Importancia de los métodos de identificación de

Candida spp. en el diagnóstico de candidiasis

invasiva: Fundamentos y análisis de casos
clínicos.

Segunda Sesión Seminario Alemán

31 marzo de 2023

María Carolina Gutiérrez Galvis

Seminario II
Maestría en Microbiología

1
 Contenido

Candida spp. y Candidiasis Invasiva Métodos para la identificación de

Candida spp.

Biomarcadores para el diagnóstico

Complejos crípticos de especies
de Candidiasis Invasiva

Presentación y análisis de casos Conclusiones

clínicos

2
Candida spp. es un organismo comensal y patógeno oportunista
Dimorfismo
Alteraciones :
- Microbiota Levaduriforme Filamentosa
- Sistema inmune

Infección severa

Penetración directa

Colonización y penetración
endotelio

(GOW ET AL., 2012); (ALVES ID ET AL., 2020); (SUDBERY, 2011) 3

 Candidiasis invasiva (CI): Principal micosis oportunista a nivel hospitalario

70 – 90% del total de las Candidemia:

88% infecciones fúngicas en Mortalidad
infecciones fúngicas invasivas.
hospitalizados. 36 – 40%

La epidemiología de Candida spp. es variable:

 Área geográfica
 Condiciones clínicas de los pacientes
Impactos  Grupo etario
Principales especies
Especies Candida no albicans
( 90% aislamientos):
Candida albicans
Ceballos-Garzon et al., 2022
C. glabrata 123 aislamientos Hemocultivos
C. tropicalis (2016-2020)
C. parapsilosis  37.4% C. albicans
C. krusei  62.6% C. no albicans
 26,8% C. tropicalis
 19,5% C. parapsilosis
 8,1% C.auris
Factores de riesgo intrínsecos y
extrínsecos

(CORTES ET AL., 2020; NUCCI ET AL., 2013; COLOMBO ET AL., 2006, 2017) 4
 Métodos para la identificación y el diagnóstico de Candida spp.

Basados en cultivo
No basados en cultivo
“Gold Standard”

Identificación Identificación Biomarcadores en

Basadas en PCR
presuntiva definitiva suero

 1,3 β-D-Glucano (BDG)

 Ag Manano y Anti-Manano IgG Panel de sepsis BCID
 Anticuerpo tubo germinal
C. albicans CAGTA
 T2Candida

(Campus virtual de salud pública; (Cvsp/ops), 2021; Clancy & Nguyen, 2018) 5
 Métodos basados en cultivo para la identificación de Candida spp.
1. Métodos para identificación presuntiva

1. Caracterización macromorfológica en
medios ricos (SDA) y agar cromogénico
( CHROMagar Candida)

2. Caracterización micromorfológica
de medio líquido (extracto malta) o
sólido ( Agar Harina de Maíz)
3. Pruebas complementarias

Agar Tabaco Prueba tubo Prueba de

germinal clamidoconidias

(Campus virtual de salud pública; (Cvsp/ops), 2021) 6

 Métodos basados en cultivo para la identificación de Candida spp.
2. Métodos para identificación definitiva
Identificación bioquímica
Kits comerciales Ensayos de asimilación,
 Manuales: API20C aux, RapID Yeast Plus acidificación o
 Comerciales: Vitek 2 XL, Phoenix enzimáticos.

Identificación Molecular
Extracción ADN, PCR, secuenciación
ITS y Dominios D1/D2 LSU rRNA

Next Generation Sequencing (NGS)

Identificación por MALDI-TOF
“Proceso de ionización por desorción láser
asistida por matriz – Tiempo de Vuelo”

(Campus virtual de salud pública; (Cvsp/ops), 2021) 7

NGS basado en amplicones a partir de marcadores moleculares de levaduras para una
identificación rápida y precisa a nivel de especie.

Secuenciación del espaciador interno transcrito

(ITS) Filogenética, Microbiología clínica
Alto grado de variación Rastrear origen de las cepas

Secuenciación Sanger
Picos secundarios, heterogeneidad

Obstáculo en la identificación molecular

(Woo et al., 2010; Colabella et al., 2018) 8

 Biopsia hepática:
55 lecturas Candida tropicalis ( 98,21% de las lecturas totales de hongos)

(JIN ET AL., 2021) 9

 Métodos no basados en cultivo para la identificación de Candida spp.
Biomarcadores en suero

 1,3 β-D-Glucano (BDG)

Orienta diagnóstico de micosis profundas y fungemias

Ensayo indirecto colorimétrico o turbidimétrico mediado por la ruta
modificada de coagulación del lisado de amebocitos Limulus (LAL)

Sensibilidad: ~ 92% Especificidad: ~ 81% CI

 Ensayo de Manano y Anti-Manano

Mn: Principal componente pared celular Candida Spp. ( 7% dw)
Ensayo Inmunoenzimático en Sándwich ( ≥125 pg/mL)

Ac: Ensayo indirecto inmunoenzimático, IgG (≥ 10 AU/mL)

Sensibilidad: ~ 83% Especificidad: ~ 86%

Útil en candidiasis hepatoesplénica

(CLANCY & NGUYEN, 2018; BARANTSEVICH & BARANTSEVICH, 2022) 10

 Métodos no basados en cultivo para la identificación de Candida spp.
Biomarcadores en suero
 C. albicans Germ tube antibody (CAGTA)

Inmunofluorescencia indirecta
Detección de anticuerpos IgG contra (Hwp1) – Fase micelial
Discrimina entre infección y colonización

Sensibilidad: ~ 84,4% Especificidad: ~ 94,7% CI

 T2 Candida

Basada en amplificación ADN y resonancia magnética

Detección de sepsis por C. albicans, C. parapsilosis, C.tropicalis, C.krusei,
C. glabrata

Sensibilidad: ~ 91% Especificidad: ~ 99%

(CLANCY & NGUYEN, 2018; TROVATO ET AL., 2020; MONDAY ET AL., 2021 ) 11
 Complejos crípticos de especies y limitación de los métodos actuales para la
identificación
Complejos de especies: Relacionadas filogenéticamente con características fenotípicas similares.

Métodos de identificación MALDI-TOF; Métodos moleculares

presuntiva y definitiva*
Complejo Candida albicans
Complejo Candida parapsilosis
Complejo Candida glabrata
Complejo Meyerozyma
guilliermondii
Complejo Candida haemulonii
(Secuenciación RNA ribosomal) MALDI-TOF
C. dubliniensis, C. africana Depende de la base de datos, actualizadas;
C. orthopsilosis, C. metapsilosis in-house:
MBT 8468 (210 sp.) ; Vitek MS ( 82 sp.) ;
C. bracarensis, C. nivariensis
Saramis ( 121 sp.)
M. guilliermondii, C. fermentati,
C. carpophila
C. haemulonii var vulnera, Secuenciación de ITS
C. duobushaemulonii. Variación y diversidad intragenómica ITS.
C. pseudohaemulonii, C. auris* (Secuenciación Sanger)

C. duobushaemulonii: Resistencia C. bracarensis, C. nivariensis:

a Anfotericina B, azoles  Susceptibilidad reducida a azoles.

(CAMPUS VIRTUAL DE SALUD PÚBLICA (CVSP/OPS), 2021; QUINDÓS, 2014; CRISEO ET AL., 2015)
12
Presentación y análisis de casos clínicos

13
Caso clínico 1

(MOHD TAP ET AL., 2018) 14

 Descripción del paciente
Dolor abdominal tipo cólico. 1 mes antes
Heces blandas (1 semana) Afebril
Pérdida de peso y apetito
63 años

Durante el examen

No se observaron Pancitopenia:
Fiebre 38ºC linfadenopatías ni Leucopenia y
Pálido alteraciones en otros neutrófilos displásicos.
sistemas.

Diagnóstico probable: Neutropenia febril;

Descartar Síndrome mielodisplásico

(MOHD TAP ET AL., 2018) 15

 Terapéutica, exámenes realizados y evolución
Inicio:
Tazocin IV (PTZ) 4.5 gr/4v día Toma día 1 y 4:
Gentamicina IV 120 mg/día Hemocultivos y urocultivos
negativos
Día 9:
Toma día 9:
Fluconazol IV 400 mg/día
Hemocultivo positivo
( Febril 40ºC durante toda su estancia)
Levaduras (Gram)

Tomografía computarizada cerebral:

Sangrado en región parietal izquierda.
Día 15:
Imipenem IV 500 Imposibilidad de realizar cirugía
mg/día

Día 16 ( Intubación): Paciente fallece dos días

Escala M4, V2, E2: Daño cerebral severo después (~D18-D19)

(MOHD TAP ET AL., 2018) 16

 Análisis del Caso Clínico 1

De acuerdo con la descripción y evolución del paciente,

¿Qué factores de riesgo podemos identificar para sospechar
del desarrollo de Candidiasis Invasiva o Candidemia en este
paciente?

17
 Identificación micológica
Remisión al Laboratorio de
Micología del Instituto para la
Investigación Médica (IMR)

Hemocultivo positivo: Crecimiento a las 48 horas en

Levaduras SDA (35ºC)

Aislamiento dos colonias de diferente

color, CHROMagar y SDA para
pruebas de identificación. 30ºC

SDA: Colonias lisas, brillantes de color

crema (48h) Subcultivo en SDA y CHROMagar
Candida 30ºC (48h)

(MOHD TAP ET AL., 2018) 18

 Azul: UZ1446 48h Rosa-Violeta: UZ1447 120h
Caracterización micromorfológica de los Identificación por pruebas bioquímicas de asimilación de
aislamientos con azul de lactofenol y carbohidratos: API 20C y Vitek 2 System
Agar Harina de Maíz

Pruebas susceptibilidad
antifúngica: Identificación molecular:
E-test - MIC ITS y LSU (D1/D2) rRNA

(MOHD TAP ET AL., 2018) 19

UZ1446 UZ1447

Caracterización
micromorfológica de los
aislamientos

UZ1446 UZ1447

Agar Harina de Maíz

con Tween 80

(MOHD TAP ET AL., 2018) 20

CLSI 2012

Paciente fallece antes de

conocer los resultados de
susceptibilidad

(MOHD TAP ET AL., 2018) 21

 Análisis del Caso Clínico 1

¿Qué otros métodos se hubiesen podido implementar para

sospechar de una infección diseminada por Candida?

¿Que falencias desde el punto de vista de diagnóstico

microbiológico encuentra en el caso que llevó a un
desenlace fatal?

22
 Discusión del caso clínico 1
 El medio CHROMagar Candida es muy útil para la identificación de candidemias
mixtas (MC), que representan del 2 al 9.3% del total de candidemias. La falta de
incorporación en la práctica clínica puede imposibilitar la detección de infecciones
mixtas.

 Las especies de Candida poco comunes son difíciles de identificar por métodos
fenotípicos convencionales. Una base de datos limitada puede llevar a la
identificación incorrecta de las especies. Subregistro de infección por
determinadas especies.

 Los hallazgos encontrados explican el estado febril continuo del paciente a pesar
del tratamiento con fluconazol.

(MOHD TAP ET AL., 2018) 23

Caso clínico 2

(CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023) 24

 Descripción del caso
Enfermedad renal en etapa terminal (ESKD)
Diálisis peritoneal continua ambulatoria (CAPD) por 12 años
68 años

Historial de tres episodios previos de peritonitis:

Efluente “cloudy” (PDE), dolor abdominal y diarrea por 1 día.

Día 0: Recuento leucocitos PDE = 484 cel/uL (92% neutrófilos)

Toma de cultivos de PDE
Diagnóstico inicial: Peritonitis asociada a diálisis peritoneal (PD)

Cefazolina y Ceftazidima IP 1 gr/día

Día 12: Tratamiento inefectivo

Día 7: Cultivos del efluente Recuento leucocitos PDE = 1474 cel/uL (93% neutrófilos)
(PDE) negativos Efluente “cloudy”

(CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023) 25

 Descripción del caso
Cambio de tratamiento por Vancomicina IP 1 gr - 3 días

Día 13: Remisión de la bolsa de diálisis peritoneal al laboratorio de Microbiología del King
Chulalongkorn Memorial Hospital (KCMH) para identificación microorganismos. ¿Resultados?

Día 16: Cultivo del PDE inicial muestra crecimiento de

levaduras.

Diagnóstico: Peritonitis fúngica

Retiro del catéter de diálisis peritoneal y cambio a hemodiálisis.

Día 16 – Día 29:

Fluconazol oral 200 mg/día
Por 14 días

(CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023) 26

 Descripción del caso

Persistencia de dolor abdominal. Hinchazón intestinal sin patología específica

Día 30: Dada de alta. Hemodiálisis 3 veces/semana

Día 34: Paciente fallece por etiología desconocida.

Posible causa: Muerte asociada a peritonitis (Guías Peritonitis ISPD 2022)

(CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023) 27

 Identificación micológica

Identificación inicial del aislamiento por Vitek 2:

Low discrimination: Candida magnoliae y Candida norvegensis

Identificación por MALDI-TOF (Vitek MS IVD)

Candida nivariensis (99,9% confianza)

Confirmación de identificación
Análisis filogenético ITS y región hipervariable D1-D2.
Lecturas crudas:
 Candida nivariensis (98,3% similitud) ITS
 Candida nivariensis (100% similitud) LSU

(D., 2023; ARBEFEVILLE ET AL., 2017) 28

 Determinación de susceptibilidad antifúngicos

E test – Agar RPMI

Concentración mínima inhibitoria ( CLSI M27-A2)

Antifúngico MIC ( ug/mL)

Anfotericina B 0,038 (S)
Voriconazol 0,125 (S)
Fluconazol > 24 (R) Fluconazol: Tratamiento de elección de
acuerdo a las guías de peritonitis ISPD 2022
Itraconazol > 3 (R)
Caspofungina 0,5 (R)

(CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023;AL-HAQQAN ET AL., 2018) 29

 Análisis del Caso Clínico 2

De acuerdo con la descripción y evolución del paciente,

¿Qué factores de riesgo podemos identificar para sospechar
del desarrollo de Candidiasis Invasiva en este paciente?

¿Que falencias desde el punto de vista de diagnóstico

microbiológico encuentra en el caso que llevó a un
desenlace fatal?

30
 Discusión del caso clínico 2

 Los métodos convencionales de asimilación de sustratos no permiten discriminar

entre especies del complejo de Candida glabrata, dada sus similitudes fenotípicas,
resultando en una identificación incorrecta de la levadura.

 No existían reportes previos de tratamiento antifúngico para peritonitis asociada a

Candida nivariensis, por lo tanto, la elección del antifúngico a administrar se
realizó de acuerdo a lo establecido en la guía de manejo de peritonitis ISPD 2022.

 Se alerta sobre las limitaciones de los métodos actuales de rutina para la

identificación de levaduras.

CHAMROENSAKCHAI ET AL., 2023 31

 Conclusiones

 La implementación de diferentes métodos de identificación dentro de la rutina de la práctica

clínica es necesario y esencial para ampliar la detección de especies de Candida poco frecuentes
o clasificadas como especies crípticas, detectar candidemia o candidiasis invasiva mixta,
proporcionando resultados con oportunidad y certeza para el manejo clínico del paciente,
evitando la mortalidad.

 Resulta de vital importancia identificar correctamente a Candida a nivel de especie con el fin
que el personal médico pueda administrar una terapia antifúngica apropiada de acuerdo al
patrón de susceptibilidad propio de cada especie. De esta manera se evita un manejo incorrecto
del paciente y con ello un desenlace desfavorable.

32
Gracias!!

33
 Referencias bibliográficas

Al-Haqqan, A., Al-Sweih, N., Ahmad, S., Khan, S., Joseph, L., Varghese, S., & Khan, Z. (2018). Azole-
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How Candida overcomes host-imposed constraints during human colonization.
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Identificación y sensibilidad a los antifúngicos en levaduras del género Candida - 2021 | Campus Virtual de Salud Pública
(CVSP/OPS). (n.d.). Retrieved July 30, 2022, from https://www.campusvirtualsp.org/es/curso/identificacion-y-sensibilidad-
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 Nucci, M., Queiroz-Telles, F., Alvarado-Matute, T., Tiraboschi, I. N., Cortes, J., Zurita, J., Guzman-Blanco, M., Santolaya, M.
E., Thompson, L., Sifuentes-Osornio, J., Echevarria, J. I., & Colombo, A. L. (2013). Epidemiology of Candidemia in Latin
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