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Peptidasa de Aspergillus niger NRRL 3: Optimización de su producción por fermentación en

estado sólido, puri fi catión y caracterización

Débora N. López una , si , C , Micaela Galante una , si , C , Germán Ruggieri una , Julia Piaruchi una , María E. Dib una ,
Natalia Montellano Duran una , si , Julia Lombardi una , si , Mariana de Sanctis una , Valeria Boeris una , si , C ,
Patricia H. Risso una , si , re , Darío Spelzini una , si , C , ∗
una Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Suipacha 531, Rosario, Argentina
si Consejo Nacional de Investigaciones Científicas fi cas y Técnicas (CONICET), Argentina
C Universidad Católica Argentina, Facultad de Química e Ingeniería del Rosario, Pellegrini 3314, Rosario, Argentina
re Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Veterinarias, Ovidio Lagos y Ruta 33, Casilda, Argentina

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Cáscaras de naranja, cáscaras de soja, Ilex paraguariensis y Platanus x hispanica fueron evaluados como sustratos sólidos para producir peptidasas a partir
Residuos agroindustriales Peptidasa fúngica de Aspergillus niger NRRL3 (PAN) bajo fermentación en estado sólido. La mezcla de cáscaras de soja y cáscaras de naranja permitió el desarrollo de hongos
extracelular Estabilidad del pH y mostró la mayor producción de peptidasa. Se encontró que las condiciones óptimas para la producción de PAN son las siguientes: relación de masa de
cáscaras de soja / cáscaras de naranja, 0.25; pH inicial, 7.05; K 2 HPO 4 4 43.5 g / L y 4.03 g / L NaNO 3; inoculación con 5000 conidios por 3 g de sustrato sólido;
Estabilidad de temperatura
condiciones de incubación, 30 ° C durante 5 días. En estas condiciones, la actividad de peptidasa fue de 1000 ± 100 UA / mL. La concentración de PAN se
realizó por adsorción en una matriz DEAE-celulosa. El puri posterior fi catión se llevó a cabo por gel fi Filtración en Sephadex G-100, con una pureza global fi factor
catiónico de aproximadamente 9. PAN demostró pertenecer al tipo serina de peptidasas, siendo su actividad de peptidasa más alta a 65 ° C. Sin embargo, la
proteólisis a 60 ° C resultó más adecuada debido a la di ff Referencias en la tasa de inactivación. Además, PAN mostró una alta estabilidad en un rango de pH
de 4 - 11. Teniendo todo esto en cuenta, en este documento describimos la producción y la pureza. fi catión de una serina peptidasa de Aspergillus niger NRRL3
para el fi primera vez

1. Introducción y los ácidos fumáricos son compuestos de valor agregado bien conocidos producidos por

A. niger. Además, dicho hongo produce muchos tipos de enzimas, como

Las peptidasas constituyen uno de los grupos más importantes de enzimas y se utilizan en
detergentes, así como en las industrias cervecera, cárnica, de cuero y láctea ( Bertucci, Liggieri,
Colombo, Vairo Cavalli y Bruno, 2015 ) De hecho, son uno de los grupos de enzimas más estudiados
debido a sus amplias aplicaciones como clari de cerveza. fi er, agente de despalillado, ayuda digestiva
y modi de proteínas fi er en procesamiento de alimentos ( Cimini, De Francesco y Perretti, 2017 ; Dey,
Adak, Bhattacharya y Banerjee, 2014 ; Yu et al., 2018 ) Además, las peptidasas se usan para producir
hidrolizados de proteínas con bioactividad mejorada o propiedades funcionales que pueden ser de
gran interés en la ciencia y tecnología de alimentos ( Agrawal, Joshi y Gupta, 2017 ; Segura-Campos,
Salazar-Vega, ChelGuerrero y Betancur-Ancona, 2013 ) Entre las varias especies de fi hongos
lamentosos adecuados para la producción de metabolitos y enzimas industriales, Aspergillus niger Es
sin duda uno de los más utilizados en las industrias. Cítrico, glucónico
α- amilasa, celulasa, amiloglucosidasa, glucosa oxidasa, catalasa, xilanasa, lipasa, peptidasa y
pectinasa ( Schuster, Dunn-Coleman, Frisvad y Van Dijck, 2002 )
La fermentación en estado sólido (SSF) consiste en el crecimiento de microorganismos en un
sustrato sólido humedecido. Aunque no hay agua libre, el contenido de humedad es suficiente para
mantener el crecimiento microbiano y el metabolismo ( Sandhu, Punia y Kaur, 2016 ) SSF presenta
varias ventajas sobre las fermentaciones sumergidas. En primer lugar, las condiciones de cultivo son
más similares a las del hábitat natural del hongo. En segundo lugar, la concentración de enzima
extracelular después de la extracción suele ser mayor que la obtenida por fermentación sumergida ( Mazotto,
Couri, Damaso y Vermelho, 2013 ) Finalmente, el uso de desechos agroindustriales en SSF hace que
la SSF sea más ecológica y económica que la fermentación sumergida ( da Luz et al., 2013 ) Las
industrias agrícola, alimentaria y forestal producen grandes cantidades de

∗ Autor correspondiente. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, CONICET, Suipacha 531, S2002RLK, Rosario, Argentina.

Dirección de correo electrónico: dspelzini@fbioyf.unr.edu.ar (D. Spelzini).

https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.09.013
Recibido el 17 de abril de 2018; Recibido en forma revisada el 7 de septiembre de 2018; Aceptado el 8 de septiembre de 2018

Disponible en línea el 10 de septiembre de 2018

0023-6438 / © 2018 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

DN López y col.
Diversos desechos que su eliminación inadecuada implica un impacto ambiental negativo. En
consecuencia, se han utilizado cada vez más como materias primas en SSF para resolver los
peligros ambientales ( John, Nampoothiri y Pandey, 2006 )
Los siguientes desechos biológicos contienen varias sustancias reutilizables de alto valor, lo que
las hace adecuadas para el crecimiento microbiano y la producción de enzimas: (a) Platanus x
hispanica ( Londres o avión híbrido) es uno de los árboles más comunes en algunos países como
Argentina, España y Uruguay. Después de que sus aquenios se liberan en primavera, se recolectan y
eliminan junto con los desechos domésticos ( Cedro, 2006 ) (si) Ilex paraguariensis Es un arbusto
ampliamente distribuido que crece en Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay. Sus hojas y tallos se
industrializan para preparar " la yerba mate ", un producto comercial utilizado para preparar " compañero ", agua por gramo de sustrato seco.
La bebida más popular en estos países. Una vez
" la yerba mate " se utiliza para preparar la infusión, se desecha junto con la basura doméstica sólida ( Valerga,
Reta y Lanari, 2012 ) (c) La cáscara de naranja se genera a partir de la extracción de jugo en plantas
industriales ( Torrado et al., 2011 ), cuya gestión es un problema importante para la industria
alimentaria. (d) La soja es uno de los cultivos más ampliamente cultivados en el mundo y su
procesamiento genera alrededor de 18 - 20 millones de toneladas de cascos ( Liu y Li, 2017 )
Además de la selección adecuada del sustrato sólido, las condiciones de cultivo como el pH y la
temperatura son de gran importancia en la producción exitosa de enzimas. Además, la producción de
peptidasa está profundamente en fl influido por la relación C / N, la densidad del inóculo, el tiempo de
incubación y la presencia de iones metálicos y azúcares fácilmente metabolizables ( Souza et al.,
2015 ) Las técnicas de optimización son e ffi herramientas cientificas para fi nd condiciones para
producir la mejor respuesta posible ( Kanimozhi, Moorthy, Sivashankar y Sivasubramanian, 2017 ) La
metodología de superficie de respuesta (RSM) se basa en el análisis de una respuesta como en fl influido
por varios factores y su objetivo es determinar la condición óptima de la respuesta ( Bezerra, Santelli,
Oliveira, Villar y Escaleira, 2008 ) Tari, Gögus y Tokatli (2007) optimizó tres parámetros utilizando
RSM para la producción óptima de α- amilasa por Aspergillus oryzae NRRL 6270 en SSF. Zhu, Han,
Chen y Han (2010) También se aplicó RSM para obtener el nivel óptimo de di ff Factores diferentes
para optimizar la extracción de astaxantina asistida por microondas de Pha ffi un rodozima
El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones óptimas para la producción de
peptidasas extracelulares fúngicas a partir de Aspergillus niger
NRRL3 (PAN) mediante la fermentación de residuos agroindustriales como sustratos sólidos. PAN
Puri fi catión y caracterización también se llevaron a cabo.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
La cepa fúngica utilizada en el presente estudio fue Aspergillus niger
NRRL3, que fue amablemente proporcionado por CEREMIC Rosario. El cultivo se mantuvo a 4 ° C en
inclinaciones de agar de malta. Los conidios de una inclinación completamente esporulada se
dispersaron en agua. Conidia quanti fi El catión se llevó a cabo mediante dilución en serie seguida de
recuento en placa.
Los sustratos sólidos no inertes utilizados fueron aquenos de Platanus x hispánica ( AP),
cáscaras de naranja (OP), cáscaras de soja (SH) y hojas
Ilex paraguariensis, comúnmente llamado como yerba mate (YM).
El medio basal salino contenía 10 g / L de MgSO 4; 10 g / l de NaCl;
0.08 g / L FeSO 4 4 y di ff Concentraciones diferentes de K 2 HPO 4 4 y NaNO 3)
El suero, amablemente proporcionado por la Cooperativa de Trabajadores Rurales Unidos Rosario,
también fue evaluado como medio basal. Los cascos de soja fueron amablemente donados por
Molinos Río de la Plata SA El aislado de proteína de suero (WPI) y la caseína se compraron de Sigma
Aldrich (St. Louis, EE. UU.).
Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado analítico.
2.2. Preparación de sustrato sólido
AP fueron lavados, secados y tamizados. OP fueron lavados, secados y
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suelo y las partículas retenidas por una malla de 297 μ m fueron seleccionados. Se lavaron y molieron
SH en un molino de trituración mecánico. YM se lixivió con agua a 80 ° C y luego se secó.
2.3. Determinación del índice de absorción de agua (WAI)
La WAI de sustratos sólidos se determinó de acuerdo con Orzua y col. (2009) . Los sustratos
sólidos (1,25 g) se suspendieron en 10 ml de agua destilada. La suspensión se agitó durante 1
minuto a temperatura ambiente y se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se
desechó, y el WAI se calculó a partir del peso del sustrato húmedo (g) y se expresó como gramos de
2.4. Producción de PAN por SSF utilizando desechos agroindustriales
2.4.1 Cribado de sustratos sólidos y medio basal
Todos los sustratos sólidos estudiados fueron fi Primero se analizó su capacidad para permitir el
desarrollo de hongos y producir peptidasas. Las condiciones experimentales se establecieron como
sigue: tiempo de incubación, 7 días; temperatura, 35 ° C; inoculación con 50000 conidios por 3 g de
sustrato sólido. Tanto el suero como el medio basal salino (que contiene 10 g / L de MgSO 4, 10 g / L
NaCl, 0.08 g / L FeSO 4, 43,5 g / LK 2 HPO 4 4 y 5 g / L NaNO 3) fueron analizados para hidratar los
sustratos sólidos. La cantidad de líquido añadido a cada sustrato se calculó como 3 g de sustrato *
WAI (g de líquido / g de sustrato). Los resultados de estas pruebas preliminares permitieron el diseño
experimental posterior, en el que solo se utilizaron los sustratos sólidos y medios basales más
adecuados.
2.4.2 Diseño experimental
2.4.2.1. Poner en pantalla de la signi fi hipocresía factores una ff ecting PAN
producción. Signi fi no puede factores a ff Se seleccionaron e identificaron la producción de peptidasa. fi ed
por el Plackett - Diseño experimental de Burman. La variable de respuesta ensayada fue la actividad
peptidasa. Los factores de fermentación y sus niveles elegidos fueron los siguientes: 1) tiempo de
incubación, 5 u 8 días; 2) temperatura de incubación, 30 o 40 ° C; 3) pH inicial (pH 0)
6.00 o 7.00; 4) inoculación con 5000 o 50000 conidios por 3 g de sustrato sólido; 5) NaNO 3 concentración,
0 o 2.5 g / L; 6) K 2 HPO 3
concentración, 43.5 u 87.0 g / L; y 7) relación de masa SH a OP, 0.25 o
0,40 g / g.
2.4.2.2. Optimización de la producción de PAN por respuesta superficie
metodología. Se aplicó un diseño central compuesto para determinar los niveles óptimos de los
factores que maximizan la producción de peptidasa. Los dos signi fi los factores no seleccionados de
la selección previa se analizaron en fi cinco niveles codificados ( - 1,42, - 1, 0, 1, 1.42) y
fi Se usaron cinco réplicas en el centro del diseño para estimar la suma de cuadrados de error. Se
realizaron un total de 13 experimentos.
2.4.3 Fermentación en estado sólido
Para producir PAN por SSF, los sustratos sólidos, el medio basal y el suero se esterilizaron en
autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Luego, se colocaron 3 g de cada sustrato, o una mezcla de
ellos, en una placa de Petri (90 x 15 mm). Los sustratos sólidos se hidrataron, de acuerdo con el WAI
determinado, usando medio salino basal o suero, y luego se dejaron reposar durante 24 ha
temperatura ambiente. Después de esto, los medios fueron inoculados con una suspensión de
conidios. La fermentación se realizó a una temperatura dada y durante un tiempo de incubación
seleccionado, de acuerdo con las condiciones experimentales.
2.5. Recuperación, concentración y puri. fi catión de PAN del extracto enzimático
extracelular
El extracto enzimático se recuperó añadiendo 10 ml de agua destilada a cada placa de Petri y
agitando magnéticamente a 300 rpm durante 10 minutos. Esta suspensión se centrifugó a 10000 g
durante 15 minutos a 4 ° C y se recuperó la fase acuosa que contenía peptidasas extracelulares.
DN López y col.
Dos di ff Se aplicaron diferentes metodologías para evaluar la mejor estrategia de concentración
de PAN. los fi El primero consistió en precipitación de sal seguido de diálisis. Se añadió sulfato de
amonio con agitación continua al extracto enzimático extracelular para lograr una saturación del 70%.
Después de la precipitación durante la noche a 4 ° C, la mezcla se centrifugó a 10000 g durante 15
minutos a la misma temperatura para recuperar las enzimas precipitadas. El precipitado se redisolvió
en un volumen mínimo de bu ff er fosfato 50 mmol / L pH 7 y dializado contra el mismo bu ff er solución
por 8 ha 4 ° C. La muestra dializada se analizó para determinar la actividad de peptidasa y el
contenido de proteínas (ver Sección 2.9 . Métodos analíticos). La segunda estrategia de concentración
consistió en la adsorción en una matriz de intercambio iónico. La adsorción se realizó con una matriz
DEAE-celulosa (Sigma-Aldrich; St. Louis, EE. UU.) Pre-equilibrada con bu ff er acetato 10 mmol / L pH
5. Veinte- fi Se pasaron cinco mililitros de extracto crudo a través de la columna (10 cm x 0,7 cm) y se
recogieron y agruparon fracciones de 1 ml que exhibían actividad de peptidasa.
Se aplicó cromatografía de exclusión por tamaño para purificar PAN. Las muestras
concentradas se pasaron luego a través de una columna Sephadex-G100 (Sigma-Aldrich; St. Louis,
EE. UU.) (10 cm × 0,7 cm) preequilibrada con bu ff er fosfato 50 mmol / L pH 7. El mismo bu ff Se usó
una solución para la elución. Se recogieron fracciones de 1 ml y se agruparon las que exhibían la
mayor actividad de peptidasa. Las muestras se liofilizaron y los rendimientos de recuperación del puri fi
Las fracciones ed fueron evaluadas por medio de la actividad de peptidasa y determinaciones de
contenido de proteína (ver Sección 2.9 . Métodos analíticos).
2.6. Electroforesis en gel
El puri fi El catión del extracto enzimático extracelular bruto se evaluó mediante electroforesis en
gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando β- mercaptoetanol como agente
reductor. La electroforesis en gel se realizó en un SDS-Tris-Glycine discontinuo bu ff er sistema (10%
de gel de apilamiento, 13% de gel de resolución) en un sistema de células miniPROTEAN 3 (Bio-Rad
Laboratories, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La electroforesis se realizó a
una intensidad constante de 40 mA. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante
de Coomassie (0,025% (p / v). Se usó una solución de 1 g / l de proteínas de suero como el estándar
de peso molecular. Dichas proteínas consisten en lactoferrina (86,000 Da), albúmina de suero bovino
( 67,000 Da), inmunoglobulina (55,000 Da), β- lactoglobulina (18.400 Da) y α- lactoalbúmina (14.300
Da).
2.7. Ensayos de inhibición
Se llevaron a cabo ensayos de inhibición para clasificar PAN según su tipo catalítico. Se
agregaron productos químicos a las soluciones PAN y se incubaron durante 15 minutos antes de
analizar la actividad de peptidasa. Fenilmetilsulfonilo fl uoruro (PMSF), un inhibidor de la serina
peptidasa; EDTA, un inhibidor de metalopeptidasa; y pepstatina, un inhibidor de la aspartil peptidasa,
se usaron en las siguientes concentraciones de trabajo: 1 mmol / L, 5 mmol / L y 1 mmol / L,
respectivamente.
2.8. mi ff Efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática y la estabilidad.
El e ff El efecto de la temperatura en la actividad peptidasa se determinó midiendo la hidrólisis de
caseína en el rango de 30 - 95 ° C. El e ff El efecto de la temperatura en la estabilidad del PAN se
determinó incubando el PAN en el intervalo de 30 ° C. - 90 ° C durante 1 h. Para determinar la
dependencia del tiempo de la estabilidad del PAN, se determinó la actividad residual de peptidasa a
60 y 65 ° C incubando PAN durante 180 min. El bu ff er medio fue TrisHCl 50 mmol / L pH 9.00 en
todos los casos.
El e ff El efecto del pH se determinó midiendo la actividad de peptidasa de PAN en el rango de
pH 2 a 12 en bu ff er acetato-fosfato-Tris 50 mmol / L usando WPI como sustrato. El pH-estabilidad pro fi
se determinó midiendo la actividad residual a pH 9 después de la incubación durante 8 ha varios
valores de pH, en el rango de 2 - 12)
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2.9. métodos analíticos
La composición de OP y SP se determinó siguiendo AOAC o ffi procedimientos ciales ( 1996 ) A
menos que se especifiquen otras condiciones fi ed, la actividad de peptidasa fue determinada a 37 ° C
por Folin - Método de Ciocalteau utilizando caseína como sustrato ( Cupp-Enyard, 2008 ) queso Brie fl y,
se añadió una alícuota de suspensión PAN a 600 μ L de solución de caseína de 2.5 g / L en 50 mmol
/ L acetato-fosfato Tris bu ff er pH 9. Después de una incubación de 15 minutos, la reacción se detuvo
mediante la adición de 400 μ L de 50 g / L de ácido tricloroacético, seguido de centrifugación a 15000
g durante 10 minutos. El sobrenadante (500 μ L) se mezcló con 1250 μ L de 0.44 mol / L Na 2 CO 3 y 250
μ L de Folin - Reactivo de Ciocalteu. La absorbancia se midió a 600 nm después de la incubación a 37
° C durante 30 minutos. Una unidad arbitraria (AU) de actividad enzimática fue de fi ned como la
cantidad de enzima que causó un cambio en la absorbancia de
0.01 unidades. Proteína cuanti fi catión se llevó a cabo por el método de Bradford ( Bradford, 1976 )
2.10. análisis estadístico
Las condiciones óptimas de producción de PAN se evaluaron mediante un diseño de
Plackett-Burman para la fase exploratoria y un diseño compuesto central para la fase de
optimización. El signi fi La cancelación de los factores se determinó mediante análisis ANOVA o
pruebas de t-Student. Signi fi no puedo di ff Las conclusiones se analizaron mediante valores p (p
<0,05). La normalidad de los residuos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. El software
utilizado para el diseño experimental, para el análisis de varianza y para probar la distribución normal
de residuos fue Design Expert 6 y Sigma Plot 11, ambos en una versión de prueba.
3. Resultados y discusión
3.1. Cribado de sustrato sólido
WAI se determinó para los cuatro materiales que pueden usarse potencialmente como sustratos
sólidos. Los resultados obtenidos se muestran en tabla 1 . WAI es la cantidad de agua que puede ser
absorbida por un material. Se prefieren los sustratos con un alto WAI ya que su contenido de
humedad puede ser modi fi ed durante la cultura de estado sólido. De hecho, A. niger cepas en
cultivos de estado sólido necesitan el modi fi catión del contenido de humedad de los medios
absorbentes ( Robledo et al., 2008 ) Teniendo esto en cuenta, OP podría proponerse como un
sustrato sólido adecuado, ya que registró la WAI más alta.
Varias condiciones medias a ff ect tanto el crecimiento de A. niger y la producción de peptidasa.
Entre ellos, la composición del sustrato sólido y del líquido utilizado para hidratar el sustrato sólido
debe considerarse particularmente debido a su gran importancia. En experimentos preliminares, una
incubación de 7 días demostró ser apropiada para el crecimiento de A. niger y el desarrollo de la
actividad peptidasa. Además, se observó que la producción de peptidasa era insignificante cuando el
fi El pH final del extracto enzimático fue inferior a 5,10. Para evitar una fuerte disminución del pH, K 2 HPO
3 se añadió al medio basal para ajustar el pH 0 0 y para prevenir un acidi rápido fi catión de la cultura.
tabla 1
Índice de absorción de agua de los cuatro sustratos sólidos analizados una .
Sustrato sólido WAI (ml H 2 O / g sustrato sólido)
AP 3.8 ± 0.4 si
OP 6,9 ± 0,2 una
SH 3.6 ± 0.7 si
YM 4.0 ± 0.4 si
una Medias ± desviación estándar de ensayos por triplicado. Los valores medios en la misma
columna seguidos de la misma letra no son significativos fi cantly di ff erent (p> 0.05).
DN López y col.
Figura 1. Actividad de peptidasa después de la fermentación en estado sólido de A. niger NRRL 3 en di ff Desechos
agroindustriales diferentes.
Figura 1 muestra el crecimiento de A. niger y la actividad peptidasa obtenida después de una incubación
de 7 días en cada medio sólido.
Cabe señalar que AP no era apropiado para apoyar A. niger
culturas Por otro lado, OP y YM mostraron el mayor crecimiento, mientras que OP y SH mostraron la
mayor actividad. La presencia de suero no mejoró ni el crecimiento ni la actividad de peptidasa (p =
0.4509); así, los experimentos posteriores se llevaron a cabo utilizando un medio salino para hidratar
los sustratos sólidos.
La combinación de di ff Se han estudiado previamente sustratos sólidos diferentes y tanto
antagonistas como sinérgicos e ff se han encontrado efectos entre ellos ( de Castro et al., 2015 ) Por lo
tanto, la actividad de peptidasa se determinó después de la fermentación en medios sólidos que
contienen mezclas binarias de OP y SH. La SSF realizada usando mezclas OP-SH causó una mayor
actividad de peptidasa que en los otros medios analizados.
La producción de peptidasa por SSF puede ser un ff afectado por la composición de los sustratos
y por varios factores de cultivo. Una vez que se seleccionaron los dos componentes del sustrato
sólido, se determinó su composición química y se muestra en Tabla 2 .
Se cree que la presencia de fuentes de proteínas induce la secreción de proteasa por el
microorganismo ( de Castro, Nishide y Sato, 2014 ) Según nuestros resultados, las mezclas de OP y
SH fueron apropiadas para ser utilizadas como fuentes complejas de carbono y nitrógeno para los
cultivos de hongos con el fin de producir peptidasa extracelular.
3.2. Selección de las condiciones apropiadas para la producción de peptidasa a partir de A niger NRRL 3
Para seleccionar el más significativo fi factores que no pueden ff ect producción de peptidasa
durante la SSF de A. niger, un Plackett - Se realizó el diseño experimental de Burman ( Chauhan,
Trivedi y Patel, 2007 ), ensayando di ff Factores diferentes, como la composición de los medios de
cultivo (relación de masa del sustrato sólido, concentración de sal y pH 0) las condiciones de cultivo
(tiempo y temperatura) y el inóculo, como se muestra en Tabla A
Tabla 2
Composición química (%) de los sustratos sólidos seleccionados una .
Componentes químicos (%) OP
Humedad (AOAC 925.10) 9.0 ± 0.2 una
Lípidos (AOAC 920.85) 1.1 ± 0.5 una
Proteína (AOAC 920.87, Factor 5.70) 4.2 ± 0.1 una
Ceniza (AOAC 923.30) 3.1 ± 0.2 una
Carbohidratos 54 ± 1 una
Fibra (AOAC 973.18) 28,7 ± 0,4 una
una Medias ± desviación estándar de ensayos duplicados. Los valores medios en la misma fila seguidos de
la misma letra no son significativos fi cantly di ff erent (p> 0.05).
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(Material suplementario).
Se realizó un análisis de regresión múltiple de los datos para determinar el significado fi no puede
factores a ff Producción de peptidasa. Aunque la producción de peptidasa se observó en casi todas las
condiciones analizadas, lo que con fi rms que las combinaciones de los componentes seleccionados
para el sustrato sólido fueron apropiadas, la actividad fue extremadamente baja en los casos en que fi
El pH final de los medios cayó por debajo de 5.10 ( Tabla A de material complementario), como se
indicó anteriormente.
Para aumentar la simetría de los datos analizados, se aplicó una transformación de raíz
cuadrada a la actividad de peptidasa antes del análisis de varianza. De acuerdo con el ANOVA que
se muestra en Tabla B (Material complementario), el más significativo fi no puede factores a ff La
producción de peptidasa fue el pH 0 0 y el NaNO 3 concentración. La normalidad de los residuos fue
con fi confirmado por la prueba de Shapiro-Wilk (p = 0,104), cuya hipótesis nula es que la muestra
proviene de una población normalmente distribuida.
3.3. Optimización de la producción de peptidasa.
Se usó un diseño compuesto central para analizar el e interactivo ff ect de los dos significados fi factores
no pueden, pH 0 0 y NaNO 3 concentración, y para lograr una condición óptima para la producción de
peptidasa. La mayoría de los no firmantes fi factores no pueden - el tiempo de incubación, la
temperatura, el inóculo y el K 2 HPO 3 concentración: se ajustaron de tal manera que se minimizaran.
Los restantes no signi fi No se puede factorizar: la relación OP / SH se maximizó ya que OP es
económicamente más conveniente que SH.
Los resultados ( Tabla C de material suplementario) fueron modelados con la siguiente ecuación
(R 2 = 0.8516), que incluye el signi fi no puede, así como los términos jerárquicos: actividad de peptidasa
(AU / mL) = - 1.39,10 4 + 3.8 10 3 pH 0 + 7.14,10 2
[NaNO 3] ( g / l) - 2.7 10 2 pH 02 - 88,65 [NaNO 3] ( g / l) 2 (1)
Aunque ambos pH 0 0 y NaNO 3 signi fi cantly a ff producción de peptidasa efectuada, no hubo
interacción entre ellos (p = 0.2133), como se muestra en Tabla D (Material suplementario). Así, el
término pH 0 *
NaNO 3 no estaba incluido en la ecuación (1) . El análisis de varianza mostró que solo existe un 0,37%
de probabilidad de que la variación total se deba al ruido y que no falte fi t (p = 0,0666). La normalidad
de los residuos fue con fi rmed por la prueba de Shapiro-Wilk (p = 0.798).
Los datos obtenidos y la superficie de respuesta generada a partir del modelo se muestran en Figura
2.
SH
8.4 ± 0.3 si
0.6 ± 0.3 si
8.3 ± 0.2 si
4.9 ± 0.2 si
17 ± 1 si
60,9 ± 0,3 si
Figura 2. Curva de superficie de respuesta de la producción de peptidasa en función de NaNO 3
concentración y pH 0.
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La superficie convexa trazada en Figura 2 sugiere que un pozo de fi Se encontró una condición
operativa óptima. Para validar el modelo predictivo mencionado anteriormente, los valores de pH 0 0 y
NaNO 3 la concentración que maximizó la producción de peptidasa se determinó y resultó ser pH 0 0 7.05
y 4.03 g / L NaNO 3) Varios autores también han informado de la producción de peptidasas a partir de A.
niger ser óptimo cuando el pH 0 0 fue 7 ( Ahmed, Zia, Iftikhar e Iqbal, 2011 ; Paranthaman,
Alagusundaram e Indhumathi, 2009 ) Sobre el NaNO óptimo 3

concentración, no hay coincidencia con otros estudios, probablemente debido a la di ff Se utilizan

diferentes sustratos sólidos y su variado contenido de nitrógeno ( Braaksma, Smilde, van der Werf y
Punt, 2009 ) De acuerdo con la ecuación (1) , una fermentación realizada bajo óptimo

las condiciones producirían una actividad enzimática máxima de 931.5 UA / mL. En un conjunto
separado de experimentos de validación realizados por quintuplicado para verificar las predicciones,
la actividad de peptidasa (AU / mL) fue de 1000 ± 100, que está dentro del valor predicho. La
actividad enzimática para la producción de estado sólido se expresa comúnmente por gramo de
sustrato sólido. En este caso, cada gramo de mezcla de sustrato sólido produjo 3300 ± 300 UA.

Fig. 3. SDS-PAGE del extracto enzimático crudo (carril 1), el concentrado obtenido después de la
adsorción con una matriz DEAE-celulosa (carril 2) y el puri fi fracción ed obtenida por cromatografía de
3.4. Concentración y puri fi catión de PAN exclusión por tamaño (carril 3). El carril 4 corresponde a marcadores de peso molecular.

Existen muchos estudios que informan la concentración exitosa de peptidasas fúngicas

mediante el fraccionamiento con sulfato de amonio y diálisis ( Krishnan y Vijayalakshmi, 1986 ) Sin
Tabla 4
embargo, este método no era apropiado para esta enzima ya que la actividad de peptidasa
mi ff ect de di ff Inhibidores de peptidasa diferentes sobre la actividad de peptidasa de puri fi ed PAN una .
disminuyó abruptamente (de 1005 a 255 UA / mL) después de la diálisis. El negativo e ff El efecto del
fraccionamiento de sulfato de amonio sobre la actividad enzimática se había informado previamente
Condiciones Actividad de peptidasa (AU / mL)
sobre una enzima de coagulación de la leche obtenida de A. niger

bu ff er 360 ± 10 si
( Osman, Abdel-Fattah, Abdel-Samie y Mabrouk, 1969 ) El mejor procedimiento para concentrar y 1mmol / L PMSF 0 ± 9 una

purificar PAN fue la adsorción en una matriz DEAE-celulosa seguida de gel fi Filtración en Sephadex
G-100. También se ha informado que estos métodos son útiles para purificar una amplia variedad de
peptidasas fúngicas ( Esparza et al., 2011 ) La concentración de PAN por adsorción en una matriz
DEAE-celulosa permitió aumentar las especi fi c actividad casi dos veces debido a la disminución en
el contenido de proteínas. Puri fi El catión con cromatografía de exclusión por tamaño permitió reducir
aún más la concentración de proteínas, lo que resultó en una purificación global. fi factor catiónico de
9 y un rendimiento de recuperación del 36%. Los resultados se muestran en Tabla 3 .
Para evaluar el puri fi Se llevaron a cabo estrategias de cationes, geles de electroforesis en
condiciones desnaturalizantes y reductoras ( Fig. 3 ) Una amplia gama de pesos moleculares de
peptidasas de A. niger Ha sido reportado ( Ahmed et al., 2011 ; Coral, Arikan, Unaldi y Guvenmez,
2003 ; Devi, Banu, Gnanaprabha, Pradeep y Palaniswamy, 2008 ;
Esparza et al., 2011 ; Mazotto et al., 2013 ) Como se puede ver en el gel de electroforesis, el extracto
enzimático crudo mostró dos bandas, correspondientes a polipéptidos de pesos moleculares de 14 y
16 kDa (carril
1) La intensidad de estas bandas se mejoró después de la adsorción con una matriz DEAE-celulosa
(carril 2). Por el contrario, estas bandas fueron menos intensas después del puri fi catión por
cromatografía de exclusión por tamaño, debido a la dilución de la muestra (carril 3).
1 mmol / L de pepstatina 360 ± 10 si
5 mmol / L EDTA 350 ± 20 si
una Medias ± desviación estándar de ensayos por triplicado. Los valores medios en la misma
columna seguidos de la misma letra no son significativos fi cantly di ff erent (p> 0.05).
a su tipo catalítico. Los resultados se muestran en Tabla 4 . PMSF inhibió completamente PAN,
mientras que EDTA y pepstatina no causaron e ff ect sobre la actividad de peptidasa (p = 0.533).
Estos resultados sugieren que PAN pertenece al grupo de serina peptidasa. Aunque parte de las
peptidasas de A. niger NRRL 3 fue reportado como clasi fi ed como serina peptidasas ( Ahamed, Singh
y Ward, 2007 ), es el fi La primera vez se han producido a partir de la mezcla de OP y SH.
Desde las peptidasas más frecuentemente estudiadas de A. niger son clasi fi ed como aspartil
peptidasas, la caracterización de la producción de serina peptidasa a partir de A. niger puede
proporcionar información valiosa para la industria alimentaria. De hecho, Alcalase y Novozym son
serina peptidasas comerciales con amplia aplicación en ciencia de alimentos ( Tavano, 2013 ) La
dependencia de la actividad peptidasa de la temperatura se muestra en
Fig. 4 A.
La temperatura óptima de PAN fue de 65 ° C y al menos el 40% de la actividad de peptidasa se
mantuvo cuando se midió en el rango de temperatura 30 - 75 ° C. Aunque hay informes anteriores que
muestran que algunas peptidasas de A. niger eran termoestables Devi et al., 2008 ), se encontró una

3.5. Caracterización de PAN gran variedad de temperaturas óptimas en la temperatura óptima informada, probablemente debido
no solo a variaciones en la tensión de

Se llevaron a cabo ensayos de inhibición para clasificar el PAN según

Tabla 3
Puri fi estrategia catiónica de PAN obtenida bajo SSF una .

Actividad de peptidasa (AU / mL) Concentración de proteínas (mg / ml) Speci fi c actividad (U / mg) Puri fi catión Rendimiento (%)

Extracto enzimático crudo 1000 ± 40 0.88 ± 0.03 1100 ± 80 1.00 100

DEAE-celulosa 900 ± 40 0.42 ± 0.02 2200 ± 200 1.9 ± 0.3 90 ± 7
Sephadex G-100 360 ± 20 0,034 ± 0,001 11000 ± 900 9±1 36 ± 3

una Medias ± desviación estándar de ensayos por triplicado.

489
DN López y col. LWT - Food Science and Technology 98 (2018) 485–491

Fig.4. mi ff El efecto de la temperatura (A) y el pH (B) sobre la actividad y la estabilidad del PAN obtenido bajo SSF. Círculos rellenos: determinación de condiciones óptimas de pH y temperatura para la actividad de peptidasa.
Círculos vacíos: determinación del rango de estabilidad de pH y temperatura.

A. niger pero también a las condiciones culturales ( Novelli, Barros y Fleuri, 2016 ; rango (4 - 11) ( Abidi, Chobert, Haertlé y Marzouki, 2011 ) Las peptidasas comerciales de
Tsang, Butler, Powlowski, Panisko y Baker, 2009 ) Sin embargo, la temperatura óptima de PAN es microorganismos tienen una actividad máxima en el rango de pH de 8 a 12 ( Yadav, Bisht, Tiwari y
similar a la encontrada para las peptidasas de Bacillus sp ( Beg y Gupta, 2003 ; Deng, Wu, Zhang, Darmwal, 2015 ) El pH estabilidad pro fi El archivo de PAN mostró que es altamente estable en el
Zhang y Wen, 2010 ) pero superior a la temperatura óptima notificada para varias peptidasas de Aspergillus rango de pH 4 - 11, que retiene más del 80% de la actividad residual.
sp ( Tunga, Shrivastava y Banerjee, 2003 ;

Wang, Chen y Yen, 2005 ) Además, la temperatura óptima de PAN fue similar a la del extracto
4. Conclusión
enzimático crudo de los hongos termofílicos.
Thermoascus aurantiacus, estudiado por Merheb, Cabral, Gomes y DaSilva (2007) y Thermomyces
La producción de una serina peptidasa a partir de Aspergillus niger NRRL3 se llevó a cabo
lanuginosus, estudiado por Li, Yang y Shen (1997) , que exhibió una actividad proteolítica óptima a
mediante fermentación sólida de una mezcla de SH y OP en una proporción de 0,25: la mezcla se
altas temperaturas (60 ° C y 70 ° C, respectivamente).
inoculó con 5000 conidias por 3 g de sustrato sólido y se incubó a 30 ° C durante 5 días. El medio
salino basal se optimizó, las condiciones óptimas fueron a pH 0 0 7.05 y
Con respecto a la estabilidad de la temperatura, PAN fue estable en el rango de 30 a 65 ° C. La
mayor actividad de peptidasa se midió cuando PAN se incubó a 50 ° C, de acuerdo con lo que se
4.03 g / L NaNO 3)
encontró para una peptidasa de A. niger producido por fermentación de salvado de trigo ( Ahmed et
Aunque el fraccionamiento con sulfato de amonio no era adecuado para PAN, el extracto
al., 2011 ) Cabe señalar que la actividad máxima de peptidasa se alcanzó a 65 ° C, que es, de hecho,
enzimático se concentró y purificó adecuadamente fi ed 9 veces por medio de adsorción en una matriz
el límite del rango de estabilidad PAN. Para determinar la cinética de inactivación a 60 y 65 ° C, se
DEAE-celulosa, seguido de gel fi Filtración en Sephadex G-100. PAN mostró alta estabilidad en un
incubó PAN a estas temperaturas durante 180 minutos y se midió periódicamente la actividad
amplio rango de pH. Aunque la mayor actividad de peptidasa se alcanzó a 65 ° C, se logró una
peptidasa residual. A 60 ° C, la actividad de peptidasa no se alteró durante el tiempo analizado. Sin
mayor estabilidad a 60 ° C después de 180 minutos de incubación.
embargo, a 65 ° C, la actividad de peptidasa se redujo al 40% después de 80 minutos de incubación
y disminuyó al 20% después de 180 minutos. Estos datos son alentadores ya que el tiempo requerido
para la inactivación de PAN fue mayor que el tiempo requerido para la inactivación de ambos
Flavourzyme 500MG ® y un extracto proteolítico obtenido de A. oryzae García-Gómez, Huerta-Ochoa,
Loera-Corral y Prado-Barragán, 2009 ) Teniendo en cuenta estos resultados, se propone que la Expresiones de gratitud
temperatura más adecuada para llevar a cabo la proteólisis con PAN sea 60 ° C. Resultados
similares fueron reportados por Esparza y ​col. (2011) , que produjo una prolil-endopeptidasa de A. Los autores desean agradecer a quienes proporcionan fi apoyo financiero: Universidad Nacional
niger que era estable a temperaturas inferiores a 70 ° C. de Rosario (1BIO585), Agencia Nacional de Promoción Científica fi ca y Tecnológica (PICT
2017-0937), Secretaría de Políticas Universitarias
(VT12-UNR4183), Universidad Católica
Argentina y Fundación Nuevo Banco de Santa Fe. Los autores desean agradecer al Departamento
de Inglés de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR, por la corrección del idioma
del manuscrito. Débora N. López, Micaela Galante, Julia Lombardi y Natalia Montellano Duran
Como se puede observar en Fig. 4 B, la actividad de peptidasa alcanzó un también quisieran agradecer a CONICET y Germán Ruggieri quisiera agradecer a la Fundación
máximo a pH 10 y fue superior al 80% entre pH 7 y 12. El mismo pH e ff El efecto sobre la actividad Nuevo Banco de Santa Fe por la beca que les otorgaron.
peptidasa y la estabilidad se encontraron en una proteasa alcalina de A. niger aislado del suelo indio
( Devi et al., 2008 ) Sin embargo, se informó que esa enzima fue inhibida por EDTA. Otras proteasas,
como VQ-VII, que es una cisteína proteasa secretada por Vasconcelle aquercifolia, mostró actividad
en un amplio rango de pH (6.0 - 9.5) ( Torres, Trejo, Natalucci y López, 2013 ) Una proteasa alcalina
Apéndice A. Datos suplementarios
extracelular secretada por Botrytis cinerea demostrado ser activo en un pH amplio

Los datos adicionales relacionados con este artículo se pueden encontrar en https: //
doi.org/10.1016/j.lwt.2018.09.013 .

490
DN López y col.
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