TAXONOMA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS

Claudia Etchebehere Ctedra de Microbiologa Facultad de Qumica y Facultad de Ciencias 2008

BIBLIOGRAFA
Brock, Biologa de los microorganismos, 8a, 9a o 10a ed. (Evolucin microbiana y sistemtica, Diversidad de Archaea y Bacteria) Prescott, Harley and Klein, Microbiologa, cuarta edicin. Captulo 19).

TEMARIO
Taxonoma y concepto de especie en procariotas Taxonoma clsica, numrica, molecular y polifsica Caracteres fenotpicos: clsicos y quimiotaxonmicos Caracteres genotpicos: clsicos y modernos (fingerprinting) Filogentica: clasificacin y relacin evolutiva gen del ARNr 16S, rbol filogentico y definicin de dominos Relacin entre taxonoma clsica y filogentica. Diversidad bacteriana. Ejemplos. Identificacin de una cepa

TAXONOMA
Taxos=estructuracin u orden, nomos=ley Comprende: Clasificacin estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud Nomenclatura asigna nombres a los taxones Identificacin determina a que taxones pertenece un organismo que se aisl

Para que sirve clasificar los microorganismos?

Ordenar los conocimientos Lenguaje comn Descubrir organismos no descriptos Caracterizar aislamientos (por ejemplo patgenos) Estudios evolutivos

Taxonoma Caracterizacin exhaustiva Aplicacin de teora y mtodo de clasificacin Formacin de grupos taxonmicos (taxones) Nomenclatura Identificacin Caracterizacin por nmero limitado de tests adecuados al problema Comparacin con spp conocidas Asignacin a una sp No identificado: estudio taxonmico

Identificacin de un aislamiento
Cultivo puro Estudios morfolgicos (macro y micro, Gram) Estudios bioqumicos, enzimas vas de degradacin,

metabolismo, relacin con el oxgeno. Comparacin con cepas ya caracterizadas Asignacin de especie

Definicin de especie
Unidad taxonmica bsica Grupo de cepas que tiene un alto grado de

similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas
Cepa: poblacin de organismos que

desciende de un nico organismo o de una sola clula

Definicin de especie en Bacterias

Definicin en revisin continua

Definicin metodolgica estndar:

- % de hibridacin ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70% - Tm < 5C (estabilidad trmica del hbrido ADN1-ADN2)

Actualmente el criterio es POLIFSICO (combinacin de caractersticas fenotpicas, genmicas y filogenticas) En el futuro definicin genmica de especie.

Determinacin del % de hibridacin ADN-ADN

Absorbancia ADN simple hebra ADN doble hebra

220 Abs. relativa 260 nm

260 300 Longitud de onda (nm)

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Tm: punto medio del perfil de desnaturalizacin trmica de ADNADN o de ADNARN

ADN simple hebra desnaturalizacin Tm = 86C ADN doble hebra 80 90 100 temperatura (C)

Cinticas de desnaturalizacin trmica de ADN homoduplex y heteroduplex

Hibridacin genmica como herramienta taxonmica

RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA

Taxones:
Dominio Phylum Clase Orden Familia Gnero Especie Sub-especie importancia en estudios clnicos y ecolgicos

Nomenclatura
Sistema binomial de nomenclatura (Linneo)
Escherichia coli Escherichia coli o E. coli

Jerarqua taxonmica de la bacteria Allochromatium warmingii

Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Bacterias Gram negativas Zymobacteria Bacterias fottrofas prpuras Chromatiales Bacterias prpuras del azufre Chromatiaceae Allochromatium Allochromatium warmingii Secuencia del gen 16S rRNA

Categoras de clasificacin a nivel de subespecie (tipificacin)

Variedades o tipos serovariedad o serotipo (antgenos distintos) fagovariedad (tipificacin por fagos) biovariedad (diferencias bioqumicas y fisiolgicas) patovariedad (patogenicidad) morfovariedad (diferencias morfolgicas) genomovariedad (grupos con ADN similares)

Manuales de microorganismos
Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergeys Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)1989(vol 4) Bergeys manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5) The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

PUBLICACIONES
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB).
Publicado por la Sociedad General de Microbiologa

Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validacin del nombre)

COLECCIONES DE MICROORGANISMOS

(cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Coleccin alemana) CIP (Coleccin del Instituto Pasteur, Francia) www.straininfo.net

Taxonoma bacteriana
CLSICA
caracteres fenotpicos (morfologa, nutricin, etc.) % G+C ponderacin de caracteres (llaves dicotmicas)

Caractersticas fenotpicas clsicas de valor taxonmico

Morfologa: forma, tamao y tincin Nutricin y fisiologa: fottrofo, quimitrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH ptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposicin de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibiticos, patogenicidad

Caractersticas genotpicas clsicas

Contenido G+C % G+C = G+C x 100 G+C+A+T

Determinacin por gradiente de CsCl, desnaturalizacin trmica o cromatografa (HPLC) Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%) Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada

Rangos de composicin de bases de ADN

TAXONOMA NUMRICA
Agrupacin de unidades taxonmicas o taxones por mtodos numricos Se basa en un gran nmero de caracteres Cada carcter tiene igual peso La similitud es funcin de la proporcin de caracteres comunes

TAXONOMA NUMRICA
- caracteres fenotpicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza = a+d . a+b+c +d
a: nmero de caracteres positivos en ambas cepas b: nmero de caracteres positivos slo en cepa 1 c: nmero de caracteres positivos slo en cepa 2 d: nmero de caracteres negativos en ambas cepas Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas

Taxonoma molecular
Basada en el estudio de molculas Caracteres Genotpicos
Hibridacin ADN-ADN Molecular fingerprinting (huella molecular)

Caracteres Fenotpicos
Quimiotaxonoma. Biomarcadores: lipdicos

(FAME), otros

Hibridacin ADN-ADN

- depende de la secuencia completa del genoma - til en organismos estrechamente relacionados - determinacin por: % hibridacin de ADN1 - ADN2 Tm del hbrido - es el criterio actual de definicin de especie

Molecular fingerprinting

secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestin con enzimas de restriccin resolucin a nivel de sub-especie.

CARACTERES FENOTIPICOS
Marcadores quimiotaxonmicos
Caractersticas - anlisis qumico con equipamiento especializado - no son universales, muy tiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminacin - presentes en distintas estructuras celulares

Marcadores quimiotaxonmicos
- Pared: peptidoglicanos en Gram + - Membrana externa Gram negativos: -lipopolisacridos - Membrana citoplasmtica: -cidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), -lpidos polares, cidos miclicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fottrofas anoxignicas. - Cadena de transporte electrnico: citocromos, quinonas. - Sistema fotosinttico: bacterioclorofilas. - Citoplasma: poliaminas en metanognicas y Gram negativas

Desventajas de una clasificacin artificial

No permite inferir propiedades No permite comprender microorganismos que no se

han cultivado en el laboratorio

No permite estudiar el origen y evolucin de

funciones celulares (resistencia a antibiticos, aerobiosis, fotosntesis)

Clasificacin natural

Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biolgica. Es ventajosa si adems establece relaciones evolutivas

POLIFSICA
Es la tendencia moderna. Consenso en la integracin de distintos tipos de caracteres: Fenotpicos: -clsicos (morfologa, nutricin, etc)
- moleculares (marcadores quimiotaxonmicos) - perfil de protenas totales y enzimas

Genotpicos:

-clsicos: % G+C - moleculares: hibridacin DNA-DNA, fingerprinting

(ej. Perfiles moleculares por restriccin o amplificacin de ADN)

Filogenticos: basados en el gen del ARNr 16S

Taxonoma polifsica

CARACTERIZACIN FILOGENTICA
CARACTERIZACIN TENIENDO EN CUENTA LA EVOLUCIN.

Bases de la filogentica molecular

El uso de secuencias moleculares para estudios filogenticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporcin de stos permanece fijo en las molculas.

CARACTERES FILOGENETICOS
Plantean hiptesis de evolucin (determina

relaciones de parentesco entre las especies)

Compara la secuencia de molculas (cronmetros

evolutivos) y establece la relacin entre ellas

Las secuencias de las molculas son el registro

histrico de la evolucin

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONMETRO EVOLUTIVO

distribucin universal (presente en todos los

organismos)

funcin homloga en todos los organismos capacidad de alinear secuencias con zonas altamente conservada

para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables

ausencia de transferencia horizontal cantidad de informacin suficiente

Molculas usadas para la determinacin de relaciones filogenticas de organismos

ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) Subunidad beta de ATPasa RecA
Factor

de Elongacin Tu

Genes funcionales

ARNr Procariotas

Nombre 5S 16S 23S

Tamao (nucletidos) 120 1500 2900

Ubicacin Subunidad mayor del ribosoma Subunidad menor Subunidad mayor

Secuencia del ARNr 16S

Estructura primaria:

Dominios de conservacin universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservacin, con cambios de secuencia, pero conservacin de estructura secundaria
Estructura secundaria:

Similar en todos los organismos Acotada por su funcin en la sntesis de protenas: funcin ancestral

Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli

Lneas gruesas: dominios de conservacin universal Lneas normales: dominios de conservacin intermedia Lneas punteadas: regiones hipervariables

rbol filogentico
Un rbol filogentico es una hiptesis de relacin evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestin es si esos errores invalidan o no la hiptesis filogentica resultante.

Cmo se construye un rbol filogentico?

1-Extraccin de ADN, PCR y secuencia

2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas
Organismos A B C D secuencias ARN CGU AGA CCU GAC C CUU CCU AGA GCU GGC CAA C CAA GAC GUG GCA C CAU GCU AGA UGU GCC
Posiciones mas variables Posicion mas conservada

Secuencia del organismo problema

secuencias obtenidas de la base de datos

Posiciones que van a ser comparadas

rboles filogenticos
Uso de programas para alinear secuencias y

construir rboles filogenticos (MEGA)

Longitud de la lnea entre organismos es

proporcional a la distancia evolutiva

Similitud de secuencias implica similitud en los genes

Secuencias sin alinear en programa Clustal IX

Secuencias alineadas en programa Clustal IX

Preparacin de un rbol de distancias filogenticas a partir del gen 16S ARN

Definicin de especie bacteriana y el anlisis del gen ARNr 16S

Definicin especie: % de hibridacin ADN1-ADN2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridacin ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Relacin entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridizacin genmica de ADN entre pares de organismos.

ANLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA
Alineamiento y correccin de la secuencia Comparacin con bases de secuencias
(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar

> 3% < 3%

pruebas fenotpicas Confirmacin con pruebas fenotpicas y genotpicas diferentes diferentes Hibridacin ADN-ADN < 70% > 70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE

similares

NUEVA ESPECIE

Caracterizacin de especies nuevas

Secuencias signaturas o firma en ARNr

Oligonucletidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos
Ejemplos: AAACUCAAA (posicin 910) en Bacteria CACACACCG (posicin 1400) en Archaea C (posicin 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

Secuencia del gen ARNr 16S

Se emplea frecuentemente para:

COMPLETAR IDENTIFICACIN Y DESCRIPCIN DE CULTIVOS PUROS ANLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO DESCRIPCIN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: Candidatus

METODOS RPIDOS DE CARACTERIZACIN Y CUANTIFICACION.

ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS

PCR gen especifica
Plsmidos con inserto Ligacin de fragmentos de inters en el vector de clonado Transformacin de cepas E. coli

B
DNA ambiental
Gen amplificado de los microorganismos A y B

Seleccion y anlisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc.

Amplificacin y clonado del gen del ARNr de 16S

para su posterior secuencia

MICROORGANISMOS NO CULTIVADOS

FISH: Fluorescence in situ hybridisation

sonda fluorforo Microscopio de Epifluorescencia blanco (rRNA) Deteccion

muestra Fijacion

Fijacion permeabilizacion

Celulas hibridadas

Lavado Hibridacin Ribosomas

Sondas de oligonucleotido fluorescentes

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RBOL FILOGENTICO UNIVERSAL

Caracteres fenotpicos con valor filogentico diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya
Bacteria Peptidoglicano Lpidos Operones RNA polimerasa Ribosomas tRNA iniciador Ribosoma sensible a: Toxina diftrica Cloranfenicol Kanamicina Estreptomicina No Sensible Sensible No Sensible No S Enl. ester S Una (4 subun) 70S Formilmetionina Archaea No Enl. eter S Varias (8-12 subun) 70S Metionina Eucarya No Enl. ester No Tres (12-14 subun) 80S Metionina

rbol del ARNr 16S

Termofilia representada en los grupos mas

profundos de Archaea y Bacteria o microaeroflicos

Muchos de los linajes profundos son anerobios Fotosntesis basada en clorofilas: distribuida en

varios linajes de Bacteria

RBOL FILOGENTICO UNIVERSAL

Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama

Caracteres que confirman el rbol universal construido a partir del ARNr 16S
Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoqumicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) Caractersticas de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia Secuencias de otras molculas, especialmente las ligadas a la replicacin, transcripcin y traduccin

Caracteres similares en taxones filogenticamente distantes

Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre s) Fottrofos anoxignicos Representantes de ambos gneros poseen clorosomas con similar funcin y estructura posibles explicaciones: transferencia lateral evolucin independiente el gen del ARNr 16S aportara informacin limitada

rbol del Dominio Bacteria

DOMINIO BACTERIA
Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Mas de 400 gneros Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (,,,,) con 270 gneros Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 gneros

DOMINIO BACTERIA

DOMINIO BACTERIA
Aquifex

Bacterias auttrofas y termfilas

Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)

Algunas fotosntesis anoxignica, autotrofa por va del hidroxipropionato

Deinococci

Altamente resistentes a la radiacin (D. radiodurans)

Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)

Fototrofos anoxignicos, anaerobios estrictos, autotrofa por ciclo reverso del cido ctrico
Planctomycetes

Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproduccin por gemacin, compartimentalizacin celular (membrana nuclear), annamox fisiologa nica, Candidatus
Cyanobacteria

Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosntesis oxignica

DOMINIO BACTERIA
Gram positivos bajo GC G+C < 50% Gneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus Gram positivos alto GC G+C > 50-55% Gneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium

DOMINIO BACTERIA
PROTEOBACTERIAS Alfa: metiltrofas y metantrofas, oligotrofas, littrofas (Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosnteticas Beta: littrofas de NH3 (Nitrosomonas) Delta: Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras

Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium

Ciclo de Myxobacterias

Ejemplos de diversidad: estructura y funcin

Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) Membranas: diferente composicin (Mycobacterium) Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formacin de hifas (Streptomyces) Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) Diferenciacin celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) Comportamiento frente a otras bacterias: predacin (Bdellovibrio) Obtencin de energa independiente del trasporte de electrones (fosforilacin oxidativa o fotosntesis) y la fermentacin, ej.: decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

DOMINIO ARCHAEA
40 gneros 3 linajes separados: Euryarchaeota (halfilos y metanognicos) Crenarchaeota (termfilos) Korarchaeota (solo secuencias ambientales)

Taxones definidos previamente coherentes filogenticamente

Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria ( Proteobacteria)

Caracteres filogenticamente no valiosos para definir taxones superiores:

Termofilia, fototrofa, tipo de movilidad, morfologa compleja (helicoidal, gemacin micelio, apndices)

Por qu hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)?

Son ancestrales

Son ubicuos: ambientes extremos, parsitos o simbiontes de Eukarya Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta an inexplorada

Cmo surge una nueva especie bacteriana?

 Concepto polifsico de especie:

Se define como un grupo de organismos individuales monofiltico y genmicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes

Concepto ecotipo (Cohan, 2004):

Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genmicamente coherente que difiere genticamente de otros subgrupos por adaptacin a condiciones locales ecolgicas.

Futuro cercano: incluir rboles filogenticos derivados de las bases de datos protemicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificacin de las especies.

ORIGEN DE LA VIDA
Origen de la tierra 4600 millones de aos Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S Temperatura > 100C Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfsiles: estromatolitos) Vida primitiva: organismos con ARN? (sin ADN) Clula moderna: ADN ARN Protena

Estromatolitos