2.

BIOSINTESIS DE NUCLEOTIDOS PIRIMIDINICOS

Vernica Gonzlez Nez Universidad de Salamanca

ESQUEMA: Biosntesis de nucletidos pirimidnicos

1. Introduccin. Importancia de la biosntesis de nucletidos 2. Localizacin 3. Biosntesis de novo de nucletidos de pirimidina - Generalidades - Precursores de la va de novo - Reacciones de la va. Sntesis de UMP - Sntesis de UTP y CTP 4. Regulacin de la biosntesis de nucletidos pirimidnicos 5. Vas de recaptacin de nucletidos pirimidnicos 6. Biosntesis de timidn-nucletidos - Mecanismo cataltico de la timidilato sintasa - Frmacos antiproliferativos

IMPORTANCIA BIOLOGICA DE LOS NUCLEOTIDOS (I)

Sntesis de cidos nucleicos

DNA

RNA

La necesaria para la sntesis de los cidos nucleicos proviene de la hidrlisis del enlace fosfoster

Importancia biolgica de los nucletidos (II)

Cofactores y coenzimas NAD, NADP, FAD, FMN, CoA, S-adenosilmetionina

FAD

NAD+
Fuente de las imgenes http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Biochemistry Creative Commons Attribution-Share Alike license

Importancia biolgica de los nucleotidos (III)

ATP: compuesto rico en = moneda de intercambio Estado de la clula: regulacin de rutas metablicas

GTP: moneda de intercambio en el movimiento de macromolculas la sntesis de protenas

Importancia biolgica de los nucleotidos (IV)

Mensajeros qumicos intracelulares

cAMP Intermediarios metablicos UDP-Glc: UDP-Gal:

cGMP

sntesis de glicoprotenas, metabolismo del glucgeno sntesis de glicoprotenas

CDP-colina: sntesis de lpidos

Importancia biolgica de los nucleotidos (V)

ATP, nucletidos pricos y adenosina Acciones como neurotransmisores y neuromoduladores

RELACION?

Cafena

Teobromina Adenosina

Teofilina

IMPORTANCIA BIOMEDICA DE LOS NUCLEOTIDOS Inhibidoresdelasntesisdenucletidos

Seempleanactualmentecomo: drogasanticancerosas antivirales(p.ej.zidovudina) Clasesdeinhibidoresdelasntesisdenucletidos Anlogosnucleotdicos ej.5fluorouracilo:analogo delatimina.El5FdUMP actacomoinhibidorsuicidadelatimidilato sintasa AnlogosdelaGln (donadordegruposNH2) Impidenladonacindegruposamonio ej.azaserina Antifolatos:inhibidoresdeladihidrofolato reductasa ej.metotrexato

5fluorouracilo

VIAS DE BIOSINTESIS DE NUCLEOTIDOS

De novo Aminocidos CO2 HCO-3 De recaptacin DNA RNA Localizacin: en el citosol - clulas en proliferacin: alta demanda - hgado: rgano con el mayor ndice de sntesis de nucletidos - cerebro: no sintetiza las bases nitrogenadas No todas las clulas expresan las enzimas implicadas en la va de novo Todos los organismos sintetizan nucleotidos de novo Rutas metablicas muy conservadas a lo largo de la evolucin
degradacion

Purinas Pirimidinas Energticamente muy costosa

Bases nitrogenadas Recaptacin

NUCLEOTIDOS DE LA DIETA
RNA DNA digestin
enzimas intestinales
nucleasas pancreticas fosfodiesterasas nucleotidasas nucleosidasas fosforilasas

Nucletidos

glcidos restos fosfato bases nitrogenadas

(absorcin por separado)

Bases nitrogenadas citosina & uracilo timina purinas

Degradacin -Ala + CO2 -aminoisobutirato + NH4+ + CO2 ac.urico alantoina alantoato urea NH4+
primates, pjaros, reptiles e insectos la mayora de mamferos peces seos anfibios, peces cartilaginosos invertebrados marinos

malonil-CoA LIPIDOS

SINTESIS DE NOVO DE NUCLEOTIDOS PIRIMIDINICOS

GENERALIDADES NH4+ Gln
4

Precursores del Asp anillo pirimidnico

5 6 1

3 2

Carbamil-P

HCO3-

Proceso ms simple que la biosntesis de purinas 1. Sntesis de UMP: 6 reacciones enzimticas Sntesis del anillo pirimidnico (orotato) Unin del orotato a la ribosa-5P 2. Sntesis de UTP y CTP

SINTESIS DEL OROTATO (I)

Procariontes - 6 enzimas independientes Eucariontes - 2 enzimas citoslicas Reacciones 1, 2 & 3: catalizadas por el mismo poliptido CAD Enzima multifuncional Carbamil-fosfato sintetasa Asp-transcarbamilasa Dihidroorotasa Reacciones 5 & 6: catalizadas por la UMP sintasa - 1 enzima unida a la cara externa de la membrana mitocondrial interna: dihidroorotato DH

Investigacin de la ruta con mutantes del hongo Neurospora crassa

Sntesis del orotato (II)

Channeling o canalizacin de sustratos Existencia de complejos multienzimticos

Los productos intermediarios no se liberan al medio, sino que se dirigen directamente al centro activo que cataliza la siguiente reaccin - los sustratos no se diluyen en el medio - los intermediarios no se acumulan Ventajas - mayor rapidez y eficacia - se evita la degradacin de los productos intermediarios - regulacin gnica coordinada ms sencilla

Sntesis del orotato (III)

Fuente de la imagen http://en.wikipedia.org/wiki/Cat egory:Biochemistry Creative Commons AttributionShare Alike license

1. Sntesis del carbamil-P (I)

HCO3- + Gln + 2ATP NH2-COO-PO42- + Glu + 2ADP + Pi

Gln

CarbamilP Enzima: Carbamil-P sintetasa

Glu

1. Sntesis del carbamil-P (II)

HCO3- + Gln + 2ATP NH2-COO-PO42- + Glu + 2ADP + Pi

Empleo de 2 ATP: ATP ADP + transferencia del grupo PO42ATP ADP + Pi + Enzima: Carbamil-P sintetasa No requiere biotina Punto clave en la regulacin (CAD en eucariontes) 2 Isoenzimas clase I: mitocondrial, forma parte del ciclo de la urea. NH2- del NH4+ clase II: citoslica, participa en la sntesis de pirimidinas. NH2 de la Gln En procariontes: una sola carbamil-P sintetasa. El NH2 proviene de la Gln

1. Sntesis del carbamil-P (III)

Mecanismo de accin propuesto para la sntesis del carbamil-P (3 pasos) Formacin de un carbanin activado = carboxi-P Intermediarios lbiles, pero el sustrato se canaliza a travs de la enzima 1. Fosforilacin del HCO3- con ATP en el dominio del carboxi-P para formar un carbanin activado HCO3- + ATP carboxi-P + ADP Hidrlisis del NH4+ de la Gln en la subunidad pequea (Gln amidotransferasa) El ion NH4+ es canalizado hacia el tercer sitio activo 2. El carboxi-P reacciona con el ion NH4+ para formar el cido carbmico, liberando Pi carboxi-P + Gln + H2O carbamato + Glu + Pi 3. Hidrlisis de una segunda molcula de ATP para fosforilar el cido carbmico, produciendo carbamil-P carbamato + ATP carbamil-P + ADP

1. Sntesis del carbamil-P: la Carbamil-P sintetasa

Subunidad Gln-amidotransferasa

Sitio activo Dominio de oligomerizacin

Dominio del Carboxi-P Dominio del carbamil-P Sitio activo

Sitio activo

Dominio alostrico Imagen modificada a partir de RCSB PDB. N. acceso: 1CS0

2. Sntesis del carbamil-Asp

carbamil-P + Asp carbamil-Asp + Pi

CarbamilP

Asp

CarbamilAsp

Enzima: ATCasa: Asp transcarbamilasa (CAD en eucariontes) - No necesita ATP, ya que el carbamil-P es una molcula activada - Punto de regulacin en procariontes: ATP vs. CTP

PALA & ATCasa

PALA

Carbamil-Asp

PALA: N-fosfonoacetil-L-Asp
- Anlogo bisustrato de la ATCasa - Estructura similar al producto intermediario de la reaccin - Inhibidor muy potente de la sntesis de pirimidinas
Imagen modificada a partir de la obtenida en NCBI PubChem

3. Sntesis del dihidroorotato

carbamil-Asp dihidroorotato + H2O

CarbamilAsp

Dihidroorotato

Enzima: Dihidroorotasa (CAD en eucariontes) - Condensacin intramolecular y cierre del anillo - Se libera una molcula de H2O

4. Oxidacin del dihidroorotato (I)

dihidroorotato + Coenzima Q orotato + Coenzima QH2

Dihidroorotato

Orotato

Enzima: Dihidroorotato DH

4. Oxidacin del dihidroorotato (II)

dihidroorotato + Coenzima Q orotato + Coenzima QH2

Enzima: Dihidroorotato DH
- El orotato ya es una pirimidina

- Reaccin irreversible - Enzima localizada en la cara externa de la membrana mitocondrial interna (m.m.i.) - Poder reductor proveniente de las quinonas - Las bacterias emplean NAD, FMN, FAD y grupos Fe no-hemo, principalmente en la ruta de degradacin del orotato (orotato dihidroorotato)

Leflunomida y la dihidroorotato DH

Leflunomida (Arava)
- Inhibidor de la dihidroorotato DH - Al abrirse el anillo isoxazol, se produce un compuesto que inhibe la catlisis - Actividad antiproliferativa y antiinflamatoria - Tratamiento de la artritis reumatoide

Rotura de este enlace y apertura del anillo isoxazol

Fuente de la imagen: NCBI PubChem

5. Unin de la ribosa al dihidroorotato (I)

orotato + PRPP OMP + PPi

Orotato

PRPP

OMP Enzima: Orotato fosforribosil transferasa

5. Unin de la ribosa al dihidroorotato (II)

orotato + PRPP OMP + PPi

Enzima: Orotato fosforribosil transferasa (+ pirofosforilasa)

- OMP: orotidina monofosfato - Reaccin irreversible - unin en de la base nitrogenada - enzima utilizada en la ruta de recaptacin (CMP &) UMP

6. Descarboxilacin del dihidroorotato (I)

OMP UMP + CO2

OMP

UMP

Enzima: OMP descarboxilasa - Ausencia de cofactores - No necesita de un carbanin activado

6. Descarboxilacin del dihidroorotato (II)

Mecanismo de accin de la OMP descarboxilasa Unin transitoria entre el OMP y el centro activo que estabiliza el estado de transicin

Fuente de la imagen http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Biochemistry Creative Commons Attribution-Share Alike license

SINTESIS DE UTP

UMP + ATP

U UDP

+ ADP

Enzima: Nucletido monofosfato kinasa enzimas especficas (UMP kinasa)

UDP + ATP

U UTP

+ ADP

Enzima: Nucletido difosfato kinasa enzimas inespecficas

AMP +ATP

2 U

ADP

Adenilato kinasa (K 1)

SINTESIS DE CTP

UTP

CTP

Enzima: CTP sintetasa Mecanismo cataltico en 2 pasos 1. Formacin de un intermediario acil-P activado (gasto de ATP) 2. Ataque nucleoflico del N del NH4+ En bacterias, el grupo NH2 es donado por NH4+

REGULACION DE LA SINTESIS DE PIRIMIDINAS

- Regulacin en la primera enzima especfica de la ruta ahorro - Sntesis coordinada de purinas y pirimidinas Bacterias ATCasa (sntesis del carbamil-Asp) + ATP CTP & UTP (feedback) Animales Carbamil-P sintetasa II: + ATP & PRPP UTP & CTP (feedback) Orotato fosforribosil transferasa: disponibilidad de PRPP
(ADP & GDP para la ribosa-P piro-fosfo-kinasa)

OMP descarboxilasa: UMP & CMP

Aciduria ortica
- Enfermedad gentica muy rara: deficiencia en la UMP sintasa (bloqueo de las reacciones 5 & 6) No hay sntesis de novo de pirimidinas

- Excrecin de grandes cantidades de cido ortico en orina, retardo en el crecimiento y anemia severa

- Al no producirse UMP, no se inhibe la carbamil-P sintetasa mayor acumulacin de cido ortico

- No existen otros defectos genticos conocidos de la sntesis de pirimidinas

- Tratamiento: administracin de uridina y citidina para la sntesis de UMP y CTP

VIA DE RECAPTACION DE NUCLEOTIDOS PIRIMIDINICOS

1. Formacin de los PirMPs Enzima: Pirimidina fosforribosil transferasa Orotato + PRPP OMP + PPi Uracilo + PRPP UMP + PPi No se recapta la citosina Enzima muy activa en tejidos adultos con baja tasa proliferativa Timina + desoxirribosa-1P timidina + Pi Enzima: Timina fosforilasa

Timidina + ATP dTMP + ADP Enzima: Timidina kinasa 2. Fosforilaciones sucesivas Transformacin de los nucletidos monofosfato de pirimidina en nucletidos trifosfato (gasto de ATP) PirMP PirDP PirTP

GASTO ENERGETICO

Sntesis de novo de UMP 2 ATP en la sntesis del PRPP 2 ATP en la sntesis del carbamil-P
4 ATP

Recaptacin de UMP 2 ATP en la sntesis del PRPP

2 ATP

BIOSINTESIS DE NUCLEOTIDOS DE TIMIDINA (I)

dTMP: componente del DNA sntesis a partir de dUMP por metilacin del C5 necesidad de la presencia de N5,N10metilen-THF Pasos previos - Transformacin de UDP en dUTP UDP dUDP dUDP dUTP - Hidrlisis del dUTP dUTP + H2O dUMP + PPi Enzima: dUTP difosfohidrolasa Importancia Evitar que se acumule dUTP en el interior celular y se incorpore al DNA Causa: La DNA polimerasa no discrimina eficientemente el dUTP de la dTTP Enzima: Ribonucletido reductasa Enzima: Nucletido difosfato kinasa

Biosntesis de nucletidos de timidina (II)

dUMP

Timidilato sintasa

dTMP

N5,N10metilenTHF Gly Serhidroximetil transferasa (+PLP)

7,8dihidrofolato(DHF) NADPH+H+ Dihidrofolato reductasa

Ser

NADPH

Tetrahidrofolato (THF)

Biosntesis de nucletidos de timidina (III)

dUMP + N5,N10-metilen THF dTMP + dihidrofolato

Enzima: Timidilato sintasa - Transferencia de un grupo metilo del N5,N10-metilen THF al dUMP - El grupo metileno se reduce a metilo - El cofactor tetrahidrofolato (THF) se oxida a dihidrofolato (DHF) - El THF es el donador de e- y de grupos metilo - Mecanismo cataltico basado en que el C6 del uracilo puede sufrir un ataque nucleoflico - Importancia evolutiva El uracilo ha de ser evolutivamente anterior a la timina

Mecanismo cataltico de la timidilato sintasa

1. Ataque nucleoflico del grupo SH al C6 del dUMP Formacin de un aducto covalente 2. C5 ataca al grupo metileno del THF Formacin del complejo ternario covalente enzima -- Cys146 -- S dUMP -- CH2 THF 3. Otro grupo nuclefilo de la enzima atrae un protn del C5 del dUMP Se forma el grupo metileno & separacin del THF 4. Migracin de un protn del C6 del THF al grupo metileno Aparicin de un grupo metilo en C5 + liberacin del DHF Desplazamiento del tiolato de la enzima

Regeneracin del THF DHF + NADPH + H+ THF + NADP

Enzima: Dihidrofolato reductasa (DHFR) Transferencia directa de un in H:- del anillo del NAPDH al DHF

THF + Ser N5,N10-metilen-THF + Gly

Enzima: Ser-hidroximetil-transferasa Reaccin dependiente de PLP (= piridoxal-fosfato)

Estructura del tetrahidrofolato (THF)

Acido paminobenzoico

Glu n=16

2amino4oxo6metilpterina

Imagen modificada a partir de la obtenida en NCBI PubChem

FARMACOS ANTIPROLIFERATIVOS 5FdUMP

Anlogo nucleotdico (Inhibidor suicida)

dUMP
Timidilato sintasa

dTMP

Antifolatos
Metotrexato Aminopterina

N5,N10metilenTHF Gly
Serhidroximetil transferasa (+PLP)

7,8dihidrofolato(DHF) NADPH+H+
Dihidrofolato reductasa

Ser

NADPH

Tetrahidrofolato (THF)

5-fluorouracilo & FdUMP

5FdUMP

5FdUMPunido alcentro activo

delaenzima timidilato sintasa

- Inhibidor suicida de la timidilato sintasa - 5-fluorouracilo = anlogo de la timina - Inmovilizacin del complejo ternario enzima -- Cys146 -- S dUMP -- F THF

Antifolatos (I)

THF

Aminopterina

Metotrexato

Fuente de las imagenes: NCBI PubChem

Antifolatos (II)
Inhiben la regeneracin del THF bloqueo de la sntesis de dTMP, de purinas, His / Met Aminopterina, metotrexato (ametopterina) Drogas anticancerosas, utilizadas especialmente en el tratamiento de leucemias infantiles y tumores de crecimiento rpido Actuan como inhibidores competitivos de la DHF reductasa Presentan 103 veces ms afinidad que el DHF Nota: Idealmente conviene utilizar una dosis letal de antifolatos y posteriormente rescatar al paciente administrando dosis masivas de THF o timidina De esta forma se evita la aparicin de resistencias a estas drogas

Antifolatos (III)

Problema:resistenciaalmetotrexato
Mecanismosderesistencia 1.Alteracindelossistemasdetransporte (elmetotrexato nosecaptadelmedio) 2.CambiosenelcentroactivodelaDHFR 3.AmplificacingnicadelaDHFR