TECNICA DE INMERSION DE HEMBRAS ADULTAS (ADULT IMMERSION TEST-AIT FAO), EN GARRAPATAS Boophilus microplus. Biol.

Jorge Osorio Miranda Coordinador Tcnico del Laboratorio de Dpteros y Resistencia Departamento de Ectoparsitos y Dpteros INTRODUCCIN La Tcnica de Inmersin de Adultas (Adult Inmersion Test) es de una gran utilidad en el diagnstico de resistencia en garrapatas Boophilus microplus de campo, al presentar ventajas como la rapidez para su realizacin y el requerimiento de un mnimo de materiales y equipo necesario. Esta tcnica permite diagnosticar rpidamente, resistencia cuando hay la cantidad mnima necesaria de garrapatas repletas Boophilus microplus. La prueba de inmersin de adultas (Adult Immersion Test AIT/FAO), es una modificacin de la Tcnica de Drummond en la cual se utiliza un tiempo de inmersin de 30 minutos, nos sirve para diagnosticar rpidamente la resistencia teniendo el inconveniente de que en ocasiones no se puede contar con suficientes garrapatas hembras repletas de campo disponibles en buenas condiciones para realizar la prueba. Teniendo la ventaja de obtener resultados rpidamente (en 7 das) y la progenie podr estar disponible para realizar pruebas complementarias de paquete de larvas (Stone & Haydock). El objetivo prctico en estudios de resistencia a insecticidas es el desarrollo de mtodos para cuantificar la resistencia y generar los datos necesarios para formular programas viables del manejo de la resistencia (Hemingway y Small 1993). Los procedimientos de monitoreo de resistencia se pueden dividir en dos grandes categoras: pruebas generales o especficas. Las primeras incluyen el anlisis probit y las dosis discriminantes; la segunda categora de pruebas para factores especficos de resistencia esta enfocada a la actividad enzimtica, la que monitorea bioqumicamente esterasas, oxidasas multifuncionales y glutation-stransferasas (Miller, 1988). OBJETIVO GENERAL Determinar mediante pruebas de Laboratorio las Dosis Discriminantes (D.D.) de diferentes ixodicidas concentrados emulsificables desafiando garrapatas hembras repletas Boophilus microplus cepa Susceptible. Objetivos especificos Determinar mediante la metodologa probit las CL 50, 90,99 de inhibicin de la oviposicin en garrapatas Boophilus microplus cepa Susceptible Establecer las Dosis Discriminantes (D.D.) de productos Organofosforados, Piretroides, Amidinas y mezclas, para diagnsticar resistencia en garrapatas Boophilus microplus cepa de campo MATERIAL Y MTODOS

Material biolgico Se utiliza la cepa de referencia de B. microplus Susceptible cultivada bajo condiciones de laboratorio. Ixodicidas El tratamiento de las hembras adultas se realiza con productos ixodicidas formulados en presentacin de concentrado emulsificable. a) Para determinar en laboratorio la D.D. de un producto, como primer tamiz, se preparan de cinco a siete diluciones arriba de la concentracin comercial recomendada en un volumen determinado. Obtencin de material biolgico: Se infesta artificialmente la eclosin de 1 g de huevos (aprox. 20,000 larvas) de garrapatas Boophilus microplus de la cepa Susceptible en un bovino de la raza Aberdeen angus para obtener hembras repletas y realizar los ensayos con el ixodicida a probar. A los 21 das postinfestacin se recuperan y seleccionan hembras repletas en buen estado, se homogenizan en talla y son utilizadas para desafiar las diferentes concentraciones empleando tres replicas y 10 especimenes por concentracin tanto para el grupo control y experimental. En el ensayo que se realiza se trata de encontrar la concentracin que vence la oviposicin en garrapatas cepa Susceptible. Los primeros bioensayos se realizaron con cinco a siete concentraciones arriba de la comercial recomendada de cada uno de los ixodicidas y sus respectivas repeticiones, los resultados obtenidos permiten ajustar la respuesta dosismortalidad; por tanto en ensayos posteriores se utilizaron de 10 a 12 concentraciones para cada producto con un mnimo de tres a siete probits, lo cual permite calcular la D.D. en hembras adultas de la cepa Susceptible para el producto evaluado; la D.D. ser de gran utilidad en campo empleando un kit para el diagnstico de resistencia en garrapatas adultas de Boophilus microplus. Inmersin de hembras repletas: b) Se colocan 10 hembras adultas en vasos de precipitado con tres replicas por concentracin, iniciando con el grupo control, continuando con la menor concentracin y finalizando con la concentracin ms alta. c) Se agrega a los vasos de precipitado aproximadamente 25 ml de agua corriente para el grupo testigo y el mismo volumen del ixodicida de trabajo para el lote experimental o tratado como se describe anteriormente, los vasos se colocan sobre un agitador rotatorio y se mantienen en inmersin durante 30 minutos. d) Transcurridos el tiempo de inmersin se filtran las garrapatas en coladores (malla de tela de alambre) y se seca el exceso de agua o producto sobre papel secante. e) En el siguiente paso, se adhieren las garrapatas dorsalmente en una tira de masking tape con doble adhesivo misma que se pega previamente dentro de una caja petri, la cual se encuentra perfectamente rotulada con el nombre del producto, cepa, concentracin y fecha de realizacin

f) Las cajas de petri se incuban a una temperatura de 28C 2C y 80-90% de humedad relativa durante un tiempo de 7 das. g) Transcurrido el tiempo de incubacin se efecta el conteo del nmero de garrapatas que han ovipositado. No es necesario pesar la masa de huevos, pero es importante observar si esta masa de huevos es pequea o grande, viable o no. Interpretacin de resultados Una vez realizadas las lecturas de las hembras adultas que ovipositaron en las diferentes concentraciones del probit, incluyendo el grupo testigo, se calcul la CIO 50, 90, 99 para estimar las D.D. de los diferentes productos concentrados emulsificables. Una vez encontrada la D.D., se desafian garrapatas B. microplus Susceptibles de laboratorio para corroborar la repetibilidad del evento. Al confirmar que la D.D. encontrada es la correcta se desafian muestras de campo registrando el nmero de garrapatas que ovipositan para determinar el porcentaje de resistencia que se obtiene mediante la siguiente formula: Nmero de garrapatas tratadas que ovipositen Numero de garrapatas no tratadas ( agua ) que ovipositen

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CONSIDERACIONES GENERALES En el Centro Nacional de Servicios de Constatacin en Salud Animal se han determinado las D.D. de diferentes ixodicidas en presentacin concentrado emulsificable solicitado por diferentes laboratorios farmacuticos a partir del 2001 a la fecha; en el cuadro 2 se ilustran los resultados de los ensayos realizados. Cuadro 1 Dosis discriminantes obtenidos por FAO mediante la Tcnica de Inmersin de Hembras Adultas-AIT en B. microplus Susceptible cepa Yeronpilly NOMBRE COMERCIAL Taktic Bayticol Neocidol INGREDIENTE ACTIVO Amitraz (A) Flumetrina Diazinon CCR (%) 0.020 % 0.0030 % 0.020 % DOSIS DISCRIMINANTE 0.25 % 0.075 % 0.5 %

Cuadro 2 Dosis discriminantes obtenidos por CENAPA mediante la Tcnica de Inmersin de Hembras Adultas-AIT en B. microplus cepa Susceptible CENAPA NOMBRE COMERCIAL Supocade Supona Barricade Bombard Batestan Butox Elantik Dursban Trak Ticoff Garraban INGREDIENTE ACTIVO Clorfenvinfos+ cipermetrina Clorfenvinfos Cipermetrina (B) Amitraz (A) Cipermetrina (B) Deltametrina Zetacipermetrina Chlorpirifos Amitraz (C) Cipermetrina (C) Chlorpirifos + permetrina CCR (%) 0.0345% 0.030% 0.015% 0.025% 0.02% 0.0025% 6.25 % 0.024 % 0.020% 0.020 % 0.029 % DOSIS DISCRIMINANTE 0.55 % 3.84 % 0.96 % 0.8 % 4.8 % 0.7 % 0.5 % 13 % 4% 1.2 % 0.058 %

BIBLIOGRAFA FAO. 1999. Standardization of diagnostic tests. Sub-group 2. Adult Immersion Test (AIT). The FAO working group and FAO/ industry contact group on parasite resistance. Embrapa-Gado De Leite. Juis de Fora MG, Brazil. Miller, T.A. 1988. Mechanism of resistance to pyrethroid insecticides. Parasit. Today. Vol. 4(7).