Tema: 12. Obtencin y anlisis de datos cinticos.

1. Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten:

1.1. Orden cero de reaccin
1.2 . Orden uno de reaccin
1.3. Orden mixto de reaccin

2. Linearizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten:
2.1. Representacin de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
2.2. Representacin de Hanes
2.3. Representacin de Eadie-Hofstee.
2.4. Representacin lineal directa o representacin de Einsenthal y
Cornish-Bowden

1. Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten:
Estudio de acuerdo con el orden de reaccin
Dependencia de la velocidad con respecto a la [S]
| |
| | S Km
S
V v
+
= max
max max V
S
S
V
dt
dS
v = = =
t V So St
dt V dS
max
max
=
=
1.1. Orden cero de reaccin
S>>>Km
10 veces la Km
Integrando entre So y St y entre 0 y t
Permite comparar cantidades totales de enzima
Vmax1= kcat [E
01
]
Vmax2= kcat [E
02
]
| |
| | 2 max
1 max
02
01
V
V
E
E
=
La razn de las cantidades de enzima es proporcional a la razn de velocidades
mximas o de las actividades enzimticas obtenidas experimentalmente
Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en
circunstancias metablicas diversas, diferenciacin, patologas, etc
1.2. Orden uno de reaccin
S<<<<Km
A concentraciones 1/10 Km
| |
| | S Km
S
V v
+
= max
Km
S
V
dt
dS
v max = =
| |
t
Km
V
t St
So
e So St
t
Km
V
St
So
t
Km
V
So St
dt
Km
V
S
dS
max
0
max
ln
max
ln ln
max
- =
=
=
=
} }
Integrando entre S
0
y S
t

Conociendo cantidad incial de
enzima [Eo] puede obtenerse la
constante de especificidad (kcat/Km)
Obtener el valor de Vmax/Km
1.3. Orden mixto de reaccin
| |
| | S Km
S
V v
+
= max
( )
t
S S
Km Km
V
St
So
t
t V St So
So
St
Km
dt V ds
dt
dS
Km
dt V
S
S Km
dS
S Km
S
V
dt
dS
v
t o
St
So
t St
So
) ( 1 max
ln
1
max ln
max
max
max
0

=
= +
=
=
+

+
= =
} } }
Km
m
1
=
S Km
Dividiendo los dos trminos por Km y por t
Vmax
St
So
t
ln
1
t
S S t o ) (
Linearizacin de la ecuacin
integrada de M-M a S Km
Estudiando el avance de una sola reaccin cuando
estamos en orden mixto se pueden obtener:
Vmax y Km
Para obtener los parmetros cinticos de una enzima lo que solemos hacer
es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.
v frente a [S]
Lo primero es obtener los correspondientes parmetros cinticos.
2. Linearizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten
v
[S]
V
max

| |
| | S Km
S
V v
+
= max
H Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L
-1
) v
o
(mol L
-1
min
-1
)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representacin V [S].
Calclenlo ahora y escriban sus resultados en la
pizarra.
* Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y
Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta
representacin tiene ciertas ventajas, aparte de su valor histrico,
pero debido a su poco xito, en la bioqumica moderna, no
comentaremos nada ms sobre ella.
Como acabamos de ver la representacin de v frente a
[S] es poco til para estos fines, debido a:
- la dificultad para dibujar con precisin una hiprbola
rectangular
- la dificultad para encontrar las asntotas (Vmax), de
manera correcta, y consecuentemente para calcular Km
Analicen los datos.
Alguna conclusin?
Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con
mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o
mtodos. La mayora de ellos basados en la linealizacin de la
ecuacin de Michaelis-Menten
Quizs las tres representaciones ms usadas sean:
- Representacin de Linenweaver-Burk o de dobles inversos
(1/v 1/[S])
- Representacin de Hanes ([S]/v [S])
- Representacin de Eadie-Hofstee (v v/[S])
Adems de estas tres representaciones, basadas en la
linealizacin de la ec. de M&M, existe una curta basada en la
representacin directa v [S], o representacin de Einsenthal y
Cornish-Bowden.
- Si escribimos la ecuacin de Michaelis-Menten en su forma inversa,
obtenemos:
1 1 Km 1
---- = ------------- + ------------- ---------
v Vmax Vmax [S]
y = b + m x
( )
S V
Km
S V
S
v
S V
Km S
v
max max
1
max
1
+ =
+
=
2.1.Representacin de dobles inversos o de Linenweaver-Burk
1/v
1/[S]
1/Vmax
- 1/Km
m =Km/Vmax
o
-Pendiente Km/Vmax
-Corte en el eje-x 1/v =0 -1/Km
-Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax
1/v
1/[S])
La representacin ms utilizada, no es la ms recomendable ya que da
impresiones extremadamente engaosas de los errores experimentales: as para
pequeos valores de v, pequeos errores en la medida de v, conducen a grandes
errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeos
errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.
Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
La representacin de [S]/v frente a [S], da una recta:
y = b + m x
- Esta representacin se conoce como representacin de
Hanes, representacin de Woolf o de Hanes-Woolf.
2.2. Representacin de Hanes
| |
| | S
V V
Km
v
S
|
.
|

\
|
+
|
.
|

\
|
=
max
1
max
| |
| | S
S V
Km
V v

|
|
.
|

\
|
+ =
1
max max
1 1
| | | |
max max V
S
V
Km
v
S
+ =
[S]/v
[S]
Km/Vmax
- Km
m = tgo = 1/Vmax
o
Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,
corta en el eje [S] en un punto = - Km
* En esta representacin, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v
son un reflejo mucho ms fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este
motivo, la representacin de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuacin
de Michaelis-Menten.
[S]/v
[S]
Cmo afectarn los errores de medida de la velocidad de
reaccin en esta representacin?
Tarea 1 Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S
P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L
-1
) v
o
(mol L
-1
min
-1
)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representacin de Hanes.
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuacin de inversos por v * Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]

y reordenando

y = b - m x
Esta representacin se conoce como representacin
de Eadie-Hofstee
2.3.Representacin de Eadie-Hofstee.
| | S
v
Km V v = max
| |
max
1
max max
1 1
vV
S V
Km
V v

|
|
.
|

\
|
+ =
La representacin de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax
- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
v
v/[S]
Vmax
Vmax/Km
m = tgo = -Km
o
Esta representacin en general proporciona resultados
realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas
como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la
medida de v, harn que la curva se acerque o aleje del origen en
lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.
v/[S]
v
Esta representacin, contrariamente a la
de dobles inversos que hace aparecer
como buenos malos resultados, hace
aparecer como malos, buenos resultados,
dificultando grandemente el ocultamiento
de puntos que se desven de la recta.
Aspectos Positivos
Aspectos Negativos
Por lo que esta representacin es la ms
adecuada para el estudio de comportamientos
que se desven del modelo de Michaelis-Menten.
Tarea 2 Imaginemos que estamos estudiando una reaccin S
P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L
-1
) v
o
(mol L
-1
min
-1
)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representacin de Eadie-Hofstee.
Independientemente, en 1974:
- J. Jimnez Vargas y J.M. Macarulla. Fisicoqumica Fisiolgica,
Interamericana (4 Edicin), Madrid, (1974)
- R. Eisenthal y A. Cornish-Bowden. Biochem J., 139, 715-720,
(1974)
* Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los
anteriores, para la obtencin de Vmax y Km, conocido como
representacin lineal directa.
2.4.Representacin lineal directa o representacin de Einsenthal
y Cornish-Bowden
- La ecuacin de M y M podemos transformarla en la ecuacin
cannica de una recta en la que tratamos a Vmax y Km como
variables, y a [S] y v como constantes,
Dividiendo por v(S)
Reordenando,

1
max
=

+
S
Km
v
V
Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuacin la podemos escribir
| |
| |
| | ( ) | |
| | v
V
S
Km
S V S Km v
S Km
S V
v
max
1
max
max
= +
= +
+
=
Si el primer par de valores observados de v y [S] son v
1
y [S
1
] y
representamos la recta que definen:
Km
Vmax
v1
-S1
Si tomamos ahora un segundo par de valores observados:
v2 y (S2), ....
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....
- Como podemos observar, las distintas rectas se cortan,
intersecan, en un punto, comn a todas ellas, de coordenadas
(Km, Vmax).
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos
un punto, si no un entorno de puntos, y la media de las
coordenadas de estos puntos nos dar el valor medio de Km y
Vmax con sus correspondientes desviaciones estndar.
Km
Vmax
v1
-S1 -S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
- El nmero mximo de puntos de corte vendr dado por: [n(n-1)]/2,
donde n es el nmero de rectas.
Tarea 3. Suponga que estamos estudiando una enzima E que
cataliza la reaccin S P, y que obtenemos los siguientes datos
experimentales:
Concentracin inicial Concentracin de producto (mol L
-1
)

de sustrato (mmol L
-1
) a distintos tiempos (t = min)
t=0 t=1 t=2 t=3 t=4
5,0 0 150 300 450 600
6,5 0 180 360 540 720
10,0 0 235 470 705 940
20,0 0 325 650 975 1300
40,0 0 410 820 1230 1640
Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos
estudiados.
Resumen
Estudiada la ecuacin de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reaccin podemos
encontrar las siguientes circunstancias-
a) A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reaccin
La comparacin de actividades enzimticas en ordn cero de reaccin puede servir para
comparar cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metablicas.
b) A concentraciones de substrato menores que un dcimo de la constante de Michaelis, nos
encontramos en orden uno de reaccin.
c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una
ecuacin a partir de la ecuacin integrada de Michaelis-Menten permite determinar
graficamente los parmetros dinticos Vmax y Km estudiando la curva del avance de una
reaccin con respecto al tiempo

La ecuacin de Michaelis-Menten es una cnica, hiprbola que pasa por el centro de coordenadas
v:S, cuya asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad mxima.

Diferentes transformaciones algebricas permiten la linealizacin de la ecuacin de M-M para
una determinacin ms fcil de los parmetros Vmax y Km.
Entre estas se encuentran:
Representacin de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
Representacin de Hanes
Representacin de Eadie-Hofstee
Representacin lineal directa o representacin de Einsenthal y Cornish-Bowden