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Manual de biotecnologa

Coordinadoras: Claudia Segal Kischinevzky y Beatriz Rodarte Murgua

Departamento de Biologa Celular Facultad de Ciencias, UNAM

Autores en orden alfabtico: Luisa Alba Lois, Roberto Coria Ortega, dgar Dantn Gonzlez, Mara Isabel de la Cruz Laina, Juan Luis Chvez Pacheco, Mara Eugenia Muiz Daz de Len, ngela Victoria Forero Forero, Anglica Gonzlez Oliver, Alejandra Abigal Gonzlez Valdez, Laura Kawasaki Watanabe, Suri Martnez Yee, Beatriz Rodarte Murgua, Bibiana Rodrguez Ponce, Mara Isabel Saad Villegas, Claudia Andrea Segal Kischinevzky, Alfonso Jos Vilchis Peluyera, Beatriz Ziga Ruiz.

Apoyado por PAPIME PE202707 Hacia una enseanza actual de la Biotecnologa 2011

Manual de biotecnologa
1a edicin, 2011 Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Ciencias ISBN Impreso y hecho en Mxico

Contenido

Prctica 1. Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Resultados Bibliografa Prctica 2. Inteligencia tecnolgica competitiva Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Resultados Bibliografa Prctica 3. Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Resultados Cuestionario Bibliografa Mapas de los plsmidos empleados en la prctica

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Prctica 4. Extraccin de dna e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses 27 Introduccin Objetivo general Material y equipo Metodologa Resultados Agradecimientos Bibliografa Prctica 5. Sesin de bioinformtica Objetivos Metodologa Discusin de resultados Bibliografa Prctica 6. Anlisis de la actividad de catalasas Introduccin Objetivo general Objetivo especfico Material y equipo Metodologa Resultados Agradecimientos Bibliografa Prctica 7. Sntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnolgicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Resultados Agradecimientos Bibliografa 33

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Prctica 8. Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Introduccin Objetivo Material y equipo Metodologa Resultados Bibliografa Prctica 9. Metabolismo secundario Introduccin Objetivos Material y equipo Metodologa Resultados Discusin Bibliografa Prctica 10. Degradacin de compuestos xenobiticos a travs de actividades enzimticas Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Primera parte. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes al petrleo Material y equipo Resultados Segunda parte. Actividad enzimtica Material y equipo Resultados Bibliografa Cultivo de tejidos vegetales. Introduccin Prctica 11. Fitorremediacin con helechos Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Resultados Discusin Bibliografa

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7

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65 67

Prctica 12. Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Parte i. Germinacin de semillas in vitro Parte ii. Induccin de callo embriognico Parte iii. Embriognesis Resultados Anlisis Bibliografa Prctica 13. Organognesis somtica de Nicotiana glauca Introduccin Objetivo general Objetivos especficos Material y equipo Metodologa Parte i. Germinacin de semillas in vitro Parte ii. Cultivo in vitro Parte iii. Induccin de brotes Parte iv. Rizognesis Resultados Anlisis Bibliografa

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Prctica 14. Identificacin de organismos genticamente modificados 85 Introduccin Objetivo Material y equipo Metodologa Mdulo i. Extraccin de dna Mdulo ii. Amplificacin de dna Mdulo iii. Electroforesis en geles de agarosa Resultados Bibliografa Anexo 93

Prctica 1

Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae

Introduccin
El vino El vino es un producto de la fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras a partir del zumo de frutas y otros materiales ricos en azcar. Los factores que determinan la calidad de un vino son el clima, el suelo, la variedad de uva empleada y el proceso de fermentacin. Las levaduras implicadas en la fermentacin del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas levaduras silvestres, que se encuentran presentes en las uvas, y las levaduras de vino cultivadas, como Saccharomyces cerevisiae, que se aaden al mosto para iniciar la fermentacin. Los azcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol), con desprendimiento de CO2 como subproducto. El grado de etanol presente en el vino se encuentra entre 6 y 13 Gay Lussac (gl) y hasta 20 gl en licores. Adems contiene sustancias orgnicas como los cidos tartrico, mlico, succnico, etc., en concentraciones de 4-7 g/L de vino, as como sustancias albuminoides, gomas, sales minerales y agua. Microflora natural de la uva Las uvas estn compuestas por el hollejo (cscara), semillas y pulpa. Sobre la superficie de las uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la superficie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp. En las uvas maduras se encuentran como microflora bacterias lcticas como Leuconostoc oenus, Lactobacillus spp, Pediococus parvulus, entre otras. Otros microorganismos presentes son las bacterias acticas, como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp. Cintica de la fermentacin alcohlica Durante la fermentacin alcohlica del mosto de la uva, las levaduras que participan en el proceso atraviesan tres fases: 1. 2. Multiplicacin. En dos das las cuentas totales (medida directa de la divisin celular) y las viables alcanzan 107 clulas por mililitro. Fermentacin. Las cuentas totales se incrementan todava ms y despus permanecen constantes. Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentracin mxima de las totales, pero muestran una fase estacionaria muy corta debido principalmente a la falta de nutrientes, as como a que el etanol ejerce un efecto txico y a una alteracin de la permeabilidad de la membrana celular.

3.

Fase de declinacin. La concentracin de las levaduras totales no vara mucho, pero las cuentas viables disminuyen rpidamente a 105 clulas/ml, ya que al morir las levaduras se presenta un fenmeno de hidrlisis de la pared celular (autlisis) por su propia lisozima. Gracias a este proceso, el mosto es enriquecido con vitaminas, aminocidos y lpidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lcticas.

La cintica de consumo de los azcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la temperatura del proceso, de que no exista sustrato limitante y de la concentracin de etanol que se genera. Bioqumica de la fermentacin alcohlica La primera parte del metabolismo de los azcares ocurre en presencia o en ausencia de oxgeno, siguiendo las rutas de Embden-Meyerhof-Parnas (gluclisis) o la de Warburg-Dickens (pentosas-fosfato). Ambas vas funcionan simultneamente, pero satisfacen diferentes exigencias: la glucosa difosfato se encarga de la sntesis de energa y la fructosa monofosfato de la creacin de precursores para la sntesis celular y del Nadph necesario.

10 Manual de biotecnologa | prctica 1

Objetivo general

Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnologa de las fermentaciones tradicionales.

Objetivos especficos

Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas tcnicas microbiolgicas. Identificar las rutas metablicas principales asociadas al proceso de fermentacin alcohlica. Determinar el grado alcohlico de las muestras y la concentracin de azcares reductores presentes al inicio y al final de la fermentacin alcohlica. Reconocer en la elaboracin del vino un proceso biotecnolgico de gran impacto en la industria y en constante transformacin

Material y equipo
Parte I
Material * 2 kg de uvas (verdes o rojas) * 1 garrafn de plstico c/tapa de 5 litros * 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml * 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml 1 asa de siembra metlica 1 mechero * 6 gasas grandes * 100 gr de algodn, hilo y tijeras * 1 L cloro comercial
*Material que debern traer los alumnos

Equipo Licuadora Autoclave Incubadora con agitacin Refrigerador Campana de flujo laminar 1 mechero

Parte II
Material Botella con el inculo Botella con el macerado de uvas * 1 frasco Gerber
*Material que debern traer los alumnos

Equipo Refrigerador

Parte III
Material 2 botellas para centrfuga de 500 ml 1 alcoholmetro 1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml 1 jarra para jugo 1 bao de hielo 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 colador de cocina * 1 frasco Gerber * 1 metro de manta de cielo * Garrafn con el fermentado de uvas
*Material que debern traer los alumnos

Equipo Centrfuga de banco Balanza de 2 platos Refrigerador


11 Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae | prctica 1

Parte IV
Material 10 tubos de ensayo de 5 ml 1 gradilla 1 micropipeta de 1,000 l Puntas para micropipeta 1 vaso de precipitados de 50 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 2 celdas para espectrofotmetro 1 piceta 1 cronmetro Reactivos Muestra inicial (tomada en la parte II) Vino centrifugado Glucosa DNS Equipo Vrtex Espectrofotmetro Bao mara Potencimetro

Metodologa
Parte I. Maceracin e inculo del medio de cultivo (preparacin del mosto) 1. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta. 2. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inculo). 3. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1,000 ml, procurando no exceder del nivel de la botella, reservar los matraces obtenidos. 4. Esterilizar ambas botellas en autoclave de 115 a 120 oC por 10 minutos. 5. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 6. En el matraz de inculo, aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces cerevisiae en condiciones de esterilidad. 7. Incubar a 37 oC por tres das u ocho das a temperatura ambiente. 8. Almacenar la botella de 1,000 ml a 4 C hasta su utilizacin. 9. Esterilizar el garrafn, lavndolo con abundante agua y cloro concentrado, dejarlo secar y almacenarlo hasta su utilizacin. Parte II. Inoculacin e incubacin 1. Se depositan en el garrafn de plstico los 250 ml de inculo cultivado y la pasta de uva restante (botella de 1,000 ml), agitando manualmente hasta su homogeneizacin. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizar en la parte IV como muestra inicial (mantener a 4 C, en el frasco Gerber hasta su utilizacin). 2. Incubar a 29 C (los estudiantes se llevan el garrafn a casa, mantenindolo en un sitio fresco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la fermentacin de los azcares hacia la produccin de cido actico. 3. Agitar dos o tres veces al da (oxigenacin) y liberar el CO2 formado girando levemente la tapa del recipiente para permitir la salida del gas. Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del semestre, mientras las partes III y IV se hacen al final para permitir una buena fermentacin. Parte III. Obtencin del producto por centrifugacin 1. Filtrar el producto en una jarra, con manta de cielo y colador, hasta separar los componentes de la uva del lquido. 2. Mantener en fro (bao de hielo) el producto hasta el momento de la centrifugacin. 3. Colocar el producto en botellas para centrfuga y balancearlas. Centrifugar a 8 Krpm durante una hora. 4. Verter el sobrenadante en un matraz de 1,000 ml, limpio y previamente desinfectado con cloro concentrado. 5. Eliminar las clulas del microorganismo que se depositaron en el fondo de la botella (pastilla). 6. Volver a centrifugar todo el sobrenadante una vez ms. Tomar una muestra de 5 mL que se utilizar en la parte IV como muestra final (mantener a 4 C en un frasco Gerber). 7. Determinar la concentracin de alcohol en grados Gl con ayuda de un alcoholmetro. a. Calibrar el alcoholmetro sumergindolo suavemente en agua; esta medida se toma como 0 Gl. b. Sumergir suavemente el alcoholmetro en el vino, tomar la medida que indique la escala.

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Parte IV. Determinacin de la concentracin de azcares reductores. 1. Determinar el pH de las muestras inicial y final (por duplicado). 2. Preparar, para todo el grupo, 30 ml de una solucin de dns al 0.5% y 30 ml de solucin de glucosa estndar (1.5 mg/ml). 3. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sol. de glucosa (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Muestra inicial (ml) 0.5 0.5 Muestra final (ml) 0.5 0.5 DNS (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

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Concentracin de glucosa (mg/ml) 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estndar.

4. 5. 6. 7. 8.

Agitar todos los tubos en vrtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente. Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a bao Mara. Sacar los tubos del bao y agregar 5 ml de agua destilada. Agitar nuevamente en Vrtex. Leer la absorbancia en el espectrofotmetro a 540 nm.

Resultados
1. pH de las muestras inicial y final:
Muestra TI1 TI2 TF1 TF2 pH

2.

Construccin de una curva patrn de glucosa:


Tubo 1 2 3 4 5 6 Absorbancia (nm) Concentracin de glucosa 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

Curva patrn de glucosa

14 Manual de biotecnologa | prctica 1


Absorbancia (nm) Concentracin de glucosa (mg/ml)

3.

Linealizar la curva anterior por regresin lineal y obtener la pendiente (m) y la ordenada al origen (b), de acuerdo a la ecuacin de la recta:

Donde: x es la concentracin de glucosa y es la absorbancia 4.

y = mx + b

Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado).


Muestra TI1 TI2 TF1 TF2 Absorbancia (nm)

5.

Sustituir en la ecuacin de la recta resultante de la regresin lineal, los datos de absorbancia de las muestras.

x=

y- b m

Donde: x es la concentracin de glucosa y la absorbancia m pendiente (obtenida en el paso 3) b ordenada al origen (obtenida en el paso 3)
Tiempo TI1 TI2 TF1 TF2 Absorbancia (nm) Concentracin de glucosa (mg/ml)

6.

Bibliografa Madigan, M.T. J.M. Martinko, y J. Parker (2003) Brock. Biologa de los microorganismos. 10a ed. Prentice Hall, Madrid. Reyes, D.A. H.L. Escalilla, y C.J.R. Verde, (1992) Elaboracin de los vinos de mesa, vol. I, uam Iztapalapa, Mxico.

Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae | prctica 1

Registrar la concentracin de alcohol en el producto (resultado de la determinacin con el alcoholmetro).

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Manual de biotecnologa | prctica 1

Prctica 2

Inteligencia tecnolgica competitiva

Introduccin
El primer paso en cualquier proyecto de investigacin, bsica o aplicada es buscar informacin publicada acerca del tema. Contar con informacin suficiente del rea tecnolgica en la que se pretende incursionar, que incluya tanto fuentes bibliogrficas como patentes publicadas y datos econmicos y comerciales, resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos, tcnicamente factibles y con un alto impacto social y econmico. Esto es importante para los grupos de investigacin de universidades e institutos, pblicos y privados, pero resulta de especial relevancia para las empresas. Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en Mxico y en el entorno mundial que cada vez resulta ms competitivo, obligan a las empresas mexicanas a observar atentamente el entorno tecnolgico en el cual se insertan. La informacin tecnolgica es actualmente condicin indispensable del xito en cualquier proceso relacionado con los sistemas productivos: investigacin, planificacin industrial, desarrollo, fabricacin, comercializacin y gestin. Se sabe que, incluso, existe una fuerte correlacin entre el nivel de desarrollo tecnolgico de los pases y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la informacin y utilizarla libremente. La inteligencia tecnolgica competitiva establece una excelente base para administrar y desarrollar proyectos tecnolgicos, porque permite identificar oportunidades y ventajas competitivas, elegir las tecnologas adecuadas y responder de forma oportuna y acertada a los cambios del entorno. Para acceder a informacin estratgica de un rea tecnolgica es indispensable utilizar fuentes de informacin electrnica, porque cada ao aparecen publicados cientos de miles de artculos cientficos en miles de revistas especializadas. La mayor parte de los artculos publicados son del rea mdica, en segundo lugar estn las publicaciones qumicas, en tercero las de biologa, en cuarto las del rea fsica y despus los artculos relacionados con las ciencias sociales. Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo particular, es importante hacer una bsqueda sistemtica y rigurosa que considere tanto la informacin cientfica, como las patentes y la informacin comercial del sector tecnolgico de inters. En los ltimos aos el proceso de diseo de las nuevas tecnologas ha visto incrementada su complejidad y su dificultad. Se hace as ms necesario en cada momento disponer de un buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnolgico, tanto en la investigacin aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovacin. La informacin de patentes puede ser una herramienta muy eficaz, no slo para el seguimiento, sino para la

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previsin y la planificacin del proceso de desarrollo tecnolgico, as como en la realizacin de investigaciones econmicas, cientficas y tecnolgicas con diferentes propsitos. El monitoreo y el anlisis sistemtico de la informacin permite construir el mapa completo del rea tecnolgica de inters. Se identifica cul es la oferta tecnolgica global y dentro de ella, cules son las tecnologas emergentes, las maduras y las que estn por entrar al mercado; a quin pertenecen esas tecnologas, cul es su tendencia de desarrollo y el posible impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. Con esta informacin es posible determinar cules son las tecnologas estratgicas para el grupo con el fin de disear programas de investigacin y desarrollo, as como localizar socios potenciales para establecer alianzas tecnolgicas en el nivel nacional e internacional; o bien, se puede identificar posibles licenciatarios de tecnologa o tecnologas de libre acceso.

18 Manual de biotecnologa | prctica 2

Objetivo general
Hacer una bsqueda sistemtica de artculos cientficos y de patentes, en torno a un tema de investigacin biotecnolgico, en bases de datos especializadas

Objetivos especficos
Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema. Identificar las bases de datos ms adecuadas para la bsqueda. Encontrar las palabras clave idneas. Aprender a recuperar las listas bibliogrficas y los artculos especficos. Aprender a recuperar patentes de las bases pblicas de Internet.

Material y equipo
Equipo Material (individual) Computadora con acceso a Internet conectada a la * Unidad de memoria usb red unam * Un tema de investigacin biotecnolgico lo suficientemente preciso
*Material que debern traer los alumnos

Metodologa
La prctica se llevar a cabo en un aula de cmputo en dos sesiones de tres horas. En la primera sesin se realizar una bsqueda de fuentes bibliogrficas, en la segunda, se efectuar una bsqueda de patentes. Los alumnos podrn hacer bsquedas individuales o formar equipos de dos integrantes. La informacin obtenida ser utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotecnolgico particular elegido libremente o sugerido por los profesores.

Segunda sesin: bsqueda de patentes 1. Ingresar a la oficina de patentes europea: (http://ep.espacenet.com/quickSearch?locale=en_EP) 2. Se realiza una bsqueda con palabras clave (en ingls) localizadas en ttulo y abstract. 3. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet. 4. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsoft Word.

Resultados
El alumno debe entregar: 1. La historia de la bsqueda. a. Una lista de las bases de datos consultadas. b. Las palabras clave utilizadas y el nmero de referencias obtenidas. c. La estrategia para acotar la informacin. 2. 3. 4. 5. Una lista de las bases de datos ms adecuadas para la bsqueda. Un archivo electrnico con la lista de referencias bibliogrficas y los artculos recuperados. Un documento impreso con la bibliografa de los artculos encontrados. Un archivo electrnico con la informacin bibliogrfica de las patentes recuperadas.

Inteligencia tecnolgica competitiva | prctica 2

Primera sesin: bsqueda de fuentes bibliogrficas 1. La bsqueda bibliogrfica se realiza en la pgina de la Direccin General de Bibliotecas de la UNAM: <http://www.dgbiblio.unam.mx/> 2. En donde dice colecciones, selecciona: Bases de datos. 3. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. La bsqueda en esta seccin se hace en espaol. Dependiendo del tema particular, pueden utilizarse palabras clave como: biologa, biotecnologa o medicina. 4. Aparece una lista de bases de datos, con los temas particulares que cada base incluye y las empresas proveedoras del servicio. 5. Se selecciona un proveedor. 6. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar tiles para la bsqueda 7. Se hace una bsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en ingls. Se anota el nmero de publicaciones encontradas en la base de datos. 8. Se localizan otras bases de datos tiles, se realiza la bsqueda con las mismas palabras clave y se comparan resultados. 9. Se realiza una bsqueda simultnea en las bases de datos que tienen el mayor nmero de citas, utilizando palabras clave en ingls. 10. La bsqueda se acota si es necesario (a los ltimos aos, buscando las palabras clave slo en el ttulo o localizando slo revisiones) hasta obtener un nmero manejable de citas (entre 150 y 200). 11. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes. 12. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad Usb. 13. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliografa consultada y se guarda en la unidad Usb. 14. Se regresa a la pgina de las citas seleccionadas y se obtienen los artculos completos que se encuentran disponibles en formato Pdf. 15. Los artculos completos se guardan en la unidad Usb.

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Bibliografa Cruz, E, P. Escorsa, R. Maspons, G. Izquierdo e I. Ortiz (2003), La deteccin de las tecnologas emergentes: El caso de los biomateriales, Seminario ALTEC 2003 Cdigo ES.03.145. Zhu, D. y A. Porter. (2002) Automated extraction and visualization of information for technological intelligence and forecasting, Technological forecasting & social change 69: 495506. Las patentes como fuente de informacin tecnolgica, Oficina Espaola de Patentes y Marcas, <http://www.oepm.es/internet/inftecn/primera.htm.>

20 Manual de biotecnologa | prctica 2

Prctica 3

Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido

Introduccin
El sistema de doble hbrido en levadura se desarroll con la idea de identificar genes que codifican para protenas que se asocian fsicamente con una protena dada in vivo. En contraste con los mtodos bioqumicos que detectan interacciones protena-protena, el sistema de doble hbrido se basa en un ensayo gentico en donde la interaccin entre dos protenas se mide por la reconstitucin de un activador transcripcional funcional en la levadura. Aun desconociendo especficamente dnde y cmo acta una protena particular, es posible encontrar las protenas con las que interacta y potencialmente utilizar esta informacin para conocer ms sobre la posible funcin de dicha protena. En este sistema se construye una fusin con el dominio de unin a dna proporcionado por el represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plsmido que contiene el marcador selectivo His3 (plsmido carnada). Por otra parte, se construye una fusin con el dominio de activacin de la transcripcin B42 (acid blob) que se expresa en un plsmido que contiene el marcador Trp1. Cuando las protenas fusionadas interactan, se reconstituye el factor transcripcional y se activa la transcripcin ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plsmido) o bien, de LexAoperador-Leu2 (localizado ro arriba del gen cromosmico Leu2 en la cepa EGY48). La mayora de las protenas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble hbrido; sin embargo, antes de intentar buscar posibles protenas que interacten con la protena de inters (carnada), es recomendable establecer si sta es adecuada para el proceso. El sistema del doble hbrido tiene restricciones que impiden que algunas protenas funcionen adecuadamente, por ejemplo, aquellas que tienen dominios transmembranales podran tener dificultades al momento de la translocacin al ncleo, o bien, puede ser que no se genere el plegamiento adecuado de la protena.

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Objetivo general
El alumno aprender a utilizar el sistema de doble hbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae como una herramienta para el anlisis de posibles interacciones entre protenas.

Objetivos especficos
El alumno aprender a transformar a la levadura S. cerevisiae. El alumno podr discriminar si dos protenas interactan o no mediante el ensayo gentico del doble hbrido.

Material y equipo
Material 1 mechero Puntas estriles blancas, azules y amarillas 3 tubos eppendorf estriles de 1.5 ml
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Equipo Vrtex Incubadora a 30C Incubadora a 42C Microcentrfuga Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml Espectrofotmetro Centrfuga Termomixer

Agua destilada, estril * 1 masking tape * 1 encendedor * 1 marcador indeleble * 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo * Cajas petri estriles * Palillos de dientes estriles Hielo Tubos para centrfuga, estriles Reactivos elaborados previamente por el profesor Medio YPD Medio SD + Leu Medio SGal + Leu + XGal Medio SGal + rafinosa Solucin PEG/acetato de litio/TE DMSO
* Material que debern traer los alumnos.

Material biolgico: 150 ml de clulas competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48 150 ml de DNA de esperma de salmn (10 mg/ml) Plsmidos: 1 mg de pEG202+Gpa1 500 ng de pJG4-5+Ste4 500ng de pJG4-5+endoquitinasa 1 mg de pSH18-34 Cepas, plsmidos, soluciones y medios. 1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Mat,trp1, his3, ura3,6, LexAop-Leu2) 2. Los tres plsmidos empleados son multicopia, contienen orgenes de replicacin de E. coli (pBR ori) y de levadura (2m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias.

a.

b.

c.

El plsmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se utiliza para la expresin de las protenas fusionadas a LexA. El sitio mltiple de clonacin se localiza ro arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura es His3 (figura A). El plsmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios nicos EcoRI y XhoI para obtener una fusin con la secuencia de localizacin nuclear de SV40 (NLS), el dominio B42 (activador de la transcripcin) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). El marcador selectivo es Trp1 (figura B). El plsmido pSH18-34 contiene un sitio de unin a LexA seguido del gen reportero lacZ de E. coli. Ura3 es el marcador selectivo para levadura.

Metodologa
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido | prctica 3

Parte I. Protocolo para transformar levadura 1. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo toda la noche a 30C y 250 rpm (profesor). 2. Al da siguiente, inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la noche anterior. Medir la densidad ptica (do) inicial a 600 nm. Incubar a la misma temperatura y rpm. 3. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0.5-0.6 (aproximadamente 1 x 107 clulas/ml). 4. Centrifugar 5 min a 2 500 rpm, eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de agua destilada estril. Resuspender en el vrtex. 5. Volver a centrifugar igual que en 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 1 ml de agua. Resuspender en el vrtex y pasar las clulas a un tubo de 1.5 ml estril. 6. Centrifugar en la microfuga 5 seg a mxima velocidad. 7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (preparado fresco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X) 8. Centrifugar igual que en el paso 6, eliminar el sobrenadante y resuspender las clulas en 300 ml de TE/acetato de litio. 9. En un tubo eppendorf limpio, colocar 50 ml de clulas y agregar 50 mg de dna de esperma de salmn sonicado y hervido. Repetir el proceso con otros dos tubos. Marcar los tubos con nmeros (1, 2 y 3). 10. Preparar los tubos de la siguiente manera: Tubo 1: agregar 500 ng del plsmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng de pSH18-34. Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng de pSH18. Tubo 3: no agregar plsmidos. 11. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado fresco con 1 vol de TE 10X, 1 vol de acetato de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%). 12. Mezclar en el vrtex e incubar 30 min a 30C 13. Agregar 40 ml de DMSO, mezclar en el vrtex 14. Dar un choque de calor a 42C por 15 min. Meter en hielo. 15. Centrifugar durante 5 segundos, eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 100 ml de agua con ayuda del vrtex.

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16. Plaquear las clulas de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30C por dos das. Transcurrido este tiempo, debe observarse el crecimiento de las colonias. Parte II. Ensayo de doble hbrido 1. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transformadas, sembrar 5 o 6 colonias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7.0, en el cual previamente se plaquearon 50 ml de X-Gal. Para sembrar las transformantes se emplean palillos planos estriles, tomando una sola colonia cada vez. 2. Incubar la caja a 30C por 2 das.

Resultados
24 Manual de biotecnologa | prctica 3

1. 2.

Transformacin de levadura: anotar y explicar por qu hubo crecimiento o no en cada una de las tres cajas. Doble hbrido: anotar si las transformantes obtenidas generaron un color azul o no en el medio SGal + X-Gal + leucina. Cmo interpretas los resultados obtenidos?
Crecimiento en medio SD + Leu Coloracin en medio SGal + Leu (pH7) + XGal

Plsmidos utilizados
pEG202 + GpaI pJG4-5 + Ste4 pSH18-34 pEG202 + GpaI pJG4-5 + endoquitinasa pSH18-34 Sin plsmidos

Cuestionario
1. 2. 3. 4. 5. Por qu crees que es importante sembrar las transformantes en un medio que slo contiene leucina? Cules son las diferencias entre un medio selectivo y un medio completo? Qu crees que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transformantes en un medio completo? En qu consiste el ensayo de doble hbrido y para qu sirve? Menciona un ejemplo. Cul es la funcin del gen reportero lacZ? Para qu sirve el compuesto X-Gal? Qu pasara si olvidaras adicionar este compuesto a tus cajas de SGal + Leu?

Bibliografa Adams, A., D.E. Gottschling, C.A. Kaiser y T. Stearns, (1997), Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Fields, S. y O. Song (1989), A novel genetic system to detect protein-protein interactions, Nature 340: 245-246. Fields, S. y R. Sternglanz (1994), The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions, Trends in Genetics 10: 286-292. Guthrie, C. y G.R. Fink (1991), Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, vol. 194. Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Mapas de los plsmidos empleados en la prctica


Figura A. pEG202: plsmido para la fusin a LexA.

25 Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido | prctica 3

Figura B. pJG4-5: plsmido para la fusin al dominio de activacin de la transcripcin.

26 Manual de biotecnologa | prctica 3

Fusion cassette
NLS B42 domain
EcoRI

HA Tag
XhoI

ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT M G A P P K K K P E F G R L E K L

Figura C. Plsmido pSH18-34: plsmido con el gen reportero lacZ.

Prctica 4

Extraccin de dna e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses
Introduccin
En el campo de las ciencias sociales, la antropologa estudia el origen del hombre. Esta disciplina integra los descubrimientos de otras ciencias, como la sociologa, la economa, la historia, la psicologa y la biologa. La antropologa ha sido subdividida en reas especializadas entre las que est la antropologa fsica o biolgica, que estudia la evolucin y biologa de las poblaciones humanas. Tradicionalmente, antes del nacimiento de un beb se tiene la expectativa de cul ser su sexo. La identificacin del gnero es importante en muchos aspectos biolgicos y sociales en la vida de una persona. Por otra parte, uno de los primeros registros que se realiza en excavaciones arqueolgicas es la identificacin del sexo en restos humanos; este dato es fundamental para reconstruir el contexto arqueolgico con la finalidad de entender a) aspectos culturales en las poblaciones antiguas, por ejemplo, la participacin del hombre y la mujer en las sociedades prehistricas, la interpretacin de artefactos y arte prehistricos, la seleccin de vctimas en casos de infanticidio, etc., y b) la historia evolutiva humana relacionada con demografa, relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro, etctera. Distintos mtodos morfolgicos permiten identificar el sexo en restos de esqueletos humanos de adultos. Para este anlisis la pelvis es considerada el hueso ideal, ya que permite identificar el sexo con un ndice de certeza de aproximadamente 95%. Sin embargo, la identificacin mediante anlisis morfomtrico resulta incierta o imprecisa en restos seos de nios y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfismo sexual, o en restos incompletos de adolescentes y adultos. En estos casos el mtodo molecular, basado en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es la herramienta idnea para la identificacin del sexo en los restos seos incompletos. Esta identificacin por anlisis molecular tambin es utilizada con frecuencia en antropologa forense. La amelogenina es una protena del esmalte dental. En los humanos hay dos genes que la codifican, stos se localizan en los cromosomas Y y X y fueron secuenciados en su totalidad en 1991. Existen varias tcnicas de PCR que se basan en la amplificacin de la amelogenina para identificar el sexo, las cuales funcionan adecuadamente en muestras forenses, individuos modernos y restos arqueolgicos. As, recientemente el grupo de investigacin en antropologa molecular del laboratorio de bioqumica de la Facultad de Ciencias de la unam, propuso un mtodo que se basa en la amplificacin del intrn 1 del gen de la amelogenina para identificar el sexo en restos seos humanos. El mtodo utiliza dos primers especficos para las secuencias de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer comn a ambos alelos; el tamao de los productos de amplificacin es diferente en los dos alelos. El sexo masculino se identifica por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y, mientras que el femenino se identifica por su ausencia. Las reacciones de amplificacin por PCR fueron optimizadas
27

y establecidas con dna humano moderno, por lo que este mtodo funciona adecuadamente para analizar dna contemporneo y antiguo. Los productos de PCR son detectados directamente en electroforesis en gel de agarosa y/o poliacrilamida.

Objetivo general
Identificar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnologa con la finalidad de que aprendan tres metodologas bsicas en el rea de la biologa molecular.

Objetivos especficos
28 Manual de biotecnologa | prctica 4

1. 2.

3.

Con el mtodo de extraccin de dna el alumno conocer las caractersticas requeridas para obtener y manipular la muestra biolgica de mucosa bucal y adquirir la capacidad para extraer dna de sta. Con el mtodo de PCR el alumno amplificar las regiones especficas del gen de la amelogenina de los cromosomas X y Y para identificar el sexo en humanos, lo cual le permitir entrenarse en una tcnica ampliamente utilizada en la antropologa molecular y la biologa. Con la tcnica de electroforesis en gel de agarosa el alumno aprender a visualizar el extracto de dna y los productos de amplificacin de PCR. Tambin aprender a cuantificar dna por comparacin con un marcador de tamao molecular. La electroforesis en gel es una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigacin cientfica.

Material y equipo
Material Tubos de 1.5 ml y de PCR de 0.2 ml Hisopos estriles Micropipetas de 0.21ml y de 0.05 - 0.1 ml Equipo Bao a 56C Vrtex Bao a ebullicin Microfuga Cmara de electroforesis

Soluciones 1. PBS 20X 2. 200ml de cloro al 30% 3. Solucin de lisis 4. Primers (200 ng c/u) 5. dNTPs (200 mM) 6. Buffer c/MgCl2 (1X) 7. Agua inyectable 8. Taq DNA polimerasa (1U) 9. GelRed 10. Agarosa 11. TAE 50X 12. Marcador de peso molecular para DNA

Metodologa
La prctica se lleva a cabo en tres mdulos: I) Extraccin de dna de las muestras II) Amplificacin del dna III) Electroforesis en geles de agarosa MDULO I. Extraccin de dna Obtencin de clulas 1. Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodn estril, raspar 30 veces la parte interna de cada mejilla para obtener las clulas. 2. Colocar el hisopo en un tubo de 1.5 ml, aadir 1 ml de buffer PBS, enjuagar el hisopo en el fondo y contra las paredes del tubo. 3. Colocar el hisopo en una solucin de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para descartarlo. Extraccin de dna Transferir las clulas/PBS a tubos de 1.5 ml y centrifugar a 14 000 rpm durante 1 min. Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 L de solucin de lisis. Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta. Incubar a 56C x 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente por 30 segundos. Agitar durante 15 segundos. Calentar en bao a ebullicin por 10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente por 2 minutos. Agitar vigorosamente por 2 minutos. Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 minutos Obtener el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio de 1.5 ml. Guardar en hielo o a 20 0C. Visualizar y cuantificar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE MDULO II. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 1. 2.
Reactivo Agua Amortiguador 10X MgCl2 25 mM dNTPs 1.25 mM BSA 2.5 g/l Primer COM Primer XSP Primer YSP 5 M 5 M 5 M

29 Extraccin de adn e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses | prctica 4

Marcar tubos de pared delgada de 0.2 o 0.5 ml de acuerdo con el termociclador que se utilizar. Poner en cada tubo:
Mezcla de reaccin cbp 2.5 l 2.5 l 2.0 l 0.5 l 1.0 l 0.5 l 0.5 l Concentracin final ajustar a 25 l 1X 2.5 mM 0.1 mM 1.25 g/l 0.2 M 0.1 M 0.1 M

dna 10 - 20ng

1 - 3 l 1U

Taq dna polimerasa

3. 4.

Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera. Colocar los tubos en el termociclador y programar:

Desnaturalizacin inicial: 94C por 5 minutos 40 ciclos

94C por 30 segundos 57 C por 30 segundos 72 C por 1 minuto

30 Manual de biotecnologa | prctica 4

Extensin final: 72 C por 7 minutos Guardar a 4 C MDULO III. Electroforesis en gel de agarosa Preparacin del gel de agarosa 1. a) Para dna genmico (agarosa al 1%): Pesar 0.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 1. b) Para productos de PCR (agarosa al 2.5%): Pesar 0.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto hasta que se disuelva completamente. Evitar que hierva, para lo cual se detendr el horno cada vez que sea necesario. 3. Enfriar la agarosa aproximadamente a 50 C. 4. En una superficie plana nivelada colocar la base acrlica que soportar el gel y colocar el peine para hacer los pozos 5. Vaciar la solucin de agarosa evitando la formacin de burbujas. 6. Dejar el gel solidificando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca. Preparacin de la cmara de electroforesis y las muestras (extracto de dna y los productos de PCR) 1. Colocar el gel dentro de la cmara de electroforesis. 2. Aadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel. 3. Preparar las muestras de la siguiente forma: a) Tomar 5 l de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1l de GelRed para monitorear la movilidad electrofortica y para visualizar en UV. Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin. b) Colocar cuidadosamente ~6 l de muestra en cada pozo utilizando la micropipeta de 10 l. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra del marcador de tamao molecular. c) Conectar la cmara de electroforesis, el cable y la fuente de poder. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cmara, el cable y la fuente de poder.

d) e) f)

Encender la fuente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. Cuando el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Las muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo. Desplazar las muestras tres cuartos del tamao del gel. Apagar la cmara de electroforesis para detener el desplazamiento de las muestras.

Resultados
Visualizacin del dna El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarn con una lmpara de luz UV o sobre un transiluminador. El tamao de los fragmentos amplificados es de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y. Tomar un registro fotogrfico del gel con una cmara digital.

31 Extraccin de adn e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses | prctica 4

Agradecimientos
Se agradece al Dr. Alfonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioqumica de la Facultad de Ciencias por su participacin. Este mtodo fue diseado como parte de un proyecto apoyado por papiit, unam y por el CONACyT.

Bibliografa De la Cruz, I., A. Gonzlez-Oliver, B.M. Kemp, J.A. Romn, D.G. Smith, y A. Torre-Blanco (2008), Sex identification of children sacrificed to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco, Current Anthropology 49: 519-526. Brown, K.A. (2001), Identifying the sex of human remains by ancient DNA analysis, Ancient Biomolecules 3:215-225. Jurmain, R., L. Kilgore, W. Trevathan y H. Nelson (2003), Introduction to physical anthropology, 9 ed., Thomson, Wadsworth, Canada, 522 p.

Prctica 5

Sesin de Bioinformtica Bases de datos y herramientas bioinformticas


Qu es la bioinformtica?
La bioinformtica es el campo cientfico que integra a la biologa, las ciencias computacionales y la tecnologa de la informacin en una disciplina nica. Al inicio de la revolucin genmica la bioinformtica se entendi como la creacin y mantenimiento de bases de datos en las cuales se guardara informacin biolgica tales como secuencias de nucletidos (genes, secuencias reguladoras, etc.) y de aminocidos (protenas). Conforme estas bases de datos fueron creciendo, fue necesario desarrollar nuevas interfases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera, las bases de datos iniciales Pir (Protein Information Resource) y GenBank fueron ampliando sus recursos informticos para incluir programas de bsqueda y comparacin de secuencias de nucletidos y aminocidos, traduccin de secuencias de nucletidos a aminocidos o bsqueda de seales estructurales o funcionales en las secuencias. As, para el resguardo y anlisis de las bases de datos de dna, a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (Ncbi, por sus siglas en ingls), dependiente de los institutos nacionales de salud en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo de Biologa Molecular (Embl) y el Banco de Datos de dna en Japn (DDBJ). Por su parte, las secuencias de protenas fueron depositadas en la base de datos Pir y, ms recientemente, en la base de datos Protein DataBank (Pdb). Como se mencion anteriormente, todas estas bases de datos cuentan con recursos bioinformticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a cabo mltiples anlisis de las secuencias. Con el desarrollo de la Red Internacional internet, todas estas bases de datos han sido puestas a disposicin de todo el pblico de manera gratuita a travs de diferentes pginas Web. Qu es el ncbi? Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de informacin en biologa molecular, el Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (ncbi) crea bases de datos pblicas de dna, conduce investigacin en biologa computacional, desarrolla herramientas de software para anlisis de datos genmicos y disemina informacin biomdica para investigacin bsica y clnica. Adems de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), existen otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biologa Molecular (http://www.ebi.ac.uk/embl), el dna Databank de Japn (ddbj; http://www.ddbj.nig.ac.jp) y Ensembl, que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http:// www.ensembl.org). Todas estas bases de datos cuentan con mltiples recursos bioinformticos para la recuperacin, comparacin y anlisis de secuencias de nucletidos y protenas.
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Objetivos
Presentar al alumno los conceptos bsicos y las herramientas computacionales en el campo de la bioinformtica. Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de bsqueda, recuperacin y anlisis de secuencias de genes y protenas.

Metodologa
1. Recuperacin de secuencias En esta sesin de bioinformtica se acceder a la base de datos del ncbi, se har una bsqueda de una secuencia determinada y se utilizarn algunas de las herramientas computacionales que el ncbi pone a disposicin de la comunidad acadmica mundial. Nota: Las bases de datos no slo incrementan constantemente sus contenidos, sino que tambin vara el diseo de las pginas, sin embargo, siempre ser posible llevar a cabo el ejercicio propuesto, mediante una bsqueda cuidadosa en toda la pgina. Para recuperar una secuencia de un gen o una protena, la nomenclatura aceptada en las bases de datos seala lo siguiente:
Se puede buscar la secuencia del gen o de la protena sealando las tres primeras letras del nombre o identificador en ingls; de esta manera, si se pretende recuperar la secuencia del gen de la insulina teclear Ins, mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh. Si el identificador de la protena cuenta con dos o ms palabras, teclear las iniciales de dichas palabras; as, para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp.

34 Manual de biotecnologa | prctica 4

Nota: Se pueden utilizar indistintamente maysculas y minsculas en la escritura del identificador. Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente direccin: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> y aparecer la pgina de presentacin del sitio:

Como se muestra, la pgina contiene el localizador Search (bsqueda) y una ventana en la que aparecen diversas bases de datos; al seleccionar Nucleotides (nucletidos) se est escogiendo una base de datos especfica y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se desea recuperar; en este caso, el del gen codificante de la protena de choque trmico Hsp10. El programa de bsqueda generar un reporte de todas las entradas que existen en la base de datos en las que aparece el registro Hsp10:
This search in Gene shows 164 results, including: hsp10 (Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock protein Hsp10 HSP10 (Bifidobacterium bifidum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES hsp10 Hsp10hsp10 (Salmo salar): heat shock protein 10

This search in Gene shows 4 results, including: HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin)

Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human se obtendrn muchos descriptores. Explralos y busca en el apartado de regiones genmicas, transcritos y productos, en donde dice GenBank, para obtener la secuencia genmica de nucletidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank:
ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 acccgcgcag gcctcgctcg atcgcgtcat aaaagcctag gcagggccct gggcgagggg cacgtgtcgc agtctgaggc cctgtctgag ttggtggcca ccttttctcc cgagaacccg aatatcttgg tttctggaaa aaagctggtc gggaattaaa gaggtttggt cctgttgata ggacaagcgt gctgaaactg caagcaacag ggaactattt cgcttattaa tttcttaaag cttattttat ggtgtgctag gttccagaac ttccgggagg aaacagctcc tggggcgaat gctagcggcg cagggccgga ggagggagta gcgtacgggg ctcagtgacc cccagggctc ggcgcacgcg gtaaaaatca aacctgaaga tggttgctca cttggaatat gttaactttc atgtgattac ttagaaagtt taaccaaagg tagtcgctgt tttatagtgt gtagagttta ggaaatgact gtgatagttt cgcgctcagc tttccagaaa ggacgaaggg ttttttcttc cgcggtgcgc accgctgggg ctgcgagtct atggtgagtc atccctgacg agcgcccgat tttgcacgcg cagcgtctca tggtgccagg aggaaaacat ccggaggagc tggttagtac aaagccaaaa atttagtttt tcttccactc aggcattatg tggatcgggt gcagtggagg tgtcgttttc aatataaagt cagagtatta cctctccggc atgccgcgct gtagttcttt cgcctccgag gtcggggcga cgagcgcgcc ctttgcggcg ccgcgtggcc cccctctttt ggcaccttgg cgtgtgctgc cctgcttctg cagggagctt ttgaccttgg gacaacgacc attcaaatgc cgtgttgaga tgtttcaaaa tttgaccgag cttccagaaa tctaaaggaa gaaaagaagt aagatcatta tgcttatttt aaaattgtcc cggcttagtc ccctacggct cacctcggct tcttcgcgtc ccgccctccc tgcgcgctgg ctacactaga ccgaggcctg gttgggctgg agcggcaagg cggtgtgtaa cagggccttt gacccagcgt aataaactaa cctaacagac gcttccttaa tgtatagcac catttctctt tattggttga aatctcaagg aggtaaatgg aattctggag actgctttgg atatgaccaa tcaataggcc tagttcccgg caagggtcaa gggcgcctag agcgtcctgc tccctgggag gtgatttttt gcagagtacg caggcccggg gcgggaggga cccgcccgac ggcagggggg gtggatgtgt ttcctgaaaa ggttgacctt gtaaggaatc cgaataagct ggtggcgttg cctacaggca aaggagtgct aaaagtattg gagctgcagt tattaaaagt ttctaatctg tgctatgatg gggtgcggtg

Sesin de Bioinformtica. Bases de datos y herramientas bioinformticas | prctica 5

Por otra parte, si se quiere restringir la bsqueda al gen que codifica a la protena Hsp10 humana, habr que escribir Hsp10 human. De esta manera el programa de bsqueda recuperar la secuencia deseada:

35

36 Manual de biotecnologa | prctica 4

//

1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421

gctctcgcct gttcaagacc gccgggtgtg catttgaacc cagtatgggg gcaatttggt aaagaggctg gaggatcgtt tgagacctcc gggcatttaa tgccctaatc cagtcttgtc actttcttaa tgttagtgta aagattgcac aagatctcag ttctagttgc aagactttgg gaacaaaaca gaaagaagga ggtttatttc gttaactaaa tagtttaagc tctgtaattc atttgagtga gaactagata gttagcgtga ctagatgaca ttgtcttaac ttcttggaaa cccattccac ataataaact tataaacact

gtaatctcag agcctgacca gtggcatgcg ctggaggcgg gacagggcga agcctagtgt tgcgtggtgg tgagctcagg tgtctacaaa gaattgagag ttaaccagtt caatctgcag aacctgatat ttttatgtgt acctctgttt ccaaaataca ttctgaggag ggagtggaca atcacaagag aaatatgacc atatagttga gttagctttt cactgtgtat tagtatgagt ccatgtttca tctttgctaa aagttggaga aggtgtgtaa taatggtttt gtacgtagac tgaagttctg aatgataact tccaaataaa

cactttggga acatggtgaa cctgtaatcc aggttgcaag gattctgtct gatcagtgtt ctcacacctg attcaaaatc ataaataaat gaaacttgga ggtatacctg cctgggacag ttcttttgca ggcccaacac tagatgttcc cagtaaacgc gaaagctcta cttagctgca tatgttctaa atttgtatat taagttatgt ccagaatatt tatttcaaag cgtatcactt ttagttgtag taaacatcct taaagttctt acttaataat tttcacttgc tgaaataagt aaatctttcg aatgacatcc aatatgtaaa

ggccgaggtg accccgtctc cagctactgg gagccgaggt caaaaaaaaa tgccttacat taatccttgc aggagttcaa acaaaagatg ctgttcgttt gttgtatacc ctctgaatgc atttttttta agttcttcca tcagttaatt cgttggggcc ctgaggagct gtccctttcc atccaaaaaa ggcattttct taatatttaa ttcttgaact tgtaactaca agccacgaaa tgatttaaaa tcctttttta ctcccagaat tctaaaaaga aggattattt cactattgaa tcatgtaaat agtgtctcca tgagtggtta

tgcggatcac tactaaagat ggaggctgag tgcaaggcgc aaaaaaaaat tctaaatttt attttgggag aatcagtctg tgcttcaagg aacccctaac taccagagga cgcctaacgc agcttaccag gtgtggccca gtttaggcct aaataatgtt gtcatggagt ccaaatctgt actttaaatt gggtgctggc cagttataaa tttacgttgg gtggtatttt tatattttta gttaactgtt agggtggaga atggaggcac agtcagatat cctatttaga atggcatcaa aatttccata aaattgtttc atcttta

aaggtcagga acaaaaatta gcaggagaat ccctgcattc cccctcaata taataagaca gccaaagcag ggcaacataa taaaatgagg acattgaaat acaggttggt aaatccctaa ctactgctaa gggaagccaa cgggcttcta aactgcattg taggaatagg tctttggagg tttgtatgtt tactgttgca gttagcttta agtcaggttt tgagtgaaga atataattgg tatgttgggt gattcaacca caaagtagtt ttgcaattag gatggtgaca catgatgctg tttctctttt cttgtactga

Como se puede observar, la secuencia contiene una numeracin que facilita la bsqueda de una subsecuencia particular. De igual forma se puede recuperar, dando clic en transcript, la secuencia del rna mensajero del gen, y en este caso, la secuencia NM_002157.2 recuperada solamente muestra los exones que conforman el rna mensajero maduro:
/gene=HSPE1 ORIGIN HSPE1/RNAm 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 acccgcgcag gcctcgctcg atcgcgtcat aaaagcctag gcagggccct gggcgagggg cacgtgtcgc agtctgaggc accgagtatt cagaaaaatc aaggaaaggg cagaatatgg gtgacattct atgctgccca ggtgtgctag gttccagaac ttccgggagg aaacagctcc tggggcgaat gctagcggcg cagggccgga ggagggagta ggttgaaagg tcaaggaaaa tggagagatt aggcaccaaa tggaaagtac ttccactgaa cgcgctcagc tttccagaaa ggacgaaggg ttttttcttc cgcggtgcgc accgctgggg ctgcgagtct atggcaggac agtgctgctg gtattgcaag caaccagtta gtagttctag gtagactgaa gttctgaaat cctctccggc atgccgcgct gtagttcttt cgcctccgag gtcggggcga cgagcgcgcc ctttgcggcg aagcgtttag aaactgtaac caacagtagt gcgtgaaagt atgacaagga ataagtcact ctttcgtcat cggcttagtc ccctacggct cacctcggct tcttcgcgtc ccgccctccc tgcgcgctgg ctacactaga aaagtttctt caaaggaggc cgctgttgga tggagataaa ttatttccta attgaaatgg gtaaataatt tagttcccgg caagggtcaa gggcgcctag agcgtcctgc tccctgggag gtgatttttt gcagagtacg ccactctttg attatgcttc tcgggttcta gttcttctcc tttagagatg catcaacatg tccatatttc

//

841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg 901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa 961 aaaaa

En esta pgina se selecciona nucleotide blast para realizar la bsqueda con una secuencia de nucletidos. Aparecer una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anteriormente. Ms abajo, en seleccin de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar sequences [blast n]) para permitir una bsqueda amplia. Entre los parmetros opcionales ms importantes del algoritmo figuran: Expect threshold: Nmero de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de Expect con elevada significacin estadstica: 0.000001 = (1 x 10-6)). Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias relacionadas.

Sesin de Bioinformtica. Bases de datos y herramientas bioinformticas | prctica 5

Con la secuencia del gen, ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de rna mensajero, se iniciar una bsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia de inserciones o deleciones de nucletidos a lo largo de la evolucin de ambas secuencias a partir de un ancestro comn. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparacin de secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Bsica de Bsqueda por Alineamiento Local). Este algoritmo est basado en la comparacin de similitudes de nucletidos o aminocidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de bsqueda (query) y cada una de las secuencias de la base de datos; para protenas, la longitud de las secuencias comparadas es de tres aminocidos y para nucletidos la longitud mnima es de 11. Cuando el algoritmo encuentra regiones idnticas o similares, ampla la bsqueda en regiones contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucletidos o aminocidos entre las secuencias. Al seleccionar en la pgina de entrada la opcin blast, aparecer una ventana con la siguiente informacin:

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Filter: Elimina secuencias con baja complejidad composicional, por ejemplo: AAAAAAAAAA.., TATATATATAT., AGAGAGAGAG. Pulsar la tecla Blast, con lo cual el programa buscar en la bases de datos las secuencias que muestren identidad total o parcial, segn se mencion antes. El resultado de la bsqueda aparecer en el siguiente formato:

38 Manual de biotecnologa | prctica 4

Las barras horizontales indican las secuencias con mayor ndice de similitud con la secuencia de bsqueda, expresado esto como el valor de Score (puntuacin), que va en decremento desde la lnea superior a la inferior en funcin de los valores de puntuacin sealados: < 40 hasta > 200. Al colocar el cursor sobre una lnea determinada aparecer en la pantalla la secuencia correspondiente. Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas, se selecciona en la ventana previa slo la base de datos de humano, se puede obtener una visin cromosmica de las ubicaciones de las secuencias obtenidas con la opcin Human genome view y el programa desplegar una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma, tal como se observa en la siguiente ventana:

Chromosome view hsp10 human

39 Sesin de Bioinformtica. Bases de datos y herramientas bioinformticas | prctica 5

2. Comparacin de secuencias La base de datos del ncbi tambin da la opcin de llevar a cabo bsquedas de secuencias relacionadas con la de inters en muy diversos genomas totalmente secuenciados, tanto procariontes como eucariontes, lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir relaciones filogenticas entre diversos organismos. Un ejemplo de lo anterior lo representa la recuperacin de la secuencia homloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chimpanc; en la pantalla siguiente se muestra el formato de la ventana configurada en la opcin Blast (Blast Home), listando una pequea muestra de los genomas secuenciados hasta la fecha con la opcin Blast Assembled RefSeq Genomes:
BLAST Assembled Genomes Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases Human Mouse Rat Arabidopsis thaliana Oryza sativa Bos taurus Danio rerio Drosophila melanogaster Gallus gallus Pan troglodytes Microbes Apis mellifera

Tambin con la opcin list all Genomic Blast databases se tendr acceso a las bases de datos de todos los genomas secuenciados hasta la fecha. Si se selecciona el genoma del chimpanc (Pan troglodytes) para buscar en l la secuencia del gen de inters, -Hsp10-, y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia

de Hsp10 en el cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opcin Begin Search (comenzar la bsqueda), el programa dar por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia del gen de Hsp10 humano y las secuencias homlogas de Hsp10 en el genoma del chimpanc. La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro:

40 Manual de biotecnologa | prctica 4

Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos secuencias en este caso de 93%, el valor de Expect, probabilidad de alineamientos al azar entre dos secuencias no relacionadas, que en este caso es del orden de 1 x 10-6 y en donde no hay lnea, las sustituciones que han ocurrido en estas protenas desde el tiempo de divergencia entre las dos especies. Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminocidos, un recurso bioinformtico muy til es UniProt, el cual es una base de datos combinada de tres depositorios internacionales de secuencias de protenas, PIR, SwissProt y TrEMBL; el sitio Web es <http://www. uniprot.org/>. Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la casilla de bsqueda (QUERY), se obtendr el siguiente resultado:

41 Sesin de Bioinformtica. Bases de datos y herramientas bioinformticas | prctica 5

La primera entrada corresponde a la protena de humano. Al dar un clic en esa entrada se obtiene toda la informacin disponible sobre dicha proteina, incluyendo la secuencia de aminocidos:

Esta secuencia corresponde a la de 102 aminocidos de Hsp10; una vez recuperada, la secuencia se copia en formato FASTA y se lleva a cabo una nueva bsqueda de su secuencia homloga en diversos organismos, de manera similar a como se realiz con la secuencia del gen. La base de datos de UniProt tambin cuenta con el recurso bioinformtico del blast, as que se puede conducir una bsqueda entre secuencias de protenas utilizando el algoritmo blast. El programa realiza bsquedas de similitud entre protenas de todos los organismos que estn en las bases de datos. En el siguiente ejemplo, la bsqueda mediante blast produjo los alineamientos entre las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de diversas especies, saliendo primero los de mamfero; se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de Hsp10 humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo, Q6WSP6:

42 Manual de biotecnologa | prctica 4

En este ejemplo, el programa blast recuper y aline las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de cerdo (Sus scrofa) que muestran una identidad de 100%.

Discusin de resultados
Puntos a discutir: a) b) c) d) Explicar cul es el mtodo de bsqueda del algoritmo blast. Analizar, desde el punto de vista estadstico, por qu se deben filtrar las secuencias de baja complejidad. Sealar cul es el significado estadstico del valor de Expect en el programa bioinformtico Blast. Discutir el impacto de la bioinformtica en la biologa.

Los alumnos presentarn un informe sobre el desarrollo de la sesin que incluya la discusin de los incisos a), b), c), y d).

Bibliografa Burks, C., et al. (1990), GenBanK: Current status and future directions, Methods in enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Collado, J. y A. Medrano (2003), La biologa computacional antes, durante y despus de los genomas, Fronteras de la biologa en los inicios del siglo Xxi. Mdulo 1: Genmica, protemica y bioinformtica. Bolvar F. (coord.), El Colegio Nacional, Mxico. Collins, J. y A. Coulson (1990), Significance of protein sequence similaritie, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Proteinand Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Dolittle, R. (1990), Searching through sequence databases, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Mount, D. (2004), Bioinformatics. Sequence and genome anlisis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, N.Y.

Prctica 6

Anlisis de la actividad de catalasas

Introduccin
El oxgeno es una molcula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a diversos agentes qumicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxgeno (Ros, por sus siglas en ingls). Estas formas de oxgeno son altamente dainas para los componentes celulares, incluyendo a los cidos nucleicos, los lpidos y las protenas. Adems de estas molculas muy reactivas, tanto el perxido de hidrgeno (H2O2) como el anin superxido (O2-), son incluidos tambin como ros, ya que llevan a la produccin de ms especies reactivas, particularmente en presencia de iones metlicos. Las Ros se pueden generar endgenamente en las clulas como consecuencia de los procesos metablicos. Tambin se forman por la exposicin de las clulas a agentes ionizantes, radiacin y recicladores redox presentes en el medio y por la exposicin a metales pesados. As, todos los organismos aerbicos estn expuestos continuamente al ataque de agentes oxidantes a travs de estos mecanismos. El estrs oxidativo ocurre cuando la concentracin de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad amortiguadora antioxidante de la clula. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares contra estos oxidantes altamente reactivos. Para defenderse contra estas especies reactivas de oxgeno las clulas contienen enzimas antioxidantes, como la superxido dismutasa, las catalasas y varias peroxidasas, adems de que tambin producen molculas antioxidantes como el ascorbato, el tocoferol y el glutatin. Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxificacin de los metabolitos de oxgeno generados en los diversos procesos celulares: 2 H2O2 O2 + 2 H2O

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La ingeniera gentica es la tcnica que se utiliza con el fin de cambiar alguna o algunas caractersticas del cdigo gentico. Estos cambios pueden consistir en retirar, modificar o agregar genes al dna de un organismo. Al modificar esta informacin, la ingeniera gentica cambia el tipo o cantidad de protenas que puede producir un organismo, con lo cual hace posible que ste elabore sustancias nuevas o desempee funciones distintas. En esta prctica se utilizarn dos cepas que han sido genticamente manipuladas y su cepa parental, con el fin de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes puedan apreciar la diferencia en la expresin gentica entre una cepa silvestre y cepas genticamente alteradas, adems de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y limitaciones de la manipulacin gentica.

Objetivo general
Identificar cmo a travs de la ingeniera gentica se puede alterar la expresin gentica de los organismos.

Objetivo especfico
Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberacin de oxgeno.

44 Manual de biotecnologa | prctica 6

Material y equipo
Material Crculos de 3 cm de dimetro de papel filtro 2 vasos de precipitados de 250 ml 1 pipeta de 5 ml 1 pipeta de 10 ml 1 probeta de 1 00 ml 1 probeta de 1,000 ml 2 tubos de cultivo de vidrio estriles Tubos eppendorf de 1.5 ml Tubos para centrfuga Bao de hielo Pinza para papel filtro Equipo Vrtex Perlas de vidrio para romper Centrfuga Incubadora con agitacin Cronmetro Cmara de video Reactivos
a a a

Triptona Extracto de levadura NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 NaOH Ampicilina(50 mg/ml)

Agua destilada
a a a a a

Hielo * Perxido de hidrgeno (agua oxigenada, H2O2)


* Material que debern traer los alumnos a Reactivos para preparar medios de cultivo. La elaboracin de los medios de cultivo est en el anexo.

Material biolgico: cepas de Rhizobium etli CFN42, cepa silvestre, contiene cromosoma y 6 plsmidos CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del plsmido p42f complementada para actividad de catalasa ++) CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del psmido p42f, catalasa )

Metodologa
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Inocular las tres cepas (silvestre, catalasa- y catalasa+) cada una por separado en tubos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. Incubar a 37 0C con agitacin constante (250 rpm) durante 12 hrs. Centrifugar los cultivos tres minutos a 13,000 g. Resuspender las pastillas en 200 l de PBS, aadir perlas de vidrio cubriendo hasta del lquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vrtex. Centrifugar a 13,000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo. En este momento preparar 400 ml de una solucin al 1% de H202 en agua destilada y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio. Empapar los crculos de papel filtro con el sobrenadante de cada cepa, tener cuidado de marcar antes con lpiz cada uno de los crculos. Tener lista la cmara y el cronmetro. Cada uno de los crculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan en la solucin de H2O2 depositndolos hasta al fondo del vaso. Se observa durante cinco minutos.

45 Anlisis de la actividad de Catalasas | prctica 6

Resultados
1. 2. 3. 4. 5. De acuerdo con los resultados, discutir los siguientes puntos: En qu vaso se formaron ms burbujas? En cul vaso no se formaron? Por qu? Por qu se forman estas burbujas? Las burbujas se generaran de la misma forma con otro reactivo? Qu aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa?

Agradecimientos
Se agradece al Dr. Alejandro Garca de los Santos del Centro de Ciencias Genmicas por permitirnos utilizar sus cepas.

Bibliografa Daz, A. (2003), La estructura de las catalasas, REB 22 (2): 76-84. Luque, J. y A. Herrez (2001), Biologa molecular e ingeniera gentica, Harcourt.

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Manual de biotecnologa | prctica 7

Prctica 7

Sntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnolgicas


Introduccin
La celulosa es el polmero de mayor abundancia natural, conformado por una larga cadena lineal de molculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace 14, ver figura).
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Estructura lineal de la celulosa.

Diversas especies dentro de los gneros Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de sntesis. Al estudiar la fermentacin de vinagre se observ que se formaba una masa gelatinosa sobre la superficie del medio de cultivo a la que se denomin madre del vinagre. Anlisis posteriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium aceti era el organismo responsable de su produccin. Posteriormente, la bacteria fue referida como Acetobacterium xylinum Bacterium xylinodes; el nombre deriv a Acetobacter xylinum y finalmente la denominacin actual de esta bacteria es Gluconacetobacter xylinum. G. xylinum es un miembro de la familia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negativa con forma de bacilo cuyo tamao vara entre 0.6 0.8 m x 1.0 1.4 m. Es un microorganismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en forma incompleta azcares y alcoholes fermentacin oxignica. Su hbitat natural son frutas y vegetales en proceso de descomposicin. En cultivo esttico, la bacteria secreta microfibrillas de celulosa, las cuales en el exterior se ensamblan formando una nata gruesa o pelcula. Se ha propuesto que la celulosa permite a las clulas alcanzar la superficie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de O2 para su crecimiento.

48 Manual de biotecnologa | prctica 7

La pelcula de celulosa posee funciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su capacidad para colonizar sustratos, evita la desecacin y protege a la bacteria contra la radiacin ultravioleta. La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en condiciones de cultivo esttico se genera una pelcula en la interfase aire/lquido mientras que en cultivo agitado se forman grnulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de celulosa. El mecanismo de sntesis de celulosa bacteriana le confiere una pureza superior a la de la celulosa vegetal y posee caractersticas peculiares: alto grado de cristalizacin, alta resistencia a la presin, elasticidad y durabilidad, elevada absorcin de agua y mayor rea superficial que la que presenta la celulosa vegetal. Adems, es inerte metablicamente, no es txica ni provoca reaccin alrgica al contacto, propiedades de particular importancia para fines biomdicos y cosmticos. G. xylinum no lleva a cabo gluclisis (carece de la enzima fosfofructocinasa-1), pero en cambio a partir de triosas fosfato realiza gluconeognesis; la ruta de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs son las vas anfiblicas ms activas en la bacteria. Mediante estas vas se produce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas fosfato (glucosa, fructosa, manosa) como por sntesis a travs de la va gluconeognica. La sntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energa y fuente de carbono; sin embargo, la pelcula permite a G. xylinum situarse cerca de la superficie del medio y obtener as un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al oxgeno, indispensable para la sntesis de Atp. Aplicaciones biotecnolgicas La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades nicas que no estn presentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningn otro material comn en la celulosa de otras fuentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de hidrofilicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta fuerza tensil y resistencia a la presin; es inerte metablicamente y no tiene propiedades alergnicas; estas ltimas caractersticas le permiten una variedad de aplicaciones en la industria cosmtica, farmacutica y biomdica (ver cuadro).
Industria Turstica Textil Papel Alimentos Refinera Maquiladora Tecnologa Investigacin Mdica Aplicaciones Ropa deportiva, equipo para acampar. Material de alta absorcin acuosa. Restauracin de documentos, papel de alta calidad. Aditivo de alimentos, emulsificante, fibra diettica. Material para la absorcin de aceites. Componente de partes y refacciones para autos, aviones, etc. Diafragmas de alta sensibilidad en micrfonos y audfonos. Inmovilizacin de protenas y clulas, resinas para cromatografa. Fabricacin de piel artificial en terapia de quemaduras. Componente en implantes dentales.

Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano.

Objetivo general
Que el alumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza.

Objetivos especficos
Demostrar las aplicaciones biotecnolgicas industriales de los productos del metabolismo bacteriano. Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la produccin de la celulosa bacteriana vs la celulosa vegetal.

Material 200 ml de medio BEGG 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Pipeta serolgica de 5 ml * Caja Petri (estril) Pinza (estril) * Recipiente para colocar la pelcula de celulosa en NaOH 1 bistur (con navaja estril) 50 ml de NaOH 0.5 M * Algodn y gasas para elaborar un tapn
*Material que debern traer los alumnos.

Equipo Potencimetro Balanza analtica Horno (opcional) Campana de flujo laminar Papel aluminio

Metodologa
Inocular G. xylinum cultivada por el profesor durante una semana anterior a la fecha de la prctica a una temperatura ~ 30C. Para inocular se utilizar un fragmento de la pelcula de celulosa formada en el cultivo esttico, ya que G. xylinum crece en la matriz de la pelcula de celulosa en estas condiciones. Para hacer ms fcil la inoculacin de G. xylinum, se sugiere que en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar o cerca del mechero) se coloque, con la ayuda de unas pinzas, la pelcula de celulosa formada en una caja de Petri vaca y una sola persona corte cinco fragmentos con el bistur; cada equipo inocular su respectivo matraz con un fragmento de celulosa. Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es importante no mover estos matraces para evitar que la pelcula de celulosa se hunda).

Sntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnolgicas | prctica 7

Material y equipo

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Resultados
Transcurrido el tiempo, se obtiene la pelcula de celulosa. Determinar el peso hmedo y el pH final del medio de cultivo. La pelcula de celulosa se coloca en NaOH O.5 M por 30 min. a 100 C, con el fin de blanquearla; posteriormente, se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente para determinar su peso seco. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a temperatura ambiente por varios das. El alumno reportar el rendimiento de celulosa tanto en peso hmedo como seco. Tambin debe reportar, con base en este rendimiento, cul es el porcentaje de humedad que retiene la pelcula de celulosa.

50 Manual de biotecnologa | prctica 7

Agradecimientos
Se agradece al Dr. Jos Edgardo Escamilla Marvn, investigador del Instituto de Fisiologa Celular de la unam por la donacin de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693.

Bibliografa Brown, A.J. (1886), On acetic ferment which forms cellulose J. Chem. Soc. 49: 432-439. Englehardt, J. (1995), Sources, industrial derivatives, and commercial applications of cellulose, Carbohydr. Eur, 12: 514. Ross, P., R. Mayer y M. Benziman (1991), Cellulose biosynthesis and function in bacteria, Microbiol 55: 35-58. Yamanaka, S. y K. Watanabe (1994), Applications of bacterial cellulose in cellulosic polymers, Chapter 11, Gilbert, R. (ed.), Hanser Publishers Inc, Cincinnati, OH. Yamanaka, S. y K. Watanabe, N. Kitamura y M. Iguchi (1989), The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose, J. Mater. Sci. 24: 3141-3145.

Prctica 8

Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses
Introduccin
Los ramnolpidos son molculas tensoactivas que actan como biosurfactantes. La funcin principal de los biosurfactantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmiscibles en agua a travs de la reduccin de la tensin superficial. Los ramnolpidos estn formados por una molcula hidrofbica que generalmente es un dmero de cido -hidroxidecanoico y una parte hidroflica constituida por una (monorramnolpido) o dos (dirramnolpido), molculas de ramnosa. En particular, los ramnolpidos producidos por P. aeruginosa han sido estudiados para su aplicacin en distintas reas, que incluyen la detoxificacin de suelos contaminados con petrleo, la eliminacin de metales txicos de suelos, recuperacin terciaria de petrleo, proteccin contra plagas, as como en la industria cosmtica y farmacutica. Son tambin una fuente importante de L-ramnosa, que es usada en qumica fina y como materia prima para la sntesis de compuestos orgnicos. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede proliferar en diversos hbitats, incluyendo agua, suelo y plantas. Esta bacteria secreta numerosos compuestos que se encuentran involucrados en el xito de colonizar diferentes ambientes. Dentro del gnero Pseudomonas, solo P. fluorescens (viscocina) y P. aeruginosa tienen la capacidad de producir biosurfactantes llamados ramnolpidos. Los factores de virulencia son expresados de una manera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora de qurum (Qs). Aunque la funcin fisiolgica de los ramnolpidos en P. aeruginosa no ha sido completamente establecida, se les ha considerado como factores de virulencia y antimicrobianos y se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregacin de las biopelculas, as como en la movilidad tipo swarming de esta bacteria. La sntesis de ramnolpidos se lleva a cabo por la ramnosiltranferasa I (Rt 1), codificada por el opern rhlAB; rhlA produce el dmero de cidos grasos (HAAs), el papel de RhlB es el de transferir una molcula de dTDP-L-ramnosaal dmero de HAAs. La ramnosiltranferasa II (Rt 2), toma una segunda molcula de dTDP-L-ramnosa. La produccin de ramnolpidos por P. aeruginosa depende de factores nutricionales y medioambientales, como la limitacin de nitrgeno, el pH, y la temperatura. La biosntesis de ramnolpidos ocurre durante la fase exponencial tarda y la fase estacionaria de crecimiento, bajo condiciones de limitacin de nitrgeno o de fosfatos.
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Objetivo
Evaluar la emulsificacin del diesel y del aceite de maz por las cepas Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcenses y Escherichia coli.

Material y equipo
Material 4 matraces Erlenmeyer de 125 ml Tubos para centrfuga 1 gradilla 12 tubos con tapa de 15 ml
52 Manual de biotecnologa | prctica 8

Equipo Incubadora a 30 C Incubadora a 37 C Centrfuga Vrtex Reactivos Medio PPGAS Medio PG Tritn X-100 *10 ml de gasolina *10 ml de diesel *10 ml de aceite de maz

Pipetas de 10 ml * Papel peridico * Regla

*Material que debern traer los alumnos

Metodologa
Obtencin de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. 1. Inocular, en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS, una colonia fresca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio inocular una colonia de Escherichia coli, e incubar ambos matraces a 37 C con agitacin de 200 rpm durante 24 horas. Al mismo tiempo, inocular en otro matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PG, una colonia fresca de la cepa Serratia marcenses, e incubar a 30 C con agitacin de 200 rpm durante 24 horas. 2. Transferir los cultivos crecidos a tubos para centrfuga. Centrifugar a 4 000 rpm por diez minutos y guardar el sobrenadante (fuente de biosurfactantes) a 4 C. 3. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos. Prueba de emulsificacin. 1. Cubrir la mesa de trabajo con papel peridico antes de comenzar. 2. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye, 3 ml de gasolina a c/u de los otros tres tubos, 3 ml de aceite de maz a c/u de los tres tubos y a un ltimo se le colocan 3 ml de tritn, que ser utilizado como blanco de reaccin. Los tubos deben etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. aeruginosa Diesel, y as los dems tubos), PaG, PaA, PaT, SmD, SmG, SmA, SmT, EcD, EcG,EcA y EcT. Agregar 2 ml del sobrenadante de cada cepa a evaluar; los que estn marcados con Pa corresponden al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa, mientras que los que llevan las letras Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con

las letras Ec corresponden al sobrenadante de Escherichia coli, de acuerdo con la siguiente tabla:
Diesel PaD PaG PaA PaT SmD SmG SmA SmT EcD EcG EcA EcT 3 ml 3 ml 3 ml Gasolina 3 ml 3 ml 3 ml Aceite de maz 3 ml 3 ml 3 ml Tritn 3 ml 3 ml 3 ml Sobrenadante P. aeruginosa 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml Sobrenadante S.marcenses 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml Sobrenadante E.coli 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
53 Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses | prctica 8

3.

Agitar en el vrtex cada tubo a velocidad mxima durante dos minutos y dejar reposar 30 minutos, hasta que se forme una nata blanca que es el indicador de emulsificacin.

Resultados
Cada equipo deber determinar los mililitros de nata que se forman en cada tubo y obtener el porcentaje de emulsificacin, con base en la siguiente apreciacin: si la nata blanca que se forma es de 5 ml y existe una sola fase, el porcentaje de emulsificacin es del 100%; en caso de que la nata formada sea de menor volumen y coexistan dos fases se deber hacer una relacin con una regla de proporciones. Anotar el porcentaje (%) de emulsificacin en la siguiente tabla:
Diesel P. aeruginosa S. marcenses E. coli Gasolina Aceite de maz Tritn X-100

En el pizarrn se anotarn los resultados de todos los equipos y con stos se obtendr el promedio y la desviacin estndar de cada muestra.

Bibliografa De Kievit, T.R., R. Gillis, S. Marx, C. Brown y B.H. Iglewski (2001), Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and their expression patterns, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1865-1873. Maier, R.M. y G. Sobern-Chvez (2000), Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633. Medina, G., K. Jurez, B. Valderrama y G. Sobern-Chvez (2003), Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter, J. Bacteriol 185: 59765983. Medina, G., K. Jurez y G. Sobern-Chvez (2003), The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of its activator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone, J. Bacteriol. 185: 377-380. Sobern-Chvez, G., F. Lpine y E. Dziel (2005), Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:718-725.

54 Manual de biotecnologa | prctica 8

Prctica 9

Metabolismo secundario

Introduccin
A medida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos, cidos carboxlicos, a travs de las mismas o similares vas de biosntesis, de manera paralela, se originan tambin otro tipo de compuestos que de acuerdo con sus caractersticas particulares y especficas se denominan compuestos o metabolitos secundarios. Las vas estn interrelacionadas con el metabolismo primario; ste provee un cierto nmero de pequeas molculas que son empleadas como precursores de todas las vas metablicas secundarias importantes. Existen tres precursores principales: 1. El cido shikmico, precursor de muchos compuestos aromticos, incluyendo los aminocidos aromticos, los cidos cinmicos y ciertos polifenoles. 2. Los aminocidos que dan origen a los alcaloides y a los antibiticos peptdicos incluyendo las penicilinas y las cefalosporinas. 3. El acetato, precursor de los poliacetilenos, las prostaglandinas, antibiticos macrocclicos, polifenoles e isoprenoides.

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Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuentran los alcaloides, terpenos, glucsidos, flavonoides, fenoles, etc., por mencionar los principales y ms comunes. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal; por su abundancia o ausencia, proporcionan a la planta caractersticas qumicas tiles para su sobrevivencia, su clasificacin botnica y su aprovechamiento por parte del hombre, y como principios activos que pueden presentar alguna actividad biolgica para un gran nmero de organismos, an de diferentes reinos. Las pruebas especficas para la determinacin de grupos de metabolitos secundarios se llevan a cabo con un extracto de planta y a travs de las tcnicas colorimtricas y de precipitacin reportadas por Domnguez. Se identifica cualitativamente la presencia o ausencia de cada uno de los grupos segn el cambio de coloracin o la precipitacin: Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff. Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. Glucsidos: se determinan mediante la prueba de Mlish.

Objetivos
Que el alumno determine, a travs de pruebas qumicas preliminares la presencia de grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexnico de hoja de planta. Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli.

Material y equipo
Parte I
Material * 2 frascos Gerber
56 Manual de biotecnologa | prctica 9

Equipo * Alcohol de curacin (para elaborar el extracto) Vrtex Propipeta Cloroformo cido clorhdrico Draguendorff cido sulfrico Metanol Mlish Liebermann-Burchard Viruta de Mg

3 goteros 1 esptula 1 vaso de precipitados de 500 ml 4 pipetas serolgicas de 5 ml 5 tubos de ensaye Esptula 1 vaso de precipitados de 500 ml para el bao de agua hielo

Material biolgico *a Extracto de planta


*Material que debern traer los alumnos

Parte II
Material * 3 cajas de Petri Perlas estriles para espatular Sensi-discos o papel filtro (1 cm dimetro) Pinzas * Regla o Vernier Equipo Mechero Campana de flujo laminar Incubadora a 37 oC Reactivos Agar nutritivo Violeta de genciana Hexano Material biolgico Cepa de Escherichia coli GM2163, cultivada en LB entre 8-24 horas previo a la prctica *a Extracto de planta

Preparacin del extracto: Una semana antes de llevar a cabo la prctica, colocar clavo entero (especia), hasta aproximadamente de volumen de un frasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del frasco con etanol al 70%; tapar y dejar macerar. El da anterior a que se lleve a cabo la prctica, tomar ~ 10 ml del extracto lquido y transferir a otro frasco Gerber limpio. Dejar destapado para evaporar el etanol. Una vez reducido el volumen, tapar y llevar ambos frascos a la clase.
a

Metodologa
Esta prctica se lleva a cabo en dos partes, en la primera se determinarn los grupos de metabolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinar la actividad biolgica del extracto mediante un ensayo biolgico con bacterias.
57

Parte I. Determinacin de los grupos de metabolitos secundarios 1. Se prepara una solucin madre del extracto y se toma 1 ml colocndolo en un tubo de ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye). 2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo: Tubo 1. Control. Slo se agrega 1ml del extracto. Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado, se agita un minuto y se deja reposar, si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. A la fase inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera positiva la prueba si se observa un cambio de coloracin al azul-verdoso o rojo-naranja. Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le aade una gota de cido clorhdrico concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. La prueba se considera positiva si se observa un precipitado de color naranja-marrn. Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (24 mm) y dos gotas de cido clorhdrico concentrado, si se observa un cambio de coloracin hacia el verde o naranja la prueba se considerar positiva. Tubo 5. Glucsidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; despus, se le agregan dos gotas de Mlish. Se coloca el tubo en un bao aguahielo y se aade 1 ml de H2SO4 concentrado dejando que ste se deslice por las paredes del tubo de ensaye formando as una interfase. Se toma lectura de la coloracin del anillo formado en la interfase, se considera la prueba positiva si se observa un color violeta. 3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales, de acuerdo al viraje o precipitado segn la prueba. Parte II. Determinacin de la actividad biolgica de un extracto de planta 1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua purificada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolucin y esterilizar en autoclave a 121 0C a 15 lb de presin por 15 minutos. Dejar enfriar a 45 50 0C. 2. Vaciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar. 3. Distribuir, con perlas estriles, 0.2 ml de cultivo lquido de Escherichia coli GM2163. 4. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del frasco 1 (20, 40, 60 y 80 ml) y uno ms que ser el control positivo, que se impregnar con 20 ml de violeta de genciana. Realizar el ensayo por triplicado. 5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja, para que se evapore el solvente.

Metabolismo secundario | prctica 9

6.

Distribuir los cinco discos por caja, separndolos de manera que se alejen lo ms posible entre ellos y del borde de la caja (ver figura).

58 Manual de biotecnologa | prctica 9

Distribucin de los discos

7. 8.

9.

Incubar las cajas por 24 horas a 37 C. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriosttica, esto es, presencia de un halo de inhibicin alrededor de los filtros, con una densidad celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a la inhibicin parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibicin total de crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente. Medir con una regla o Vernier el dimetro de los halos

Resultados
Para las pruebas colorimtricas y de precipitacin, completar la tabla siguiente y asignar valores (+), (++), (+++) y (++++) segn la intensidad de la reaccin y (-) para aqullas en las que no se observa reaccin.
Grupo qumico Terpenos Alcaloides Glucsidos Flavonoides Intensidad

Para el ensayo con E. coli, elaborar una tabla como la indicada abajo, en donde se especifique el dimetro de los halos, indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida.
Caja 1 2 3 4 5 20l 40 l 60 l 80 l

Graficar el promedio de los halos por la cantidad de extracto en una grfica de lnea: Dimetro del halo (mm)

20

40

60

80
59 Metabolismo secundario | prctica 9

extracto (l)

Discusin
1. 2. 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimtricas y de precipitacin, analizar los valores asignados (+) segn la intensidad de la reaccin y determinar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios. Para el bioensayo con E. coli, analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibicin en cada una de las concentraciones y de qu tipo principalmente (bacteriosttico o bactericida). En la grfica, al observar la media del dimetro de los halos de inhibicin, analizar si la actividad biolgica (bacteriosttica o bactericida) depende de la cantidad de extracto.

Bibliografa Anaya, L. A. L. (2003), Ecologa qumica, Instituto de Ecologa, unam/ Plaza y Valds, Mxico. Domnguez, X. A. (1988), Mtodos de investigacin fotoqumica, Limusa, Mxico. Romeo, J. T. (2004), Secondary metabolism in model systems, Elsevier, Amsterdam. Hui, Y. H. (2008), Food drying science and technology: microbiology, chemistry applications, Lancaster Pennsylvania.

Prctica 10

Degradacin de compuestos xenobiticos a travs de actividades enzimticas


Introduccin
La biorremediacin es el proceso que se ocupa de la utilizacin de sistemas biolgicos para degradar compuestos txicos, contaminantes y sustancias de importancia ambiental (denominados genricamente compuestos xenobiticos) en suelos, aguas y aire, generando compuestos de menor o ningn impacto ambiental, o bien aislando la sustancia txica. Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza entonces se denomina atenuacin natural sin embargo, la velocidad de tales cambios es baja. Mediante una adecuada manipulacin, los sistemas biolgicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradacin para que puedan ser usados en sitios con una elevada concentracin de contaminantes. Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediacin: pesticidas, herbicidas, petrleo y sus hidrocarburos derivados, gasolinas y metales pesados, entre otros. Entre los sistemas ms interesantes para la biorremediacin se encuentran los hongos ligninolticos. Estos organismos degradan la madera a travs de un conjunto de enzimas oxidasas poco especficas que pueden usar como sustrato un sinnmero de compuestos xenobiticos. Entre estas enzimas, las lacasas han sido ms estudiadas ya que son enzimas robustas y con un amplio rango de sustratos. Las lacasas pertenecen al grupo de las fenol oxidasas y contienen cuatro tomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reacciones de xido reduccin. En esta prctica se harn ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolticos, as como su determinacin por mtodos colorimtricos.
61

Objetivo general
Determinar la actividad enzimtica de lacasas y relacionarla con su funcin como agentes de biorremediacin.

Objetivos especficos
Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolticos en presencia de petrleo. Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior.

Parte I. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes a petrleo Material y equipo


Material 1 mechero 2 vasos de precipitados de 1,000 ml 1 probeta de 1,000 ml 3 matraces Erlenmeyer de 1,000 ml Bistur * 24 cajas Petri de 45 mm de dimetro Reactivos Petrleo crudo Maya K2HPO4 MgSO47H2O Lecitina de soya KCl Agar

* Frasco de vidrio de boca ancha de 500 ml (previa- ABTS (2,2-azinobis 3 etilbenzotiazolina-6-cido mente esterilizado) (de caf Oro) sulfnico) * Papel aluminio
62 Manual de biotecnologa | prctica 10

Carbonato de calcio * Jugo V8

Equipo Autoclave Incubadora Cmara fotogrfica Balanza

*Material que debern traer los alumnos Material biolgico Cepa de hongo resistente a petrleo Cepa de hongo no resistente a petrleo

Metodologa
Preparacin del medio V8 + petrleo crudo Maya y crecimiento de hongos 1. En un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuacin:
Reactivo Jugo V8 CaCo3 Agar Por litro de volumen final 180 ml 2.0 g 20 g

Composicin del medio V8 2. 3. Aforar a 1,000 ml y dividir en dos matraces con 500 ml c/u. A uno de ellos se le agrega lecitina de soya (0.25% p/v). Esterilizar ambos matraces durante 15-20 min a una temperatura de 120 C y 1 atm de presin. Al salir de la autoclave y mientras sigue caliente el medio que contiene lecitina de soya, se vaca en el frasco de vidrio de boca ancha y se agrega 20 g de petrleo crudo Maya, para una concentracin final de 200 000 partes por milln (ppm). Agitar vigorosamente hasta alcanzar un mezclado homogneo.

4. 5. 6.

Se vacan ~ 10 ml de medio con petrleo en cada caja Petri (45 mm de dimetro) y lo mismo del medio sin petrleo. Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un fragmento de 44 mm de la caja original, inoculando por triplicado en las cajas V8 con y sin petrleo bajo condiciones de esterilidad. Los hongos se dejan crecer 30 das a temperatura ambiente y se observa el resultado.

Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarn los hongos tolerantes y no tolerantes cultivados en medio V8 de esta primera parte de la prctica.

Resultados

La cepa del hongo tolerante a petrleo deber crecer de manera similar a la condicin control, mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notar afectado. Anotar las observaciones, teniendo en cuenta los siguientes puntos: 1. Qu mecanismos son los responsables de comportamientos diferentes en los hongos bajo estas condiciones? 2. Qu efectos tendr el petrleo en los organismos vivos? Parte II. Actividad enzimtica Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos compuestos, entre estas enzimas se encuentran las lacasas, que estn involucradas en la transformacin de una amplia variedad de compuestos fenlicos. Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninoltica de estos hongos a travs de un ensayo colorimtrico, en donde un sustrato es oxidado (cambiar el color del sustrato como indicador) en presencia de la enzima lacasa.

63 Degradacin de compuestos xenobiticos a travs de actividades enzimticas | prctica 10

1. Preparacin del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modificado de Olsson, 2001. Composicin del medio mineral 20X (stock 1 L):
Reactivo K2HPO4 MgSO47H2O KCl Por litro de volumen final 2g 2g 2g

Material y equipo

En un vaso de precipitados, preparar:


Reactivo Stock medio mineral 20X ABTS [1mM] Agar Por litro de volumen final 50 ml 0.5487 g 20 g

Nota: Este medio es slo para la determinacin de actividad, la abundancia del hongo no es relevante. 2. Aforar a 1 litro con agua destilada. Transferir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar durante 1520 min. a una temperatura de 120 oC y 1 atm de presin. Vaciar 10 ml de medio en cada caja Petri (45 mm de dimetro). Colocar a 4 oC en oscuridad (envolver con papel aluminio). Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio V8 y se cortan en cuadros de 1 cm2; se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. Se incuban durante una semana a 28 oC. en ausencia de luz, cubriendo las cajas con papel aluminio. El ensayo se lleva a cabo por triplicado.

3.

64 Manual de biotecnologa | prctica 10

Resultados
El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloracin a verde o azul oscuro, por lo que la cepa del hongo tolerante a petrleo deber hidrolizar al ABTS, mientras que la cepa no tolerante no tendr reaccin alguna. De acuerdo con lo observado, responder: 1. Qu relacin tiene el ABTS con el petrleo? 2. Por qu cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa?

Bibliografa Baldrian P. (2006), Fungal laccases - occurrence and properties, FEMS Microbiol 30: 215-242. Field, J.A., E. De Jong, G. Feijoo-Costa, y J.A.M. De Bont (1993), Screening for ligninolytic fungi applicable to the biodegradation of xenobiotics. Trends Biotechnol 11: 44-49. Rojas-Avelizapa, N., E. Olvera-Barrera y L. Fernndez-Linares (2005), Feasibility study of bioremediation of a drilling-waste-polluted soil: Stimulation of microbial activities and hydrocarbon removal. Journal of environmental science and health, Part A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering 40: 2189-2201. Margesin, R., A. Zimmerbauer y F. Schinner (2000), Monitoring of bioremediation by soil biological activities, Chemosphere 40: 339-346.

Cultivo de tejidos vegetales


Se conoce como cultivo de clulas vegetales a una serie de tcnicas encaminadas a conseguir la reproduccin de clulas, tejidos u rganos de una planta bajo condiciones controladas y aspticas. Mediante el empleo de estas estrategias se puede reproducir una gran cantidad de plantas completas, en poco tiempo y espacio, a partir de pequeas porciones de una sola planta. La reproduccin de plantas in vitro puede darse por dos rutas: organognesis y embrio gnesis somtica. En la organognesis las plantas se reproducen por formacin secuencial de rganos vegetales. Primero tallo y hojas y despus races. La embriognesis somtica involucra la formacin de pequeas semillas, llamadas embriones bipolares (porque tiene la capacidad de dar origen a races y tallos), que pueden germinar y formar plantas completas. Solo excepcionalmente es posible reproducir a una especie por las dos rutas, por lo general, una de estas tcnicas de propagacin in vitro es la elegida porque es ms eficiente que la otra, o incluso porque es la nica que produce plantas completas y frtiles. Pueden iniciarse cultivos a partir de hojas, tallos o races de plantas crecidas en suelo, pero los mejores resultados en los cultivos de tejidos vegetales se obtienen cuando se emplean como explantes tejidos de plantas que han sido germinadas in vitro en condiciones estriles. Esto ocurre porque los tratamientos de desinfeccin pueden ser ms severos en semillas que en rganos de las plantas, ya que las primeras cuentan con una o varias cubiertas que protegen a las clulas meristemticas del efecto de los agentes antispticos.

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Manual de biotecnologa | prctica 11

Prctica 11

Fitorremediacin con helechos

Introduccin
La polucin de ambientes naturales con metales pesados es un problema muy complejo que ha llevado a la bsqueda de estrategias menos costosas y ms efectivas que las utilizadas hasta ahora para su control. La eliminacin biolgica de contaminantes de los ambientes naturales es sin lugar a duda la mejor alternativa disponible. Los contaminantes orgnicos como el petrleo, aguas residuales, agrcolas y pesticidas son generalmente susceptibles a ser degradados por microorganismos; pero los contaminantes inorgnicos como los metales pesados, nitratos, cianuros y los istopos radioactivos son ms difciles de tratar. Una posibilidad muy promisoria de biorremediacin para elementos txicos se encuentra en el empleo de especies vegetales para remover contaminantes de los ecosistemas. La fitorremediacin es una tecnologa emergente que utiliza a plantas y a los microorganismos asociados a la rizsfera para remover, transformar o contener sustancias contaminantes localizadas en suelos, sedimentos, acuferos, cuerpos de agua superficiales e incluso en la atmsfera. Las plantas son el grupo biolgico con las ms altas capacidades biosintticas de la tierra, por lo cual pueden transformar y mineralizar una amplia variedad de complejos orgnicos. En el caso de los contaminantes orgnicos, la meta de la fitorremediacin es la mineralizacin de las sustancias hasta componentes no txicos (fitodegradacin o fitotransformacin). Los contaminantes elementales, que incluyen metales txicos y radio nucletidos, son esencialmente inmutables a la accin enzimtica. Las plantas sin embargo pueden secuestrarlos y almacenarlos en sus tejidos (fitoextraccin y fitoacumulacin). La eliminacin biolgica de contaminantes ambientales se lleva a cabo generalmente por organismos que han logrado adaptarse a las condiciones particulares del sitio a tratar. Las plantas silvestres que crecen en sitios contaminados con metales pesados pueden ser una fuente muy importante de posibilidades para la biorremediacin. Uno de los grupos biolgicos ms resistentes a la presencia de contaminantes elementales son los helechos. Pteridium aquilinum (L.) Kuhn es un helecho silvestre ampliamente distribuido en todo el mundo. Es una especie helifila, pionera, que tiene propiedades alelopticas, fungicidas, antibacterianas y cancergenas. Esta planta se encuentra como especie dominante en zonas perturbadas o con una alta concentracin de cromo -el cromo hexavalente es un agente mutagnico y altamente cancergeno que tiene efectos adversos para la salud humana y animal, lo cual sugiere su gran potencial como especie til para la fitorremediacin de suelos contaminados.

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Objetivo general
Determinar la tolerancia a cromo VI de los gametofitos de Pteridium aquilinum.

Objetivos especficos
1. 2. 3.
68 Manual de biotecnologa | prctica 11

Probar el efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinacin de esporas de Pteridium aquilinum. Determinar cul es el efecto del cromo VI sobre el desarrollo de gametofitos y su maduracin. Probar el efecto del cromo sobre el desarrollo de esporofitos.

Material y equipo
Material Vrtex Micropipeta de 1,000 l Mechero 10 tapas para frascos Gerber Puntas para micropipetas de 1,000 L estriles Microtubos de 2 ml estriles Papel filtro estril Embudo de cristal estril Equipo Autoclave Microcentrfuga Potencimetro Balanza analtica Campana de flujo laminar Incubadora de vegetales Microscopio estereoscpico Cmara digital

6 filtros Millipore con membrana de 0.22 m estriles Reactivos * 1 paquete de cajas Petri de 10 cm de dimetro esMedio MS triles * 1 esptula delgada * 10 frascos Gerber grandes * Papel aluminio * 2 pinzas largas estriles * Un frasco de vidrio con algodn * Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack Sacarosa Agar Dicromato de potasio Alcohol etlico * Cloro

* Material que debern traer los alumnos. Material biolgico Esporas de Pteridium aquilinum

Metodologa
Los experimentos se llevarn a cabo empleando un medio de cultivo ms (Murashige y Skoog) modificado se emplea solo la mitad de la concentracin de macronutrientes (ver anexo). Se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizar en autoclave durante 20

minutos a 120 0C. El medio de cultivo se deja enfriar. Cuando llegue a 55 o 60 0C se agregarn diferentes concentraciones de dicromato de potasio (0, 25, 50, 100, 150, 200 m) esterilizado por filtracin con membranas Millipore de 0.22 m (cada equipo probar uno de los tratamientos). Germinacin de esporas in vitro 1. Se colocan 90 mg de esporas en un microtubo de 2 ml que contiene 1.5 ml de una solucin de hipoclorito de sodio al 0.3%. 2. El tubo se agita vigorosamente durante dos minutos en un agitador Vrtex. Nota: Es importante que la solucin de hipoclorito de sodio se prepare en el momento en que va a usarse y que las esporas no permanezcan en la solucin un tiempo mayor al indicado. 3. Se centrifuga el tubo en microcentrfuga durante un minuto a 14 000 rpm.
69 Fitorremediacin con helechos | prctica 11

Nota: Antes de centrifugar debe tenerse listo un tubo con 1.5 ml de agua para equilibrar la centrfuga. A partir de este punto el procedimiento se realiza en condiciones estriles. 4. Se vierte el sobrenadante con las esporas suspendidas, en un papel filtro estril colocado en un embudo de vidrio. 5. Las esporas que se encuentran adheridas al papel filtro se enjuagan tres veces con 5 ml de agua destilada estril. 6. El papel filtro se coloca en una caja de Petri estril. 7. Las esporas se resuspenden en 10 ml de agua destilada. 8. Se inoculan 250 l de suspensin de esporas de P. aquilinum, en cajas de Petri de 10 cm de dimetro con 25 ml de medio de cultivo semislido. 9. Los bordes de las cajas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack). 10. Las cajas se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 C, en foto-periodo de 16 horas luz 8 oscuridad, bajo lmparas fluorescentes. Induccin de formacin de esporofitos 11. Despus de 21 das de sembradas las esporas, los gametofitos se transplantan a frascos Gerber con el mismo medio utilizado en la germinacin, los gametofitos se riegan con 1 ml de agua destilada cada semana hasta la aparicin de los esporofitos La respuesta se evaluar a los 7, 14, 21 y 56 das despus de la siembra, por el porcentaje de germinacin de las esporas y la capacidad de desarrollar gametofitos y esporofitos. Los resultados de todos los equipos se reunirn y el reporte de la prctica se har con el resultado de todos los experimentos. Para determinar el porcentaje de germinacin de las esporas y el desarrollo protlico, se observan los cultivos en un microscopio estereoscpico (a 320 aumentos) y se toman cuatro fotografas de diferentes campos (de cada caja Petri), a los 7, 14 y 21 das despus de la siembra. Se considera que una espora ha germinado cuando aparece la clula rizoidal (ver figura). A los 56 das despus de la siembra se determina en cules de los tratamientos se desarrollaron esporofitos.

70 Manual de biotecnologa | prctica 11

Espora trilete (a). Germinacin tipo Vittaria, dos a cinco das (b). Filamentos cortos de cuatro a seis clulas, seis das (c). Gametofito espatulado, ocho das (d). Gametofito cordiforme, desnudo, con simetra bilateral y meristemo apical, 11 das (e). Gametofito masculino con anteridios en la superficie ventral de la lmina, entre los rizoides, 13 das (f). Acercamiento de los anteridios (g). Morfologa del anteridio, mostrando la clula basal, la clula media y la clula opercular (h). Gametofito femenino con los arquegonios cerca de la muesca, 17 das (i). Cuello del arquegonio con cuatro clulas (j). Gametofito monoico, 21 das (k). Gametofitos dioicos con dimorfismo sexual marcado: masculinos (), pequeos con alas poco desarrolladas, femeninos () de talla mayor con alas amplias (l). an= anteridio, ar= arquegonio, cb= clula basal, cm= clula media, co= clula opercular, cr= clula rizoidal, cu= cuello, es= espora, fi= filamento, me= meristemo, mu= muesca, ri= rizoide.

Resultados
Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinacin de esporas de P. aquilinum
Tratamiento * Caja 1 Control Cromo VI 25 M Cromo VI 50 M Cromo VI 100 M Cromo VI 150 M Cromo VI 200 M
71 Fitorremediacin con helechos | prctica 11

Porcentaje de germinacin (siete das) Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio

Tratamiento * Caja 1 Control Cromo VI 25 M Cromo VI 50 M Cromo VI 100 M Cromo VI 150 M Cromo VI 200 M

Porcentaje de germinacin (14 das) Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio

Tabla 2. Evaluacin del desarrollo protlico de los gametofitos de P. aquilinum por tratamiento *(Cromo VI 25 M)
Tratamiento * Caja 1 Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Tratamiento * Caja 1 Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro
* Cada equipo reporta slo sus resultados

Porcentaje (14 das) Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio

Porcentaje (21 das) Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio

Tabla 3. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre el desarrollo protlico de los gametofitos de P. aquilinum.
Etapa 0 M Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Etapa 0 M Gametofito filamentoso Gametofito laminar
72 Manual de biotecnologa | prctica 11

Porcentaje (14 das) 25 M 50 M 100 M 150 M 200 M

25 M

Porcentaje (21 das) 50 M 100 M

150 M

200 M

Gametofito maduro

Discusin
Temas que se sugieren para el anlisis: 1. Cul es la ventaja de la fitorremediacin sobre otros mtodos de limpieza de sitios contaminados? 2. Cules son las condiciones ms importantes que pueden influir en el proceso de germinacin de las esporas? 3. Cul es la condicin indispensable para que los anterozoides realicen la fecundacin de las oosferas? 4. Comparar los resultados obtenidos y los reportados en la literatura con otras especies vegetales. 5. Pteridium aquilinum es una especie prometedora para la fitorremediacin de suelos contaminados con metales pesados? 6. Cul es la fase haploide y cul la diploide en el ciclo de vida de los helechos? 7. Cul es la ventaja que puede tener hacer seleccin de organismos haploides en un sistema de mejoramiento gentico de esta especie?

Bibliografa Arthur, E., P. Rice, T. Anderson, S. Baladi, K. Henderson y J. Coats (2005), Phytorremediation-An overview, Critical Review in Plant Science 24:109-122. Cervantes, C., J. Campos-Garca, S. Devars, F. Gutirrez-Corona y H. Loza-Tavera (2001), Interactions of chromium with microorganisms and plants, FEMS Microbiology Reviews 25: 335 347. Gomez V. y M.P. Callao (2006), Chromium determination and speciation since 2000, Trends in Analytical Chemistry 25: 1006-1015. Lewandowski, I., U. Schmidt, M. Londo y A. Faaij (2006), The economic value of the phytoremediation function-assessed by the example of cadmium remediation by willow (Salix spp.), Agricultural Systems. 89: 68-89. Lone, M.I., Z. He, P.J. Stoffella y X. Yang (2008), Phytoremediation of heavy metal polluted soils and water: Progresses and perspectives, J. Zhejiang Univ. (Sci B) 9:210-220. Padmavathiamma, P.K. y L.Y. Li, (2007), Phytoremediation technology: Hyper-accumulation metals in plants, Water, Air, Soil Pollut 184:105-126.

Prctica 12

Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria

Durante la embriognesis somtica las clulas en cultivo experimentan un proceso de desarrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se forman las semillas. El desarrollo de un embrin tanto in vivo como in vitro est codificado por los mismos genes. La embriognesis somtica es un proceso complejo regulado por tres programas genticos que se prenden de forma secuenciada y son los responsables de la formacin de tejido competente para la embriognesis, del desarrollo y la maduracin de los embriones. La obtencin de un embrin maduro, frtil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento adecuado. Generalmente, la produccin de embriones somticos se divide en tres etapas: En la primera, conocida como induccin, se induce el desarrollo de un tejido embriognico. Sometidas a los estmulos adecuados, las clulas meristemticas suelen dar dos tipos de respuestas: a) se multiplican y generan una masa desorganizada de clulas que recibe el nombre de callo embriognico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones), o bien, b) se dividen para formar directamente embriones. Cuando se obtiene callo embriognico es necesario estimular el desarrollo de los embriones. Durante la etapa de desarrollo, el callo embriognico se transplanta a un nuevo medio de cultivo, donde se estimula a los cmulos de clulas potencialmente embriognicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y formen embriones. En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduracin. Durante este proceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrin pierde paulatinamente humedad. La maduracin de los embriones mejora la eficiencia de germinacin y es muy conveniente cuando los embriones no estn destinados a producir de inmediato plantas completas, tambin hay semillas sintticas que emplean otros propgulos: brotes (tallos con algunas hojas) o races, los cuales pueden generar despus de uno o varios pasos de cultivo in vitro plantas completas. Pero la mayor parte de las veces, las plantas se generan directamente por germinacin de embriones sin madurar. Como los requerimientos de cultivo de estas tres etapas son distintos, se ocupan en las diferentes etapas, medios de cultivo diferentes. El principal modelo de estudio de la embriognesis somtica es la zanahoria. Esta posibilidad tecnolgica se descubri precisamente en esta especie. Steward, en 1958 y Reinert en 1959, observaron que las clulas de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensin, tenan la capacidad de formar unidades estructurales discretas, con una forma de desarrollo similar a la que presentan los embriones cigticos. Si estos embriones se ponan en condiciones adecuadas, germinaban y producan plantas completas. Ellos llamaron a estos propgulos embriones somticos.

Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria | prctica 12

Introduccin

73

Objetivo general
Obtener embriones somticos de zanahoria.

Objetivos especficos

74 Manual de biotecnologa | prctica 12

Germinar semillas de zanahoria en condiciones estriles. Probar el efecto de diferentes concentraciones de 2,4-D sobre la induccin de callo embriognico de zanahoria. Determinar cul es el mejor explante para la induccin de callos embriognicos de zanahoria. Probar el efecto de la concentracin de sacarosa y la fuente de nitrgeno en el desarrollo de embriones somticos de zanahorias.

Material y equipo
Material 1 esptula estril 30 tapas para frascos Gerber Pinzas largas estriles 2 mecheros 2 mallas de acero inoxidable estriles *1 paquete de cajas Petri estriles *12 frascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml) *Mango para bistur del no. 4 Reactivos Medio MS 2, 4-D (2, 4 cido diclorofenoxiactico) Alcohol etlico al 70% *5 hojas para bistur estriles del no. 21 o 22 *Papel aluminio *Una caja de cartn *Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack Material biolgico Semillas de zanahoria
*Material que debern traer los alumnos

Equipo Autoclave Potencimetro Balanza analtica Incubadora de vegetales Campana de flujo laminar

Agar Sacarosa L-glutamina Cloro al 30% HCl 1N KOH 1N

Metodologa
Los experimentos se llevarn a cabo empleando el medio de cultivo bsico ms (ver anexo), al que se le agregarn distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados. En todos los casos se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.

El proceso de induccin de embriognesis somtica se efectuar en tres etapas: germinacin in vitro de semillas, induccin de callo embriognico y embriognesis. PARTE I. Germinacin de semillas in vitro Desinfeccin de semillas 1. Las semillas se colocan en una solucin jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. 2. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta que se elimine el detergente por completo. 3. Se baan con alcohol al 70% para eliminar aceites, grasas y ceras 4. Se sumergen en una solucin al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solucin comercial). Las semillas se mantienen en la solucin de cloro durante 20 minutos en agitacin constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan ms tiempo en la solucin. 5. En la campana de flujo laminar, se remueve la solucin con ayuda de un colador de acero inoxidable estril. 6. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estril. 7. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. Cultivo in vitro Se emplearn frascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo bsico ms semislido (ver anexo) adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. 1. El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero 2. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada frasco (cada equipo sembrar cinco frascos). Nota: Las pinzas, despus de usarse, se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodn en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Antes de volver a usar las pinzas, se flamean y cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un frasco con agua destilada estril para que se enfren. 3. 4. 5. 6. Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rpidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack). Los frascos se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 C en foto-periodo de 16 h luz/8 h oscuridad, bajo lmparas fluorescentes. Despus de seis semanas de cultivo las plantas estn listas para utilizarse como explantes.

75 Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria | prctica 12

PARTE II. Induccin de callo embriognico 1. 2. 3. Se probarn tres tratamientos para la induccin de callo embriognico: Medio semislido ms (ver anexo) con 1, 1.5 y 2 mg/L de 2,4-D. En todos los casos se colocarn cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Se ocuparn porciones de tallos, races y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad) como explantes. Se harn cinco repeticiones por tratamiento. Las cajas se mantendrn a 25 C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probar uno de los tratamientos).

4.

La respuesta se evaluar despus de cinco semanas de tratamiento por la presencia de callo embriognico y la frecuencia de respuesta. Los resultados de todos los equipos se reunirn y el reporte de la prctica se har con el resultado de todos los experimentos.

PARTE III. Embriognesis 1. Se probarn cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somticos de zanahoria: Medio ms con 3% de sacarosa, medio ms con 6% de sacarosa, medio ms con 3% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio ms con 6% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina (cada equipo probar uno de los tratamientos). En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarn cuatro porciones de callo (del mejor callo obtenido en la etapa de induccin, se harn tres repeticiones por tratamiento). Las cajas se mantendrn en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas, el resultado se evaluar por la presencia de embriones somticos en estado cotiledonario. Los resultados de todos los equipos se reunirn y el reporte de la prctica se har con el resultado de todos los experimentos.

2. 3.

76 Manual de biotecnologa | prctica 12

Resultados
Germinacin de semillas Da Frasco 1 2 3 4 5 Promedio DS Germinacin Germinacin (%) 2 4 6 8 10 12 14 16

No. de semillas germinadas

Das Grfica de velocidad de germinacin

Induccin de callo embriognico* Presencia de callo embriognico por explante** Frasco 1 2 3 4 5 Total % de respuesta por explante
* La evaluacin se hace a las cinco semanas de tratamiento ** Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos 77 Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria | prctica 12

1 mg/L de 2,4-D

1.5 mg/L de 2,4-D

2.0 mg/L de 2,4-D

Desarrollo de embriones somticos* Nmero de brotes por explante** Frasco 1 2 3 4 5 No. de brotes por tratamiento
* La evaluacin se hace a las cuatro semanas de tratamiento Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos ** Se emplearn como explante los mejores callos obtenidos en la etapa anterior

3% de sacarosa

6% de sacarosa

3% de sacarosa 750 mg/L de glutamina

6% de sacarosa 750 mg/L de glutamina

Anlisis
1. 2. 3. 4. 5. A qu se llama clulas totipotenciales? Qu son los meristemos? Cules son los factores que determinan la induccin de un cultivo embriognico? Qu caractersticas debe tener un tejido que se usa como explante para embriognesis somtica? Cules son los factores ms importantes durante el desarrollo de embriones somticos?

Bibliografa Berleth, T. y S. Chatfield, (2002), Embryogenesis: Pattern formation from a single cell, Arabidopsis Book 7: 1-22. Feher, A., T.P. Pasternak, y D. Dudits, (2003), Transition of somatic plant cells to an embryogenic state. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 201-228. Jimenez, V.M. (2005), Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis. Plant Growth Regulation 47: 91-110. Murashige, T. y F. Skoog (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473- 497. Rose, R.J. y K.E. Nolan (2006) Genetic regulation of somatic embryogenesis with particular reference to Arabidopsis thaliana and Medicagotruncatula. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 42: 473-481. Invited review. Thorpe, T.A. (2007), History of plant tissue culture. Molecular Biotechnology 37: 169-180.
78 Manual de biotecnologa | prctica 12

Prctica 13

Organognesis somtica de Nicotiana glauca

La organognesis somtica ha resultado ser una herramienta muy valiosa para la propagacin comercial de cultivos industriales, plantas ornamentales y hortalizas. Las condiciones de organognesis son variables para cada especie vegetal. El enfoque emprico que ha sido extensamente usado en estudios in vitro de organognesis ha mostrado que el proceso depende principalmente de tres factores, la eleccin del explante, el medio de cultivo y el control del ambiente fsico. La manipulacin de estos factores lleva a la induccin del desarrollo organizado. En general es mejor utilizar explantes jvenes con crecimiento activo y con meristemos abundantes. Las hojas y los nudos de los tallos suelen dar muy buenos resultados. Cuando los explantes se colocan en un medio de cultivo con ciertas hormonas vegetales, generalmente citocininas (solas o en combinacin con una proporcin mucho menor de auxinas), los brotes axiales emergen y forman un agrupamiento de brotes. Una vez que estos brotes se desarrollan pueden subdividirse en grupos ms pequeos o brotes individuales que pueden a su vez cultivarse en medio fresco con auxinas, para inducir la formacin de races. Los explantes de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum L.) pueden formar brotes o races directamente, dependiendo de las fitohormonas presentes en el medio. La organognesis de novo inicia a partir de clulas en divisin activa localizadas en los centros meristemticos de las plantas, clulas que generan primordios que finalmente formarn brotes y races. El proceso de organognesis ocurre en diferentes etapas que incluyen: la adquisicin de competencia, la induccin o determinacin de una ruta morfogentica particular y la diferenciacin morfolgica y el desarrollo. La determinacin se completa cuando el tejido es capaz de continuar su programa de desarrollo en ausencia de reguladores de crecimiento exgenos. Recientemente se ha encontrado que los explantes de hojas de tabaco requieren permanecer de cuatro a seis das en el medio de cultivo para que se determine la formacin de brotes y slo requieren un da en el medio de cultivo para que se determine la formacin de races. Nicotiana glauca es una planta perteneciente a la familia Solanaceae con una amplia distribucin en Mxico y el mundo. Es una especie con rpido crecimiento y alta produccin de biomasa que produce alcaloides repelentes de herbvoros. Esta planta se comporta como pionera en ecosistemas perturbados y resiste concentraciones elevadas de diversos contaminantes. Existen varios estudios que reportan su capacidad de retener en sus tejidos altas concentraciones de Pb, Zn, Cd y Co. Por estas caractersticas, N. glauca es considerada un modelo ideal para llevar a cabo estudios de fitorremediacin. Por tratarse de una especie silvestre, su empleo en biorremediacin de suelos contaminados depende en gran medida del desarrollo de un protocolo eficiente de reproduccin para la especie.

Organognesis somtica de nicotiana glauca | prctica 13

Introduccin

79

Objetivo general
Obtener plantas completas a partir de cultivos in vitro de Nicotiana glauca por organognesis somtica

Objetivos especficos
1. 2. 3.
80 Manual de biotecnologa | prctica 13

Probar el efecto de diferentes concentraciones de bencil aminopurina (Bap) en combinacin con cido naftalenoactico (Ana) sobre la induccin de brotes adventicios de tabaco. Determinar cul es el mejor explante para la induccin de brotes. Probar el efecto de la composicin del medio de cultivo en la rizognesis de los brotes obtenidos.

Material y equipo
Material 2 mecheros 30 tapas para frascos Gerber Tubos eppendorf de 1.5 ml 1 esptula estril Pinzas largas estriles 1 jeringa hipodrmica estril *1 paquete de cajas Petri estriles de 10 cm de dimetro *15 frascos Gerber grandes de boca ancha *Papel aluminio *Algodn *Mango para bistur del nmero 4 *5 hojas para bistur estriles del no. 21 o 22 *Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack Material biolgico Semillas de N. glauca
*Material que debern traer los alumnos

Equipo Autoclave Potencimetro Balanza analtica Incubadora de vegetales Campana de flujo laminar Reactivos Sales del medio ms Sacarosa Agar Ana Bap Alcohol etlico 70% HCl 1N KOH 1N Cloro 30%

Metodologa
Los experimentos se realizarn empleando el medio de cultivo bsico ms (Murashige y Skoog, al que se le agregarn distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados. En todos los casos se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 120 0C. El proceso de induccin de organognesis somtica se efectuar en tres etapas: germinacin in vitro de semillas, induccin de brotes y rizognesis.

Parte I. Germinacin de semillas in vitro Desinfeccin de semillas Las semillas se colocan en un microtubo de 1.5 ml con una solucin jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. Con ayuda de una jeringa hipodrmica se retira la solucin jabonosa (cuidando no succionar las semillas, que deben permanecer en el fondo). Se enjuagan las semillas con agua corriente empleando una jeringa hipodrmica, hasta eliminar el detergente por completo. Se baan con alcohol al 70% durante un minuto para eliminar aceites, grasas y ceras. Se adiciona a las semillas una solucin al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solucin comercial) que debe prepararse en ese momento y se mantienen en la solucin de cloro durante 20 minutos en agitacin constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan ms tiempo en la solucin. En la campana de flujo laminar se remueve la solucin con ayuda de una jeringa hipodrmica estril. Empleando la jeringa estril, se enjuagan las semillas tres veces con agua destilada estril. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. Deben sembrarse las semillas inmediatamente en los frascos con medio de cultivo. Parte II. Cultivo in vitro Se emplearn frascos Gerber de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo bsico Murashige y Skoog (1962) semislido, adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero. Con ayuda de unas pinzas y una esptula delgada estriles, se colocarn entre 10 y 15 semillas en cada frasco (cada equipo sembrar 5 frascos).

81 Organognesis somtica de nicotiana glauca | prctica 13

Nota: Las pinzas y la esptula despus de usarse se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodn en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Antes de volverse a usar, las pinzas y la esptula se flamean, cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un frasco con agua destilada estril para que se enfren. Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rpidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack). Los frascos se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 oC, en foto-periodo de 16 h luz 8 h oscuridad, bajo lmparas fluorescentes. Despus de 6 semanas de cultivo las plantas estarn listas para utilizarse como explantes.

Parte III. Induccin de brotes Se probarn seis tratamientos (uno por equipo) para la induccin de brotes en hojas y races de N. glauca:
Tratamiento 1 2 3 4 5 6
82 Manual de biotecnologa | prctica 13

(mg/L) 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0

bap

(mg/L) 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1

ana

Se emplearn como explantes hojas y races provenientes de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad. Cada equipo sembrar cinco frascos con races y cinco frascos con hojas. Los experimentos se evaluarn despus de cinco semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y el nmero de brotes obtenidos por explante. Los reportes de las prcticas deben contener los resultados de los experimentos efectuados por todos los equipos. Parte IV. Rizognesis Para la induccin de races en los brotes obtenidos se probar el efecto de la osmolaridad del medio de cultivo sobre el desarrollo de races. Se utilizarn como medio de induccin: el medio ms completo, el medio ms con la mitad de los macronutrientes y el medio ms con un cuarto de los macronutrientes. Los brotes ms desarrollados obtenidos en la etapa anterior se emplearn como explantes. Se sembrarn tres brotes por frasco, cinco frascos por tratamiento (un tratamiento por equipo). La respuesta se evaluar despus de cuatro semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y la biomasa fresca promedio de las races obtenidas.

Resultados
Induccin de brotes de N. glauca* Tratamiento** 1 2 3 4 5 6
* La respuesta se evaluar despus de cinco semanas de tratamiento ** Se incluirn los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviacin estndar. Los valores debern estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarn que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey.

% de respuesta

Nmero de brotes por explante***

Nmero de brotes por tratamiento

Grado de desarrollo de los embriones

Enraizamiento de los brotes* Tratamiento** 1 2 3


* La respuesta se evaluar despus de cuatro semanas de tratamiento ** Se incluirn los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviacin estndar. Los valores debern estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarn que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey.

% de respuesta

Biomasa promedio de raz ***

Biomasa de races por tratamiento

1. 2. 3. 4. 5.

Cul es el papel de las hormonas de crecimiento en la induccin de brotes? Cmo se comporta la planta en respuesta a las fitohormonas utilizadas? Observaciones en relacin con la eficiencia del proceso de micropropagacin generado. Comparar los resultados de esta planta con los procesos de micropropagacin de plantas del mismo gnero Cul puede ser la utilidad de contar con un protocolo eficiente de micropropagacin para el proceso de domesticacin de la especie?

Bibliografa Debnath, M., C.P. Malik y P.S. Bisen (2006), Micropropagation: A tool for the production of high quality plant-based medicines, Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49. Parc, G., J. Rembur, P. Rech y D. Chriqui, (2007), In vitro culture of tobacco callus on medium containing peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stability, Plant Cell Reports 26: 145-152. Pennazio, S. (2002), The culture of single plant cells: A historical view, Rivista Di Biologia - Biology Forum 95: 455-472. Thorpe, T.A. (2007), History of plant tissue culture, Molecular Biotechnology 37: 169-180. Ziv, M. (2005), Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81: 277-285.

Organognesis somtica de nicotiana glauca | prctica 13

Anlisis

83

Prctica 14

Identificacin de organismos genticamente modificados

Introduccin
Los jitomates, semillas de soya y granos de maz fueron los primeros organismos genticamente modificados en ser aprobados en Estados Unidos en los aos noventa. A partir de entonces la biotecnologa de alimentos contina creciendo rpidamente. La introduccin de genes especficos a travs de la biotecnologa puede proveer de ciertas ventajas. Como ejemplo, una planta genticamente modificada se protege a s misma contra parsitos despus de la introduccin de un gen para la produccin de una endotoxina capaz de destruirlos. Las plantas tambin pueden ser modificadas para inhibir la expresin de genes especficos que estn involucrados en la maduracin de la fruta. Existen varios procedimientos biotecnolgicos que pueden ser usados para la ingeniera gentica de plantas. Como ejemplo podemos mencionar el uso de pistolas genticas, la introduccin de genes mediante el plsmido Ti y la tecnologa antisentido.

85

Objetivo
Los alumnos podrn identificar la presencia de transgenes en muestras vegetales adquiridas comercialmente.

Material y equipo
Material 20 Tubos eppendorf de 1.5 ml limpios y estriles por equipo Equipo Bao Mara a 65 oC por grupo Licuadora o mortero por grupo Micropipetas por equipo 1 mechero por equipo *100 g de soya
*Material que debern traer los alumnos. La idea es que traigan soya adquirida en distintos sitios: mercados, supermercados, tiendas orgnicas, pueblos, etctera.

Centrfuga por grupo

Reactivos por grupo 1. 50 ml de amortiguador de extraccin CTAB pH 8.0 (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 1 M y Na2 EDTA 0.02 M). 2. 50 ml de amortiguador de precipitacin CTAB (CTAB 5 g/l y NaCl 0.04 M) 3. 50 ml de NaCl 1.2 M 4. 50 ml de solucin fisiolgica salina (NaCl 0.9%) 5. 1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) o pronasa (50 mg/ml) 6. 50 ml de cloroformo 7. 50 ml de isopropanol 8. 50 ml de etanol al 75% 9. 10 ml de agua estril

86 Manual de biotecnologa | prctica 14

Metodologa
Esta prctica se realiza en tres mdulos: I) Extraccin de dna de las muestras. II) Amplificacin del dna. III) Electroforesis en geles de agarosa. MDULO I. Extraccin de dna Extraccin de dna usando ctab (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) 1. En una licuadora se trituran 100 g de muestra con 25 ml de solucin fisiolgica salina, el homogenizado servir para todo el grupo. 2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml se colocan de 50-300 mg de muestra (1 tubo por alumno) 3. Agregar 1.0 ml de amortiguador de extraccin CTAB precalentado a 65 C, agitar e incubar por 30 min. 4. Adicionar 10 l de proteinasa K (20 mg/ml), incubar a 55 oC por 30 min. 5. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. El sobrenadante se transfiere un tubo nuevo y limpio. 6. Agregar un volumen de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. 7. Tomar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo y limpio. 8. Agregar 2 volmenes del amortiguador de precipitacin CTAB, incubar a temperatura ambiente por 60 min. Posteriormente centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. 9. El sobrenadante se descarta y el dna precipitado se disuelve en 350 l de NaCl 1.2 M. 10. Adicionar 350 l de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. Transferir la fase superior a un tubo nuevo y limpio. 11. Agregar 600 l de isopropanol, mezclar suavemente e incubar 20 min a temperatura ambiente. 12. Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min, descartar el sobrenadante. 13. Adicionar 500 l de etanol al 75%, mezclar con vrtex por 2 min. 14. Centrifugar a 14 000 rpm por 2 min, descartar el sobrenadante. 15. Secar la pastilla en el mechero y posteriormente resuspender en agua estril (aproximadamente 100 l).

La pureza y concentracin del dna puede calcularse de la siguiente manera: 1. Hacer una dilucin 1:100 de la muestra obtenida y medir la DO a 260 y 280 nm. La pureza se estima sacando la siguiente proporcin: DO260/DO280. La concentracin se calcula de acuerdo con la siguiente formula: 1.0 de DO260 = 50mg/l para dna de doble cadena. Mdulo II. Amplificacin del dna La produccin de plantas genticamente modificadas se lleva a cabo mediante la insercin selectiva de genes forneos de inters dentro de su genoma. El proceso mediante el cual se realiza la construccin requiere el corte y empalme de diferentes elementos para formar una unidad genticamente funcional. La modificacin generalmente incluye dos elementos regulatorios, un promotor y un terminador, as como un gen que confiere una ventaja. Dos de los elementos regulatorios ms utilizados son el promotor para una elevada expresin constitutiva en tejidos de plantas, CaMV-35, aislado del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador Nos aislado del gene de la nopalina sintasa (nopaline synthase) de Agrobacterium tumefaciens, el cual da la seal de terminacin de la transcripcin y dirige la poliadenilacin. Estos dos elementos pueden estar juntos o separados. Al inicio de los aos ochenta, Chua y colaboradores en la Universidad de Rockefeller aislaron el promotor responsable de la transcripcin del genoma completo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por cauliflower mosaic virus). El promotor fue nombrado CaMV 35S o promotor 35S por su coeficiente de sedimentacin. El promotor 35S es un promotor constitutivo muy fuerte, ya que provoca altos niveles expresin de genes en plantas dicotiledneas, aunque es menos efectivo en plantas monocotiledneas, especialmente en cereales. La discrepancia se debe probablemente a la diferencia en la cantidad y/o cualidad de los factores de regulacin.

87 Identificacin de organismos genticamente modificados | prctica 14

Metodologa
Mezcla de reaccin: 1. Volumen total 25 l 2. 2.5 l de amortiguador de reaccin (10X) 3. 50 pmol de cada primer 4. 2.5 U de Taq dna polimerasa 5. X l de agua libre de nucleasas estril 6. 1-5 l de dna 7. 2.5 l dNTPs 2 mM. Es conveniente que el profesor haga un stock para todo el grupo con el fin de optimizar el uso de los reactivos. La cantidad de reacciones de PCR ser determinada por el profesor, ya que no se pueden realizar para todo el grupo debido al elevado costo de los reactivos. Oligonucletidos utilizados para la amplificacin Promotor CaMV 35S CaMV 35SF CaMV 35SR Tamao esperado del amplicn: 196 pb

Terminador NOS NOSF NOSR Tamao esperado del amplicn: 180 pb


Programa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Desnaturalizacin Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final Nmero de ciclos
88 Manual de biotecnologa | prctica 14

94 C, 5 min. 94 C, 30 seg. 54 C, 30 seg. 72 C, 30 seg. 72 C, 7 min. 30 ciclos

Mdulo III. Electroforesis en geles de agarosa La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromolculas en una solucin. Muchas molculas biolgicamente importantes (aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. La electroforesis permite separar molculas de dna al ser sometidas a un campo elctrico, ya que son atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero, la fuerza elctrica atrae el dna hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su intensidad depende del tamao y la forma de la partcula. La electroforesis permite adems, hacer una aproximacin de la cantidad de dna que se obtiene despus de un proceso de extraccin. Tambin se utiliza para visualizar el resultado de procesos como la restriccin y PCR. Reactivos Amortiguador TAE 50X GelRed Agarosa

Metodologa
Preparacin del gel de agarosa 1. 2. Determinar la concentracin y el volumen de gel que se necesita. Si el dna tiene un tamao desconocido se debe utilizar un gel de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Preparar el gel al porcentaje de agarosa deseado segn se indica en el siguiente ejemplo.

Ejemplo 1: preparar 30 ml de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Hay que determinar qu cantidad de agarosa se necesita para preparar 30 ml: (30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)

Se despeja la ecuacin para la X. El resultado en este caso es 0.3 g 3. Pesar la cantidad de agarosa que se necesita (ejemplo 1 = 0.3 g) y transferir a un matraz Erlenmeyer. 4. Aadir el volumen deseado de solucin amortiguadora Tris acetato EDTA (TAE) 1X (ejemplo 1 = 30 ml). 5. Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente (aproximadamente un minuto), pausando el horno cada vez que sea necesario para impedir que hierva. 6. Enfriar la agarosa hasta unos 50 C. 7. Colocar el molde para hacer los pozos en la charola que soporta el gel. Para que el gel quede de un espesor uniforme la charola debe estar en una superficie plana nivelada. 8. Vaciar la solucin de agarosa en la charola evitando la formacin de burbujas. Si se forman burbujas, se pueden remover usando una punta para micropipeta. 9. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos). El gel slido tiene una apariencia opaca. Preparacin de la cmara y de las muestras 1. 2. 3. 4. 5. 6. Colocar el gel dentro de la cmara de electroforesis. Aadir suficiente TAE 1X para cubrir completamente el gel (aproximadamente 0.5 cm) Las muestras se preparan de la siguiente forma: Tomar 5 l de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1ml de GelRed para monitorear la movilidad electrofortica. Siempre se debe de usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin. Cargar cuidadosamente ~ 6 l de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Cargar todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra de un marcador de peso molecular. Conectar el equipo de electroforesis. Unir los electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a las terminales correspondientes. Encender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100 voltios). Si el equipo est funcionando bien, entonces se podrn observar burbujas saliendo de los electrodos. Conviene asegurarse de que las muestras estn corriendo en la direccin correcta, hacia el electrodo positivo. Correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido aproximadamente entre la mitad y tres cuartos de la charola. Apagar el equipo.

89 Identificacin de organismos genticamente modificados | prctica 14

7. 8.

Resultados
Visualizacin del dna Colocar el gel en una lmpara de luz UV o transiluminador Fotografiar el gel usando una cmara digital.

Bibliografa Elenis, D.S., D.P. Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou y T.K. Christopoulos (2008), Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms, Anal Bioanal Chem 392: 347-354. Gryson, N., K. Messens y K. Dewettinck (2004), Evaluation and optimization of five different extraction methods for soy DNA in chocolate and biscuits. Extraction of DNA as a first step in GMO analysis, J Sci Food Agric 84:1357-1363. Michelini, E., P. Simoni, L. Cevenini, L. Mezzanotte y A. Roda (2008), New trends in bioanalytical tools for the detection of genetically modified organism: an update, Anal Bioanal Chem 392: 355-367. Oraby, H.A.S., A. A. Hassan y A.A. Mossallam, (2005), Screening food products for the presence of CaMV 35S promoter and NOS 3 terminator, J Sci Food Agric 85: 1974-1980.

90 Manual de biotecnologa | prctica 14

Anexo

Prctica 1.
Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae se mantendr sembrada en cajas de medio rico (YPD) y se utilizar para el inculo una caja con no ms de una semana de haber sido sembrada. YPD Y (extracto de levadura) P (peptona de casena) D (glucosa) Agar DNS (Miller, 1959) Hidrxido de Na cido 3,5- dinitrosaliclico Tartrato de Na y K Fenol Metabilsulfito de Na 1% 2% 2% 2%

Prctica 3.
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido Preparar por grupo: Medio YPD (g/L) (5 matraces con 30 ml c/u para el grupo): Extracto de levadura 10 g, peptona 20 g, dextrosa (glucosa) 20 g. Cajas de SD + Leu (3 por equipo): Base nitrogenada para levaduras, sin aminocidos (YNB) 0.67 %, glucosa 2 %, leucina 20 mg/L, agar 2%. Cajas de SGal + Leu, pH 7.0 (1 por equipo): YNB 0.67%, galactosa 2%, leucina 20 mg/L, ajustar el pH a 7.0, agar 2%. Cajas SGal + rafinosa al 1% sin leucina (1 por equipo): YNB 0.67%, rafinosa 1%, agar 2%. TE 10X, pH 8.0 (10 ml para el grupo): Tris 100 mM, EDTA 10 mM. Acetato de litio 10X (10 ml para el grupo): Preparar una solucin 1 M de acetato de litio, pH 7.5. PEG 50%: Disolver 25 g de PEG 3350 en 50 ml de agua y esterilizarlo. X-Gal: solucin al 2% en N,N-dimetilformamida (guardar a -20 C). dna de esperma de salmn: Solucin de trabajo 10 mg/ml, preparado segn Sambrook et al., 1989. Prctica 4. Extraccin de dna e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses PBS 20X (0.2 M PBS, pH 7.2): Na2HPO4 (anhidro) 21.8 g

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1.40 % 0.75 % 21.60 % 0.54 % 0.59 %

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NaH2PO4 (anhidro) NaCl Agua destilada Ajustar pH a 7.2 Guardar a temperatura ambiente

6.4 g 180 g 1,000 ml

Solucin de Lisis: Tris-HCl 1 M, pH 7.5 1 ml EDTA 500 mM 2 ml NaCl 5 M 1 ml SDS 20% (p/v) 10 ml Agua libre de nucleasas cbp 100 ml Esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.
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TAE 50X (1L): Tris base cido actico EDTA 0.5 M, pH 8.0

242 g 57.1 ml 100 ml

EDTA 500 mM, pH 8.0: EDTA (sal de sodio) 18.61 g Ajustar a pH 8.0 con lentejas de NaOH. Aforar a 100 ml, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente Proteinasa K o Pronasa (20 mg/ml) Proteinasa K o pronasa 100 mg Agua estril 5 ml Almacenar a -20 C en alcuotas de 400 l Acetato de sodio 3 M pH 5.2 (100 ml) Acetato de sodio trihidratado 40.8 g Ajustar el pH a 5.2 con cido actico glacial. Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Esterilizar con autoclave y almacenar a temperatura ambiente Prctica 6. Anlisis de la actividad de catalasas Preparacin de medio PY, en un vaso de precipitados, preparar como se enlista a continuacin:
Reactivo Peptona de casena Extracto de levadura Por litro de volumen final 5g 3g

Esterilizar en autoclave 20 minutos a 120 0C y 1 atm de presin. Despus, aadir 10 ml de CaCl2 0.7 M.

Preparacin de PBS 10X: en un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuacin:


Reactivo KCl NaCl Na2HPO4.2H2O KH2PO4 Por litro de volumen final 2g 80 g 14.4 g 2.4 g
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH

Prctica 7. Sntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnolgicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum Preparar 200 ml (por equipo) de medio de cultivo BEGG (g/L): Glucosa* 40, extracto de levadura 5, glutamato de sodio 10, KH2PO4, 13.6, MgSO4.7H2O 0.5, etanol** al 1.4% (v/v) pH 6.0. NaOH 0.5 M 50 mL (por equipo): 1 g de hidrxido de sodio, aforar a 50 mL con H2O
* La glucosa se esteriliza por separado y se aade posteriormente al medio para evitar que el grupo amino de las protenas del extracto de levadura reaccionen con la glucosa. ** El etanol se aade despus de la esterilizacin y una vez que el medio se encuentre a una temperatura 30 C para evitar su volatilizacin.

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Prctica 8. Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. Medio MS 100 ml (por equipo), para preparar 1 L: Cloruro de amonio 20 mM Cloruro de potasio 20 mM Tris - HCl 120 mM Peptona 1% Dextrosa (20%) 0.5% Sulfato de magnesio (1.0 M) 1.6 mM 1.068 g 1.492 g 18.912 g 10g 26ml 1.6ml

Pesar y disolver los reactivos excepto la dextrosa y el sulfato de magnesio en 200 ml de H2O desionizada, ajustar el pH a 7.4 y aforar a 975 ml. Esterilizar durante 20 minutos. Stock de Dextrosa al 20%, 100 ml Dextrosa 20% 20g Pesar y disolver en 85 ml de H2O desionizada y aforar a 100ml. Esterilizar durante 20 minutos. Sulfato de magnesio 1.0 M 12.32g Pesar y disolver en 50 ml de H2O desionizada. Esterilizar por filtracin.

Antes de usar el medio PPGAS, se aaden 26 ml de glucosa al 20% y 1.6 ml de sulfato de magnesio. MEDIO PG (50 ml por equipo), para preparar 1,000 ml: Bacto peptona 5g Glicerol 10 ml Ajustar pH a 7.2 Aforar a 1 L Esterilizar 20 minutos Prctica 9. Metabolismo secundario
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Preparacin de reactivos: Liebermann-Burchard (1 ml por equipo). Mezclar 1 ml de anhdrido actico y 5 ml de cloroformo a 4 C (en bao de agua-hielo), aadir una gota de cido sulfrico concentrado. Draggendorff (2 gotas por equipo). Preparar por separado dos soluciones: Solucin A.- mezclar 10 ml de cido actico y 40 ml de agua y agregar 0.85 g de nitrato de bismuto bsico. Solucin B.- Disolver 20 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Mezclar la solucin A con la solucin B y guardar en un frasco mbar. Mlish (2 gotas por equipo). Pesar 0.5 g de -naftol y disolver en 10 ml de etanol. Prctica 11. Fitorremediacin con helechos Prctica 12. Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria Prctica 13. Organognesis somtica de Nicotiana glauca Estas tres prcticas contemplan el manejo de cultivos vegetales, por lo que se utilizar el medio Murashige y Skoog, Ms, modificado. Medio Ms modificado: Preparar soluciones stock. Las soluciones stock se preparan por separado para evitar que se precipiten:
Stock 1 macros Componente (NH4)NO3 KNO3 MgSO4 7H2O KH2PO4 CaCl2 gramos/litro 1.65 1.9 0.37 0.17 0.44 10X (g/L) 16.5 19 3.7 1.7 20X (g/L) 2 44

3 micros

MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3 KI NA2MoO4 2H2O CuSO45H2O CoCl2 6H2O FeSO47H2O Na2EDTA TiaminaHCl c. nicotnico PiridoxinaHCl Inositol Glicina Sacarosa

0.01689 0.0086 0.0062 0.00083 0.00025 0.000025 0.000025 0.0278 0.0373 0.0001 0.0005 0.0005 0.10 0.002 30

1.352 0.688 0.496 0.020 0.020 0.002 0.002 2.224 2.984 0.008 0.040 0.040 8.0 0.160
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4* 5 vitaminas 6 7

*Pesar y disolver el fierro y el EDTA por separado. Calentar el EDTA sin ebullir hasta que se disuelva y luego mezclar con el fierro, debe quedar una solucin color mbar (amarillenta).

Preparar 1 L de stock 1(10X). Elaborar 200 ml de c/u de los stock 20X restantes. Todas las soluciones deben conservarse en refrigerador, de preferencia juntas en un recipiente de plstico. Preparacin del medio Ms, 1 L: Poner 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitados y en agitacin constante, se agregan 100 ml del stock 1 y de manera secuencial 10 ml de cada uno de los dems stocks. Al final se agrega la sacarosa necesaria y cuando se haya disuelto por completo, se aade agua destilada hasta llegar a 950 ml y ajustar el pH de la solucin a 5.7 con HCl KOH 1N. Finalmente se afora el medio nutritivo a un litro. Para que los alumnos prueben los distintos tratamientos, se llevan a cabo los siguientes pasos durante la prctica con el grupo: Cuando el medio nutritivo va a vaciarse a cajas Petri: se vierte en un matraz Erlenmeyer de 2L (es importante que el volumen del matraz sea mucho mayor que el del medio) y se le agrega el agar (8 g por litro) directamente. El medio se esteriliza en autoclave durante 20 minutos a 120 oC. Se deja que el medio enfre hasta alcanzar alrededor de 60 0C y se vaca en cajas Petri estriles en una campana de flujo laminar. Cuando el medio va a vaciarse en frascos de 125 ml (Gerber), se disuelve con agar en una parrilla con agitacin hasta que se torna claro y transparente (generalmente cuando llega al punto de ebullicin). Se vacan 25 ml del medio de cultivo a cada frasco. Los frascos con el medio se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120 oC. Es importante dejar que la autoclave se enfre lentamente para evitar que las tapas de los frascos se boten por cambios bruscos de presin.
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