MICROSCOPIO, TCNICAS PARA HACER PREPARACIONES MICROSCOPICAS

Integrantes: CLARA ANGULO DAZA DAYANA BURGOS FLOREZ JULIO CORDERO DANIEL PEREZ ISAZA

Profesor: (Bilogo) LUIS ALFONSO CAUSIL VARGAS

UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE MVZ PROGRAMA MVZ ASIGNATURA BIOLOGIA CELULAR LABORATORIO GRUPO

INTRODUCCIN

La biologa es una ciencia netamente experimental, la que ha avanzado gracias a la implementacin tecnolgica, el xito de su estudio depende de varios factores tales como la observacin, el empleo de instrumentos y tcnicas especiales; para lo cual es necesario apoyar las explicaciones tericas con prcticas de laboratorio; en donde cada persona puede realizar sus propias observaciones e investigaciones y de esta forma llegar a sacar conclusiones. Debido a que los seres vivos presentan una gran variedad de tamaos, formas, estructuras y funciones, etc. Con relacin al tamao ste vara y el ojo humano logra identificar elementos de hasta 200 micras, por lo que se hace necesario recurrir a estos instrumentos pticos los cuales faciliten la observacin de objetos de menor tamao. Todas estas dificultades se han podido resolver parcialmente permitiendo, aunque en casos limitados, la observacin de especmenes vivientes mediante el microscopio electrnico. Al principio, el microscopio surgi como una lente que agranda la imagen (lupa), lo que dio origen al microscopio ptico compuesto, que consta de un juego de lentes (parte ptica), sostenida por estructuras metlicas (parte mecnica). Por su extraordinario poder de resolucin, el microscopio electrnico es un instrumento ideal para el estudio de la estructura submicroscpica de la clula. Sin embargo, su uso est reducido por una serie de dificultades tcnicas y de limitaciones. Una de ellas se debe al escaso poder de penetracin que tienen los electrones. Si el espesor del material excede de 5000 A (0.5 u), la opacidad es casi total. El objeto debe depositarse sobre una pelcula extremadamente fina (de 75 a 150 A de espesor) de celodin, carbn, etc., que acta como material de sostn y que a su vez est apoyada sobre una fina grilla de metal. Otra limitacin proviene del hecho de que el espcimen debo deshidratarse para ser colocado en el vaco. Ello hace casi imposible el estudio de clulas vivas. Para observar los objetos a travs del microscopio ptico compuesto, es necesario colocarlos sobre una laminilla de vidrio (Porta objetos) y generalmente se le coloca otra laminilla de vidrio ms delgada (Cubre objetos); en esta forma se obtiene la preparacin microscpica; la que puede durar poco tiempo (preparacin temporal), o puede ser guardada (preparacin permanente), lo que nos da la clasificacin de preparaciones de acuerdo a su duracin. Las tcnicas de preparacin microscpica de los especmenes varan considerablemente. En biologa existen dos clases principales de preparacin: suspensiones de pequeas partculas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partculas, como virus y macromolculas, una de las dificultades es la tendencia que tienen las partculas en amontonarse entre s durante la desecacin sobre la pelcula de sostn. Pueden obtenerse pequeas gotas por medio de cierto tipo de atomizador.

OBJETIVOS

Conocer el microscopio ptico y aprender la funcin de cada una de sus piezas. Conocer los conceptos elementales del microscopio y de sus partes fundamentales. Identificar las partes pticas y mecnicas del microscopio. Reconocer el uso adecuado de cada una de las partes del microscopio ptico compuesto. Adquirir entrenamiento en el uso y cuidado del microscopio y algunas tcnicas relacionadas. Realizar preparaciones microscpicas temporales. Elaborar adecuadamente sus reportes de laboratorio.

MATERIALES

Microscopio ptico compuesto Cinta de enmascarar Porta Objetos y Cubre Objetos Corcho Flores con polen Hoja de lirio Cuchilla de afeitar nueva Pipeta pasteur Frascos gotero con agua destilada

MARCO TEORICO PREPARACION DEL MATERIAL BIOLOGICO PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA: Por su extraordinario poder de resolucin, el microscopio electrnico es un instrumento ideal para el estudio de la estructura submicroscpica de la clula. Sin embargo, su uso est reducido por una serie de dificultades tcnicas y de limitaciones. Una de ellas se debe al escaso poder de penetracin que tienen los electrones. Si el espesor del material excede de 5000 A (0.5 u), la opacidad es casi total. El objeto debe depositarse sobre una pelcula extremadamente fina (de 75 a 150 A de espesor) de celodin, carbn, etc., que acta como material de sostn y que a su vez est apoyada sobre una fina grilla de metal. Otra limitacin proviene del hecho de que el espcimen debo deshidratarse para ser colocado en el vaco. Ello hace casi imposible el estudio de clulas vivas. Todas estas dificultades se han podido resolver parcialmente permitiendo, aunque en casos limitados, la observacin de especmenes vivientes mediante el microscopio electrnico. Las tcnicas de preparacin de los especmenes varan considerablemente. En biologa existen dos clases principales de preparacin: suspensiones de pequeas partculas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partculas, como virus y macromolculas, una de las dificultades es la tendencia que tienen las partculas a amontonarse entre s durante la desecacin sobre la pelcula de sostn. Pueden obtenerse pequeas gotas por medio de cierto tipo de atomizador Tambin pueden producirse gotas submicroscpica transformando la suspensin en un aerosol (coloide de lquido en aire) y luego depositando las partculas cargadas por medio electrostticos sobre las grillas. Un mtodo importante para el estudio de macromolculas es la denominada tcnica de monocapas de Kleinschmidt, en la cual las macromolculas se extienden sobre una~interfase aire-agua antes de ser recogidas sobre una pelcula. Este procedimiento ha dado excelentes resultados en la demostracin de molculas de ADN y ARN de distintos orgenes y tipos. Los especmenes gruesos son susceptibles de ser desintegrados por medios mecnicos, como la homogeneizacin, ondas sonoras, o supersnicas, etc. El material es dividido por estos medios a lo largo de sus planos de clivaje en fragmentos, suficientemente finos como para que sean en parte transparente a los haces de electrones. Ultramicrotomia: El estudio de clulas y tejidos se logra tambin con el uso de cortes fino. La tcnica es esencialmente similar a la que se emplea en preparaciones para el microscopio ptico, pero sus requisitos son mucho ms crticos. Para cortar el tejido, sta debe previamente fijarse o incluirse. La necesidad de realizar cortes ultrafinos ha conducido al uso de medios de inclusin de considerable dureza. Los ms usados son los monmeros acrlicos o las resinas de epoxi, que impregnan los tejidos y luego se polimerizan por medio de catalizadores apropiados. Un medio hidrosoluble de glico-metcrilato ha sido

desarrollado para estudios citoquimicos, permitiendo la extraccin selectiva de sustancias y la accin de diferentes enzimas. En los ltimos aos se han perfeccionado considerablemente los mtodos de corte, construyendo diversos micrtomos que tienen un avance tcnico o mecnico. Con ambos tipos, los cortes ms finos que pueden realizarse estn en el orden de los 200 A. Los factores que influyen aparentemente en la limitacin son la inclusin apropiada y el filo de la cuchilla, En la actualidad se emplean generalmente las cuchillas de vidrio o diamante. Es posible asimismo realizar cortes ultrafinos a baja temperatura en material incluido simplemente en gelatina. Gua de Laboratorio de biologa Mtodos para intensificar el contraste: Ciertos materiales biolgicos como finas membranas, filamentos o macromolculas (de 100 A o menos de dimetro), tienen un poder muy pequeo de dispersin electrnica debido a que son uniformemente delgados y estn compuesto por tomos livianos. Se han utilizado mtodos que tienden a corregir esta dificultad aumentando el contraste y demostrando detalles ms finos de la superficie de los objetos. Una tcnica de stas, denominada de sombreado, consiste en colocar el espcimen dentro de una cmara de vaco y en evaporar metales pesados como cromo, paladio, platino o uranio, depositndola en un ngulo determinado, a partir de un filamento incandescente. De esta manera, el material se deposita sobre un lado de la superficie de las partculas del espcimen, mientras que del otro lado se produce una sombra cuya longitud permite calcular el espesor de dichas partculas. Las fotomicrografas de esos especmenes presentan un aspecto tridimensional que normalmente no se produce. Una de las tcnicas ms recientes e importantes en el estudio de los virus y macromolculas es el de la "coloracin negativa", en el cual el espcimen es embebido en una gota de material denso como el fosfotungstato. Este penetra en todos los espacios vacos existentes entre las macromolculas, que aparecen muy bien limitados en contraste negativo. Con dicha tcnica se determin el nmero de molculas proteicas (capsmeras) de diferentes virus y se realizaron observaciones interesantes en algunas estructuras celulares.

PROCEDIMIENTO 1. MICROSCOPIO PARTES Y FUNCIONES Partes pticas y mecnicas del microscopio Partes pticas: OBJETIVOS: Son los elementos ms importantes del microscopio. Estn formados por la reunin de varias lentes para corregir las aberraciones. Deben tratarse con mucho cuidado, pues cualquier golpe puede variar la posicin de las lentes y averiarlas. Se atornillan a la parte inferior del tubo o al revolver portaobjetivos. La lente inferior del objetivo denominase lente frontal. De ella depende principalmente la mayor o menor ampliacin. Es siempre plano-convexa, de foco muy corto y de dimetro tanto menor cuanto mayor sea el aumento. Detrs de esta lente hay otras, que son las que corrigen las aberraciones cromticas y esfricas. OBJETIVOS EN SECO: Son los que se emplean ms corrientemente. Entre la lente frontal y el cubreobjetos solo hay aire. A este grupo pertenecen los objetivos de menores aumentos. Las lentes frontales tienen de 3 a 10 milmetros de dimetro. Poseen gran profundidad de foco, lo cual permite observar diferentes planos paralelos del objeto. OBJETIVOS DE INMERSION: Se llama as a aquellos en los cuales, para la observacin, deben interponerse entre la lente frontal y la preparacin un lquido que, por su ndice de refraccin apropiado, permita una mayor luminosidad. Este lquido puede ser agua, aceite, monobromuro de naftaleno, etc. Son, estos objetivos, de gran aumento y de gran poder definidor. Se emplean en Bacteriologa y Parasitologa. Requieren gran luminosidad y empleo de condensador. OBJETIVOS APOCROMATICOS: Todos los objetivos, secos o de inmersin, estn acromatizados solo para dos rayos del espectro, el rojo y el azul. Son los llamados cromticos, pero si conseguimos corregir este defecto para tres rayos, se elimina casi completamente el llamado espectro secundario, y tenemos los objetivos apocromticos. OCULARES: Los forman dos lentes separadas por un diafragma, y van montados en la extremidad superior del tubo. La lente superior se llama lente ocular; la inferior, lente de campo. Hay dos tipos de oculares; los positivos o de Ramsden, que tienen dos lentes plano-convexas, y cuyas convexidades se oponen una a la otra y los negativos, o de Huyghens, que se llaman tambin de compensacin, por tener compensadas las desigualdades del espectro y en los que las curvaturas de las lentes se dirigen al objeto. Tanto el microscopio simple como el compuesto pueden

ser binoculares; estos dan mejor calidad a la imagen y ms cmoda visin. El tubo se bifurca, con los correspondientes prismas de reflexin total, y termina en dos oculares iguales. DIAGFRAGMA Y CONDENSADORES: El diafragma va montado bajo la platina. Es de sistema iris, y permite, por medio de una palanca, obtener a voluntad conos luminosos de distinto tamao y, mediante condensadores, conos luminosos muy grandes. Los condensadores constan de un sistema de lentes de gran abertura sujetos a una montura y colocados entre la platina y el espejo, pueden subirse y bajarse a voluntad y tienen un diafragma unido al conjunto.

Partes Mecnicas: EL PIE: Es una pieza maciza y pesada, para asegurar la estabilidad del aparato y servir de soporte a sus dems partes. Suele estar provista de charnela, que permite la inclinacin de la parte superior. LA PLATINA: Es una pieza metlica, redonda o cuadrada, donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una abertura circular por la que pasarn los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminacin. El pie se prolonga por encima de la platina, en arco ms o menos curvo. La parte superior de este arco es la que sostiene el tubo y su mecanismo de traslacin vertical. Esta tiene suma importancia, pues permite enfocar el objetivo mediante dos movimientos uno rpido, gracias a una cremallera, y otro lento, con un tornillo micromtrico. CARRO: En los microscopios corrientes la platina puede ser fija o estar endosada a un carro con dos tornillos y cremallera que permitan dos movimientos de translacin, para centrarla, y tambin, si los tornillos estn graduados, para medir sus desplazamientos. UAS O GANCHOS: La preparacin se sujeta, en las platinas fijas, con dos palanquitas mviles, y en las platinas de carro, por un reborde, en forma de escuadra y pestillo, que le impide cualquier movimiento imprevisto. EL TUBO: En l est instalado el sistema ptico. Est constituido por dos tubos o cuerpos. Uno de ellos, externo, en el que se encuentran la cremallera y el ocular, y otro, interno, yuxtapuesto al anterior, donde est el objetivo. En la parte superior hay una divisin milimtrica que permite modificar la distancia entre objetivo y ocular. Facilitan la visin con los dos ojos, y los revlveres portaobjetivos, con los cuales se pueden cambiar los objetivos instantneamente, sin desenfocar la preparacin. TORNILLOS MACROMETRICO Y MICROMETRICOS: Son tornillos que permite el movimiento o desplazamiento del preparado, el macromtrico permite desplazamientos grandes y el micrometrico desplazamiento fino que ayudan a darle nitidez a la imagen. 2. ENFOQUE DEL MICROSCOPIO

1. Baje completamente la platina del microscopio. 2. Haciendo uso del mecanismo del revlver, coloque frente a la preparacin el objetivo de menor aumento (4X). 3. Coloque la preparacin microscpica sobre la platina sujetndola con las pinzas del carro y centre la preparacin haciendo uso de los tornillos del carro. 4. Regule la luz mediante el uso del mecanismo del diafragma. 5. Haciendo uso del tornillo macromtrico suba al mximo la preparacin hasta que encuentre tope sin observar por los oculares. 6. Observando a travs del ocular, accione el tornillo macromtrico hasta que visualice la imagen en el campo microscpico. 7. Una vez enfocada la imagen, afine el enfoque microscpico, haciendo uso del tornillo micromtrico. 8. Si desea mayor detalle, cambie de aumento rotando el mecanismo del revolver a un objetivo que le proporcione el aumento deseado, corrigiendo el enfoque de imagen moviendo el tornillo micromtrico, y graduando la intensidad de luz con el diafragma. 9. Despus de haber realizado la observacin, se limpian las lentes con papel limpia lentes, se coloca el objetivo de menor aumento en posicin de enfoque, se baja la platina, se desconecta y se guarda. PARA OBSERVAR EN UN MICROSCOPIO CORRECTAMENTE: se debe poner la mano derecha en los tornillos que mueven la platina y la mano izquierda en los tornillos macro y/o micromtricos se deben graduar los oculares a nuestros ojos si el microscopio es binocular, si es monocular la observacin se debe hacer con los dos ojos abiertos. 3. PREPARACIONES MICROSCOPICAS TEMPORALES A) Preparacin de corcho: Haga varios cortes delgados de corcho utilizando la hoja de afeitar nueva y escoja el ms fino. En un porta objetos coloque una gota de agua destilada y coloque en l el pedazo de corcho seleccionado, y colquele un cubre objetos, procurando que no lo quede burbujas de aire. Proceda a su observacin microscpica. Haga su esquema correspondiente utilizando los objetivos DE 4x, 10x y 40x. Haga una breve descripcin de lo observado.

4x

10x

40x

Descripcin: Se pueden apreciar claramente las clulas muertas del corcho, solo contienen pared celular y estn rellenas de aire, de tal manera que no contienen ncleo ni mucho menos citoplasma; Con el objetivo de 4x, se podra decir que las clulas son iguales aunque cambian un poco su forma, pero de manera que nos acercamos a ellas se puede observar con el objetivo de inmersin poco a poco la diferencia. Se podan observar las clulas del corcho encimadas, (formando una mancha negra), indicando que las clulas se encontraban amontonadas, formando esta mancha con la pared celular. Es por eso que el corte del corcho debi ser muy delgado, para poder observar las clulas polidricas que contiene el corcho, las cuales eran parecidas a un panal de abejas. B) Observacin de granos de polen: Coloque granos de polen del estigma de una flor en un portaobjetos, con ayuda de un gotero ponga una gota de agua y observe al microscopio. Es necesario colocar el cubreobjetos. Esquematice sus observaciones utilizando los objetivos de 4x, 10x y 40x Describa las imgenes de estas con los diferentes aumentos.

4x

10x

40x

Descripcin: se lograba apreciar en estas clulas una compleja arquitectura interna, notablemente presentaban separaciones del medio circundante por medio de una membrana celular, se encontraban juntas las unas con las otras dndole esto un aspecto de unas celdas. RESULTADOS

Preparacin de corcho: se enfoc y observo con objetivos de 4x 10x 40x Observacin de granos de polen: se enfoc y observo con objetivos de 4x 10x 40x Con el objetivo de 4X observamos el cuerpo a gran escala Al incrementar nuestro objetivo a 10X , logramos observar una mayor cobertura en el campo visual Luego aumentasmos nuevamente la intencidad de nuestro lente objetivo a 40X e inmediatamente pudimos observar la muestra, pero esta vez a una mayor escala, es decir a un mayor tamao.

DISCUSIN DE RESULTADOS En las clulas observadas anteriormente en la prctica de laboratorio, pudimos ver que aunque las dos clulas eran vegetales, la diferencia en el contenido de ella es muy notoria, ya que las clulas muertas del corcho, solo contienen pared celular y estn rellenas de aire, de tal manera que no contienen ncleo ni mucho menos citoplasma como las clulas de la epidermis de la cebolla. Con el objetivo de 4x, podra decir que las clulas son iguales aunque cambia un poco su forma, pero de manera que nos acercamos a ellas hasta poder observarlas con el objetivo de inmersin, poco a poco se va notando la diferencia. Las tcnicas de preparacin de los especmenes realizadas durante el laboratorio variaron considerablemente. Existen dos clases principales de preparacin: suspensiones de pequeas partculas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partculas, como cortes delgados de corcho y granos de polen del estigma de una flor una de las dificultades que se presento fue la tendencia que tienen las partculas a amontonarse entre s durante la desecacin sobre la laminilla, para el caso del corcho, esto posiblemente originado debido a que las clulas se encontraban yuxtapuestas las unas con las otras, originando as una poca visibilidad en el campo visual. A diferencia de los granos de polen los cuales se encontraban juntos, pero con la diferencia de que se lograba ver la presencia de organelas celulares

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Por qu es importante utilizar microscopio en el estudio de la biologa? 2. Qu diferencia encuentra entre las imgenes observadas al microscopio y observadas a simple vista? 3. las imgenes observadas al microscopio son reales o virtuales? Explique 4. llene los espacios en blanco en la imagen del microscopio (Fig. 1) 5. elabore una conclusin a cerca de su trabajo en el trabajo en el laboratorio realizado 1. R/ Los hombres han intentado siempre hacer evidentes de una manera o de otra los fenmenos que estudian, sea por medio de diagramas, grficos o escritos. El microscopio ptico haba permitido ver los microorganismos y probar definitivamente su existencia. El microscopio revela no slo que las plantas y animales estn constituidos por clulas o por productos celulares si no que existe todo un mundo de pequeas plantas y animales invisibles a simple vista. El microscopio electrnico permitira poner en manifiesto la organizacin celular interna de los organismos, y ms recientemente observar la organizacin molecular de los procesos vivos; El microscopio electrnico es el nico instrumento que permite conocer directamente la ultraestructura biolgica y submicroscpica de la clula, puesto que posee un poder de resolucin mucho mayor que el del microscopio ptico y En el estudio de la biologa ha sido de vital importancia debido a que con la ayuda de este se han descubierto infinidades de sucesos que han contribuido en la evolucin del hombre como por ejemplo, el descubrimiento de enfermedades que seran imposible de detectar sin la ayuda de este instrumento; tambin nos ha facilitado el estudio de microorganismo tomos y otras entes las cuales no se encuentran al alcance de la vista humana, debido a que el tamao de las clulas se encuentra por debajo del lmite de resolucin LR (LR es la mnima distancia a la que deben estar dos puntos para verlos de manera separada.) del ojo humano. El microscopio ha sido una de las herramientas ms esenciales para el estudio de las ciencias de la vida. Dividi la intuicin y la trascendencia humana hacia una nueva dimensin. 2. R/ la principal diferencia se halla en el tan alto aumento que la imagen logra obtener en el microscopio ptico el cual se debe principalmente por los objetivos, dejando como gran diferencia y muy claramente la poca apreciacin que se logra obtener de las imgenes observadas a simple vista 3. R/ Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sita cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen.

4. R/ EL MICROSCOPIO (Fig. 1)

5. R/ Para concluir devemos recalcar que el microscopio es sin duda el elemento ms importante en cualquier laboratorio. Nos permite, por ejemplo, ver clulas, microorganismos y bacterias, lo cual es imposible de observar a simple vista. La clula es una unidad bsica y funcional la cual representa una gran complejidad, mucho ms de lo que muchos pensamos, y su estudio as como su comprensin es ms importante de lo que creemos. No todas las clulas tienen la misma forma, en unas es ms difcil su estudio que en otras. Por lo tanto para apreciar y ver cmo estn constituidas, es requerible de la utilizacin del microscopio, debido a que el ojo humano por s solo no puede captar las dimensiones proporcionadas por estos individuos microscpicos, es por ello que se le atribuye al microscopio por la gran labor que desempeada desde su creacin hasta nuestros das y por todos los avances que por medio de este se lograron obtener. En esta prctica adquirida asimilamos como es la correcta utilizacin de un microscopio, as como las partes que tiene dicho instrumento y para que sirven, igualmente, lo valioso que son estos, su finalidad y la contribucin que le brinda a la ciencia. De la misma manera aprendimos en qu tipo de observaciones o experimentos es necesario y/o requerible este instrumento, ya que sin este no se lograran realizar mltiples investigaciones.

BIBLIOGRAFIA

CASTRO FERNANDO, VLEZ MARIA CATALINA.

GONZLEZ IVN.

RONDN FERNANDO. Manual De Prcticas Y Talleres En Biologa General. Universidad Del Valle 2002 GMEZ O. HUMBERTO, GALN ROBERTO, HEREDIA FABIO. Curso de Biologa (vegetal, Animal y Humana). Editorial Norma. 1964 TORRES CELINA. BRAND LIZETH. ERAZO MNICA. Prcticas De

Laboratorio De Microbiologa. Departamento De Biologa. Facultad De Ciencias. Universidad De Antioquia 2002