistmicas el factor ms importante sera el fracaso de la regulacin inmunolgica con una hiperactivacin policlonal aunque restringida de linfocitos B. El nmero de enfermedades a las que se adjudica un mecanismo autoinmune especfico de rgano, se ha incrementado con el tiempo, lo que se debe por una parte, al desarrollo de tcnicas ms sensibles para la deteccin de autoanticuerpos y, por otra al empleo de tcnicas de estudio funcional, que permiten demostrar el efecto que producen dichos anticuerpos. Mecanismos patognicos en las enfermedades autoinmunes Los mecanismos inmunolgicos de dao tisular en las enfermedades autoinmunes son de los mismos tipos que los que operan en las reacciones inmunolgicas denominadas de hipersensibilidad. En algunos casos el resultado final es la consecuencia de la reaccin secuencial o simultanea de varias de ellas (ver Hipersensibilidad). Cuando la respuesta autoinmune va dirigida contra antgenos presentes en las membranas basales como en el caso del sindrome de Goodpasture, la activacin del complemento in situ conduce a la liberacin de mediadores que concentran granulocitos en la zona, los cuales liberan localmente enzimas lisosomales que conducen al dao de la membrana. En algunos casos los autoanticuerpos van dirigidos contra receptores hormonales, y pueden actuar como activadores como en el hipertiroidismo de Graves (Figura 19.1). En otros los autoanticuerpos no activan sino que bloquean los receptores y conducen a una situacin de hipofuncin sin destruir tejidos, esta es la situacin en un tipo de diabetes denominada insulino resistente, en la que anticuerpos contra el receptor de la insulina, interfieren con la accin de dicha hormona. En la miastenia gravis, los autoanticuerpos contra el receptor de acetil colina, no solo bloquean los receptores de acetilcolina en la placa neuromuscular sino que facilitan la internalizacin y degradacin de dichos receptores. En todos los casos descritos y por los mecanismos expuestos, los autoanticuerpos son patognicos. Figura 19.1 La adjudicacin de responsabilidad patognica en los casos de enfermedades autoinmunes no rgano especficas es ms incierta. En el lupus eritematoso sistmico, los anticuerpos anti DNAds (de doble hebra) o nativo, mediante la formacin de complejos DNA-anti DNA circulantes, se depositan preferentemente en riones y piel en donde activan complemento. Los productos liberados durante la activacin del complemento atraen y activan clulas fagociticas a la zona . Dichas clulas vertiendo localmente sus enzimas lisosomales,y determinadas quimocinas, son las verdaderas efectoras del dao local.

Para otros muchos autoanticuerpos muy frecuentes y variados en el lupus eritematoso sistmico no se ha podido demostrar un papel claro en la patogenia. Solamente los anticuerpos anti Ro y anti La en los casos de lupus neonatal, se han demostrado patognicos, produciendo en algunos casos bloqueo aurculo ventricular y lesiones dermatolgicas denominadas eritema anular. El mecanismo de accin no queda claro, pero su patogenicidad si, ya que las lesiones guardan correlacin con la presencia de tales autoanticuerpos en la madre, que los transfiere al hijo a travs de la placenta. Las lesiones del nio remiten cuando el catabolismo de la IgG (y por tanto los autoanticuerpos transferidos de la madre) lleva a su desaparicin. Mientras que la patogenicidad de los autoanticuerpos es en general fcilmente demostrable, la de los linfocitos T no lo es. La complejidad del sistema que reconoce el linfocito T (pptidos en el contexto de antgenos de histocompatibilidad), constituye un sistema mucho ms complejo que el de antgenos y anticuerpos, para analizar in vitro. Por otra parte el anlisis in vivo por transferencia pasiva solo es posible en modelos animales, de modo que es a travs de dichos modelos, que conocemos algunos datos a este respecto. En este sentido se ha podido demostrar que linfocitos T obtenidos de animales con enfermedades autoinmunes, bien desarrollada de una forma espontanea como en el caso de la Diabetes tipo I en los ratones NOD, o bien inducida mediante la administracin de antgenos o pptidos de dichos antgenos, como en la encefalomielitis autoinmune experimental, son capaces de transferir pasivamente a animales de la misma cepa, la enfermedad correspondiente. Los linfocitos T pueden producir lesiones por dos mecanismos fundamentalmente. Uno es dependiente de linfocitos T citotxicos, que estn mediados por poroperforinas, granzimes y apoptosis y el otro por linfocitos T colaboradores mediante la liberacin de citocinas inflamatorias. En este ltimo caso, es difcil entender como un mecanismo de este tipo podra actuar con tal finura como para destruir unas clulas y respetar otras intimamente relacionadas en el espacio (como ocurre por ejemplo con las clulas beta de los islotes pancreaticos en la dibates tipo I). No obstante en modelos de transferencia pasiva en ratones se ha podido demostrar que clulas CD4+ con especificidad para antgenos presentes en clulas beta de los islotes, pueden mediar la destruccin de dichas clulas. Recientemente se ha puesto en evidencia un nuevo mecanismo en la produccin de lesiones tisulares en varias enfermedades autoinmunes: tiroiditis de Hashimoto, diabetes de ratones NOD, y sindrome de Sjgren. En estas entidades la concomitante expresin de Fas y Fas-L, en los tirocitos, clulas beta de los islotes pancreticos y epitelio de las glndulas salivares, correspondientes a los rganos diana de las enfermedades antes enunciadas, lleva a la denominada muerte fratricida por mecanismo de apoptosis (la destruccin se produce entre las propias clulas al interacionar el Fas-L de unas con el Fas de las otras). Este mecanismo no requerira en principio una respuesta autoinmune. Desde esta perspectiva las reacciones autoinmunes formaran parte de una fenomenologa ms amplia que conducira a la destruccin de las clulas o tejidos involucrados.

BIBLIOGRAFA 1. Stites, D.P., Terr, A. y Parslow, T. 1994. Basic and Clinical Immunology. Lange Medical Publications 2. Rose, N. R. y Mackay, I.R. 1998. The autoimmune diseases. Academic Press. 3. Peter, J. B. y Shonfed, Y. 1996. Autoantibodie. Elsevier.

Lupus eritematoso sistmico

Manifestaciones cutneas

Enfermedad multisistmica Manifestaciones clnicas y de laboratorio mltiples Produccin excesiva de autoanticuerpos y formacin de inmunocomplejos con dao citotxico.

Aguda Acompaa manifestaciones sistmicas Fotosensibilidad Subaguda Crnica

Manifestaciones musculoesquelticas
Artritis : es la manifestacin ms comn de presentacin No erosiva Deformante Mano de Jaccoud

Erosiones seas

Manifestaciones articulares Manifestaciones renales

Artritis
Pequeas articulaciones -Escasa frecuencia de derrame articular -Lquido articular: Puede tener ANA y clulas LE, escasamente inflamatorio Patrn no erosivo: -menor hipertrofia sinovial -radiolgicamente:ausencia de erosiones

Glomerulonefritis proliferativa difusa. Depsito de inmunocomplejos

Artralgias

Manifestaciones renales

Manifestaciones neuropsiquitricas
Neurolgicas -Cefaleas intratables -Convulsiones -Corea (tipo Sydenham) (Anticuerpos antifosfolpido positivos frecuentes) Psiquitricas -Franca psicosis (anticuerpos antiribosoma P) -Depresin severa -Trastornos cognitivos variables -Anticuerpos anti-neurona en LCR

Biopsia renal: Depsitos de C3 Distribucin capilar

Manifestaciones hematolgicas
Citopenias frecuentes: -leucopenia -linfopenia -trombocitopenia Anemia -Inflamatoria crnica -Insuficiencia renal -Drogas -Hemoltica autoinmune: autoanticuerpos antiglbulo rojo

Manifestaciones hematolgicas
Anticoagulante lpico
Prolongado PTT Falsos tests positivos para sfilis Sindrome de anticuerpos antifosfolpidos

Otras anomalas serolgicas

Autoanticuerpos en el LES
Antincleo 5% ANA negativos (piel, serositis, Ro) Anti ds DNA- primariamente encontrados en lupus. Anti Sm Especificidad para lupus Anti histonas- Lupus inducido por drogas Ro (SSa) y La (SSb)-Comunes a Sjgren y Lupus

Componentes del complemento: C3 y C4 disminuidos en lupus activo ( por consumo) . Anticuerpos Utilidad diagnstica. Pronstica??

Inmunocomplejos en LES
Rol central en la patognesis. Patognesis:-Propiedades de anticuerpos y antgenos Complemento y receptores del complemento Autoanticuerpos Inmunidad celular

Sindrome de Sjgren
Enfermedad autoinmune lentamente progresiva que afecta primariamene glndulas excrinas Infiltrado linfocitario de glndulas excrinas con disminudas secreciones (exocrinopata) Produccin de autoanticuerpos caractersticos Ro (SS-A) y La (SS-B)

Hechos clnicos
Sequedad mucosa manifestada por queratoconjuntivitis sicca Xerostoma Xeroftalmia Xerotrquea
Poliartritis no erosiva Afectacin visceral extraglandular: -pulmn -hgado, -riones -vasos sanguneos Asociacin con otras EAI (AR, LES, Ssc, PM Incremento de malignidad linfoide

Factores que influencian la reactividad autoinmune en SS

Virus Gentica: (HLA B8,DR3, DW52)

Activacin del sistema inmune Hormonales Relacin mujer/hombre 9-1

Otros

Activacin de clulas B Alteracin de la inmunoregulacin

Activacin Policlonal de cel. B Activacin polioligo-monoclonal de cel. B Enfermedad Sistmica Activacin Monoclonal de Cel. B

Sindromes de superposicin
Manifestaciones clnicas, de laboratorio, etc. que no permiten definir un diagnstico preciso. Sindrome se superposicin o solapamiento Enfermedad indiferenciada del tejido conectivo Enfermedad mixta del tejido conectivo

Exocrinopata

Linfoma

Artritis reumatoidea
Enfermedad inflamatoria, autoinmune, que compromete fundamentalmente las articulaciones mviles o sinoviales. Prevalencia de 1% es similar en todo el mundo Etiologa multifactorial -Factores genticos (HLA-determinante de
severidad).

Criterios diagnsticos (ARA 1987)

Entumecimiento matinal Artritis de 3 o ms reas articulares. Artritis de 3 o ms articulaciones de las manos Artritis simtrica Ndulos reumatoideos Factor reumatoideo Radiologa caracterstica (erosiones, desmineralizacin periarticular)

Artritis reumatoidea (manos)

Patognesis de la AR
Tradicionalmente considerada una enfermedad mediada por clulas T Evento inicial ? Uno o escasos antgenos Ulterior reclutamiento de varios antgenos **

Elementos no T
Macrfagos Sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS) Produccin de citocinas enzimas que degradan la matriz Proliferacin e ivasin a tejidos articulares adyacentes de una manera autnoma.

Citocinas
Citocinas relevantes en la AR TNF IL-1 Mediadoras de Inflamacin Destruccin articular

Destruccin articular mediada por citocinas

Osteoblastos Citocinas proinflamatorias TNF-, IL-1,IL-6

OPG RANK

Clulas sinoviales (pannus)

+ +

Cel. T activadas

OPGL
diferenciacin TGF ? Precursor osteoclasto activacion

OPG RANK

Erosiones marginales

Espectro de la enfermedad autoinmune

Especfica de rgano
-Tiroiditis de Hashimoto -Mixedema primario -Tirotoxicosis autoinmune (Enf. Graves - Basedow) -Anemia perniciosa -Enfermedad de Addison -Diabetes insulino dependiente -Sndrome de Goodpasture -Miastenia gravis - Pnfigo

Comparacin de las enfermedades autoinmunes Especfica de rgano

Antgeno Lesiones
Escencialmente localizado en un rgano El antgeno en el rgano es atacado por el sistema inmune. Se solapa con otras de rgano

Sistmica
Ampliamente distribuido en el cuerpo. Se depositan inmunocomplejos de forma sistmica particularmente en piel, articulaciones y rin

-Sndrome de Sjgren

No especfica de rganos Sistmica

-Artritis reumatoidea -Enfemedad mixta del tejido concetivo -Lupus eritematoso sistmico

Solapamiento enfermedades especficas Se solapa con otras

enfermedades sistmicas

Efermedad autoinmune especfica de rgano Efermedad autoinmune especfica de rgano

Tioriditis de Hashimoto Tiroides Mixoedema primario Tirotoxicosis (Enfermedad de Graves) Estmago Anemia perniciosa

Tendencia a la asociacin en individuos y familas.

Curso lento y progresivo

Predominio del sexo femenino

Enfermedad de Addison

Suprarrenales

Pncreas

Dibetes insulino dependiente

Aparente normalidad de las dems funciones del sistema inmune

Los daos tisulares y sntomas clnicos son el resultado de mecanismos efectores.

Autoanticuerpos en tiroiditis autoinmunes

-Anti tiroglobulina (citoplasmtica)

No parece ser patognico. 50-70 %

- Accin de anticuerpos anti-receptor. -Bloquean (miastenia gravis) -Estimulan la accin de la clula (Graves- Basedow, hipertiroidismo) -Anti tiroperoxidasa -Anti hormonas tiroideas

Algunos pacientes los presentan

Se detectan en todas las tiroidopatas autoinmunes con ttulos muy elevados. (citoplasmtica) Responsables de la citotoxicicidad dependiente de complemento. (70%)

-Anti receptor de la TSH

Anti receptor estimulador Enfermedad de Graves - Basedow.

Tiroiditis de Hashimoto o crnica

- Aparece infiltracin de linfocitos en la tiroides -Se ecuentran anticuerpos contra antgenos tiroideos
-Anti tirogobulina -Anti TPO

Tiroiditis de Hashimoto o crnica

Hipotiroidismo
En el transcurso de la enfermedad pude haber hipertiroidismo transitorio, siempre converge a hipotiroidismo por destruccin de la glndula

-Proceso inflamatorio con destruccin progresiva de la tioroides - mayora de mujeres, especialmente ancianas (85% de los pacientes) - Propencin gentica (con otra enfermedad autoinmune) - Se solapa con la enfermedad de Graves

Crecimiento de la tiroides (la causa ms comn de bocio)

Tiroiditis de Hashimoto

Miastenia gravis

Autoanticuerpos contra receptor de acetil colina

Patognesis: involucra clulas T sensibles a antgenos tiroideos, con incierta cotribucin de anticuepros contra TSH

Se bloquea la trasmisin de impulsos nerviosos Debilidad (astenia) Muscular (mio)

El receptor de acetil colina

El receptor de acetil colina es reconocido por su subunidad alfa, la cual tiene sitios inmunognicos (autoanticuerpos en MG) y de unin a toxinas de ciertas serpientes que causan la misma debilidad muscular.

La unin neuromuscular: A.- Normal

Miastenia grave
Los msculos estriados se tornan dbiles, lo cual se aprecia primero en los msculos extraoculares como diplopa (doble visin) o ptosis (cada de prpados). La debilidad farngea y facial origina disfagia y disartria. La debilidad en msculos esquelticos origina dificultad para subir escaleras, peinarse, levantarse de las sillas, etc. Izquierda: paciente antes de la inoculacin de un frmaco anticolinesterasa, derecha: despus del ensayo hay una mejora transitoria de la fuerza muscular.

B.- En Miastenia gravis Normalmente se libera acetilcolina de la terminal nerviosa que es captada por receptores en la membrana posinptica. Los autoanticuerpos contra el receptor inducen la destruccin de la membrana y la perdida de receptores.

18 Inmunodeficiencias
E. Gmez de la Concha y J. Pea
INTRODUCCIN En ocasiones, por fortuna poco frecuentes, existe una deficiencia de alguno de los componentes del sistema inmune, apareciendo las enfermedades que llamamos inmunodeficiencias primarias. En ellas, el defecto se circunscribe en general a un solo aspecto de la respuesta, por lo que se pueden catalogar en inmunodefiencias especficas (si se afecta la parte especfica de la respuesta inmunitaria, es decir los linfocitos B o T) o inespecficas, si afectan a la porcin inespecfica de la respuesta (clulas fagocticas y complemento). Con mayor frecuencia, la respuesta inmunitaria se afecta secundariamente a la aparicin de otra patologa (cncer, enfermedades metablicas, malnutricin etc.) o a la administracin de drogas (drogas inmunosupresoras), hablamos entonces de inmunodeficiencias secundarias. Tanto las inmunodeficiencias primarias como las secundarias se manifiestan clnicamente por la aparicin de infecciones crnicas, persistentes o recurrentes. Es la consecuencia lgica de un trastorno del sistema encargado de defendernos frente a microorganismos. Tambin numerosas infecciones provocan secundariamente una inmunodeficiencia, siendo la ms antiguamente conocida el sarampin, y la ms grave e importante en la actualidad la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), que produce el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).En enfermos con inmunodeficiencia tambin aumenta el riesgo de padecer tumores y enfermedades autoinmunes, todo ello como consecuencia de un mal funcionamiento y una mala regulacin del sistema inmunitario. Debido al rpido progreso en los ltimos aos de la gentica y la biologa molecular, cada da se conocen mejor las causas de las inmunodeficiencias primarias, siendo ms precisos y efectivos su diagnstico y su tratamiento. Inmunodeficiencias primarias Son enfermedades en general poco frecuentes, que en su mayora aparecen en la infancia y tienen un componente gentico importante, habindose definido en muchas de ellas el modo de herencia y la localizacin cromosmica de la alteracin (Tabla 18.1). TABLA 18.1 Principales tipos de inmunodeficiencias IDCS ligada al cromosoma X Agammaglobulinemia ligada al cromosoma X Sindrome de hiper IgM Sindrome de Wiskott-Aldrich Enfer. granulomatosa crnica ligada al X Dficit de ADA Dficit de PNP Ataxia-telangiectasia Dficit de adhesin leucocitaria

Especficas En ellas se afecta la parte especfica de la respuesta inmunitaria (aquella capaz de reconocer al antgeno): los linfocitos T o B, o los anticuerpos. Inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos. Si se afecta solo la produccin de anticuerpos hablamos de una inmunodeficiencia humoral, que puede afectar nicamente a la produccin de anticuerpos de la clase IgA (dficit selectivo de IgA), a la produccin de IgA e IgG (Sndrome de Hiper IgM) o a todas las clases de inmunoglobulinas (agammaglobulinemia ligada al sexo e inmunodeficiencia variable comn).

Son las ms frecuentes dentro de las inmunodeficiencias especficas (especialmente el dficit aislado de IgA), y tambin las menos graves y las que mejor responden al tratamiento. Inmunodeficiencias combinadas En ellas se afectan los linfocitos B y T. Se presentan prcticamente desde el nacimiento con infecciones graves que ponen en peligro la vida, falta de desarrollo, linfopenia e hipogammaglobulinemia. Pueden confundirse con el SIDA trasmitido por la madre, debindose investigar por PCR la presencia de genoma viral. Las ms frecuentes son las diversas formas de inmunodeficiencias combinadas severas (SCID) (Figura 18.1). Entre ellas cabe mencionar:
Figura 18.1

SCID ligada al cromosoma X: debida a una mutacin en la cadena gamma del receptor de la IL-2. Casi siempre se presenta con cifras normales de linfocitos B circulantes. Dficit de adenosina desaminasa (ADA): debida a mutaciones o delecciones en el gen que codifica para este enzima. Dficit de purinanuclesido fosforilasa (PNP). Tambin debida a defectos en el gen que codifica para el enzima PNP. En ambos defectos enzimticos la acumlacin de metabolitos txicos afecta a los linfocitos impidiendo su proliferacin; pero mientras que en el defecto de ADA se afectan tanto los linfocitos T como B, en el defecto de PNP se afectan preferentemente los linfocitos T. Dficit de HLA clase II: Al faltar estas molculas el reconocimiento del antgeno por los linfocitos T CD4+ no se puede realizar. El nmero total de linfocitos es normal pero las clulas T CD4+ estn disminuidas, as como la produccin de anticuerpos y las inmunoglobulinas del suero... Disgenesia reticular: Producida por la falta de diferenciacin de las clulas progenitoras de la mdula sea hacia clulas linfoides y mieloides, por lo que adems de linfopenia se observa neutropenia y trombocitopenia. La muerte suele ocurrir en este caso pocos das despus del nacimiento. Inmunodeficiencias asociadas a otros defectos En algunas enfermedades la inmunodeficiencia no es ms que uno de los componentes del proceso:

1. Sndrome de Wiskott-Aldrich: Caracterizado clnicamente por inmunodeficiencia, eczema

y trombocitopenia. Aparecen alteraciones en el citoesqueleto de los linfocitos T y de las plaquetas. Se conoce el gen defectuoso presente en el brazo corto del cromosoma X, que ha sido clonado y codifica para una protena de 501 aminocidos (WASP), pero la funcin de esta protena an se desconoce.

2. Ataxia-telangiectasia: Es un trastorno autosmico recesivo caracterizado por ataxia

cerebelosa progresiva, dilataciones vasculares (telangiectasias) y una extrema sensibilidad a las radiaciones ionizantes que junto con una incidencia muy elevada de cncer parecen depender de un defecto en los mecanismos de reparacin del DNA.

3. Anomala de Di George: Caracterizado por la aparicin de mltiples anomalas en el

desarrollo de la tercera y cuarta bolsas faringeas (aplasia del timo y las paratiroides y anomalas cardiovasculares severas).

Inmunodeficiencias inespecficas Estas pueden ser por defecto del sistema del complemento o de clulas fagociticas principalmente. Deficiencias del sistema del complemento. Se han descrito defectos en prcticamente todos los componentes del sistema del complemento, aunque son poco frecuentes. Todos tienen una herencia autosmica recesiva, y los heterozigotos pueden ser reconocidos por tener la mitad de los niveles normales del componente afectado. Tanto en el caso de los defectos de los primeros componentes de la va clsica (C1q, C1r, C4 y C2), como en los defectos de los ltimos (C5, C6, C7, C8 y C9) no se observa un aumento en el nmero de infecciones o el incremento es escaso, lo que indica que la va clsica no es indispensable, y que la parte terminal de la cascada tampoco es esencial, existiendo una proteccin aceptable con la activacin del C3 por cualquiera de las dos vas. Defectos de las clulas fagocticas. Adems de las neutropenias, que pueden tener diversas causas, existen diversos defectos de las clulas fagocticas (en general muy poco frecuentes) que pueden afectar a los fagocitos polimorfonucleares o mononucleares. En la enfermedad granulomatosa crnica existe un defecto de la capacidad para producir la muerte intracelular de los microorganismos fagocitados al no producirse intermediarios reactivos del oxigeno. En la enfermedad de Chediak-Higashi los lisosomas son deficientes en elastasa y catepsina G. Ms frecuentes son los defectos de molculas de adhesin de los leucocitos. Son debidos a la biosntesis anormal de la cadena (CD18) comn para el receptor del iC3b, el receptor del C3dg denominado p150/95 y la molcula de adhesin de los fagocitos y de los linfocitos T, LFA-1. Se hereda de forma autosmica recesiva y su expresin fenotpica es variable, pudiendo expresar desde el 1% de las molculas de adhesin normales (casos severos) hasta el 10% (fenotipo moderado). Estos enfermos tienen con frecuencia infecciones en la piel, periodontitis y fstulas perianales o intestinales. La deficiencia de mieloperoxidasa, que es uno de los enzimas ms abundantes en los leucocitos polimorfonucleares, tampoco es demasiado rara, pero cursa en general sin sintomatologa. Diagnstico de las inmunodeficiencias primarias La historia familiar y la aparicin de infecciones recurrentes son en la mayora de los casos los datos iniciales que apuntan hacia un diagnstico de inmunodeficiencia. El tipo de infecciones orienta haca el tipo de inmunodeficiencia. As los dficits puramente de anticuerpos tienen infecciones por bacterias pigenas, mientras que en las deficiencias que afectan tambin a los linfocitos T predominan las infecciones por hongos, virus y bacterias intracelulares. Inmunodeficiencias secundarias La respuesta inmunitaria puede afectarse secundariamente por numerosos factores. La afectacin es en general difusa, aunque suele predominar el defecto de la respuesta celular, y de intensidad muy variable dependiendo del proceso primario. En el tercer mundo la malnutricin es la causa ms frecuente de inmunodeficiencia. En pases desarrollados lo son las enfermedades metablicas, los tumores, las enfermedades infecciosas y diversos tratamientos (drogas citotxicas y corticosteroides fundamentalmente). Entre los tumores, aunque en todos los casos de cncer se acaba produciendo una inmunodeficiencia secundaria, aquellos que afectan a las clulas del propio sistema inmunitario (leucemias y linfomas) son los que ocasionan un trastorno ms grave de la respuesta. Numerosas infecciones, desde la lepra lepromatosa al paludismo producen un trastorno de la respuesta inmunitaria, pero son sin duda las infecciones por virus las que lo afectan ms frecuentemente y con mayor intensidad. Aunque el prototipo ha sido siempre el sarampin, en la actualidad la infeccin por el HIV es la que supone un riesgo ms importante, dada su frecuencia y su capacidad para producir una inmunodeficiencia (SIDA) que acaba con la vida del enfermo.

Sndrome de inmunodeficiencia adquirida. Es una inmunodeficiencia secundaria a la infeccin por el virus HIV. La infeccin se trasmite a travs de la sangre o el semen habiendo resultado especialmente afectados los hemoflicos que han recibido factor VIII derivado de concentrados de plasma, los drogadictos por va intravenosa, los homosexuales del sexo masculino y los hijos de madres infectadas. Sin embargo en la actualidad y en las zonas donde la infeccin est ms extendida, especialmente en Africa y ya tambin en los pases desarrollados, el contacto heterosexual se est constituyendo como un modo de transmisin cada vez ms frecuente. Despus de aos de padecer una infeccin asintomtica por el HIV, se presenta sbitamente una inmunodeficiencia predominantemente celular asociada a infecciones por microorganismos que en condiciones normales no son patgenos (los llamados "oportunistas"). Esto es consecuencia de la destruccin progresiva de la poblacin de linfocitos T CD4+. La glicoprotena gp120 de la corteza del virus se fija con avidez a las molculas CD4 facilitando la entrada del virus en estas clulas. Los macrfagos, las clulas dendrticas y la microgla tambin presentan en su membrana bajas densidades de molculas CD4, por lo que tambin resultan infectados. Otras molculas, tales como ciertos receptores de citocinas, actan tambin como correceptores para la entrada del virus a las clulas. Adems de la desaparicin progresiva de las clulas T CD4+, estos enfermos presentan una hipergammaglobulinemia, (Figura 18.2) que sugiere una estimulacin policlonal, y una desaparicin de capacidad de respuesta celular que se refleja en las pruebas in vitro y en la negativizacin de las pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada. El diagnstico de la infeccin puede hacerse en pocas tempranas por la aparicin de anticuerpos contra el virus. Estos anticuerpos generalmente no son capaces de impedir la unin de la gp 120 al CD4. La iniciacin de los tratamientos con retrovirales ha representado un importante paso en el tratamiento de esta inmunodeficiencia pero no se termina de conseguir una vacuna, ni preventiva ni curativa, eficaz. En la fase de inmunodeficiencia el enfermo presenta infecciones de todo tipo, pero fundamentalmente pulmonares y con frecuencia complicaciones que afectan al sistema nervioso central. Figura 18.2

BIBLIOGRAFA

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DEFINICIN Y CLASIFICACIN DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Definicin

Enfermedades debidas a defectos primarios en la generacin, en la cantidad o en la funcionalidad de las clulas que participan en la respuesta inmune (linfocitos B, T, NK y otros leucocitos), o de factores moleculares que colaboran en la misma (Sistema del complemento y citocinas). Tienen una incidencia relativamente baja, pero suelen presentar una clnica grave, sobre todo por la presencia de infecciones repetidas y graves. Se incluyen tambin algunas afecciones no estrictamente relacionadas con esta clnica (por ej.: el defcit de C1 inhibidor). Se han localizado los defctos genticos causantes algunas de estas enfermedades.

CLNICA DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS

IDP IDP de Anticuerpos Precoz o en el adulto A veces + IDP combinadas Muy precoz Dficit de fagocitosis Precoz Dficit de complemento Variable

Edad de comienzo H familiar de IDP Signos y sntomas

A veces +

A veces +

A veces +

Ausencia tejido linf. perifrico Linf. B ausentes, disminudos o normales Inf. bacterianas Diarrea crnica Bacterias Enterovirus

Linfopenia Candidiasis persistente Neumona intersticial Retraso de crecimiento Virus, Hongos Bacterias Poco frecuente

Infecciones mucocutneas Hipergammaglobulinemia Abscesos cutneos y viscerales Bacterias Hongos Infrecuente No

Meningitis Autoinmunidad

Microorganismos

Bacterias

Autoinmunidad Frecuente Tumores

Frecuente No

Carcinoma Linfomas y digestivo leucemias Linfomas,leucemias

CLNICA DE LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS CAUSAS SECUNDARIAS MS FRECUENTES DE LAS HIPOGAMMAGLOBULINEMIAS

Las cifras de inmunoglobulinas pueden estar muy disminudas, pero su capacidad de formar anticuerpos es normal y la susceptibilidad a infecciones no est normalmente aumentada. Sndrome nefrtico Linfangiectasia intestinal Otras enteropatas en que se pierde protenas Grandes quemados Hipoplasia medular Neoplasias linfoides B Distrofia miotnica Timoma Uremia prolongada Tratamiento prolongado con citotxicos, corticoides o radioterapia Tratamiento prolongado: Fenitoina, Sales oro,Penicilamina,Sulfasalazina

PARMETROS INMUNOLGICOS SEGN LA EDAD Complemento

Componentes del complemento Recin nacido a trmino Recin nacido prematuro

CH50 56-90* 45-71 AP50 49-65 40-51 C1q 65-90 SD (sin datos) C4 60-100 27-58 C2 76-100 42-91 C3 60-100 96 C5 75 SD C6 47 SD C7 67 SD C8 ~ 20 SD C9 <20 SD B 35-59 36-50 P 33-71 13-65 H 61 SD C3bi 55 SD adulta SD: sin datos. * Los niveles corresponden al % de los niveles normales de la poblacin

CLASIFICACIN DE LAS IDP

DIAGNSTICO PRENATAL Enfermedad Anlisis gentico Hallazgos en directo/indirecto sangre de cordn fetal o clulas amniticas
+ + + + Ausencia de clulas B Ausencia de clulas T Ausencia de clulas T(y clulas B) Linfocitos "calvos" en microscopa electrnica Radiosensibilidad Ausencia de molculas MHC clase II en la superficie celular Ausencia de CD18 en fagocitos Produccin de radicales de oxgeno anormal Produccin de radicales de oxgeno anormal Disminucin de ADA en hemates Disminucin de PNP en hemates

IDP DE ANTICUERPOS Clasificacin

La clasificacin de la OMS recoge 10 entidades bien diferenciadas, unas con defectos cuantitativos y otras cualitativos, pero todos afectan a la respuesta de anticuerpos. De alguna de estas inmunodeficiencias se conoce el tipo de herencia. En alguna se ha descrito los defectos moleculares que la producen, facilitando el diagnstico de portadores.

Agammaglobulinemia ligada al X IDP combinada severa ligada al X IDP combinada severa autosmica recesiva Sndrome de Wiskott-Aldrich Ataxia-telangiectasia Deficiencia de MHC clase II Deficiencia de adhesin leucocitaria Enfermedad granulomatosa crnica ligada al X Enfermedad granulomatosa crnica autosmica recesiva Deficiencia de adenosn-desaminasa Deficiencia de purn-nucleosido fosforilasa

+ +

IDP DE ANTICUERPOS IDP DE ANTICUERPOS Definicin

Las ID predominantemente de Anticuerpos se caracterizan por la ausencia total o parcial de todas o algunas de las inmunoglobulinas o de sus subclases. En algunos pacientes el defecto no es cuantitativo sino cualitativo, en los que a pesar de tener niveles normales de inmunoglobulinas no existe la capacidad de realizar una respuesta en anticuerpos correcta. En estos pacientes debe realizarse un estudio de la funcin de los anticuerpos.

Diagnstico Clnico
El cuadro que con mayor frecuencia se asocia a este tipo de inmunodeficiencias son las infecciones bacterianas de repeticin. El aparato respiratorio suele ser el ms afectado, presentando bronquiectasias y distintos grados de insuficiencia respiratoria. Las otitis de repeticin y la sinusitis crnica son tambin. Algunos pacientes presentan malabsorcin grave con infestacin por Giardia lamblia. Es frecuente la asociacin con patologa autoinmune, as como la presencia de autoanticuerpos circulantes sin significacin clnica. La gravedad de estas manifestaciones y sus secuelas, estn en relacin con el tiempo transcurrido desde el inicio de la patologa hasta el tratamiento adecuado. En alguna de estas patologas, como la Agammaglobulinemia ligada al X, la infeccin por virus lentos puede ensombrecer el pronstico.

IDP DE ANTICUERPOS Diagnstico Laboratorio

Las IDP predominantemente de anticuerpos suelen cursar con disminucin o ausencia de una, algunas o todas las inmunoglobulinas o de sus subclases. En ocasiones se requiere el estudio de la funcin de los anticuerpo, valorndose por: presencia de anticuerpos naturales (isohemaglutininas o antiestreptolisinas) e inducidos post-vacunacin. Los antgenos recomendados para realizar la inmunizacin son: el Bacterifago, til para valorar la respuesta primaria y secundaria, o la revacunacin con antgenos a los que el paciente se haya inmunizado previamente (Toxoide tetnico o diftrico). Para valorar la respuesta especfica a polisacridos se recomienda la vacuna neumoccica no conjugada. La pauta a seguir es la titulacin de los anticuerpos especficos previa y 3-4 semanas post-vacunacin. El estudio del fenotipo linfocitario y la respuesta proliferativa a mitgenos y antgenos completan el estudio.

PARMETROS INMUNOLGICOS DEPENDIENTES DE LA EDAD Sistema mononuclear fagoctico

El sistema mononuclear fagoctico puede presentar deficiencias en el perodo neonatal y en los primeros meses de la vida. Los neutrfilos pueden presentar deficiencia parcial del receptor CR3, cuya consecuencia es la existencia de una disminucin de la capacidad de adherencia y una pobre capacidad fagoctica. La quimiotaxis de los neutrfilos puede estar disminuida en el recin nacido. Los valores normales se alcanzan aproximadamente a los dos aos de vida. La quimiotaxis de los monocitos adquiere los niveles del adulto ms lentamente, aproximadamente entre los 6-8 aos de edad.

PATRONES CARACTERISTICOS DE ALGUNAS IDP PATRONES CARACTERISTICOS DE ALGUNAS IDP

En pacientes de 0 a 6 meses IDP
IDCS IDCS con GVHD Sndrome de Omenn Sndrome de Hiper IgM Anomala de Di George Defecto molculas de adhesin Sndrome de Wiskott-Aldrich

En pacientes de 6 meses a 5 aos IDP Clnica

Clnica
Diarrea, neumona, incapacidad de ganar peso Exantema mculo-papular, diarrea, dermatitis Dermatitis descamativa, eritrodermia, diarrea Infecciones repeticin, lcera bucal,neutropenia Hipocalcemia, cardiopata, facies peculiar Retraso cada cordn, leucocitosis, infecciones Ezcema, heces con sangre, otitis supurada.

Agammaglobulinemia ligada al X Polio paraltica tras vacuna de polio oral S. linfoproliferativo ligado al X Mononucleosis infecciosa severa Candidiasis mucocutnea crnica Muguet, candidiasis ungueal, endocrinopatas Sndrome de Hiper IgE Inf. estafilococo, facies tosca, anomala dentaria Sndrome de Chediak Higashi Albinismo culocutneo, infecciones Enf. granulomatosa crnica Abs.cutneos-viscerales,osteomielitis,neumona

PATRONES CARACTERISTICOS DE ALGUNAS IDP

En pacientes mayores de 5 aos y adultos IDP
Agammaglobulinemia ligada al X Sndrome variable comn Ataxia-Telangiectasia Deficiencia de C6,C7,C8 Deficiencia de Tap 1/ Tap 2

IDP PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS Tratamiento

Bsicamente con preparados de gammaglobulina, va intravenosa, intramuscular o subcutnea. La intravenosa es ms empleada por la menor cantidad de efectos secundarios, mayor vida media (~21 das) y la posibilidad de administrar dosis ms altas. La dosis se debe ajustar para cada paciente y deben conseguirse niveles de IgG sricas >500 mgrs/dl, mantenidos entre dosis. Se suelen utilizar dosis de 300-500 mgr/kilo de peso, cada 21 das. El parmetro ms valorable para la dosis correcta de gammaglobulina, es la evolucin clnica del paciente, debeiendo reducir drsticamente las infecciones de repeticin. Adems de la gammaglobulina se debe emplear una terapia antibitica correcta y precoz. La mayora de los pacientes requieren seguimiento en hospitales. Es aconsejable realizar diagnstico prenatal y deteccin de portadoras cuando se conoce el defecto gentico, como en las mutaciones de la tirosin quinasa Btk, en la Agammaglobulinemia ligada al cromosoma X.

Clnica
Dermatomiositis, encefalitis por enterovirus Inf.sinopulmonares,malabsorcin,autoinmunes Inf. sinopulmonares, ataxia, telangiectasias Meningitis recurrente por neisseria Infecciones pulmonares, bronquiectasias

CLNICA DE LAS IDP IDP PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS Etiopatogenia

Este tipo de Inmunodeficiencias puede ser consecuencia de: alteraciones intrnsecas de las clulas B alteraciones secundarias a anomalas de otras poblaciones celulares stas influyen directa o indirectamente en su desarrollo o capacidad funcional y le impiden convertirse en una clula productora de anticuerpos
Fibrosis qustica de pncreas Cuerpo extrao en vas respiratorias Defectos anatmicos cardiopulmonares Anomalas ciliares Asma bronquial Reflujo gastro-esofgico Estenosis uretral o ureteral Drepanocitosis Diabetes Ezcema Enteropata Malnutricin Linfoma Esplenectoma Terapia inmunosupresora Sndrome de Munchausen

OTRAS ENFERMEDADES CON SUSCEPTIBILIDAD AUMENTADA A INFECCIONES

PARMETROS INMUNOLGICOS SEGN LA EDAD

Marcadores fenotpicos de clulas citotxicas naturales

DEFINICIN Y CLASIFICACIN DE LAS IDP LOCALIZACIN EN EL MAPA CROMOSMICO

Inmunodeficiencia combinada severa ligada a X Xq13.1-13.3 Agammaglobulinemia ligada a X Xq21.3-22 Inmunodeficiencia ligada a X con IgM elevada Xq26-27 Sndrome de Wiskott- Aldrich Xp11.22-11.3 Enfermedad granulomatosa crnica ligada a X Xp21.1 Sndrome linfoproliferativo ligado a X Xq26 Deficiencia de adenosn-desaminasa 20q13-ter Deficiencia de purn-nuclesido fosforilasa 14q13.1 Deficiencia de ZAP-70 2q12 Deficiencia de Jak3 19p13.1 RAG-1 / RAG-2 11p12-13 Deficiencia de cadena kappa 2p11 Deleccin de cadenas pesadas de Ig 14q32.3 Ataxia-telangiectasia 11q23.1 Enfermedad granulomatosa crnica autosmica recesiva a. p22phox : 16q24 b. p47phox : 7q11.23 c. p67phox :1q25 Deficit de adhesin linfocitaria 21q22.3 Deficiencia de la cadena alfa de IFN gamma R 6q16.21 Sndrome de Chediak-Higashi 1q4.3 TAP-2 6p21.3 CIITA 16p13.1-2 RFX5 1q21 RFXAP 13q RFXANK 19p12

CD16
Edad meses
0 1-5 6-12 aos 1-4 5-8 9-13 Adultos

clulas/l

CD56
%

clulas/l

CD57
%

clulas/l

13'84'3* 709316 9'14'3 12'74'6 790352 10'65'4 12'54'9 714300 12'26'0

481198 627308 676295

1'20'7 1'40'8 1'71'5

6040 8040 120110

12'94'6 14'45'2 15'24'2 15'55'4

573264 13'15'6 586310 2'61'9 12090 418134 15'06'7 431181 12'56'7 360170 408196 16'55'9 438181 15'86'9 410190 318191 16'46'5 343214 20'55'5 400150

* Mediadesviacin estandar

PARMETROS INMUNOLGICOS SEGN LA EDAD Niveles de Inmunoglobulinas

Edad Ig G Ig M
11 5 30 11 43 17 54 23 58 23 61 19 56 18 65 25 79 33 59 20 99 27

PARMETROS INMUNOLGICOS SEGN LA EDAD Valores de Ig E srica en el nio

Ig A
23 21 13 28 18 37 18 50 24 71 37 93 27 124 45 131 60 148 63 200 61

Ig totales Edad
1044 201 481 127 498 204 752 242 870 258 1024 205 1078 245 1112 293 1334 254 1153 169 1457 353

Recin nacido 1031 200 1-3 meses 4-6 meses 7-12 meses 13-24 meses 25-36 meses 3-5 aos 6-8 aos 9-11 aos 12-16 aos Adultos 430 119 427 186 661 219 762 209 892 183 929 228 923 256 1124 235 946 124 1158 305

Media +1D.T. Geomtrica 0.25 2.5 4 6 10 25 30 36 0.55 6.5 7.5 9.5 25 45 110 70

+2D.T.

-1D.T.

-2D.T.

Recin nacido 6 meses 1 ao 2 aos 4 aos 7 aos 10 aos 14 aos

1.3 15 17 29 50 150 200 190

0.1 1 1.7 2 3 3.6 5.5 7

0.5 0.8 0.9 1 1 1 2

Valores en mg/dl. Media desviacin estandar

De 14 a 50 aos los valores son similares A partir de los 50 aos los valores descienden

CLNICA DE LAS IDP DEL SISTEMA FAGOCTICO

La sintomatologa suele comenzar en la primera infancia, pero alguno de estos sndromes pueden aparecer en la edad adulta Signos y Sntomas Neutropenia o leucocitosis Hipergammaglobulinemia Ulceras mucocutneas Linfadenitis Abscesos cutneos y viscerales Periodontitis Neumonas frecuentemente con bullas Osteomielitis Granulomas en ganglios, bazo, hgado e intestino Eczema Retraso en cada de cordn umbilical Susceptibilidad a mycobacterias y salmonella

CLNICA DE LAS IDP DEL SISTEMA FAGOCTICO

Enfermedades Autoinmunes Lupus eritematoso discoide (En 25% de portadoras de granulomatosis crnica ligada al cromosoma X)

CLNICA DE LAS IDP DEL SISTEMA FAGOCTICO

Bacterias Estafilococo dorado Estreptococo dorado Escherichia coli Serratia Salmonella Mycobacterias Klebsiella Burkholderia cepacia Hongos Cndida albicans Aspergillus Nocardia

CLNICA DE IDP DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

Pueden: tener aumento de infecciones, procesos autoinmunes o angioedema o ser asintomticos segn el componente del complemento deficitario Infecciones Infeccin meningoccica (recidivante o por serotipo infrecuente) Infecciones cutneas pigenas Gonococias de repeticin Enfermedades Autoinmunes Lupus eritematoso sistmico Lupus eritematoso discoide Dermatomiositis Esclerodermia Prpura anafilctica Vasculitis Glomerulonefritis membranoproliferativa

CLNICA DE IDP DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

Pueden: tener aumento de infecciones, procesos autoinmunes o angioedema o ser asintomticos segn el componente del complemento deficitario

CLNICA DE LAS IDP COMBINADAS

Signos y Sntomas Historia familiar Ausencia de sombra tmica Linfopenia Candidiasis Diarrea crnica. Anorexia Retraso pndero-estatural Neumona ( con frecuencia intersticial) Anemia aplsica Otitis, Estomatitis Sepsis, Meningitis Colangitis Infeccin diseminada tras vacuna de BCG Tumores Linfomas Leucemias Hepticos Vas biliares

Edema angioneurtico Edema vas areas superiores: recidivante, no pruriginoso ni doloroso Dolor abdominal Rash Bacterias Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhea Haemophilus infuenzae Escherichia coli Estreptococo neumonie Estafilococo dorado

CLNICA DE LAS IDP COMBINADAS

Enfermedades Autoinmunes Anemia hemoltica autoinmune Prpura trombopnica idioptica Neutropenia Hipotiroidismo Lupus eritematoso sistmico Vasculitis Enfermedad injerto contra husped (puede ocurrir por injerto en el feto de clulas maternas o por recibir una transfusin de sangre no irradiada) Eritrodermia Diarrea profusa Hepatitis Eosinofilia

CLNICA DE LAS IDP COMBINADAS

Bacterias Pseudomona Salmonella Haemophilus influenzae Estafilococo dorado Estreptococo neumonie Campylobacter Virus Virus sincitial respiratorio Herpes virus Citomegalovirus Enterovirus Parvovirus Hongos Cndida albicans Aspergillus Pneumocystis carinii Criptococus Protozoos Giardia lamblia Criptosporidium

CLNICA DE IDP ASOCIADAS A OTROS DEFECTOS

Hay una serie de enfermedades en las que la inmunodeficiencia tienen un fenotipo peculiar. Con frecuencia tienen antecedentes familiares Sndrome de Wiskott-Aldrich Infecciones recurrentes (otitis, neumonas, sepsis) Eczema Hemorragias de repeticin por trombopenia Linfomas Anemia hemoltica autoinmune Vasculitis Glomerulonefritis Ataxia-Telangiectasia Ataxia cerebelosa progresiva Telangiectasias en conjuntiva y pabellones auriculares Infecciones sinopulmonares bacterianas y vricas Nistagmus Disartria progresiva Hipogonadismo Linfomas y leucemias a-fetoprotena en suero elevada

CLNICA DE IDP ASOCIADAS A OTROS DEFECTOS

Sndrome de Nijmegen Microcefalia Retraso psicomotor Facies peculiar Infecciones sinopulmonares Predisposicin a tumores a-fetoprotena en suero normal Anomala de DiGeorge Hipoparatiroidismo (hipocalcemia) Malformaciones cardiacas Facies anmala (orejas de implantacin baja, hendidura palpebral pequea, hipertelorismo,micrognatia) Hendidura palatina. Clnica de inmunodeficiencia muy variable

CLNICA DE IDP ASOCIADAS A OTROS DEFECTOS

Sndrome de Chediak-Higashi Albinismo culo-cutneo Grnulos gigantes en clulas nucleadas Linfoproliferacin asociada al virus de Epstein-Barr Sndrome de Griscelli Albinismo parcial Encefalopata Infecciones de repeticin Sndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X Hipogammaglobulinemia Mononucleosis infecciosa fatal Linfomas y leucemias Hepatitis Anemia aplstica

CLNICA DE IDP PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS

Signos y Sntomas Historia familiar de I.D.P Linfticos perifricos pequeos o disminudos Linfocitos B ausentes, disminudos o normales Otitis. Sinusitis Neumonas Diarrea infecciosa Sndrome malabsortivo Sepsis Meningitis Conjuntivitis Dermatomiositis like Hepatitis vrica Poliomielitis tras vacunacin Artritis Uretro-cistitis Gastritis atrfica Granulomas

CLNICA DE IDP PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS

Tumores Linfomas Leucemias Adenocarcinomas (tracto digestivo) Hiperplasia nodular linfoide (no neoplasia) Enfermedades Autoinmunes Anemia hemoltica autoinmune Prpura trombopnica idioptica Neutropenia Anemia perniciosa Lupus eritematoso sistmico Tiroiditis Artritis reumatoide Enfermedad celaca Hepatitis crnica activa Cirrosis biliar Enfermedad inflamatoria intestinal

CLNICA DE IDP PREDOMINANTEMENTE DE ANTICUERPOS

Bacterias Haemophilus influenzae Estreptococo neumonie Estafilococo dorado Pseudomona Campylobacter Helicobacter pylori Virus Rotavirus Enterovirus (Echo) Hepatitis B y C Protozoos Giardia lamblia Criptosporidium Otros Mycoplasma (Ureaplasma urealtico)

Conjunto de enfermedades debidas a defectos en el sistema inmune.

Se las clasifica en: primarios: defectos intrnsecos del sistema inmune, congnitos o adquiridos secundarios: defectos del sistema inmune debidos a otra patologa o factores externos En un componente del S.I. o en una protena que lo afecte.

Tendencia a infecciones:

Vricas Bacterianas Fngicas Parasitarias

Incluso microorganismos no infectivos

Inmunodeficiencias primarias
Son desrdenes de la funcin del sistema inmune heredables. defecto en un nico gen (la mayora de ellas). defecto en varios genes (polignicas). interacciones entre caractersticas genticamente determinadas y estrs ambiental o infeccioso.

Tipos de Inmunodeficiencias
Deficiencias de Anticuerpos (Inmunodeficiencias de clulas B o humorales) produccin de anticuerpos afectada; inmunidad celular intacta Deficiencias Celulares inmunidad celular afectada; produccin de anticuerpos intacta Deficiencias Combinadas ambos mecanismos efectores estn afectados Deficiencias en la funcin Fagoctica Deficiencias en el sistema Complemento

Tasa de ocurrencia: 1 en 10000 a 1 en 2000 nacimientos vivos. Se clasifican segn los mecanismos inmunolgicos afectados por el defecto gentico particular.

Innata
Fagocitos: bacterias: Klebsiela, Stafilococos, Nocardia, Serratia, Proteus hongos: Candida, Aspergillus B:

Adquirida

bacterias: pigenas, Stafilococos, Hemophilus, Streptococos protozoos extracelulares: Giardia, Criptosporidium

Complemento: Bacterias: Pigenas, Neiseria, Hemophilus Hongos: Aspergillus

T: patgenos intracelulares Bacterias: Mycobacterium, Listeria, Streptococus Hongos: Cndida, Aspergillus, Pneumocistis virus: Herpes, CMV, Parotiditis

NK:

virus: Herpes

Agamaglobulinemia ligada al cromosoma X

Aproximadamente el 85% de los pacientes son varones. Presentan mutaciones en el gen que codifica para una tirosin-quinasa (Btk o tirosin-quinasa de Bruton). Mutaciones en el gen de la cadena pesada . Mutaciones en los genes que codifican para componentes de la cadena ligera sustituta. Mutaciones en el gen que codifica para el componente Ig del complejo Receptor B. Mutaciones en el gen que codifica para la protena BLNK, protena andamio en la traduccin de seal del Receptor B. Defectos en estos genes afectan las etapas tempranas de la diferenciacin de las clulas B. Los individuos portadores presentan uso selectivo del cromosoma X normal en las clulas B y condensacin del cromosoma defectuoso en otras clulas. Estatus de los pacientes: Igs sricas totales: no detectables o muy disminuidas Clulas B circulantes: < 2%

Clula madre

Clula Pro-B

Clula Pre-B temprana

Clula Pre-B tarda

Hgado fetal Mdula sea

Independiente de antgeno

Seleccin por antgeno

Clula B inmadura

Clula B madura

Plasmocito Dependiente de antgeno

Inmunodeficiencia comn variable (CVID) Agamaglobulinemia autosomal recesiva

Constituye una forma severa de hipogamaglobulinemia comprendida dentro de los desrdenes conocidos como Sndrome de hiper-IgM. Defecto en la citidin-deaminasa inducida por activacin (AICDA), enzima editora de ARN que slo se expresa en las clulas B. Defectos en este gen afectan el cambio de clase de las Igs y la hipermutacin somtica de los genes de Igs. Se observa linfoadenopata e hiperplasia linfoide intestinal, como consecuencia de la disrupcin del desarrollo B dependiente de antgeno. (Hipogamaglobulinemia adquirida, hipogamaglobulinemia del adulto o disgamaglobulinemia) Grupo heterogneo de desordenes involucran B y T, con hipogamaglobulinemia hiperplasia linfoide nodular, infiltracin linfoide difusa hipertrofia de otros tejidos linfoides tambin son frecuentes. neutropenia o trombocitopenia secundaria pueden ser consecuencia de la hepatoesplenomegalia Igs srica: marcadamente disminuida (una o todas) pero mayor que en XLA Clulas B circulantes: niveles normales (hay excepciones) Funcin T: variable

Estatus de los pacientes: IgM srica: normal o aumentada; otros isotipos: disminuidos Clulas B circulantes: slo fenotipo IgM+IgD+

Mecanismos propuestos para estas patologas: defecto intrnseco de clulas B actividad excesiva de clulas T supresoras funcin deficiente de clulas T colaboradoras deficiencias de citocinas Mala interaccin de clulas T y B por expresin deficiente de CD40L

Inmunodeficiencias Celulares (Sndrome parcial de DiGeorge) Deficiencia de IgA

Es la ms comn de las deficiencias de anticuerpos, con una incidencia de 1 en 400 a 1 en 3000. Se define como valores disminuidos de IgA y normales para IgM e IgG. Ambas subclases (IgA1 e IgA2) estn marcadamente disminuidas o ausentes aunque se han descrito deficiencias especficas para cada una. Puede encontrarse en asociacin con otras deficiencias inmune como Ataxia-telangiectasia y deficiencias de subclases de IgG. La aparicin de esta deficiencia en ambos sexos y su agrupacin familiar sugiere un defecto autosomal heredable. La deficiencia selectiva de IgA est fuertemente asociada con alergia atpica. La deficiencia est relacionada con la imposibilidad de que clulas B maduras con fenotipo IgA+IgD+ se transformen en plasmocitos.

Grado variable de hipoplasia tmica y glndulas paratiroideas. Presentan inmunidad celular y produccin de anticuerpos defectuosa. Hipoplasia tmica consecuencia de dismorgnesis de los sacos farngeos 3 y 4 en la embriognesis temprana. Se manifiestan en los primeros meses de vida. Defecto en el cromosoma 22. Es importante identificar el grado de deficiencia T ya que la prctica de transfusiones sanguneas puede resultar en reacciones severas de injerto contra husped. No puede administrarse vacunas a organismos vivos a individuos que presenten deficiencia T.

Inmunodeficiencias Combinadas Severas autosomales recesivas

Inmunodeficiencias Combinadas (CID) Se diferencian de las severas en que la funcin T es defectuosa pero no nula Deficiencia en la Fosforilasa de Purin-Nucletidos (PNP): Deficiencia T profunda con o sin disfuncin B Falla en la enzima produce metabolitos txicos

Defecto en los genes RAG1/RAG2 : Fenotipo: T- B- NK+ Falla en la diferenciacin de las clulas B y T (no hay reordenamiento de los segmentos gnicos que codifican para el receptor) Falla en la inmunidad especfica 20% de los casos de SCID. Defecto en el gen ADA (adenosin-deaminasa) : Fenotipo: TBNKAcumulacin de metabolitos txicos (adenosina, 2-deoxiadenosina y 2-o-metiladenosina), que conducen a la muerte por apoptosis de los linfocitos Falla en la inmunidad especfica 20% de los casos de SCID.

Ataxia-telangiectasia: Inmunidad celular y humoral defectuosa Autosomal recesiva Deficiencia de IgA en el 50 a 80% de los individuos Niveles de IgE generalmente bajos IgG2 o IgG total puede estar disminuida Porcentajes bajos de cls T CD3+ y CD4+, con respuesta moderada a mitgenos

Inmunodeficiencias Combinadas (CID) Sndrome de Wiskott-Aldrich: Naturaleza recesiva ligada al cromosoma X Expresin del gen defectuoso, protena de Wiskott-Aldrich (WASP), limitado a las lneas linfoide y megacarioctica Se caracteriza por eczema, prpura trombocitopnico con nmeros normales de megacariocitos y deficientes de plaquetas Respuesta humoral defectuosa a antgenos polisacridos, ausencia de isohemaglutininas (generalmente) Concentracin de inmunoglobulinas sricas: baja IgM, normal a levemente baja IgG, elevadas IgA e IgE Porcentaje moderadamente reducido de cls. T y respuesta a mitgenos disminuida

Inmunodeficiencias en la funcin fagoctica

Constituyen defectos en la funcin de neutrfilos. Pueden ser cuantitativas (neutropenia) o cualitativas (disfuncin de neutrfilos)

Neutropenia
Es la forma ms comn Generalmente est asociada a otras inmunodeficiencias primarias Las causas primarias a menudo son fatales

Disfuncin de neutrfilos
Se las clasifica de acuerdo al tipo de defecto Se han identificado causas primarias

Inmunodeficiencias en la funcin fagoctica

Enfermedad granulomatosa crnica (CGD)
Se han identificado variantes ligadas al cromosoma X y autosomales La forma ligada al cromosoma X corresponde al 75% de los casos Todas estn relacionadas con mutaciones que afectan elementos del complejo fagocito oxidasa; falta de citocromos Los fagocitos presentan metabolismo oxidativo y actividad microbicida bajos

Inmunodeficiencias en el Sistema Complemento

Se han descrito deficiencias en todos los componentes solubles del Sistema Complemento excepto facto B Deficiencias en los componentes iniciales de la va clsica (C1q, C1r, C2 y C4) originan patologas inflamatorias autoinmunes tipo SLE Deficiencias en los componentes finales (C5 a C8) estn asociadas con infecciones recurrentes de Neisseria meningitidis as como enfermedad reumtica Deficiencias en C3 y las protenas reguladoras factor I y factor H favorecen infecciones recurrentes del tipo observado en deficiencias de anticuerpos

Inmunodeficiencias en el Sistema Complemento

Deficiencia en factor I
Conduce a un consumo excesivo y disminucin acelerada de C3 Tiene carcter autosomal recesivo Los individuos con esta patologa presentan opsonizacin defectuosa

Deficiencia en el inhibidor de C1
Es la deficiencia heredable ms comn Tiene carcter autosomal recesivo Provoca angioedema hereditario; el inhibidor de C1 tambin inhibe otras serin-proteasas del sistema de la coagulacin y del sistema de quininas

22 Inmunologa de los Transplantes

M. F. Gonzlez y A. Nez
INTRODUCCIN Un transplante o injerto es la transferencia de clulas vivas, rganos o tejidos de una parte del organismo a otra o de un individuo a otro. Segn la relacin existente entre donante y receptor, existen diferentes tipos de transplante. As, se denomina autotransplante aquel injerto en el que donante y receptor son el mismo individuo, como ocurre, por ejemplo, en transplantes de piel; transplante singnico es aquel que se realiza entre dos individuos que son genticamente idnticos (gemelos univitelinos o animales de experimentacin seleccionados); alotransplante es el que se realiza entre dos individuos diferentes pertenecientes a la misma especie y xenotransplante, el efectuado entre dos individuos de especies distintas(Figura22.1)
Figura 22.1

La prctica de los transplantes en clnica humana se ha extendido considerablemente en los ltimos aos al llegar a convertirse en el tratamiento de eleccin en el fracaso renal, heptico o cardiaco. Igualmente, el transplante de mdula sea representa, hoy en da, la terapia ms adecuada para determinadas inmunodeficiencias y sndromes linfoproliferativos, especialmente leucemias. En ambas situaciones se trata de alotransplantes en los que donante y receptor son en la mayora de los casos individuos genticamente distintos. Precisamente estas diferencias genticas son las responsables de que el receptor ponga en marcha una respuesta inmunitaria de rechazo dirigida contra las estructuras extraas presentes en las clulas del injerto que, en la Figura 22.3 clnica, tratamos de evitar mediante el uso de diversas sustancias inmunosupresoras(Figura 22.2).

El transplante de mdula sea es, desde el punto de vista inmunolgico, un caso especial, pues el injerto contiene clulas inmunocompetentes. En esta situacin la respuesta inmunitaria es bidireccional: una reaccin de rechazo, promovida por el receptor contra el injerto, y una inversa, denominada de injerto contra hospedador, tambin conocida por las siglas GVHD (del ingls graft versus host disease) producida por la respuesta inmunitaria de las clulas inmunocompetentes del injerto contra el organismo receptor (Figura 22.3).

Figura 22.3

TIPOS DE RECHAZO Dependiendo de la velocidad con la que se produzca, se distinguen 4 tipos de rechazo: El rechazo hiperagudo, que se produce slo horas o incluso minutos despus de realizado el injerto, y el rechazo acelerado que se manifiesta durante los primeros das postransplante se producen, en la mayora de los casos, por la presencia de anticuerpos preexistentes en el suero del receptor frente a las molculas HLA del donante. El rechazo agudo, es aquel que se produce en el primer mes postransplante. No se conoce el mecanismo exacto por el que se produce un rechazo agudo, pero los hallazgos histolgicos y la respuesta a la terapia inmunosupresora indican que en l intervienen tanto la inmunidad especfica (humoral y celular) como otros mecanismos no especficos (respuesta inflamatoria con estimulacin de polimorfonucleares, plaquetas y macrfagos, etc.). Por ltimo, el rechazo crnico, se produce meses o aos despus del transplante y su etiologa no se conoce con exactitud. Debemos aclarar que este esquema es sobre todo vlido en el caso del transplante renal, que al ser el ms extendido, sirve de modelo general para el resto de los injertos. Factores que influyen en el rechazo de rganos Nos hemos referido ya a que el xito o el fracaso de un determinado transplante, depende en gran medida de la relacin gentica existente entre donante y receptor. Pues bien, cada especie animal posee un conjunto de genes denominado genricamente Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), y en el caso de los humanos sistema HLA (del ingls Human Leukocyte Antigens), que ha sido estudiado en el captulo 5, que codifica para una serie de molculas presentes en la superficie de las clulas, que son las que determinan en gran parte el grado de compatibilidad o incompatibilidad en el transplante de rganos. Es evidente que la funcin fisiolgica de estas molculas no es el rechazo de rganos o tejidos, pero el conocimiento que se tiene en la actualidad de ellas, proviene en gran medida de la influencia que ejercen en la inmunologa del transplante. La presencia en los rganos injertados de molculas HLA distintas a las del receptor (situacin de incompatibilidad HLA) provoca en ste el desarrollo de anticuerpos y clulas T citotxicas dirigidas frente a dichas molculas, lo que conduce al rechazo de dicho rgano. Por el contrario, si las molculas HLA presentes en el rgano injertado son iguales a las del receptor (situacin de compatibilidad HLA), se reduce en gran medida la incidencia y la severidad del rechazo, aumentando por tanto la supervivencia del injerto. En la prevencin del rechazo (y de la GVHD en su caso) se puede actuar a diferentes niveles. Antes del transplante, buscando la mxima compatibilidad posible entre el donante y el receptor y asegurndose de que, en todo caso, el receptor no tiene anticuerpos preformados contra los antgenos HLA del donante; y despus del transplante con el uso de una terapia inmunosupresora adecuada a cada caso.

Influencia de la compatibilidad HLA Si se analiza el tiempo de supervivencia del injerto, se demuestra que cuanto mayor es la compatibilidad HLA mayor es la supervivencia de los mismos. En efecto, la supervivencia a largo plazo (sobre todo despus de los 5 primeros aos), es mayor cuanto mayor sea el grado de compatibilidad HLA, sobre todo en lo que se refiere a las molculas de clase II. Por ello, es necesario realizar la tipificacin HLA de aquellos pacientes que entran en lista de espera para recibir un determinado rgano. En el momento en que se produce una donacin de cadver, se realiza la tipificacin HLA del donante, lo que nos permite seleccionar los mejores receptores de entre todos los candidatos que figuran en la lista de espera. El hecho de que la compatibilidad HLA de clase II, sea ms importante que la de clase I en el transplante de rganos, no esta totalmente aclarado, pero parece tener su origen en la manera en que se induce la respuesta inmune. Se sabe que los linfocitos T CD4+, slo son capaces de reconocer las molculas que le son presentadas en la superficie de las clulas unidas a molculas de clase II (restriccin por clase II), por el contrario, los linfocitos T CD8+, slo son capaces de reconocer molculas que le son presentadas en la superficie de las clulas unidas a molculas de clase I (restriccin por clase I). Como la activacin de las clulas T CD8+ requiere la participacin de clulas T CD4+ activadas, es bastante lgico pensar que las diferencias en las molculas de clase II induzcan una respuesta alognica ms intensa que las diferencias en las molculas de clase I. La compatibilidad HLA (sobre todo para el locus HLA-DRB1*) aumenta la supervivencia del injerto en todos los tipos de transplantes, salvo en el transplante heptico. Sin embargo, en determinados tipos de transplante, por ejemplo el transplante cardiaco, prima la urgencia clnica sobre cualquier otra consideracin, por lo que la mayora de las veces no se tienen en cuenta los criterios de compatibilidad. En el transplante heptico los resultados de supervivencia del rgano en relacin con la compatibilidad HLA del donante y receptor son contradictorios e incluso se ha asociado un mayor grado de compatibilidad con una mayor incidencia de rechazo. La explicacin a este hecho, en principio sorprendente, podra ser que mecanismos inmunolgicos distintos del rechazo podran contribuir al fallo heptico. Esta respuesta inmunolgica podra estar dirigida frente a antgenos virales o asociados a enfermedades autoinmunes que operen a travs de mecanismos restringidos por molculas HLA. Por lo tanto en el transplante heptico el papel de la compatibilidad HLA podra ser dual, por un lado la compatibilidad reducira el riesgo de rechazo, pero aumentara la posibilidad de que se produjeran otro tipo de reacciones inmunolgicas dirigidas contra el hgado injertado. En cuanto al transplante de mdula sea, la mayora se realiza entre hermanos HLA idnticos, siendo necesario estudiar a todos los familiares en primer grado (padres y hermanos) para determinar que efectivamente donante y receptor heredan los mismos haplotipos HLA parentales. En caso de no existir hermanos HLA idnticos se podra recurrir a padres o a otros parientes haploidnticos, sobre todo en los casos en los que el haplotipo no idntico fuese compatible. A veces, cuando el paciente presenta un haplotipo extendido con una frecuencia relativamente elevada en la poblacin, es adecuado realizar una bsqueda de donante compatible entre los familiares en segundo grado (tos y primos). En estos casos la bsqueda se realizar siempre en la rama de la familia (paterna o materna) que, en principio, no presenta el haplotipo extendido, ya que buscamos un individuo que presente el haplotipo ms raro por herencia y el haplotipo extendido por azar. Actualmente, funcionan bancos de donantes voluntarios de mdula sea para aquellos individuos que carecen de hermanos HLA idnticos. La probabilidad de encontrar un donante voluntario no emparentado para un determinado paciente depende de la frecuencia con la que sus antgenos HLA se encuentren en la poblacin (Tabla 22.1). Antes de realizar un transplante de mdula sea, sea de un donante familiar o de un individuo no emparentado se realiza una prueba denominada cultivo mixto de linfocitos (MLC), consistente en enfrentar los linfocitos del donante y del receptor y observar si existe proliferacin celular, hecho que ocurre si existen diferencias en la regin HLA de clase II de ambos individuos. El desarrollo de mtodos de tipaje de alta resolucin sobre DNA de cada locus HLA, est permitiendo obviar el MLC. De hecho, ya existen trabajos en este sentido en los que se observa una mejor correlacin entre la aparicin de GVHD de grado severo y la existencia de diferencias en la regin HLA cuando se utilizan estos mtodos de tipaje, que cuando se utiliza el MLC.

TABLA 22.1 Seleccin de donantes en transplantes de mdula sea Secuencia Primero Segundo Tercero Parentesco con el receptor Padres y hermanos Parientes ms cercanos Bancos de donantes voluntarios de mdula

Influencia de otros factores genticos Un hecho demostrado repetidamente es que la supervivencia del injerto es mayor entre individuos emparentados HLA compatibles que entre individuos no emparentados con el mismo grado de compatibilidad HLA, esto puede ser originado por tres causas. En primer lugar, en un estudio familiar, los hermanos que presentan los mismos haplotipos son HLA idnticos. Sin embargo, cuando se trata de individuos no emparentados no se puede hablar de individuos HLA idnticos, ya que aunque dos individuos presenten aparentemente las mismas molculas HLA, el polimorfismo del sistema es tan elevado que pueden existir diferencias que no se puedan apreciar con la tcnica de tipaje serolgico que es la que habitualmente se utiliza. En segundo lugar, normalmente slo se estudian 3 4 loci del MHC (normalmente los loci HLA-A, HLA-B, HLA-C y HLA-DRB1), en el caso de hermanos, y debido al desequilibrio de ligamiento entre todos los genes de la regin MHC, los loci no estudiados sern tambin idnticos, salvo en aquellos raros casos en los que se haya producido alguna recombinacin. Sin embargo, entre individuos no emparentados los loci no estudiados pueden ser diferentes. Por ltimo, la compatibilidad MHC es importante en la supervivencia del injerto, pero no es el nico sistema que influye en la aparicin del rechazo. En este sentido, se sabe que existe un grupo de elementos polimrficos, no relacionados entre s ni con el MHC denominados antgenos menores de histocompatibilidad que presentan importancia en el rechazo de injertos. Es fcil entender que la probabilidad de que estas molculas sean idnticas es mayor entre hermanos que entre individuos no emparentados. Presencia de anticuerpos anti-HLA preexistentes en el suero del paciente. Para prevenir el rechazo hiperagudo y el rechazo acelerado es necesario determinar si en el suero del receptor se encuentran anticuerpos frente a las molculas HLA del donante. Para ello, se realiza una prueba cruzada entre las clulas T del donante y el suero del receptor. Si en el suero del receptor existen anticuerpos capaces de reconocer las clulas T del donante, el transplante se contraindica totalmente, ya que esta reaccin evidencia, en la mayora de los casos, la existencia de anticuerpos preformados en el suero del receptor dirigidos frente a las molculas de clase I del donante que causara un rechazo hiperagudo o acelerado si el injerto se realizara. El transplante heptico constituye una excepcin a esta regla, es decir, la existencia de una prueba cruzada positiva frente a linfocitos T del donante no contraindica el transplante. Las bases de la resistencia del transplante heptico al rechazo hiperagudo son desconocidas pero podran estar determinadas, por ejemplo, por la secrecin de molculas HLA solubles por parte de las clulas hepticas, estas molculas solubles podran neutralizar los anticuerpos anti-HLA preexistentes en el suero del receptor Terapia inmunosupresora Como hemos dicho anteriormente el transplante puede fracasar desde un punto de vista inmunolgico porque se produzca rechazo (o en su caso GVHD). Hasta ahora nos hemos referido a las diferentes cuestiones que es necesario tener en cuenta para mejorar la supervivencia del injerto antes del transplante. Despus del transplante se puede actuar en la prevencin del rechazo con la utilizacin de agentes inmunosupresores (Figura 22.4).Por supuesto, el agente inmunosupresor ideal, sera aquel capaz de reducir o anular la posibilidad de un rechazo, pero sin afectar al resto de las respuestas inmunes.

Por desgracia este agente inmunosupresor no ha sido descubierto hasta el momento, por lo que es necesario tener en cuenta que los pacientes inmunosuprimidos presentan problemas de disminucin de defensas frente a todo tipo de organismos patgenos y de desarrollo de determinados tipos de tumores.
Figura 22.4

BIBLIOGRAFA

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rganos. ELA.

2. Strom T.B. y Walmann H. 1994. Transplantation. Current Opininon in Immunology,

l6:5.

3. http://www.msc.es/ont/esp/estadisticas

23 Inmunologa de la infeccin
M. Fresno y M. A. Muoz - Fernndez
INTRODUCCIN Una amplia variedad de agentes infecciosos (virus, bacterias, protozoos, hongos y helmintos) son capaces de infectar a los seres humanos. En muchos casos, el agente infeccioso puede colonizar un tejido u rgano y mantener su nmero sin causar dao (colonizacin). La enfermedad infecciosa ocurre cuando ocasiona signos y sntomas de inflamacin o de perturbacin funcional de los rganos dando lugar a un problema clnico y no es una consecuencia inevitablemente asociada a infeccin. La patogenicidad es un termino relativo, que resulta del balance entre virulencia, o poder patognico intrnseco, y los recursos defensivos utilizados por el hospedador para neutralizar la amenaza infecciosa. Los factores de virulencia son los componentes del microorganismo que les permiten colonizar, proliferar, invadir y destruir los tejidos del hospedador y determinan su capacidad de causar enfermedad. Existen dos tipos principales: 1) Factores que estimulan el crecimiento de los microorganismos y favorecen la colonizacin e invasin tisular, como molculas de superficie (adhesinas), enzimas digestivas segregadas por el microorganismo invasor, etc.) Las toxinas bacterianas, que pueden ser secretadas (exotoxinas), o lipopolisacridos estructurales muy heterogneos que forman parte de la pared de las bacterias Gram-negativas (endotoxinas). Las exotoxinas son protenas que pueden originar una enfermedad sin infeccin previa. Existen una gran variedad de mecanismos mecnicos, qumicos, celulares e inmunolgicos que se han desarrollado a lo largo de la evolucin de la especie humana para prevenir la invasin de los microorganismos. Entre estos ltimos el ms importante es el sistema inmune. Una ligera perturbacin en uno de estos mecanismos puede dar lugar a una infeccin por microorganismos poco virulentos y una alteracin mayor, incluso a microorganismos avirulentos. Muchos microorganismos cuya patogenicidad habitual es baja, pueden dar lugar a una enfermedad grave en hospedadores con inmunidad deprimida y se les llama microorganismos oportunistas.

MECANISMOS DE DEFENSA DEL HOSPEDADOR Las reacciones de defensa pueden producirse de forma especfica o inespecfica. Las respuestas inespecficas, aunque indiscriminadas y no especficas de Ag, tienen la ventaja de intervenir rpidamente durante una infeccin aguda y pueden permitir la supervivencia del hospedador hasta que las respuestas especficas congreguen nuevas defensas. Las respuestas inespecficas, la mayora de las cuales se producen minutos u horas despus de la infeccin, componen lo que se denomina respuesta o inmunidad natural o innata cuyo nivel no se incrementa por inmunizacin repetida. En contraposicin, la inmunidad adaptativa o Ag especfica, se incrementa por inmunizacin repetida del Ag que la induce, tarda en aparecer das o semanas tras la exposicin primaria, pero con frecuencia es indispensable para una completa resolucin de la enfermedad (Figura 23.1). Aunque la mayor parte de los mecanismos de defensa se describen por separado son sistemas ntimamente relacionados que rara vez actan independientemente.

Figura 23.1

Inmunidad natural. La inmunidad natural implica los mecanismos inespecficos, mecnicos, qumicos, celulares y algunos de los inmunolgicos, que previenen la colonizacin o infeccin de individuos sanos por los microorganismos del entorno (ver capulo 1). Una de las ms importantes defensas contra la infeccin la constituyen, los fagocitos profesionales del hospedador, polimorfonucleares (PMN) y los monocitos/macrfagos. Cuando se produce una infeccin, los PMN son las clulas que primero acuden al sitio de la misma. Los PMN guiados por sustancias quimiotcticas difundidas desde la regin infectada, alteran sus mecanismos de adhesin adhirindose y atravesando el endotelio. Posteriormente, estos mismos factores provocan una migracin dirigida de los PMN hacia el lugar de la inflamacin e infeccin. Estos factores quimiotcticos son sustancias liberadas por el hospedador en respuesta a la infeccin y productos microbianos, entre los que se encuentran los formil pptidos producidos por las bacterias que son reconocidos por los fagocitos. Varios microorganismos activan la va alternativa del C, generando C5a. Adems, los fagocitos secretan leucotrieno LTB4. Tanto C5a como LTB4 son quimiotcticos. Los fagocitos son capaces de internar por endocitosis y destruir toda una serie de microorganismos, aunque estas funciones se ven potenciadas por componentes de la respuesta inmune especfica entre los que se encuentran: 1. Citocinas, secretadas principalmente por linfocitos despus del reconocimiento del Ag, necesarias para su activacin. 2. Acs, secretados por linfocitos B, que les dotan de propiedades opsonicas y efectoras aumentando el reconocimiento y unin de los microorganismos. Los fagocitos producen una serie de molculas que median su accin antiinfecciosa que se han dividido clsicamente en dependientes o independientes del metabolismo de oxgeno. Entre estas ltimas se incluyen una serie de compuestos microbicidas extremadamente bsicos como lisozima, lactoferrina, catepsina, elastasa y las recientemente descritas defensinas (un conjunto de pptidos homlogos que daan una gran variedad de microorganismos procarticos y eucariticos). Tambin producen C que sirve para eliminar determinadas bacterias, bien promoviendo la opsonizacin en presencia de Ac, bien directamente, o incrementando la permeabilidad celular asociada con las respuestas

inflamatorias. Los eosinfilos contienen una serie de protenas txicas que destruyen helmintos. En los mecanismos dependientes de oxgeno se incluyen una serie de compuestos derivados del consumo de O2, como O2-, H2O2, y radical hidroxilo, muy reactivos y que son muy importantes en la destruccin de patgenos intracelulares. Recientemente, se ha descrito un nuevo mecanismo que implica la sntesis de intermediarios reactivos de xidos de nitrgeno, como el NO, a partir de L-arginina, por una enzima denominada NO sintetasa. Esta enzima es inducible en macrfagos por citocinas como TNF e IFN-g o por endotoxinas bacterianas como LPS y parece ser el mecanismo mas importante en la destruccin de patgenos intracelulares. Las clulas NK son un grupo de linfocitos grandes granulares que destruyen algunas clulas infectadas por virus y parsitos intracelulares mediante citotoxicidad directa no restringida por el MHC o por mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC). Los productos de los microorganismos tambin estimulan directamente la sntesis de citocinas por macrfagos y clulas NK, por lo que algunas citocinas pueden ser consideradas como parte de la inmunidad natural. Sin embargo, su cantidad aumenta despus de una respuesta inmune especfica debido a su sntesis directa o a su control por parte de los linfocitos T Ag-especficos. Las endotoxinas bacterianas estimulan directamente la sntesis de IL-1 y TNF por macrfagos aumentando la adhesin de fagocitos y linfocitos al endotelio. El TNF juega un papel central en la respuesta antiinfecciosa por sus propiedades inflamatorias, activando a los macrfagos y PMNs, adems de tener un importante papel como inductor de necrosis e inducir fiebre. Esta citocina tambin induce la produccin de prostaglandinas, activa las propiedades antitrombocticas, la sntesis de factor activador de plaquetas (PAF) y la expresin de molculas de adhesin en clulas endoteliales y la proliferacin de fibroblastos. Adems, TNF estimula la citotoxicidad de otras clulas efectoras inmunes, como son los eosinfilos, clulas NK y linfocitos T. Los virus inducen la sntesis de varios IFNs que juegan un papel muy importante en la resistencia a ciertas infecciones virales. Los IFNs son capaces de ejercer la accin antiviral de varias maneras sinrgicas: bloqueo de la replicacin viral, aumento en la expresin de MHC, activacin de las clulas NK y de los macrfagos. Inmunidad adquirida. La respuesta inmune especfica normalmente es lenta y no muy efectiva cuando se enfrenta a un microorganismo por primera vez. Sin embargo, cuando se induce memoria inmunolgica, la segunda vez es mucho ms rpida y efectiva. Esta respuesta, que se caracteriza por poseer especificidad y memoria, est mediada tanto por linfocitos T como B que poseen receptores especficos de Ag en su membrana capaz de reconocer variados determinantes antignicos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden ser de tres tipos principales considerando los principales mecanismos efectores (ver captulo 8). Los monocitos son incapaces de destruir ciertos patgenos, pero su capacidad de destruccin aumenta considerablemente si son activados por citocinas secretadas por clulas Th1. Esta activacin es mediada por IFN-g, aunque otras linfocinas, especialmente TNF juegan un papel coestimulador de la actividad de IFN. La activacin de macrfagos implica un mayor aumento de todos los mecanismos de destruccin de los mismos especialmente de aquellos dependientes de oxgeno y de NO. Los linfocitos B segregan Acs especficos con la cooperacin de los linfocitos Th2 y en menor medida por los Th1. Estos Acs son capaces de erradicar ciertas infecciones por varios mecanismos: 1. Previenen la unin de los microorganismos a sus receptores tisulares y celulares. 2. Neutralizan o inactivan directamente al microorganismo; ocurre cuando los Acs se unen a un Ag que posee una funcin vital para el parsito, como pueden ser las toxinas. 3. Activan la fijacin y el sistema del C promoviendo la lisis de los microorganismos. 4. Favorecen la fagocitosis de los monocitos, macrfagos y PMNs a travs de la unin a los FcR (opsonizacin) y

5. Promueven las reacciones de citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC) de las clulas citotxicas y eosinfilos (Figura 23.2).
Figura 23.2

Las clulas T CD8+ citotxicas destruyen clulas infectadas con microorganismos intracelulares a travs del reconocimiento del Ag asociado al MHC. Su activacin requiere la cooperacin de las citocinas producidas por las clulas Th1, IL-2 y en menor medida IFN-g. Median preferentemente la actividad antiviral aunque tambin son efectivas contra algn protozoo intracelular. Su accin puede ser directamente citotxica o debida a la secrecin de linfocinas como IFN-g. La induccin de una u otra subpoblacin de linfocitos T (Th1 o Th2), que implica la sntesis concomitante de las respectivas linfocinas, es clave para inducir una respuesta inmune protectiva en la mayora de las infecciones por microorganismos. EVASIN DE LA RESPUESTA INMUNE Desgraciadamente, los agentes infecciosos se han adaptado de la manera ms conveniente para su propia supervivencia, desarrollando sofisticados sistemas de evasin de las respuestas protectivas del hospedador. As, ciertos parsitos intracelulares facultativos, especialmente protozoos y bacterias, estn protegidos de gran parte de los sistemas efectores inmunes, debido a su localizacin intracelular y aunque la clula hospedadora puede expresar Ags del parsito en su membrana, stos, de hecho, no suelen desencadenar una respuesta inmune protectiva frente a las clulas infectadas, a diferencia de lo que ocurre con infecciones virales. Otros muchos parsitos han desarrollado diversas estrategias para evitar el reconocimiento antignico del cual dependen todos los mecanismos inmunolgicos: mimetismo, debido a la absorcin de protenas del hospedador o por imitacin de las protenas de superficie del hospedador; liberacin de Ags al medio bloqueando la interaccin de los Acs con el microorganismo; cambio de Ags durante las diferentes fases del desarrollo.

1. Variacin antignica. El mecanismo ms evidente de evasin inmunolgica es la variacin antignica, conocida especialmente bien en algunos tripanosomas africanos bacterias y virus. Esta puede ser por mutacin, cambio de genes o por recombinacin gnica. En teora el cambio antignico puede estar relacionado con la respuesta a los mecanismos inmunes efectores, pero en la prctica, ningn parsito que utilice la variacin antignica lo hace, posiblemente porque as evita que se produzca su eliminacin por una respuesta inmune efectiva.

2. Evitando la lisis mediada por C. Muchos microorganismos evitan la lisis mediada por C, bien por inhibicin de la activacin de la cascada del C o de la accin del C. La inhibicin de la activacin se puede conseguir por la sntesis o adquisicin de molculas reguladoras, el bloqueo de la activacin del C o la formacin de un complejo del complemento C5b9 no ltico. 3. Evasin de los sistemas microbicida. Ciertos microorganismos intracelulares facultativos son capaces de evadir los sistemas microbicidas de los fagocitos. Existen bsicamente 3 tipos de evasin: a) Inhibicin de la fusin entre el fagosoma y el lisosoma. b) Escape de la vacuola fagoctica al citoplasma c) Resistencia a los sistemas de degradacin de los lisosomas. 4. Induccin de supresin de la respuesta inmune Para evitar ser eliminados por el sistema inmune los parsitos inducen generalmente una supresin de la respuesta inmune. Los mecanismos son muy variados e incluyen la induccin de clulas supresoras, la alteracin de las funciones de las citocinas o la induccin preferencial de la subpoblacin Th no protectiva. A veces la inmunosupresin causada por una infeccin conduce a estados de inmunosupresin severa. Este es el caso de la infeccin por HIV-1 que como es sabido conduce a una inmunosupresin, de ah su denominacin de SIDA (sndrome de inmunodeficiencia adquirida) que se alcanza cuando avanza la infeccin. Otros casos de deficiencias inmunolgicas como consecuecia de una infeccin viral aparecen en el sarampin, hepatitis A, B y C, influenza y rubola. Tras infecciones bacterianas tambin se han observado defectos inmunolgicos. INMUNOPATOLOGA Existen multitud de factores que determinan por qu ciertas complicaciones patolgicas estn asociadas a unas infecciones y no a otras. La patologa puede ser mediada por el parsito o por la propia respuesta del hospedador. En algunos microorganismos el dao tisular se produce como consecuencia de la propia replicacin, para permitir la colonizacin, para evadir la respuesta inmune o debido a las toxinas. En muchos otros casos es la propia respuesta inmune frente al microorganismo la causante de una Inmunopatologa. Las respuestas inmunes pueden ser potencialmente peligrosas debido principalmente a reacciones autoinmunes o de hipersensibilidad. La autoinmunidad, suele ser una consecuencia del mimetismo antignico utilizado como mecanismo de evasin de la respuesta inmune realizado por varios microorganismos. Existe cada da ms la creencia que ciertas enfermedades autoinmunes tienen una etiologa infecciosa debido a la similitud antignica entre microorganismos y el hospedador. Cuando las reacciones inflamatorias son de intensidad leve o moderada constituyen un mecanismo importante de defensa, favoreciendo la llegada de clulas inmunes a los lugares de la infeccin. Sin embargo, un exceso de respuesta inmune, hipersensibilidad, puede ser perjudicial para el hospedador destruyendo tejidos normales. La produccin excesiva de ciertas citocinas, puede provocar tambin patologa. El ejemplo mas dramtico lo constituye el papel de TNF en el shock sptico asociado a mltiples infecciones bacterianas y en malaria cerebral. El predominio, en la respuesta inmune frente a un agente infeccioso, de una u otra subpoblacin de linfocitos T (Th1 o Th2), y de las respectivas linfocinas que ellos producen da lugar bien a resistencia o a Inmunopatologa en muchas infecciones. La inhibicin de un tipo de Th con la consiguiente estimulacin del otro esta asociada a la patologa de muchas enfermedades entre ellas el SIDA. En resumen, una mejor comprensin de todos los fenmenos implicados en las relaciones hospedador-agente infeccioso es fundamental para conseguir vencer a las infecciones mediante una estimulacin correcta de la respuesta inmune permitiendo: 1) Corregir los factores que predisponen a la infeccin. 2) Una quimioprofilaxis y sobre todo una

mejor inmunoprofilaxis pasiva que incluya adems de Igs, citocinas, etc. 3) Mejorar enormemente los procesos de inmunizacin activa (estabilidad, ruta de administracin, etc.) para conseguir aumentar la eficacia de las nuevas vacunas.

BIBLIOGRAFA

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24 Inmunologa tumoral
R. Ramrez, C. Pera y J. Pea
INTRODUCCIN Las clulas de los organismos se diferencian y proliferan siguiendo un programa gentico que esta regulado por estmulos extracelulares. Alteraciones en este sistema de regulacin constituyen la base gentica del cncer, que se entiende como una acumulacin de mutaciones que afectan a las clulas somticas durante la vida de un organismo y hacen que estas proliferen de forma incontrolada. Son necesarios varios pasos para transformar una clula normal en una clula cancerosa. La mayora de ellos, si no todos, incluyen mutaciones genticas. La mayora de los cnceres comienzan de una sola clula, la cual, ha tenido que acumular mutaciones en varios genes diferentes antes de llegar a formar un cncer. El que una determinada clula se convierta en cancerosa en un memento determinado depender de varios factores, tales como ciertos agentes qumicos e ionizantes, errores durante la duplicacin celular del DNA, interaccin de ciertos agentes virales con el genoma de la clula husped o hereditarios, etc. En este capitulo trataremos de las mltiples evidencias indicativas de que el sistema inmune identifica estas clulas tumorales que destruye y evita la aparicin de tumores. Sin embargo en otros casos este proceso falla y consecuentemente se produce la malignizacin celular y el desarrolla tumores. MALIGNIZACION CLULAR Y SISTEMA INMUNE Los genes relacionados con el cncer pueden ser de tipo a) inductor, b) supresores o c) reguladores de la apoptosis. 1. Los genes inductores regulan la proliferacin celular, por lo que generalmente estn presentes y son funcionales en todas las clulas normales en forma de proto-oncogenes pasando a denominarse oncogenes cuando modifican su actividad normal. 2. Los genes supresores, entre los que destaca p54, inducen mutaciones conducentes a la prdida en la capacidad proliferativa celular. A diferencia de los anteriores, los genes supresores de tumores estn normalmente activos (vigilantes) para evitar el crecimiento incontrolado de la clula. La prdida de estos genes (o su falta de expresin) es un evento comn en muchos tumores. 3. Por ultimo los genes reguladores de la apoptosis son importantes por su capacidad para modular la apoptosis celular, mecanismo primordial en la eliminacin de clulas que sufren alteraciones incompatibles con el desarrollo de su actividad normal Considerando la alta incidencia de mutaciones celulares, cabe pensar que el organismo debe poseer algn sistema eficaz que le proteja frente al desarrollo y crecimiento de estas clulas tumorales. Efectivamente estudios realizados por Burnet demostraron que el sistema inmune juega un importante papel defendiendo al individuo frente al crecimiento de clulas neoplsicas. Esto se conoce como teora de inmunovigilancia y postula que las clulas tumorales expresan antgenos, que no estn presentes en las clulas normales, y que hacen que la clula tumoral sea reconocida por el sistema inmune como extraa y por consiguiente sea destruida (Figura 24.1)

Figura 24.1

Esta hiptesis se ha visto confirmada por mltiples evidencias entre las que destacan: 1. La existencia de una estrecha relacin entre la aparicin y desarrollo de cnceres y el estado funcional del sistema inmune. Por ejemplo, la incidencia de cnceres es mayor en inmunodeficiencias. 2. La terapia biolgica veces llamada inmunoterapia, bioterapia o terapia modificadora de la respuesta biolgica ha demostrado ser eficiente enfermos con cncer. 3. Finalmente, se ha descrito infiltracin celular, principalmente linfocitos y macrfagos, en tumores y por ultimo 4. Se ha encontrado en individuos portadores de cncer la presencia de linfocitos CD8 con capacidad citotxica frente al tumor. MECANISMOS EFECTORES ANTITUMORALES Los mecanismos responsables de la accin citosttica y citotxica del sistema inmune son muy heterogneos. Aqu trataremos solo algunos de los aspectos ms esenciales. Accin antitumoral linfocitos T Tanto las clulas CD4 como las clulas CD8 tienen capacidad para inducir resistencia contra el crecimiento tumoral, aunque por mecanismos distintos. Las clulas CD8 ejercen un efecto antitumoral directo, presumiblemente debido a la capacidad citotxica de stas, mientras el efecto mediado por CD4 se debe a la produccin de citocinas. Accin antitumoral de clulas NK Las clulas NK poseen una importante capacidad de lisis de clulas tumorales in vitro e in vivo. As, mediante la reconstitucin de animales irradiados con clulas NK, se ha observado regresin de ciertos tumores. De igual manera, se ha demostrado en humanos, que suelen ser de mejor pronstico aquellos tumores que se encuentran infiltrados con clulas NK. Accin antitumoral de macrfagos Los macrfagos son constituyentes importantes en el infiltrado celular de los tumores y pueden afectar al crecimiento tumoral por varias vas. Pueden influir directamente inhibiendo la proliferacin de clulas tumorales, y promueven tambin la formacin de estroma y angiognesis. Adems, pueden atacar directamente a las clulas tumorales, slo o en cooperacin con otros mecanismos efectores... Accin antitumoral de mediadores solubles de la respuesta inmune Los factores qumicos de la respuesta inmune cuya accin se ha demostrado ms efectiva frente al desarrollo y crecimiento de la clula tumoral son el interfern g, la interleucina 2

y el factor necrosante tumoral. Junto a estos, la respuesta inflamatoria antitumoral hace que se produzcan otros muchos factores solubles que van a inhibir el crecimiento y desarrollo tumoral. ANTGENOS TUMORALES Al menos alguno de los mecanismos de la oncognesis involucra la alteracin estructural de genes implicados en diferenciacin y/o proliferacin. Esto dara lugar a la aparicin de protenas alteradas que funcionaran como verdaderos antgenos. En general los antgenos tumorales se pueden dividir en: Al menos alguno de los mecanismos de la oncognesis involucra la alteracin estructural de genes implicados en diferenciacin y/o proliferacin. Esto dara lugar a la aparicin de protenas alteradas que funcionaran como verdaderos antgenos. En general los antgenos tumorales se pueden dividir en: Antgenos especficos de tumores (TSA) Son antgenos que solo aparecen en tumores y por tanto son exclusivos para estas clulas. Presentan como el que son de cada tumor, ya que generalmente se asocian a mutaciones. En general, se trata de protenas citoslicas con alteraciones estructurales. La mayora de estos antgenos solo se han encontrado en modelos murinos de tumores inducidos por carcingenos, y son escasos los definidos en tumores humanos. Antgenos asociados a tumores (TAA). Se trata de componentes celulares sobreexpresados o expresados de forma aberrante. Dentro de estos antgenos se incluyen: 1. Antgenos de origen viral. Es conocido que un grupo importante de tumores como el papiloma humano presentan una fuerte asociacin con virus y expresan una serie de productos virales. En algunos casos se ha podido demostrar la existencia tanto de anticuerpos como de linfocitos T sensibilizados frente a estos productos. Estos antgenos son siempre especficos del tipo de virus inductor del tumor, independientemente del tipo de clula o tejido en donde se desarrolla el tumor. 2. Antgenos procedentes de reactivacin de genes embrionarios. Son antgenos producidos normalmente por clulas embrionarias o fetales y que por lo tanto no son expresados por las clulas de individuos adultos. Sin embargo, estos antgenos pueden ser expresados por clulas cancerosas en el adulto, quiz por desrepresin del gen regulador de su sntesis. Entre ellos se encuentran el antgeno carcinoembrionario y la a-fetoprotena. 3. Protenas oncognicas .Las mutaciones celulares que conducen a la aparicin de un tumor tienen lugar en tres tipos de genes: proto-oncogenes, genes supresores de tumores, y genes reparadores de ADN. Estos genes pueden mutar o bien ser expresados de forma anmala dando lugar a un producto modificado que pueden constituir antgenos especficos de tumor. 4. Idiotipos. El idiotipo de las inmunoglobulinas de superficie de las neoplasias de clulas B, as como el idiotipo del TCR en los linfomas T. A ambos se consideran antgenos especficos de tumor frente a los cuales es posible el desarrollo de una estrategia de inmunoterapia

MECANISMOS DE ESCAPE DE LA RESPUESTA INMUNOLGICA La aparicin de un tumor implica que las clulas neoplsicas son capaces de crecer a pesar de los mecanismos de control inmunolgico. Por ello se ha postulado que las clulas tumorales podran utilizar diferentes mecanismos para evitar el reconocimiento y destruccin del sistema inmune. Entre ellos destacan: 1. Ignorancia de los antgenos tumorales. En ciertas ocasiones, los antgenos tumorales no son presentados al sistema inmue y en consecuencia ste no responde. Esto puede ocurrir en tumores cuyos antgenos no llegan a los ganglios linfticos, son endocitados o el tumor se encuentra en lugares donde no llega el sistema inmune, como es el caso del cerebro y ojos. 2. Baja inmunogenicidad. Un descenso de las molculas HLA de la membrana celular puede hacer que el reconocimiento inmunolgico por linfocitos CD8 de las clulas tumorales no sea posible, y por tanto no se genere una respuesta inmune eficaz. Por este motivo el estudio de las molculas HLA en el tumor es importante en el pronstico de los tumores (Figura 24.2). Tambin es importante considerar la falta de molculas de adhesin intercelular en las clulas tumorales. 3. Supresin de la respuesta inmune inducida por el tumor. Las clulas tumorales pueden producir diferentes factores solubles capaces de inhibir la respuesta inmune, entre los que se pueden considerar complejos Ag-Ac preformados y TGF-a Il-10 que como es sabido ejercen una potente accin inmuno inhibidora y por ltimo tambin se ha observado en ciertos casos una 4. Induccin de tolerancia por parte del tumor. Esto puede ocurrir en tumores que carecen de ciertas molculas de coestimulacin (por ejemplo CD28) o por la induccin de clulas de tipo supresor. 5. Sobreesxpresin de FASL por las clulas tumorales. Se induce apoptosis y muerte de las clulas del sistema inmune que acuden al tumor bloqueandolo. a Figura 24.2 c c i n p r o t e c t

ASPECTOS INMUNOLGICOS DE LAS METSTASIS La capacidad metastatizante y la heterogeneidad biolgica del cncer son los principales problemas para su erradicacin. Slo una mnima proporcin de clulas son capaces de generar metstasis, aun cuando potencialmente un gran nmero de clulas son capaces de pasar al torrente circulatorio y por ello tienen capacidad de producir metstasis. De esta forma, la invasin y metastatizacin tumoral se considera un proceso multifsico en el que en primer lugar, dentro de la masa tumoral aparecera una clula modificada, con capacidad para penetrar la membrana basal, entrar en el torrente vascular, y migrar para implantarse en un nuevo rgano. No obstante, se pueden considerar varias posibilidades para explicar la aparicin y desarrollo de metstasis. As es posible que la metstasis se desarrolle concomitantemente con una respuesta inadecuada efectora a travs de una insuficiente estimulacin va segunda seal: B7, ICAM-1, LFA-3, VCAM-1 etc. o que las clulas que originan las metstasis poseen caractersticas diferentes a las del tumor del que proceden. INMUNOLOGA Y DIAGNSTICO TUMORAL El diagnstico precoz de tumores es de espacial importancia y en ello puede contribuir la inmunologa. Estudio de los productos especficos de tumor Muchas de las sustancias especficas de tumores son liberadas por los mismos y se encuentran en sangre, en donde pueden ser identificadas y medidas incluso desde fases muy tempranas del desarrollo tumoral. Las sustancias comnmente utilizadas en este sentido son: el antgeno carcino-embrionario (CEA), (a-feto-protena) y otros. Por otra parte, hoy se comienza tambin a emplear la deteccin de algunas oncoprotenas en el diagnstico tumoral. Ello es posible al disponer de anticuerpos monoclonales frente a las oncoprotenas codificadas por los oncogenes c-myc, c-ras, c-erb-C, c-sys y c-fos. Localizacin anatmica de tumores y metstasis. Cuando se trata de tumores slidos, uno de los problemas ms serios a la hora de evaluar el pronstico de un enfermo oncolgico es determinar la existencia de micrometstasis, dado que en muchos casos stas no son detectables por los mtodos convencionales. Los mtodos ms sofisticados utilizados hasta el momento para este propsito han sido el empleo de la tomografa axial computerizada (TAC) y en la tcnica de inmunoescintografa. INMUNOTERAPIA Las formas habituales de tratamiento de los enfermos cancerosos con radioterapia, ciruga y quimioterapia no son suficientes en multitud de casos, sobre todo en cnceres con gran invasin de tejidos o con metstasis. Prueba de ello es que, en la actualidad, la segunda causa de muerte es el cncer, lo que ha motivado un gran inters de mdicos e investigadores para encontrar nuevas teraputicas contra esta terrible enfermedad. Este esfuerzo est dirigido al perfeccionamiento de los sistemas tradicionales de tratamiento y a travs de la introduccin de unas nuevas formas teraputicas, para lo cual se tienen grandes esperanzas puestas en el desarrollo de la inmunoterapia (Figura 24.3)
Figura 24.3

Las nuevas estrategias en la inmunoterapia tienen como objetivo el potenciar la respuesta inmune frente al tumor, e incluyen la 1. Activacin inespecfica ejemplo con BCG. del sistema inmune, por

2. Utilizacin de citocinas, como es el caso de la IL-2 que acta generando clulas LAK y TIL muy eficientes como antitumorales. 3. Utilizacin de anticuerpos monoclonales sin modificar o unidos a toxinas, enzimas o radioistopos poseen capacidad citoltica de las clulas tumorales. 4. Mediante vacunas utilizando virus oncognicos a partir de clulas tumorales modificadas o alteradas genticamente. 5. Mediante terapia gnica introduciendo genes capaces de modular la actividad de la tumoral (supresin o de genes mutados) o genes dirigidos a amplificar la produccin de citocinas molculas coestimuladoras en las clulas tumorales 6. Estimulando clulas dendrticas cargadas con pptidos del propio tumor y administradas de nuevo al individuo. (Figura 24.4).
Figura 24.4

En la actualidad sigue siendo muy alta la incidencia de tumores y las muertes causadas por esta enfermedad. Son frecuentes los tumores de mama, colon, prstata, piel, etc. (Figura 24.5). Ello hace que nuevos esfuerzos de investigacin interdisciplinaria necesarios, al objeto de conocer mejor la maquinaria celular responsable de la malignizacin celular y los mecanismos inmunolgicos responsables de su destruccin.
Figura 24.5

BIBLIOGRAFIA 1. Bishop JM. 1987. The molecular genetics of cncer. Science 235:305-311. 2. Garrido F, Cabrera T, Concha A, Glew S, Ruiz-Cabello F, Stern PL. 1993. Natural history of HLA expression during tumor development.Immunology Today, 14:491-499 3. Klein E, Mantovani A.1993. Action of natural killer cells and macrophages in cancer. Curr Op Immunology, 5:714-718 4. Pea J y Solana R.:1992. MHC antigens in NK recognition and lysis.Immunology Research, 11:130-140. 5. Foss FM.:2002, Immunologic mechanisms of antitumor activity. Semin Oncol. 2002,29:5-11.

LEUCEMIAS Las neoplasias hematolgicas son procesos malignos delas clulas sanguneas. Por la transformacin de las clulas hematopoyticas en clulas cancerosas. Estas clulas proliferan e invaden la mdula sea, el tejido linfoide (ganglios) y la sangre perifrica pudiendo llegar a todos los tejidos. Segn el tipo de clulas que proliferan se distinguen las leucemias linfocticas y las mieloides. En las primeras los linfocitos. En las segundas son los mielocitos, precursores del resto de los glbulos blancos. La evolucin y el curso de la enfermedad clasifica a las leucemias en agudas y crnicas. En las agudas son clulas que no han madurado lo suficiente y han crecido indiscriminadamente. En las crnicas las clulas invasoras son clulas maduras. Tipos de Leucemia Leucemias agudas: linfoctica ( LLA ) y mieloctica (LMA ). La leucemia aguda linfoctica ms frecuente en la infancia. La mieloctica se ve fundamentalmente en adultos. En ambos tipos las clulas tumorales invaden la medula sea impidiendo que esta pueda formar el resto de las series, con lo que disminuyen los hemates, leucocitos y plaquetas produciendo as "pancitopenia". Leucemias crnicas: Linfoide ( LLC ) y mieloide ( LMC ): LLC: es una enfermedad neoplsica debida a la proliferacin de linfocitos maduros. Es ms frecuente en varones mayores de 50 aos. En el 25% de los casos se descubre de forma accidental pero existen adenopatas y mnimo aumento del bazo y del hgado. LMC: Produce un exceso en la produccin de granulocitos, particularmente neutrfilos. Sntomas: Leucemia aguda Anemia como palidez, fatigabilidad y disnea. Hemorragias por la trombocitopenia con hematomas cutneos, petequias y hemorragia mucosas. Infecciones frecuentes. La afectacin del sistema nervioso central produce cefalea, vmitos e irritabilidad. En ocasiones es el dolor seo y articular el sntoma predominante. Entre los signos ms habituales est la fiebre, el aumento del bazo y del hgado, dolor abdominal. La afectacin testicular es exclusiva de la LLA.

Leucemia linfoide crnica: Aumento de los ganglios linfticos e infecciones frecuentes. Aunque pueden estar asintomticos durante aos. Leucemia mieloide crnica: Primero una fase crnica en la que los granulocitos van proliferando. Sntomas pasan desapercibidos, pero puede haber anemia, disminucin de peso y fiebre. Bazo aumentado. La segunda blstica ms maligna: anemia, fiebre y hemorragias frecuentes, con ganglios de gran tamao. Diagnstico: Leucemia aguda Laboratorio y el estudio al microscopio. Examen de mdula sea. Leucemia linfoide crnica: Sospecha por adenopatias. Hemograma, puede haber anemia y trombopenia. La biopsia de mdula sea con infiltracin de linfocitos. Leucemia mieloide crnica: El hemograma, Esplenomegalia. El 95% "cromosoma Filadelfia". LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA MNIMAMENTE DIFERENCIADA (LMA-M0) DEFINICIN. LMA sin evidencia de diferenciacin mieloide por morfologa o citoqumica. INMUNOFENOTIPO. CD13,CD33 GENTICA. Las anormalidades ms frecuente son cariotipo complejo, trisoma 8 y 4. Sin reordenamiento de IgH ni TCR. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA CON MADURACIN (LMA-M1) DEFINICIN. Caracterizada por un alto porcentaje de blastos en mdula sea sin evidencia de maduracin. INMUNOFENOTIPO. Al menos dos marcadores mielomonocticos (CD13, CD33) y otros marcadores sin especificidad mieloide (HLA-DR, CD34, CD7,CD4, CD15,CD11b, CD11c). LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA CON MADURACIN (LMA-M2) DEFINICIN. La LMA-M2 se define por la presencia de 30% de blastos en sangre con 10% de neutrfilos maduros. Los monocitos son 20% de las clulas de la mdula sea. La LMA-M2 es el tipo morfolgico que se asocia predominantemente con la t(8;21) y es ms frecuente en nios que en adultos.

LEUCEMIA PROMIELOCTICA AGUDA (LMA-M3) DEFINICIN. LMA con proliferacin de blastos y promielocitos anormales. GENTICA. t(15;17), t(11;17) (q23;q21), t(5;17)(q32;q12) QUIMOTERAPIA. ATRA (cido todo-trans retinoico) induce la maduracin de glbulos blancos. LEUCEMIA MIELOMONOCTICA AGUDA (LMA-M4) DEFINICIN. Proliferacin de precursores de neutrfilos y monocitos. La mdula sea contiene 30% de blastos; los monocitos y precursores de los monocitos son 20%.. n elevado porcentaje de monocitos pueden estar presentes en sangre perifrica >5x109/L. INMUNOFENOTIPO. No hay marcadores especficos. LEUCEMIA MONOCTICA AGUDA (LMA-M5) DEFINICIN. 80% o ms de las clulas son de la lnea monoctica. INMUNOFENOTIPO. No hay marcadores especficos para la lnea monoctica. GENTICA. Delecciones y translocaciones del cromosoma 11 band q23. LEUCEMIA MEGACARIOBLSTICA AGUDA DEFINICIN. >30% de blastos de la lnea megacarioctica en mdula sea y/o sangre. INMUNOFENOTIPO. TdT, CD34, HLA-II negativos. Expresin de uno o ms glicoprotenas plaquetarias: CD41, CD42, y/o CD61. GENTICA. inv(3)(q21;q26). En niosmenores de 1 ao, puede haber t(1;22)(p13;q13). HALLAZGOS CLNICOS. Generalmente se presenta con trombocitopenia y en algunos casos trombocitosis. Pronstico pobre. LEUCEMIA ERITROIDE AGUDA DEFINICIN. Proliferacin neoplsica de clulas inmaduras casi exclusivamente de la lnea eritroide (ms del 80%). HALLAZGOS CLNICOS. Ocurre en adultos y nios. Generalmente se presenta con trombocitopenia y en algunos casos trombocitosis. La hepatoesplenomegalia es infrecuente excepto en nios con t(1;22). Pronstico pobre, particularmente en estos ltimos casos. 1.- LEUCEMIA LINFOBLSTICA AGUDA DE CLULA B PRECURSORA. HALLAZGOS CLNICOS. Ocurre ms frecuentemente en nios y en viejos. Pronstico menos favorable en nios menores de un ao y en los adultos. INMUNOFENOTIPO. Tdt +, CD19, 22, 20, 79, 45 y 10 +/-..

GENTICA. En nios > 50% tienen hiperdiploidia y t(12;21) con supervivencia del 85-90%. Otros se asocian a translocaciones del gen MLL en el 11q23, mal pronstico. En los adultos: t(9;22) en el 25% de los casos, mal pronstico. 2.- LEUCEMIA LINFOBLSTICA AGUDA DE CLULAS T INMUNOFENOTIPO. CD1a, CD2,3,5 y 7. HALLAZGOS CLNICOS. 15% de las LLA en adolescentes que en nios. 25% de las LLA del adulto. Mal pronstico. Se presentan con leucocitosis elevada en sangre. LEUCEMIA LINFOBLSTICA AGUDA L3 (LEUCEMIA DE BURKITT) MORFOLOGA. Blastos de tamao intermedio a grande con citoplasma moderado y vacuolas claras. 2-4 nuclolos llamativos. INMUNOFENOTIPO. Igs con restriccin de cadenas. Generalmente CD19, 20, 22 y 79+. HALLAZGOS CLNICOS. Con tratamiento agresivo tienen buen pronstico, supervivencia del 8090%. LINFOMA LINFOBLSTICO (LLB) GENTICA. LLB T: translocaciones diversas afectando al loci receptor T en el 14q11 y 7q34. LLB clula precursora B: idntico a la LLA clula precursora B. HALLAZGOS CLNICOS. LLB es ms frecuente en adolescentes varones. Frecuente afectacin de mdula sea. Proliferacin nodal o extranodal de linfoblastos de diferenciacin T (80-90%) o clula precursora B (10-20%). MIELOMA MLTIPLE Se caracteriza por un crecimiento exagerado y disfuncin de las clulas plasmticas de la mdula sea. El crecimiento de estas clulas plasmticas adicionales interfiere con la produccin de glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas. Causa anemia, susceptibilidad a infecciones. Con el tiempo causan dolor y destruccin de los huesos. Si se afecta a los huesos de la columna, causan entumecimiento o parlisis. La insuficiencia renal es una complicacin frecuente causada por exceso de calcio en la sangre debida a la destruccin de los huesos. Afecta a personas de edad avanzada. SNTOMAS. Dolor en los huesos o en la espalda. Fracturas sin causa aparente. Problemas de sangrado. Aumento de la susceptibilidad a infecciones. Sntomas de anemia tales como: cansancio, dificultad respiratoria y fatiga TRATAMIENTO. El objetivo es aliviar los sntomas, ya que la quimioterapia o el trasplante rara vez llevan a una cura definitiva. El promedio de supervivencia de las personas con mieloma mltiple es de aproximadamente 3 aos.

26 Inmunofarmacologa
F. Ruiz Cabello, P. Jimnez, R. Gonzlez y G. Fontn
El sistema inmune puede ser manipulado desde el exterior por una serie de agentes farmacolgicos que inciden directamente sobre las clulas inmunitarias produciendo diferentes efectos, que van desde las interferencias en las rutas de activacin o diferenciacin celular a la muerte celular. Con excepcin de la teraputica mediada por pptidos o anticuerpos anitidiotipo, en general, las drogas no tienen una accin clono especfica, es decir, aquella dirigida contra las clulas responsables de un determinado proceso inmunopatolgico. Esta inespecficidad trae como consecuencia que se vean tambin suprimidas respuestas beneficiosas contra los agentes infecciosos. En los siguientes apartados sern considerados diversos aspectos relacionados con el mecanismo de accin, farmacologa y citotoxicidad de los frmacos con capacidad para modular la respuesta inmunolgica. AGENTES INMUNOSUPRESORES Estos agentes tienen la propiedad de inducir una inmunosupresin del sistema inmune (Figura 26.1). Aunque la inespecificidad de los frmacos inmunosupresores supone un gran inconveniente, no es menos cierto que actualmente son imprescindibles para el control de las enfermedades autoinmunes y evitar el rechazo de los rganos trasplantados. Entre estos destacan:
Fig.:26.1

Frmacos que interfieren en la transmisin de seales. Dentro de este grupo se incluyen una serie de frmacos con diferente mecanismo de accin. As tenemos la ciclosporina y tacrolimus que inhiben la produccin de IL2. La ciclosporina es ampliamente utilizada adems de en el trasplante de rganos, en el tratamiento del psoriasis, sndrome de Behcet, artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal. El tacrolimus, previamente denominado FK506, tiene una aplicacin fundamentalmente restringida en el trasplante y un menor ndice teraputico. En ambos casos se trata de frmacos que inhiben la trasmisin de seales de la clula T que son dependientes a su vez de un aumento de Ca++ intracelular y de la activacin de la proten cinasa C, PKC. La ciclosporina A y el tacrolimus impiden la activacin linfocitaria por inhibicin de la calcineurina (Figura 26.2) que desempea un importante papel en la regulacin de la trascripcin de diferentes genes, entre ellos el de la IL-2.

Fig.:26.2

Para que estos dos frmacos sean efectivos se requiere su interaccin con unas protenas intracitoplasmticas denominadas inmunofilinas: el tacrolimus se une a la protena FKBP-12 y la ciclosporina a la ciclofilina (CyP). Es por tanto el complejo droga-inmunofilina quien inhibe la actividad de la calcineurina impidiendo que esta defosforile la subunidad citoplasmtica del factor transcripcional NF-AT que de esta manera no se trasloca al ncleo. NF-AT interacciona con una regin dentro del promotor de IL2. Por tanto si se impide la accin de la calcineurina se inhibe en gran medida la sntesis

de IL-2. La ciclosporina adems de inhibir a la IL2, tambin disminuye otras citocinas importantes en la respuesta inmune como la IL3, factor de crecimiento de clulas B, IFN-g, etc. El tacrolimus adems es capaz de inhibir el TGFb que es una citocina implicada en la fibrognesis lo que explicara la capacidad de tacrolimus de revertir rechazos refractarios a CsA y el rescate de algunos rechazos crnicos en sus estadios iniciales. Otros frmacos impiden ms bien que la IL-2 desarrolle su accin, siendo el ms utilizado la rapamicina, mientras que con leflunomida se tiene bastante menos experiencia. La rapamicina o sirolimus es otro agente inmunosupresor muy potente, que presenta homologa estructural con el tacrolimus y que se une al mismo tipo de receptores intracelulares aunque su mecanismo de accin es diferente (Figura 26.2). La protena de unin intracelular tambin es la inmunofilina FKBP12 y el complejo FKBP12sirolimus inhibe una va de sealizacin independiente de calcio a travs de su unin directa y de la inhibicin de dos enzimas dianas especficas: TOR1 y TOR2 (targets of rapamycin) impidiendo la activacin del complejo ciclina/cdk que es necesario para la transicin de la fase G1 a la fase S. Por otra parte inhibe la fosforilacin de las cinasas p70 y p34 inducida por la IL2, quinasas que son cruciales para la regulacin de la progresin del ciclo celular. Adems bloquea la activacin celular va CD28/CTLA4 que tambin es independiente de calcio El resultado es que inhibe la respuesta a la IL2, as como a la IL4 y a la IL6. En clnica se han demostrado excelentes resultados en el trasplante de rganos y como profilaxis de enfermedades autoinmunes como la diabetes. Frmacos con funcin inductora de la citotxidad Dentro de este grupo incluimos: antagonistas de la purina como azatioprina, derivados del cido micofenlico y mizoribina, antagonistas de la pirimidina como brequinar sdico, agentes alquilantes como la ciclofosfamida y por ltimo antifolatos. La azatioprina es un anlogo de la purina y su efecto final es la inhibicin de la sntesis de DNA y RNA afectando fundamentalmente a la fase S del ciclo celular. Fue usada ampliamente en trasplantes formando parte de la triple terapia. Hoy en da se usa muy poco en enfermos trasplantados, mas bien es empleada en el tratamiento de la artritis reumatoide refractaria a los tratamientos clsicos.

El derivado del cido micofenlico (MPA), micofenolato mofetil (MMF) o RS61443 evita la proliferacin al ser antagonista de las purinas como la azatioprina concretamente inhibe la sntesis del nucletido guanosina, no incorporndose por tanto dicho nucletido al DNA. Tambin se ha podido comprobar que bloquea la glicosilacin de las molculas de adhesin implicadas en la interaccin con los endotelios vasculares impidiendo as el reclutamiento de los linfocitos y macrfagos hacia los sitios de inflamacin. Es un agente inmunosupresor muy eficaz en el trasplante y se usa con corticoides asociado a ciclosporina y FK 506. Tambin se est empleando en artritis reumatoide y psoriasis. En la actualidad la experiencia clnica con mizoribina y brequinar sdico es escasa por lo que no sern tratados ms extensamente. La ciclofosfamida es un agente alquilante citotxico que fue introducido como agente anticanceroso y posteriormente en procesos tales como el lupus eritematoso, la artritis reumatoide, la granulomatosis de Wegener y las vasculitis. Ejercen su mecanismo de accin por el establecimiento de enlaces covalentes con las macromolculas: protenas, RNA y DNA provocando la muerte celular Los antifolatos fueron introducidos tambin en la terapia del cncer, particularmente para inducir remisiones en la leucemia linfoblstica. En la actualidad se emplean tambin en el tratamiento del psoriasis y la artritis reumatoide. El exponente ms importante de stos frmacos es el metotrexato que es un anlogo estructural del cido flico interfiriendo con su metabolismo. El resultado final tambin es la inhibicin de la sntesis de DNA y de RNA lo cual bloquea numerosas funciones biolgicas. Corticoides Los glucocorticoides (GC) son hormonas que regulan diversos procesos fisiolgicos en las clulas nucleadas, interviniendo tambin en la diferenciacin de rganos y tejidos. Debido a sus efectos antiinflamatorios e inmunosupresores, estn siendo ampliamente utilizados como agentes teraputicos en trasplante de rganos y enfermedades autoinmunes e inflamatorias. El GC se une primero en el citoplasma a su receptor especfico que posee diferentes dominios funcionales y posteriormente el complejo GC/receptor se une a secuencias especficas de DNA (glucocorticoid responsive elements o GRE) en el ncleo actuando como un factor transcripcional que puede activar o inhibir a determinados genes (Figura 26.3). La mayora de los efectos antiinflamatorios e inmunosupresores son debidos a la regulacin negativa de diferentes genes. En concreto la interaccin entre el GC, su receptor y GRE antagoniza diferentes factores de transcripcin necesarios para la expresin ptima de citocinas y la activacin de linfocitos T, incluyendo los complejos trascripcionales AP-1 (activating protein-1), NF-kB y NF-AT. NUEVOS FRMACOS Actualmente estn en fase de estudio frmacos como la Desoxipergualina (DSG) que tiene poco en comn con otras drogas inmunosupresoras. A nivel molecular puede ser un inhibidor del factor de trascripcin NF-kB. Su accin dependera del bloqueo en la produccin de anticuerpos, del procesamiento
Fig.:26.3

antignico y de la supresin de la expresin de los receptores para la IL2. Tambin se estn conociendo los efectos inmunosupresores de otros frmacos en principio utilizados para otras patologas sin relacin con el sistema inmune, as las estatinas conocidas en el tratamiento contra la hipercolesterolemia. Una de estas estatinas, la lovastatina, inhibe por un mecanismo indirecto la interaccin de LFA-1 con ICAM1, demostrndose su unin a un nuevo lugar descubierto en LFA-1, denominado sitio de lovastatina (LFA-1 L-site). Se tienen fundadas esperanzas de su utilidad en psoriasis, artritis reumatoide y trasplante. Tambin podramos incluir el calcitriol, steres del cido fumrico etc. Tambin est en fase de estudio la administracin exgena de algunos factores solubles presentes en el organismo, sobre todo citocinas con un importante efecto antiinflamatorio como la IL-4, IL-10 y IL11, observndose importantes efectos teraputicos con escasos efectos secundarios. Parece que puede suponer un importante avance el uso de molculas recombinantes como CTLA4Ig que est siendo probada inicialmente en los trasplantados y enfermedades autoinmunes por su efecto inductor de tolerancia INMUNOESTIMULANTES Algunos de estos agentes han mostrado resultados prometedores en determinadas situaciones clnicas, pero en general la informacin disponible es escasa y es necesario realizar ms estudios clnicos controlados, con metodologa adecuada, que permitan valorar definitivamente su utilidad clnica. En Espaa hay comercializados cinco principios activos considerados estimulantes inmunitarios inespecficos: timoestimulina, glicofosfopeptical, inosina pranobex, palmidrol y procodazol; relacionados con ellos estn el extracto de Polypodium leucotomos y la lisozima. INMUNOGLOBULINAS COMO AGENTES TERAPEUTICOS Los anticuerpos, ya sean policlonales o de tipo monoclonal, se suelen utilizar bien como agentes inmunosupresores o bien como elementos de reposicin en inmunodeficiencias cuando el individuo carece de todos o algunos de los isotipos. Anticuerpos que producen inmunosupresin Clsicamente se han venido usando anticuerpos como GAL, GAT y OKT3 para inducir una inmunosupresin en pacientes trasplantados. La globulina antilinfocitaria (GAL) y antitimocitaria (GAT) son obtenidas tras inyectar en animales linfoblastos para producir GAL y timocitos para producir GAT. Un problema de estos anticuerpos es el diferente grado de inmunosupresin de cada preparado debido a la mezcla polimorfa de anticuerpos que poseen y que se acaban formando anticuerpos contra las globulinas administradas. El efecto inmunosupresor se puede conseguir por varias vas disminuyendo drsticamente el nmero de linfocitos T, as: lisis celulomediada a travs del receptor Fc, por complemento, aclaracin por el SRE, y enmascaramiento de los antgenos de membrana.
Fig.:26.4

OKT3 fue el primer anticuerpo monoclonal aceptado por la Food and Drug Administration (FDA) para uso teraputico en humanos. Es un anticuerpo murino de tipo IgG2a dirigido contra la cadena e del complejo CD3 unindose por tanto a todos los linfocitos T maduros (Figura 26.4). Inhibe la actividad de los linfocitos efectores, provocando tambin la internalizacin en el propio linfocito T del antgeno de superficie CD3. Los principales problemas que ocasiona son los efectos colaterales (fiebre, escalofros,

etc) y la formacin de anticuerpos contra l por parte del receptor que puede provocar problemas del tratamiento.

Para evitar los problemas que presentan los anticuerpos citados anteriormente y que han sido clsicamente muy empleados en la prctica clnica, se est tratando de utilizar anticuerpos quimricos, humanizados y anticuerpos monoclonales humanos obtenidos por tecnologa de ADN recombinante y que presentan mejor tolerabilidad, con un mecanismo de accin ms especfico y que evitan la formacin de anticuerpos neutralizantes presentando menos efectos secundarios. Anticuerpos en el tratamiento de inmunodeficiencias Los anticuerpos tambin tienen utilidad en el tratamiento de las inmunodeficiencias. El contenido de estas gammaglobulinas teraputicas, es fundamentalmente IgG, siendo mnimas las cantidades de IgA e IgM. Las gammaglobulinas teraputicas se obtienen actualmente de mezclas de plasmas de 3.000 a 10.000 donantes y proporcionan al receptor una inmunidad pasiva dependiente del repertorio de anticuerpos de los donantes. Su indicacin en inmunodeficiencias son todos aquellos defectos graves de la produccin de IgG o de anticuerpos mediados por este isotipo. Se usa casi exclusivamente la Ig por va intravenosa (IGIV) ante la posibilidad de una mejor dosificacin, as como de administrar cantidades tan elevadas como sea necesario, la menor cantidad de reacciones adversas y los mejores resultados teraputicos En general las dosis se repiten cada 3 4 semanas que es la vida media de estas Igs. Las reacciones adversas mas frecuentes consisten en fiebre, escalofros, cefaleas, sudoracin, dolores lumbares. Muchas de estas reacciones estn causadas por una velocidad de infusin excesiva. La aparicin de anticuerpos anti IgG, mediados por IgE pueden provocar reacciones anafilcticas muy graves. Anticuerpos en otros tratamientos Por ltimo tambin se estn empleando anticuerpos en el tratamiento de patologa inflamatoria y autoinmune. As puede ser usada en la prpura trombopnica inmune y en la trombopenia asociada a la infeccin por el VIH. Se considera el tratamiento de eleccin en el sndrome de Kawasaki siempre que la administracin de la IGIV se realice antes de los 10 das de su comienzo. Tambin se han publicado ensayos clnicos controlados que demuestran su eficacia en el sndrome de Guillain-Barre, en la dermatomiositis/ polimiositis, en la prevencin de las complicaciones de la infeccin por citomegalovirus en pacientes de riesgo y en la enfermedad injerto contra husped, aunque no existe un consenso unnime sobre su superioridad sobre otras actuaciones teraputicas. El mecanismo de accin de IGIV, en estas patologas no est claro, es probable que acten mediante mecanismos diferentes as entre las propiedades inmunorregulatorias con posible efecto sobre estas enfermedades se cuentan: inhibicin del dao mediado por complemento, ya que la IgG es capaz de unir productos derivados de su activacin, bloqueo del receptor Fc de IgG del sistema mononuclear fagoctico y su modulacin, alteracin de la funcin de las clulas NK, neutralizacin de superantgenos, interaccin con autoanticuerpos y receptores de las clulas B y T por los anticuerpos antiidiotipicos que contiene la IGIV, disminucin y solubilizacin de complejos inmunes, modulacin de la produccin de citocinas y de sus antagonistas, disminucin de la activacin endotelial y de la expresin de molculas de adhesin, disminucin de la capacidad proliferativa de los linfocitos, aumento del catabolismo de la IgG, induccin de anticuerpos antiidiotpicos contra autoanticuerpos, seleccin del repertorio de las clulas T, etc.

BIBLIOGRAFIA

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TIPOS DE VACUNAS

INMUNOLOGA GENERAL 2006-2007

ANTIGENO COMPOSICION FABRICACION USO SANITARIO

Tema 30. Introduccin a la Inmunoterapia

1. Vacunacin - Inmunizacin pasiva - Inmunizacin activa 2. Terapia de enfermedades autoinmunes) 3. Terapia de inmunodeficiencias 4. Terapia anti-tumoral 5. Terapia de las alergias 6. Prevencin del rechazo en trasplantes de rganos

BACTERIANAS VIRICAS POLISACARIDAS

MONOVALENTES POLIVALENTES COMBINADAS

ATENUADAS INACTIVADAS RECOMBINANTES SINTTICAS

SISTEMATICAS NO SISTEMATICAS

VIRUS

BACTERIAS Atenuada Toxoide Polisacridos

INACTIVADOS (muertos)

INACTIVOS (atenuados) DNA desnudo

Conjugadas, Pptidos sintticos, Recombinantes,

(heterogeneidad HLA) (insercin gen/plsmido) (vectores)

Clasificacin de las vacunas humanas

Microorganismos completos

Clasificacin de las vacunas humanas

Macromolculas purificadas

-Anticuerpos producidos por otro individuo -Rpida -Duracin restringida -Tipos: natural, artificial
Sarampin Parotiditis

-Anticuerpos producidos por el mismo individuo -Ms lenta -Duracin prolongada -Tipos: natural, artificial
Fiebre amarilla

Comparacin de vacunas de microorganismos atenuados, inactivados y de DNA

Inmunizacin va mucosa
vacunas sin agujas
Requerimiento de esfuerzo

Diseo de una estrategia vacunal -Proteger antgeno de proteolisis (vehculos, sistemas de admon) -Aumentar captacin de antgeno por el epitelio o las clulas M -Estimular I. innata y adaptativa -Inducir memoria inmunolgica Eficaz en modelos animales Por confirmar en humanos.

Vacunas de ADN: basadas en la identificacin de eptopos inmunognicos

Inmunoterapia en las enfermedades autoinmunes

TLR

-Bloqueo de las molculas MHC -Anticuerpos monoclonales anti CD4 (agotan TH) anti TCR anti IL-2R (ms especfico)

CCR9

CPA
B7.1/2 CD28

CD40 MHC TCR CD40L

-Reinduccin de tolerancia por ingestin oral del antgeno

(segn dosis, pauta de admon, etc.)

CD4

-Induccin de clulas T reguladoras

(ratones: dosis baja, repetida)

*Varicela

Difteria Ttanos Tosferina

Sarampin Rubeola Parotiditis

Objetivo: Inhibicin / control de los linfocitos T reactivos

EA2006

Terapia anti-tumoral

Terapia de la autoinmunidad con anticuerpos monoclonales: (A) seales pro-inflamatorias del TNF-D, (B) su bloqueo farmacolgico

Tres vas de reconocimiento de un tumor por el sistema inmune

Prevencin del rechazo en trasplantes de rganos

-Los corticosteroides son frmacos antiinflamatorios, de accin inespecfica. -Frmacos inmunosupresores (ciclosporina y otros macrlidos, como tacrlimo) inhiben las vas de transduccin de seales de activacin en los linfocitos T

Mecanismos de escape de los tumores frente al reconocimiento por el sistema inmune: baja inmunogenicidad (molculas de superficie), modulacin antignica, desfase entre crecimiento tumoral y respuesta inmune, supresin de respuesta inducida por tumor

Terapia anti-tumoral con Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpo combinado con toxina. Al ser endocitado el complejo Ag-Ab, la toxina ejerce su accin letal sobre la clula tumoral.

Toxina

Istopo radioactivo

Anticuerpo combinado con Istopo Radioactivo Al ser endocitado el complejo Ag-Ab, el istopo desprende Radioactividad letal para la clula tumoral.

Antgeno tumoral Linfocito T citotxico

CELULA TUMORAL
LISIS TcR CD3 Toxicidad

Prodroga

5
L I S I S

enzima

4
FcJR

Toxicidad Droga

Anticuerpo bi-especfico: reconoce el Ag tumoral por un lado, y una molcula de la clula T por el otro. La clula Tc puede ahora lisar la diana.

Linfocito NK

Anticuerpo combinado con un enzima: al aadir una pro-droga, la enzima sta transforma en droga de accin muy localizada en el entorno tumoral.

Anticuerpo parcialmente humanizado. Reconoce el Ag tumoral, y su porcin Fc (humana) es reconocida por Linfocitos NK que ahora pueden lisar la clula tumoral

TERAPIA ANTI-TUMORAL CON CLULAS AUTLOGAS

EXTRACCIN DE SANGRE DEL PACIENTE

BIOPSIA DEL TUMOR

PACIENTE CON UN TUMOR SLIDO

AISLAMIENTO DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA IL-2

AISLAMIENTO DE LOS LINFOCITOS QUE INFILTRABAN EL TUMOR (TIL)

CULTIVO

CULTIVO

reinfusin Enriquecimiento en clulas LAK (asesinas, activadas por citocinas)

reinfusin Enriquecimiento en clulas TIL (T citotxicos anti-tumorales)