MÉTODOS EXPERIMENTALES PARA EL

CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS

¿La ecuación de Michaelis-Menten

permite el cálculo exacto de parámetros
cinéticos?
El gráfico de la ecuación de Michaelis-
Menten no permite la determinación de los
parámetros cinéticos KM y Vmax debido a
que la Velocidad máxima existe solo en el
INFINITO de acuerdo al concepto de
hipérbola; por esta razón, los trabajos de
investigación en la rama de la Enzimología a
partir de los años 30, fueron orientados
hacia la búsqueda de una ecuación que
permita resolver este problema. Desde ese
punto de vista se tienen cuatro modelos
matemáticos de mucha importancia y que
serán considerados a continuación
 1.- Método de LINEWEAVER BURK
Estos dos investigadores solucionaron el problema invirtiendo la ecuación de
Michaelis-Menten (de allí el nombre de este método, ploteo de los inversos):
1 = [So] + KM
vo Vmx [So]
ordenando: 1 = [So] + KM
vo Vmx [So] Vmx [So]
simplificando y separando constantes de variables:
1 = KM 1 + 1
vo Vmx [So] Vmx
esta ecuación es de la forma y = mx + a y representa una línea recta con pendiente positiva que
no pasa por el origen
 La recta corta al eje “y” (cuando 1/[S]= 0) en el
punto 1/Vmx, un punto que existe realmente, por
0 lo tanto, el cálculo de Vmx se obtiene sacando la
inversa del valor de ese punto en la gráfica.
Asimismo, la recta corta al eje “x” (cuando 1/vo =
0) en el punto – 1/ KM con lo cual se puede
calcular también este parámetro.
Este modelo tiene la deficiencia de darle mucha
importancia a las mediciones hechas a bajas
concentraciones de sustrato, las que se encuentran
bien separadas en la gráfica, a diferencia de las de
alta concentración; por otro lado, las desviaciones
de la linealidad son menos evidentes que en otros
métodos (tapa errores).
 2.- Método de EADIE-HOFSTEE:
Este método toma como punto de partida la Ecuación de Lineweaver Burk; ambos lados
de la ecuación se multiplican por el factor vo (Vmx):
1 vo (Vmax) = KM 1 vo (Vmax) + 1 vo (Vmax)
vo (Vmax) [So] (Vmax)

Simplificando Vmax = KM 1 vo + vo
[So]
Reordenando: vo = - KM vo + Vmax
[So]
Esta ecuación representa una línea recta con pendiente negativa, que no pasa por el
origen; corta al eje vo en Vmx y al eje vo/[So] en el punto Vmax/K M y la pendiente es
igual a –KM
Esta ecuación representa una línea
recta con pendiente negativa, que
no pasa por el origen; corta al eje
vo en Vmx y al eje vo/[So] en el
punto Vmx/KM y la pendiente es
igual a –KM
 3.- Método de HANES:
Al igual que la anterior, parte de la ecuación de Lineweaver Burk, pero en
este caso se multiplica ambos términos de la igualdad por [S0] así:
1 [S0] = KM 1 [S0] + 1 [S0]
v0 Vmax [S0] Vmax
Simplificando y separando constantes de variables:
[So] = 1 [So] + KM
vo Vmax Vmax
Esta ecuación también es una función lineal a partir de la cual se pueden
obtener los valores de Vmx y KM como se muestra:
HANES
 4.- Método de EISENTHAL y CORNISH-BOWDEN:
En vista de las dificultades de los métodos anteriores para obtener valores de Vmx y K M,
aun con la ayuda de análisis estadísticos, Eisenthal y Cornish-Bowden (1974) sugirieron una
vía diferente, pero basada igualmente en la ecuación de Michaelis Menten.

La ecuación recíproca a un valor constante de [Eo] puede ser transformada de la siguiente

forma: 1 = KM + [So]
v0 Vmax [So]
Reordenando:
Vmax = KM + [So]
v0 [So]
Simplificando:
Vmax = KM + 1
v0 [So]
A valores constantes de v0 y [S0], el gráfico de Vmax en función de KM
es lineal. Al principio no parece tener sentido sugerir un gráfico de una
constante (Vmax) en función de otra constante (KM) aunque
matemáticamente la ecuación sea válida.

Cuando KM es igual a cero la Vmx es igual a la v0 y cuando Vmx es

igual a cero KM es igual a la [S0] con signo negativo; por lo tanto, cada
par de valores (v0,[S0]) puede ser utilizado para generar una línea,
marcando la v0 correspondiente en el eje de Vmax y la [So]
correspondiente con signo negativo (-[S]) en el eje de KM; estos dos
puntos se unen y se extrapola la recta. Las rectas para todos los pares de
valores deben pasar a través de valores reales de KM y Vmax, de modo
que estos valores deben estar dados por el punto de intersección de
todas las rectas.
 EISENTHAL Y CORNISH - BOWDEN

Sin embargo, debido a errores experimentales, las rectas pueden

interceptarse sobre un rango de valores, los cuales pueden ser arreglados
a través de las medianas de los valores obtenidos, a partir de la
intersección de las rectas. El ploteo de Eisenthal-Cornish es el que
permite detectar con más precisión los errores experimentales
EJERCICIOS
1.- Calcule la vo de una reacción cuando la concentración de
sustrato es igual a 10 KMs (expresada como porcentaje de la Vmax)

2.- Compruebe matemáticamente que la KM corresponde a aquella

concentración de sustrato donde se alcanza la mitad de Vmax.
TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las técnicas que permiten seguir el curso de una reacción enzimática pueden ser de dos tipos:
DISCONTINUAS y CONTINUAS; en el primer tipo, las observaciones no se hacen directamente
en la mezcla de reacción sino en alícuotas tomadas a diferentes tiempos, midiéndose en ellas la
cantidad de producto formado o sustrato que desaparece o alguna modificación del cofactor o
coenzima (si participa); esto nos proporciona un número dado de puntos por separado.

Otra alternativa más frecuentemente utilizada es la determinación de la reacción a un tiempo

determinado, lo que nos permite el análisis puntual de los productos formados en ese tiempo.
En este caso, para seguir el curso de la reacción en el tiempo, se requiere de la preparación de
varias mezclas de incubación por separado, en las que se detiene la reacción a tiempos
diferentes, para así poder construir la curva cinética.

Usualmente se requiere de por lo menos tres puntos para la determinación de la velocidad; uno
a tiempo cero, el segundo después de un intervalo de tiempo adecuado y el tercero después de
aproximadamente dos veces ese tiempo; esto permite chequear la linealidad de la curva en el
intervalo de tiempo seleccionado. Las técnicas discontinuas usualmente consisten en
estimaciones químicas del sustrato o del producto de la reacción.
TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
En las técnicas CONTINUAS por el contrario, las observaciones se realizan en
la mezcla, mientras ocurre la reacción, de modo que haciendo un número
largo de lecturas o mediante un registro automático, se pueden trazar u
obtener directamente las curvas cinéticas.

La mayoría de las técnicas utilizadas para seguir las reacciones enzimáticas son
de tipo continuo y son preferibles mientras sea posible. Con este tipo de
técnicas solo es necesario tomar un número suficiente de lecturas para estar
seguros de que se ha obtenido una línea recta. En muchos casos se puede
utilizar un registrador automático en cuyo caso, la velocidad es la pendiente
del trazado obtenido. En otros casos, el instrumento puede brindarnos
directamente la velocidad.
 MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL PRODUCTO,
SUSTRATO O MODIFICACIÓN EN EL COENZIMA O
COFACTOR, EN LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE
UNA ENZIMA

Existen muchos MÉTODOS para detectar la formación o desaparición de

alguno de estos elementos, en la determinación de la actividad de una
enzima, los más importantes los definiremos a continuación:
1.- Técnicas Espectrofotométricas

Si el sustrato o el producto absorben luz a una longitud de onda determinada, la reacción puede ser monitoreada siguiendo los
cambios en la absorbancia a esa longitud de onda, esto es respaldado por la ley de Lambert y Beer:
A=ε.c.l
Esto es generalmente verdadero para cualquier longitud de onda de luz visible (rango 400 – 700 nm) o ultravioleta cercano (de
200 a 400 nm).
En las determinaciones de velocidad, es posible que la absorbancia aumente o disminuya en el tiempo, pero debido a que en las
etapas tempranas, que son las mas cruciales de la reacción, se opera en la parte más sensible de la escala de absorbancia (las de
menor valor), es preferible que la DO aumente. Se prefieren instrumento de lectura directa, acoplados a registradores automáticos
que permiten seguir el curso de la reacción gráficamente.
Existen dos problemas principales en los métodos espectrofotométricos; en primer lugar, solo pueden ser utilizados
satisfactoriamente en las zonas de bajas absorbancias; valores altos, además de reducir la sensibilidad, producen desviaciones de
la ley de Lambert y Beer debido a interacciones de las moléculas de soluto en soluciones concentradas. En segundo lugar, se
pueden introducir errores cuando hay un valor de absorbancia de fondo alto, o cuando la muestra contiene material en
suspensión.
Las técnicas espectrofotométricas son ampliamente utilizadas para seguir el curso de una reacción enzimática y son preferidas a
cualquier otra técnica por su sencillez, simplicidad y sensibilidad. Un ejemplo clásico son las enzimas de óxido-reducción que
utilizan como cofactor al NAD+, donde se aprovecha la propiedad que tiene esta sustancia en su forma reducida (NADH), de
absorber selectivamente luz a una longitud de onda de 340nm.
2.- Técnicas Fluorimétricas

Los compuestos fluorescentes son aquellos que absorben la luz a una longitud de onda determinada y luego
emiten luz de una longitud de onda mayor. En general la FLUORIMETRÍA es varias veces (unas 100 veces) más
sensible que la espectrofotometría; sin embargo, los efectos de fluorescencia varían con la temperatura, por lo
que es muy importante controlarla.
Los coenzimas NADH y NADPH tienen la propiedad de fluorescencia, absorbiendo luz a 340 nm y emitiéndola a
460 nm; por consiguiente, las reacciones que utilizan estos coenzimas, pueden ser seguidas a través de estas
técnicas. Se utilizan ampliamente en el estudio de reacciones de hidrólisis, empleando sustratos sintéticos no
fluorescentes, los cuales son esteres de alcoholes o aminas altamente fluorescentes. Por ejemplo, la enzima
triacilglicerol lipasa puede ser monitoreada por la siguiente reacción:
TRIGLICEROL LIPASA

Dibutiril fluoresceína fluoresceína

en esta reacción el producto es fluorescente

Es importante indicar que tanto tirosina como triptófano fluorescen a 330-350 nm; si se tiene en cuenta que estos
aminoácidos están presentes en las enzimas, estos producen un alto fondo de emisión en la región UV. Por esta
razón es que es aconsejable utilizar la fluorimetría en los análisis enzimáticos, cuando la detección de sustancias
que emiten luz se hace en la región visible.
3.- Técnicas Electroquímicas
Muchas reacciones enzimáticas involucran la producción de un ácido o base a partir de un compuesto neutral (o
viceversa), por lo que el curso de esas reacciones puede ser seguido mediante el cambio del pH, a medida que la
reacción procede. Sin embargo existe un problema, el cambio del pH puede producir la inactivación de la enzima,
además, el efecto amortiguador que tiene la misma enzima, (por ser una proteína), y/o el del buffer empleado, pueden
influir en los cambios antes mencionados.

La mejor forma de monitorear el curso de estas reacciones es mediante el uso de un pH-stat; este equipo consiste en un
pH metro acoplado a una jeringuilla automática que actúa como bureta, y un circuito para desconectar el motor de la
bureta, cuando el pH de la mezcla de reacción se encuentra en el valor original fijado. A medida que la reacción
procede y el pH de la misma empieza a cambiar, se conecta el motor que fuerza el álcali (o el ácido) de la bureta a la
celda de reacción (la cual se mantiene en constante agitación), para recobrar el valor original de pH.

Un registrador automático acoplado a este instrumento permite obtener el gráfico de la cantidad de álcali o ácido
añadida en relación con el tiempo de reacción. De este modo el pH se mantiene aproximadamente constante y la
cantidad de álcali (o ácido) requerida para esto, es una medida de la velocidad de reacción. Este tipo de técnica se usa
ampliamente para monitorear la hidrólisis de esteres.
El pH Stat
CONDUCTÍMETRO
Muchas reacciones forman
iones que pueden ser
detectados a medida que
ocurre la reacción
4.-Técnicas Radioquímicas
La utilización de sustratos radiactivos permite el uso de
técnicas radioquímicas. Los isótopos mas frecuentemente
usados con propósito de marcaje son hidrógeno-3 (tritio),
carbono-14, fósforo-32, azufre-35 y yodo-131. Todos estos
isótopos emiten radiación beta (electrones) durante su
desintegración.
Para la utilización de estas técnicas se requiere que la reacción
proceda durante un tiempo fijo, posteriormente el sustrato se
separa del producto por técnicas cromatográficas o
electroforesis y la concentración del producto se determina
indirectamente por medición de la radioactividad de la fracción
de producto.
Las emisiones beta de alta energía 32P o 131I pueden ser
detectadas directamente con un contador Geiger-Müller,
mientras que las emisiones de baja energía (3H, 14C, 35S) son
usualmente monitoreadas por un contador de centelleo líquido.
Un ejemplo típico de análisis enzimático con este
procedimiento es la medición de la actividad de
colinesterasa, utilizando acetil colina marcada con
carbono 14:
CH3-COO-CH2-CH2N+(CH3)3 à CH3-COOH + HO-CH2-CH2N+(CH3)3
14 14
Acetilcolina ácido acético colina
Después de la incubación, el sustrato que no reaccionó y
la colina deben ser eliminados en una resina de
intercambio iónico y se determina la radioactividad de la
fracción de ácido acético.
Los procedimientos radioquímicos son extremadamente
sensibles pero tienen algunas desventajas, la
peligrosidad en la manipulación de radioisótopos y las
etapas de separación que deben realizarse.
5.- Técnicas microcalorimétricas
La microcalorimetria en el análisis enzimático está ganando cada vez mas importancia por su
sensibilidad, ausencia de interferencias y sus posibilidades casi universales de aplicación.

En la mayoría de las reacciones, se gana o se pierde calor (entalpía), a medida que la reacción
procede. En microcalorimetría la reacción se lleva a cabo bajo condiciones controladas en un
calorímetro y se monitorea el cambio de temperatura; estos cambios son muy pequeños, del orden
de 0,01 a 0,0001ºC, por lo que se requiere del uso de TERMOSTATOS DE ALTA PRECISIÓN,
conjuntamente con sensores de temperatura muy sensibles.

Pueden ser utilizadas reacciones secundarias con el buffer para incrementar la señal y así
aumentar la sensibilidad del procedimiento. Por ejemplo, un protón producido por la reacción
primaria puede ser atrapado por el buffer con producción de calor; en este sentido el Tris es muy
útil debido a que su calor de protonización es alto. La actividad de la hexoquinasa puede ser
estimada de esta forma, utilizando el buffer Tris a pH 8.
6.- Técnicas químicas
Actualmente muchas reacciones enzimáticas son seguidas con métodos discontinuos, donde a
determinados intervalos de tiempo se requiere de la estimación de la cantidad de sustrato o del
producto por técnicas químicas.

Un ejemplo clásico es la determinación de proteasas frente a sustratos naturales como hemoglobina,

caseína, etc. Esta técnica requiere de la adición de ácido tricloroacético a la mezcla de reacción
después de transcurrido un tiempo definido (que garantice el periodo de velocidad inicial). Los
filtrados o sobrenadantes que contienen los productos de la reacción, solubles en TCA, pueden ser
estimados mediante su absorbancia a 280 nm o la adición, en medio alcalino, del reactivo Folin
Ciocalteau (se produce un complejo de color azul debido a la reacción de los grupos aromáticos
presentes en estos productos (Phe, Tyr y Trp) que absorben luz a una longitud de onda entre 650 y 750
nm). En cualquiera de los dos casos, la actividad enzimática puede expresarse en términos de
micromoles de tirosina por unidad de tiempo.
 REACCIONES
ENZIMÁTICAS
MULTISUSTRATO

LAS REACCIONES BISUSTRATO

SON LAS MÁS COMUNES
REACCIONES ENZIMÁTICAS BISUSTRATO
La mayoría de las reacciones enzimáticas son de tipo bisustrato y biproducto, si
para la determinación de su cinética aplicamos la misma deducción que para las
reacciones monosustrato vistas en el capítulo anterior, no siempre se tiene en
cuenta que el valor de KM para un sustrato en particular, a una concentración
fija del cosustrato, puede no representar el valor real de KM, sino mas bien un
valor aparente que varia a medida que la concentración del cosustrato varia.
Asimismo, el valor de Vmx observado para un preparado enzimático, a
concentración saturante de uno de los sustratos, puede no ser el mismo valor de
Vmx observado cuando el otro sustrato es saturante. El verdadero valor de KM
para un sustrato dado es aquel determinado CUANDO TODOS LOS DEMÁS
SUSTRATOS SON SATURANTES. El verdadero valor de Vmx es aquel
CUANDO TODOS LOS SUSTRATOS ESTÁN PRESENTES A
CONCENTRACIONES SATURANTES.
 PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS PARA LA
DEDUCCIÓN DE LAS ECUACIONES DE VELOCIDAD
PARA REACCIONES MULTISUSTRATO

Si utilizamos el procedimiento convencional hecho por Michaelis y

Menten para deducir las ecuaciones de las reacciones multisustrato, el
proceso se hace un poco complicado en el sentido que hay muchos
términos por procesar, aunque al final se llega a las ecuaciones
correspondientes. Por esta razón, se han propuesto procedimientos
alternativos que faciliten estas deducciones; en este sentido es importante
resaltar la propuesta de KING y ALTMAN en 1956 que fue desarrollada
posteriormente en 1962 por WONG y HANES. Asimismo es importante la
propuesta de SEGEL en 1975.
 1. Reacciones de desplazamiento simple o secuenciales:
En estas, los dos sustratos deben estar presentes simultáneamente en el centro activo de la enzima, para formar un
complejo ternario EAB. Estas reacciones se pueden producir en dos formas, al azar (random) y ordenadas.

1.1. Al Azar o random: En ellas, cualquiera de los dos sustratos puede ingresar primero al centro activo
de la enzima, lo cual se representa de la siguiente manera:
Este comportamiento lo tienen muchas fosfotransferasas como la creatinofosfokinasa o creatino kinasa (CPK o CK),
cuyos sustratos son el ATP y la creatina, pudiendo cualquiera de los dos ingresar primero; asimismo, en el esquema se
puede apreciar que también la salida de los productos es al azar.
A B P Q

EA EQ

EB EP
E EAB EPQ E
e

B A Q P

Para nombrar una reacción bisustrato de acuerdo a la nomenclatura de Cleland, se especifican con: Uni si es uno, Bi
si son dos, Ter si son tres y Quad si son cuatro, sustratos o productos. El esquema de arriba es una reacción Bi bi
random; el primer bi corresponde al número de sustratos y el segundo bi, al número de productos.
1. Reacciones de desplazamiento simple o secuenciales
1.2. Ordenada: En ellas existe una secuencia obligatoria para el ingreso de los sustratos, de
modo que uno de los dos es el CONDUCTOR y el otro es el ACOMPAÑANTE:
A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E

Muchas deshidrogenasas que usan al NAD+ como coenzima se comportan de acuerdo a este
modelo, así por ejemplo la malato deshidrogenasa en donde el NAD + debe unirse primero y
luego el malato. De acuerdo a la nomenclatura de Cleland este esquema es de tipo Bi bi
ordenado, pues también los productos salen en orden.
2. Reacciones de doble desplazamiento o no secuenciales
Son también conocidas como reacciones de tipo PING PONG; en ellas, ingresa el primer sustrato y antes de
que ingrese el segundo, debe salir el primer producto; a continuación ingresa el segundo sustrato y luego sale el
segundo producto. En estas reacciones el primer sustrato reacciona con la enzima y origina una forma modificada
de la misma, habitualmente por la transferencia de un grupo funcional; en la segunda etapa este grupo funcional se
transfiere desde la enzima al segundo sustrato:
A P B Q

E EA FP F FB EQ E

Constituye un ejemplo de este tipo de mecanismo, la reacción catalizada por la transaminasa glutámico oxalacética
(TGO), que cataliza la transferencia de un grupo amino desde el aspartato hasta el alfa cetoglutarato. El aspartato que
actúa como SUSTRATO CONDUCTOR, se une primero a la enzima, el grupo amino del aminoácido es transferido
al piridoxal fosfato, cofactor de la enzima; quedando el aspartato transformado en oxalacetato, primer producto que
sale de la reacción. A continuación, ingresa el segundo sustrato el alfa cetoglutarato, el cual solo reconoce a su
enzima cuando esta última tiene unido covalentemente el grupo amino; una vez realizada la unión, el grupo amino
es transferido al cetoácido recién ingresado, la enzima recupera su forma original y sale el segundo producto, el
glutamato.
Es importante hacer notar que en el esquema, se observa la letra “F”, esta
corresponde a una segunda forma enzimática, en este caso, la enzima
aminada. Recordemos que de acuerdo a la nomenclatura de Cleland,
cuando existen varias formas enzimáticas durante la catálisis, éstas se
nominan como E, F, G, H, etc.; cada una de estas formas se supone que
son modificaciones covalentes de la enzima inicial.
La reacción del esquema será de tipo Bi bi ping pong.