Cromatografía

Definición e historia:
Técnica separativa de mezclas de sustancias .
Significa escritura en colores.
Michael Tswett en 1906.
Extrajo con éter de petróleo una mezcla de pigmentos de hojas verdes , al hacer pasar el extracto
por una columna de vidrio empacado con carbonato de calcio. Fueron saliendo por la parte
inferior los distintos pigmentos que componen las hojas verdes demostrando que no era solo
una sustancia. Recién en la década del 40 y 50 la técnica
Comenzó a desarrollarse.
 Glosario de términos:
1)Absorción: es la retención de una especie química por parte de una
masa y depende de la tendencia que ti ene ésta a formar mezcla o
a reaccionar químicamente con la misma.

2) Adsorbente: fase estacionaria en la Cromatografía de adsorción y de

reparto.

3) Adsorción: Es la retención de una especie química en los sitios

activos de la superficie de un sólido , puede ser física o química.
 Glosario de términos:
4-Cromatografía en fase inversa: Cromatografía con una fase
estacionaria no polar y una fase móvil polar.

5-Cromatografía en fase normal: Cromatografía con una fase

estacionaria polar y una fase móvil no polar.

6-Disolvente o revelador: Cualquier fase móvil

7-Elución o eluir: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase
estacionaria transportando los componentes a separar.
 Glosario.
8-Eluyente o efluente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.
9-Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna
cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente
de la muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un
líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte o un gel.
10-Fase ligada: Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a
las partículas de soporte o a la pared interior de la columna (lugar donde
se produce la separación).

11-Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido

supercrítico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar
a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria.
 Glosario.
12-Fase inmovilizada: Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las
partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo, por
polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.

13-Muestra : Mezcla consistente en cierto número de componentes,

cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser
arrastrados o eluidos por la fase móvil.
14-Componentes de la Muestra: Los constituyentes químicamente puros
de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir,
no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos
diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los
términos eluito y analito para un componente de la muestra.
15-Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio.
 Glosario.
16-Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de
cromatografía. Ponerlo en evidencia.
17-Soporte: El material sólido inerte que en la Cromatografía de
reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio.

18-Soluto: Término que se refiere a los componentes de la muestra en

la cromatografía de reparto.

19-Disolvente: Término que en ocasiones se refiere a la fase

estacionaria líquida en la cromatografía de reparto
 Glosario
20-Zona o banda: Región del lecho cromatográfico donde se localizan uno
o más componentes de la muestra.

21-Cromatograma: Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta

de un detector (la concentración de un analito en el efluente u otra
magnitud usada como medida de la concentración en el efluente) frente al
volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana,
"cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.

22-Cromatografiar: Separar por cromatografía.

23-Cromatógrafo: El instrumento empleado para realizar una separación

 Cromatografía-Fundamentos
Separación de componentes de mezclas transportadas por
una fase fluida móvil a través de una fase estacionaria
sólida o líquida.

La separación está relacionada con la movilidad del soluto

y de un equilibrio en su distribución entre las dos fases.

Va a depender de : cargas ,masas, tamaños moleculares ,

polaridad y potenciales rédox etc.
 Clasificaciones de las técnicas
A) Según el mecanismocromatográficas.
de separación:
1- cromatografía de reparto:
Separación basada en las solubilidades de los analitos entre las fases móvil y
estacionaria.
Es función del llamado coeficiente de reparto entre ambas fases.
Se aplica para mezclas de compuestos de polaridad media y alta.
Ejemplos : cromatografía sobre papel.
2- cromatografía de adsorción:
Basada en al afinidad de adsorción de los componentes de una muestra entre la
fase estacionaria (sólida) y la fase móvil (líquida o gaseosa).
Por ejemplo la cromatografía en capa fina de colorantes verdes.
Clasificaciones de las técnicas
cromatográficas.
3- Cromatografía de exclusión:
Basada en efectos de exclusión tales como diferencia de
tamaño molecular (SEC) o forma geométrica o diferencias
de carga.
La cromatografía de permeación en gel (GPC).
Cromatografía de exclusión de iones .

4- Cromatografía de intercambio iónico.

Basada en la separación de solutos según su carga.
 Clasificaciones de las técnicas
cromatográficas.
B)-Según el estado de la fase móvil:
1- cromatografía de gases(fase móvil un gas).
1º-gas líquido.
2º gas –solido.

2-Cromatografía líquida (fase móvil es líquida).

a-Líquido-liquido.
b-liquido sólido.
c-de exclusión.
d-de intercambio iónico.
 Clasificaciones de las técnicas
cromatográficas.
C- Por técnica analítica(naturaleza del soporte de la fase estacionaria).
I)Plana:
A- cromatografía en papel.
B- Cromatografía en capa fina.

II) Columna:
1- cromatografía en columna.
2-HPLC.
3-Cromatografia gaseosa(GL-GS).
4- Cromatografía de intercambio iónico.
 Cromatografía en papel
-Combinación de cromatografía de partición y
adsorción ,dado que la fase estacionaria es el agua
retenida en el papel.

-Es una técnica de separación cualitativa.

-La fase móvil es líquida pudiendo ser un líquido puro o

mezcla de ellos.
 Cromatografía en papel
-Este se marca para definir la superficie el lugar de siembra y la
distancia que recorrerá el solvente.

-Puede ser ascendente (capilaridad) o descendente

( gravedad).

-La Tira se coloca en una cuba cerrada y saturada en la

atmosfera de la fase móvil.
 Cromatografía sobre papel.
-Se utiliza un revelador a menos que los analitos posean color
propio.

-Con los datos obtenidos y las condiciones de reacción se

calculan los Rf.

- El Rf se calcula con la relación entre la altura alcanzada por la

fase móvil y los distintos analitos.

-Es una relación menor que 1. Y depende de las condiciones de

la experiencia.
Cromatografía sobre papel.
 Cromatografía en capa fina(T.L.C.)

-Es una técnica analítica cualitativa para separar mezclas de sustancias

, combinada con otras puede ser semicuantitativa.

-la fase estacionaria se distribuye suspendida en agua sobre un

soporte inerte(vidrio ,Al).

-Tiene un espesor y composición determinada.

-La placa se deja secar y luego puede operarse una técnica por
partición o activando(secando) la placa a una temperatura y tiempo
 Cromatografía en capa fina(T.L.C.)
-Tiene como ventaja ,respecto de la cromatografía en columna que se
puede desarrollar simultáneamente estándar y muestra.

-Puede desarrollarse en dos dimensiones con dos solventes diferentes

y lograr una mejor separación.

-Las placas se utilizan una sola vez, por lo cual puede removerse los
analitos por raspado y recuperarlos.

-también se calcula el Rf relacionando la altura de la fase móvil y de

los distintos analitos. Dependiendo de las condiciones
Cromatografía en capa fina(T.L.C.)
-También se puede calcular el coeficiente de distribución o
reparto K del analito entre las dos fases.

- Se pueden utilizar fases estacionarias con fluorescencia para

resaltar analitos .

-O se utilizan reveladores que se aplican pulverizados finamente

o por saturación en la cuba cromatográfica.

- La técnica es ascendente desarrollándose por la capilaridad en

 Cromatografía en capa fina(T.L.C.)
Pasos de una T.L.C.
A- preparación de las placas.

B-Marcado de las placas . Activado de ser necesario.

C-Sembrado de las placas.

D-Corrida del solvente.

E-Revelado

F-Medida de los rf.

Cromatografía en capa fina(T.L.C.)
A- Preparado de las placas.
Se debe extender el adsorbente sobre el soporte en una fina película de espesor
parejo.
Elegir previamente el adsorbente y el espesor.
Pesar una cantidad determinada y se suspender en un volumen de agua.
(generalmente la proporción es 2:1).
Antes de los dos minutos extender utilizando un extensor y aplicador o en forma
manual.
Dejar secar al aire,
Protegida del medio ambiente.
 Cromatografía de capa fina(T.L.C.)
B- Marcado de las placas.
Las placas de vidrio pueden ser de 20 x 20 o 10 x 20 cm.
Ejemplo corrida en una dimensión:

Ejemplo corrida en dos dimensiones:

 Cromatografía de capa fina(T.L.C.)
C- Sembrado de las placas:
1-Previo al sembrado las placas deben activarse en estufa un tiempo y una
temperatura determinado (mecanismo de adsorción).
2-Luego se procede al sembrado.
3-se utiliza una pipeta Pasteur ,una jeringa ,micropipeta .
4-Se colocan pequeños círculos uno al lado del otro conformando una banda de no
mas de 2 cm. Separándolas al menos 2 cm entre sí.
5-Conviene sembrar los distintos estándar junto a la muestra.
 Cromatografía en capa fina(T.L.C.
D- Corrida del solvente.
Colocar la placa sembrada en la cuba cromatográfica ,teniendo cuidado que el nivel
de la fase móvil este por debajo de la línea de partida y la cuba este impregnada y
saturada del mismo .

Tapar y dejar transcurrir el tiempo para que la fase móvil alcance la línea final
marcada.
 Cromatografía en capa fina(T.L.C.)

E- revelado de las placas.

Una vez que el frente del solvente llega a la línea final se retira la placa y se
deja secar al aire.
Luego si los analitos no poseen color se
Realiza el revelado. Este puede ser por
Un rociado o por colocación en otra cuba
con una sustancia volátil que reacciona
Con los analitos(figura).
 Cromatografía en capa fina.T.L.C.
F- medida de la relación de frentes(Rf).
Distancia recorrida por el sustrato
Rf= ------------------------------------------------
Distancia recorrida por el solvente
Cromatografía en papel y T.L.C.
Cromatografía en papel y T.L.C.
Trabajo Práctico Nº -Métodos de separación cromatográfica.
A- Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
Objetivo: separar los componentes de los pigmentos verdes por una cromatografía
en capa fina de adsorción , utilizando como adsorbentes:
A- Silicagel G-60
B- Silicagel G-60 –F254.
Las bandas se extraerán y junto al extracto crudo se medirán espectros de
absorción.
fases móviles :mezclas de hexano : acetona en la proporción 70:30 y 50:50.

Reveladores: No se utilizarán y para el ensayo con soporte B ,luego se irradiara con

luz U.V de 254 nm par visualizar el contraste.
Soporte rígido: placas de vidrio de 20 x 20 y 10 x 20 cm respectivamente.
 Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.

Parte experimental:
A- Preparación de la muestra:
-Pesar la cantidad de espinaca a utilizar . Lavar y secar con un
trapo una cantidad suficiente de hojas, retirar los cabos y
nervaduras.

-Macerar en mortero con una mezcla de acetona 90% en agua ,

éter etílico o mezcla hexano-acetona 50:50.

-Pasar el líquido a una ampolla de decantación y añadir igual

volumen de éter etílico y el doble de volumen de ClNa 10%.
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-Extraer la fase etérea y repetir dos veces mas ,juntando
las fases en un recipiente con tapa esmerilada. Secar con
sulfato de sodio anhidro.

-Evaporar hasta sequedad ,sin llegar a sequedad y

lentamente , al baño María ,baño de arena ,corriente de
nitrógeno o al vacío el solvente( no usar llama abierta).

-Tomar el extracto con 3-4 ml de acetona o eter etílico en

tubo con tapa esmerilada y conservar en heladera.
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
B- Preparación de las placas:
-La proporción de Silicagel para un espesor de 0,25 mm en placas de
20 x20 cm es 5 g por placa , la mitad para las de 10 x 20 cm.

-La proporción de agua es 2 x masa de Silicagel , es decir en estos caso son 10

y 5 ml respectivamente por placa.

-Armar las placas perfectamente limpias en el extensor teniendo el cuidado

de colocar una placa de iniciación y otra de terminación y en el centro las que
serán corridas.

-Pesar la proporción necesaria de Silicagel y colocarla en un Erlenmeyer con

Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-Medir la cantidad de agua necesaria.

-Mezclar con movimientos de rotación de tal anera de evitar formación

de grumos

-Volcar sobre la placas y realizar la extensión con un movimiento firme

y que no se detenga hasta el final.

-Las placas deben estar sin irregularidades y ser uniformes.

-Remover con cuidado las placas del extensor y dejar secar 24 horas de
Cromatografía en capa fina ,extensor.
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
C-Marcado ,activado y siembra de las placas:
-Marcar con ayuda de una regla y una espátula según indica la figura ,lo sombreado
se debe remover y soplar evitando aspirar el polvo.

-Las placas se deben activar 30 minutos a 105ºc ,en estufa.

Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-Sembrar la muestra aplicando con un capilar tres gotas
una al lado de la otra y reforzar para que se forme una
banda , soplar para favorecer la evaporación.

-Separar al menos 2 cm entre las bandas dejando un

espacio de los bordes.

- Tener cuidado al marcar la línea de salida para que no se

interrumpa totalmente la placa y permita que ascienda la
fase móvil.
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
D- Preparación de las cubas cromatográficas y corrida de la muestra.
-Preparar las dos fases móviles a utilizar: Hexano-acetona 50:50 y 70:30.

-Colocar una volumen que no supere el nivel de 1,5 cm ,dentro de la cuba.

-asegurarse el cierre hermético de la misma y envolver los laterales con

papel de filtro ,para crea una atmosfera de fase móvil.

-Colocar las placas dentro con cuidado que no se rocen , tapar y dejar que
transcurra la corrida.

-cuando la fase móvil llega a la línea final marcada , retirar y dejar secar al
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-El cromatograma ideal debería tener como resultado el siguiente detalle:
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-Identificar los componentes separados ,medir los Rf .

-Comparar los resultados con las dos fases móviles utilizadas.

- Comparar dentro de las placas que corrieron en la misma

fase móvil y verificar si los resultados fueron similares ,
justificar.

-Luego raspar los componentes separados ,colocar en tubos

de ensayo con tapa y suspender en acetona.
Cromatografía en capa fina (T.L.C.)-separación de pigmentos verdes.
-Realizar un espectro de absorción de cada sustrato encontrado ,
barriendo entre 400 y 800 nm.

-Identificar los picos de máxima y comparar con el espectro del extracto

crudo.
-Utilizar celdas de vidrio para la corrida.

-El extracto crudo será utilizado para el práctico de la clorofila ya

explicado.

- El práctico puede replicarse utilizando zanahoria y tomate para

identificar la presencia de beta –caroteno y comparar con los pigmentos
B-Cromatografía en papel-separación de indicadores ácido-base.
Objetivo:
Separar una mezcla de indicadores ácido base a través de un mecanismo de
partición por cromatografía sobre papel.
Soporte y fase estacionaria:
papel de uso cromatográfico- agua contenida en papel.
Muestras :
Soluciones al 0,1% en alcohol de : Rojo Congo , rojo fenol, azul de bromofenol, azul
de bromotimol, púrpura de bromocresol, rojo de metilo ,fenolftaleína , tintura
universal.
Fase móvil:
Solución de alcohol isopropílico , agua , amoníaco concentrado en la proporción:
45:10:5
B-Cromatografía en papel-separación de indicadores ácido-base.
Cuba cromatográfica:
Cada grupo
-Dispondrá de dos probetas con tapón y un alambre en donde se colocará la tira de
papel.
- Se sembraran dos indicadores (como testigos) en una tira y en la otra tira
indicador universal .
Cortado y marcado de las tiras:
Las tiras de cortarán como para ajustarlas a una probeta de 100 ml,la línea de
partida a 2 cm del fondo y un recorrido de 15 cm.

Se marcará con lápiz un circulo de 0,5 cm aproximadamente para el sembrado de

la muestra.
B-Cromatografía en papel-separación de indicadores ácido-base.
Sembrado y corrida cromatográfica de la muestra .
-Sembrar con un capilar ,repasando al menos dos veces cada
indicador y soplando para favorecer la evaporación rápida del
solvente y evitar la difusión.

-Colocar fase móvil a una altura de 1,5 cm ,

en la probeta.

-Colocar la tira dentro de la probeta y

esperar que los vapores amoniacales hagan virar los indicadores
 Cromatografía sobre papel.
-Suspender la tira sumergida en la fase móvil y tapar la probeta.

-dejar que la fase móvil ascienda hasta la línea de llegada.

- Retirar las tiras una vez que se complete ,dejar secar , medir
los Rf de los indicadores puros y comparar con la tintura
universal.

-tabular los resultados de todos los ensayos.