CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

H.P.L.C.
Instrumentación
Recipiente de la fase móvil.

Material:
Vidrio.
Polímero.
Filtro.
Desgasificación:
Vacio.
Calentamiento.
Arrastre con gas inerte.
Membranas/vacio
Recipiente de la fase móvil.
 Tuberías

Resistente a altas presiones.

Acero inoxidable.
Poliméricas (polipropileno o teflón)
Diámetro externo: 1/16 pulgada.
Diámetro interno:
0.5 a 0.7 mm por donde no pasa muestra.
0.2 mm por donde pasa muestra.
Longitud de la columna. 10 a 30 cm
 Materiales en la bomba

• Cuerpo: Acero inoxidable.

• Titanio: Muestras incompatibles con el acero.
• Pistones: Zafiro.
• Válvulas de retención: Rubí
 Características de las bombas

• Flujo: 0.01 a 10.0 ml/min; 6000psi.

• Exactitud del flujo: Afecta los tiempos.
• Ruido: Variación en el flujo.
• Sistema de corte: Detener el sistema cuando
sale de cierto rango de presión.
Bomba peristáltica

válvula

pistón

válvula
Técnicas de trabajo en HPLC
• ISOCRATICO: Fase móvil constante.
20% Disolvente A/80% Disolvente B
• GRADIENTE DE ELUCION: Variación de la
composición de la fase móvil.
20%A/80%B, t=2min; 75%A/25%B en 10 min.

100 Gradiente de elución

90

80

70

60

%A 50

40
Isocrático
30

20

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tiempo
 Fase Móvil (disolventes)

• Alto poder solubilizante de las muestras.

• Baja reactividad.
• Baja viscosidad.
• Seguridad personal.
• Alto grado de pureza.
• Índice de polaridad: Medición de la “fuerza” de
interacción con los solutos polares.
 Inyectores

• Fácil de operar.
• Inerte al ataque químico.
• Soportar altas presiones.
• Preciso en cuanto a la cantidad de muestra.
• No debe provocar diluciones de la muestra.
Inyector manual
Columna analítica
 Fase estacionaria
Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios
C1 -CH3, metil Para compuestos muy retenidos en C18.
C2 -CH2-CH3, etil Análisis más rápidos que con C18. Análisis de
C4 -(CH2)-CH3, butil péptidos y proteinas.
C6 -(CH2)-CH3, hexil
C8 -(CH2)7-CH3, octil Empleo general.
C18 -(CH2)17-CH3, Empleo general. Es la fase más empleada.
octadecil (ODS)
FENIL -(CH2)3-Phe, Compuestos moderadamente polares.
fenilpropil Retención similar a C8, pero más selectiva
para compuestos aromáticos
CIANO -(CH2)3-CN, Solventes polares y no polares. Selectividad
cianopropil hacia dobles y triples enlaces.
NITRO -(CH2)3-Phe-NO2, Separación de compuestos con dobles
nitrofenilpropil enlaces y aromáticos.
 Fase estacionaria

Tipo Grupo ligado Aplicaiones, comentarios

AMINO -(CH 2 ) 3 -NH 2 , Selectividad a CN, NO 2 y silicagel. Análisis
aminopropil de carbohidratos. Intercambio aniónico débil.
DIOL -(CH 2 ) 3 -O- Menos polar que silicagel, pero más que CN.
CH(OH)- Menos estable
CH 2 (OH)
N(CH 3 ) 2 -(CH 2 ) 3 -N(CH 3 ) 2 Intercambiador aniónico débil (W AX)
-SO 3 Na -(CH 2 ) 3 -Phe- Intercambiador catiónico fuerte (SCX)
SO 3 -
-N(CH 3 ) 3 + -(CH 2 ) 3 -Phe- Intercambiador aniónico fuerte (SAX)
NMe 3 +
-COONa -COO - Intercambiador catiónico débil (W CX)
 Selección sistemática en HPLC

MUESTRA TIPO DE ANALISIS FASE FASE

Solubilidad Polaridad o acidez CROMATOGRAFICO ESTACIONARIA MOVIL
No-polar Partición C-18 Metanol o agua/acetonitrilo
(70:30)
Polaridad Fase reversa C-8 Agua/acetonitrilo (50:50)
moderada
Insoluble Adsorción Sílica
en agua Adsorción n-Heptano/cloroformo
Fase Normal Silica (95:5)
Polar Fase reversa C-8 Agua/acetonitrilo (70:30)
Partición Fase normal CN n-heptano/isopropanol
(98:2)
Fuerte Intercambio iónico Catiónica 0.01 a 0.1 M Na2HPO4
Básico Débil Partición; Fase reversa C-18 Agua (0.005M Acido
Soluble en hexanosulfónico)/Metanol
agua Fuerte Intercambio iónico Aniónica 0.01 a 0.1 M NaH2PO4
Acido Partición; Fase reversa C-18 Agua /metanol (0.005M
Débil Hidróxido de tetrabutil
amonio)
 Detectores
• Amplio rango dinámico.
• Respuesta lineal.
• Responder a todos los solutos.
• Sensibilidad apropiada.
• No afectarse por cambios en la temperatura.
• Poseer una buena relación señal/ruido.
• No reaccionar con la muestra.
 Detectores

• Generales: Miden el cambio de alguna

propiedad física de la fase móvil; Indice de
refración, conductividad.
• Selectivos: Sensibles a alguna propiedad propia
del soluto; UV/VIS, fluorescencia,
electroquímico.
Detector de Indice de Refracción.
 Detector de UV/VIS

• Fotómetro: Longitud de onda fija.

• Espectrofotométrico: Selección de la longitud
de onda libremente.
• Arreglo de diódos.
Fotómetro
Espectrofotómetro
Arreglo de diodos
 Detector de Fluorescencia

• Derivatización.
• Dos longitudes de onda: una de excitación y
una de emisión.