IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA

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IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. A continuacin se propone un esquema de trabajo para la identificacin de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioqumico (Biotipo): 1) Obtener un cultivo puro 2) Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. 3) Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4) Realizacin de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad. 5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.) Serotipo A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el nmero o letra del antgeno correspondiente. En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. Tambin se pueden utilizar mtodos de cromatografa gaseosa para identificar productos metablicos, en particular para la identificacin de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: Yersinia entercoltica 4 03 gnero especie biotipo serotipo ENSAYOS BIOQUIMICOS

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La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. Los sistemas comerciales ms comnmente usados son : * BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas bioqumicas. * API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 23 pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana. Otros sistemas: Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. API 10S, versin miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria - Haemophilus) Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras: API 20 C (Para levaduras del gnero Candida)

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Auxacolor de Diagnostics Pasteur Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificacin de levaduras de inters mdico) b) En la Ctedra se desarroll un sistema para la identificacin de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies ms frecuentemente aisladas de muestras clnicas. Est integrado por las siguientes pruebas: produccin de H2S en agar triple azcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, produccin de indol, descarboxilacin de lisina, descarboxilacin de ornitina, crecimiento en citrato, fermentacin de arabinosa, fermentacin de sorbitol y produccin de acetona (VP). En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiracin a) oxidasa b) catalasa 2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros 2.1) Requerimientos de oxgeno OF (xido-fermentacin) Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gas Fermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico) d) Esculina e) Hipurato 3) Fuente nica de carbono a) citrato b) malonato c) hipurato para coliformes 4) Utilizacin de compuestos nitrogenados 4.1) Reduccin de nitrato

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a) asimilacin b) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros a) indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea 5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6) Deteccin de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) 7) Miscelneos a) KCN b) Bilis c) produccin de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibicin a) Temperatura b) NaCl c) Antibiticos

TABLA MODIFICADA DE COWANS & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERTROFAS

tincin gram (cultivo fresco) forma agrupacin crecimiento aerobio crecimiento anaerobio esporas movilidad catalase oxidase fermentacin de glucosa a acido o a acido+gas O/F Micrococcus Staphylococcus

+ coco

+ coco

+ coco

+ coco

bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn bastn coco pares + + + + +o + + + +o + + + +o + + + + + + + O + + + + F + + + + + + F + + + O

racimos racimos cadenas tetradas + + + + + + + + +

+o +o +o-

+ (o )

X X

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Streptococcus Lactococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Aerococcus Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomonas Enterobacterias Aeromonas Chromobacterium Neisseria

X X X X X X X X X X X X X X X X X

Bibliografa: http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html

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