PEPTIDASAS

• Las peptidasas son

enzimas que catalizan la
hidrólisis de enlaces
peptídicos.
• Se clasifican según el
pH, especificidad del
sustrato y otros.
• Según el pH optimo que
tengan se denominan
peptidasas acidas,
neutras o alcalinas.
 CLASIFICACIÓN
También se clasifican de acuerdo a las similitudes que presentan
en sus estructuras tridimensionales y del mecanismo catalítico
que tengan. Algunas como:
• Serin-proteasas
• Tiol-proteasas
• Metal-proteasas
• Proteasas acidas
APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA
 MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales

- Se utilizara como hongo productor de enzimas el

Aspergillus Niger porque es un microorganismo con mayor
aplicación para producir enzimas extracelulares.
- Los sustratos sólidos a utilizarse serán cascaras de naranja,
cascaras de soja, yerba mate y platanus x hispanica (si es
posible conseguir).
- El medio basal salino contendrá los siguientes elementos:
• 10 g/l de MgSO4
• 10 g/l de NaCl
• 0,08 g/l de FeSO4
• Diferentes concentraciones de K2HPO4 y NaNO3
 PREPARACION DEL SUSTRATO SOLIDO
• El platanus x hispanica fue lavado,
secado y tamizado.
• Las cascaras de naranja se lavaron,
secaron y molieron.
• Las cascaras de soya se lavaron y se
molieron en un molino de trituración.
• La yerba mate se lixivió con agua a
80ºC y luego se secó.
 DETERMINACION DEL INDICE DE
ABSORCIÓN (WAI)
La WAI se determina para saber cuanta cantidad de agua es
capaz de absorber los sustratos solidos que se van a utilizar.
 SUSTRATOS Y MEDIO BASAL
Condiciones experimentales:
o Tiempo de incubación de 7 días
o Temperatura de 35°C
o Inoculación con 50000 conidios por 3 gramos de
sustrato solido.
Composición del suero y el medio basal:
• Contienen: 10 g/L MgSO4, 10 g/L NaCl, 0,08 g/L FeSO4,
43,5 g/L K2HPO4 y 5 g/L NaNO3.
Cantidad de liquido agregado al sustrato:
• 3 gramos*WAI (g liquido/ g sustrato).
 DISEÑO EXPERIMENTAL
Los factores que podrían afectan la producción de peptidasas se
determina por el diseño experimental de Plackett-Burman.
Los factores y niveles elegidos para la fermentación son las
siguientes:
1. Tiempo de incubación de 5 a 8 días.
2. Temperatura de incubación de 30 a 40°C.
3. pH inicial debe ser de 6 o 7.
4. Inoculación con 5000 o 50000 conidios por cada 3 gramos de
solido sustrato.
5. Concentración de NaNO3, 0 o 2,5 g/L.
6. Concentración de K2HPO3, 43,5 o 87,0 g/L.
7. Relación de masa SH a OP de 0,25 o 0,40 g/g.
 FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
 
 Los sustratos sólidos, el medio basal serán esterilizados en
autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
 Se colocará 3 g de cada sustrato hidratado de acuerdo con el
WAI, en una caja Petri con medio basal.
 Se dejara en reposo a T° ambiente por 24 H.
 FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
 Después de esto, los medios serán inoculados con una
suspensión de esporas de Aspergillus Niger.
 La fermentación se realizará a 35°C y 7 días, de acuerdo con las
condiciones experimentales.
 Recuperación, concentración y
purificación de PAN
 El extracto enzimático se recuperó añadiendo 10 ml de agua
destilada a cada caja Petri y agitando magnéticamente a 300
rpm durante 10 minutos.
 Esta suspensión se centrifugó a 10000 g durante 15 minutos a
4 ° C y se recuperó la fase acuosa que contenía peptidasas
extracelulares.
 Recuperación, concentración y
purificación de PAN
 Se añadió sulfato de amonio con agitación continua al
extracto enzimático extracelular para lograr una saturación
del 70%.
 Después de la precipitación a 4 ° C, la mezcla se centrifugó a
10000 g durante 15 minutos a la misma temperatura para
recuperar las enzimas precipitadas. El precipitado se
redisolvió.
 en un volumen mínimo de buffer fosfato 50 mmol / L pH 7 y
dializado contra el mismo buffer solución
 por 8 h a 4 ° C.
 La muestra dializada se analizó para determinar la actividad
de peptidasa y el contenido de proteínas.
ESTABILIDAD
 pH Y TEMPERATURA

 estabilidad en un rango de pH de 4–11

 mayor actividad de peptidasa se alcanzó en 65 ° C, se
logró una mayor estabilidad a 60 ° C después de 180
minutos de incubación.
 ACTIVIDAD DE LA PEPTIDASA
La actividad se determinó a 37 °C por el método de Folin
Ciocalteau utilizando caseina como sustrato.
• se añadió una alícuota de suspensión PAN a 600 μl de
solución de caseína de 2,5 g / l en tampón acetato-fosfato
Tris 50 mmol / l pH 9.
• Después de una incubación de 15 minutos, la reacción se
detuvo mediante la adición de 400 μl de 50 g / L de ácido
tricloroacético, seguido de centrifugación a 15000 g
durante 10 min.
• El sobrenadante (500 μL) se mezcló con 1250 μL de 0,44
mol / L de Na2CO3 y 250 μL de reactivo Folin-Ciocalteu.
• La absorbancia se midió a 600 nm después de la
incubación a 37 ° C durante 30 min.