•DETERMINACION DE VIABILIDAD Y

PUREZA DE CEPAS DE REFERENCIA

METABOLIS •INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA

MO
BACTERIAN •I SEMESTRE PERÍODO 2020-I
O
•DOCENTES: LISY GRACIA HERRERA
ANDREA DORIA PEDRAZA
 METABOLISMO BACTERIANO:
Conjunto de reacciones químicas que desarrolla la célula. Estas reacciones pueden ser
catabólicas cuando descomponen un sustrato con liberación de energía y anabólicas
cuando forman algunos compuestos a partir de elementos más simples.

Estas Reacciones se realizan gracias a la presencia de enzimas que pueden ser

intracelulares o extracelulares.
Número y clase de enzimas bacterianas son diferentes: cada enzima está
fabricada bajo un control genético, se dan variaciones en la utilización de los
sustratos.

Variaciones: ayudan a determinar los diferentes grupos y especies bacterianas.

CEPA O CLON: población de células genéticamente idénticas
derivadas de la división sucesiva de una sola célula

CULTIVOS DE REFERENCIA: son cultivos provenientes de una colección

reconocida nacional e internacionalmente acompañada de un
certificado que especifique las características genotípicas y
fenotípicas.
CEPAS DE REFERENCIA: son microorganismos definidos por lo menos
a nivel de género y especie, catalogados, muy caracterizados y de
origen conocido, con características fenotípicas y genotípicas definidas
que son empleadas como control para las determinaciones
microbiológicas
CEPAS DE RESERVA: son cultivos obtenidos a partir de la reactivación y
resiembra de un cultivo de referencia certificado y mantenido como
una fuente para la preparación de cultivos de trabajo, las cepas de
trabajo son subcultivos obtenidos de un cultivo de trabajo.
Requisitos para las cepas de referencia:
• Viabilidad: células microbianas capaces de crecer.
• Cultivos de referencia: suministran las cepas con instrucciones para su recuperación
(ej: ATCC).
• Pureza: se debe tratar de un cultivo puro
• Estabilidad: genéticamente estables (características genotípicas y fenotípicas)

Necesidad de los cultivos de referencia:

a. Para evaluar la calidad de los medios de cultivo
b. Realización de controles de calidad internos durante la ejecución de ensayos en el
laboratorio de microbiología.
c. Realizar controles de calidad de los reactivos, realizar pruebas confirmatorias , validar
métodos analíticos, acreditar o mantener la acreditación de un ensayo.
 Son un conjunto de ensayos que
permiten evaluar la actividad bioquímica
Definición y metabólica de las cepas de referencia
de pruebas sobre sustratos específicos permitiendo
su caracterización en género y especie,
de viabilidad en la verificación del cumplimiento de los
y pureza: requisitos mínimos establecidos para un
microorganismo de una colección en
particular. (ej: E. coli ATCC 25922).
 A. Generación de cultivos de trabajo:
• A partir de cepas de reserva cultivadas en
tubos con caldo BHI (previamente
PROCEDIMIENTO: caracterizadas y conservadas en
ultracongelamiento. Ej. E.coli ATCC 25922,
S.aureus ATCC 6538), genere cultivos de
trabajo del laboratorio de microbiología.

Cultivo de E.coli Cultivo de S.aureus

VIABILIDAD Y PUREZA A PARTIR DE CULTIVO DE E. coli:

1.Tome una asa estéril y a partir del cultivo de E. coli asignado por el docente, realice frotis en lámina
portaobjeto fíjela a la llama del mechero y realice coloración de Gram, anote y esquematice lo que
observa.

Bacilos Gram negativos

Cultivo de E. coli
 AGAR EMB
2.Con asa redonda estéril sembrar por
agotamiento, en agar nutritivo y en agar EMB

Incubar por 24 horas a 37°C.

CEPA DE RESERVA E.coli

ATCC25922

AGAR NUTRITIVO
 PRUEBAS METABÓLICAS
A. TSI: Triple azúcar hierro
El agar TSI medio nutriente y diferencial permite estudiar la capacidad de las bacterias de producir de
ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa, y detectar la producción de H 2S. Adicionalmente,
puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por
ruptura del agar o hasta por su desprendimiento del fondo del tubo.

Indicador de ph rojo de fenol que en condiciones normales (pH 7,4) confiere al medio un color
naranja. En condiciones de alcalinidad o acidez vira a rojo y amarillo. Es una prueba bioquímica útil
en la identificación de Enterobacteriaceae. La reacción se observa en la porción inclinada (bisel),
expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo), está protegida del
aire y, es relativamente anaerobia.

Procedimiento :
Con asa en punta estéril inocule el medio TSI por punción hasta el fondo del tubo agotando luego
sobre la parte inclinada. Incube a 37°C por 24 horas. Haga la lectura correspondiente.
 INTERPRETACIÓN DEL TSI

(A) Parte inclinada y parte profunda amarilla: ácido/acido,

fermentación de los tres azúcares (glucosa, lactosa y
sacarosa). Agar fragmentado: producción de gas (CO2 yH2).

(B)Parte inclinada roja y parte profunda

amarilla:alcalino/ácido fermentación de la glucosa.

(C) Parte inclinada roja y parte profunda

amarilla,negro:alcalino/ácido Precipitación del sulfuro
ferroso (negro) indicando formación de H2S.

(D)Parte inclinada y parte profunda roja “sin cambio":

alcalino/alcalino, no hay fermentación de azúcares

A B C D
 B. Prueba del medio SIM

Procedimiento: Inocule el medio SIM(medio semisólido) por puntura.

Incube a 37°C por18-24 horas.

Interpretación: Haga la lectura correspondiente observando

motilidad, producción de H2S e indol las lecturas deben hacerse antes
de efectuar el test para indol.

Los organismos móviles muestran un crecimiento difuso alrededor de

la línea de siembra, mientras que los organismos con movilidad
negativa, muestran crecimiento solo a lo largo de la línea de siembra.
La formación de H2S se manifiesta por ennegrecimiento a lo largo de
la línea de siembra o en la totalidad del medio.
 C. Prueba de la utilización del citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de ciertas
enterobacterias. Esta, se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono, mediante
el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de
bromotimol, que vira a pH 7,6 .

Procedimiento: Inocule el agar Simons citrato por puntura y agotamiento.

Incube a 35-37°C por 24 horas.

INTERPRETACIÓN
A-Un test positivo es indicado por el desarrollo de un color azul en el medio,
indicativo de crecimiento de gérmenes que utilizan el citrato como única fuente de carbono.

B-En el caso de un test negativo, no hay crecimiento o no hay cambio de color. Este test depende de la
habilidad del organismo para utilizar el citrato del medio como única fuente de carbono. Puesto que el
medio Simons citrato contiene una sal amonio, si el citrato es utilizado por el organismo, el cultivo se
convierte alcalino cambiando el medio de verde azul.
 • Señala la capacidad de las bacterias
para oxidar el triptófano, por la acción
enzimática de la triptófanasa produce
varios metabolitos entre los cuales está
el indol.

• Procedimiento: El indol producido se

detecta adicionándole al cultivo del
SIM unas 5 gotas de reactivo de kovacs
o adicione 2 ml de éter al tubo, agite
suavemente y después de unos
minutos deje caer 1 ml del reactivo de
Ehrlich por las paredes del tubo de tal
forma que se coloque entre el éter y el
medio; la formación de un anillo
púrpura indica la producción de indol.
Este test puede efectuarse en otros
medios como el caldo triptófano, etc.

D. Prueba de Indol • Interpretación: En caso de un test

indol positivo se formará un anillo rojo
después de adicionar el reactivo de
Ehrlich o Kovacs.
VIABILIDAD Y PUREZA A PARTIR DE CULTIVO DE S. aureus:

1.Tome una asa estéril y a partir del cultivo de S.aureus asignado por el docente, realice frotis en
lámina portaobjeto fíjela a la llama del mechero y realice coloración de gram, anote y esquematice
lo que observa.
 AGAR SALADO MANITOL

2.Con asa redonda estéril sembrar por

agotamiento, en agar nutritivo y en agar
salado manitol. Incubar por 24 horas a
37°C.

CEPA DE RESERVA S.aureus

ATCC 6538

AGAR NUTRITIVO
 3. a. PRUEBA DE CATALASA

Procedimiento: con asa redonda estéril transfiera una asada de colonias de S. aureus del
cultivo asignado por el docente, a una lámina portaobjetos inmediatamente agregue una o
dos gotas de peróxido de hidrogeno al 3%.

Interpretación: La rápida aparición y sostenida producción de burbujas de gas o

efervescencia constituye un resultado positivo, esta prueba se emplea para diferenciar los
Streptococcus (catalasa negativos) de los Staphylococcus (catalasa positivos).
 • Procedimiento: con asa
redonda estéril transfiera una
asada de colonias de S. aureus
del cultivo asignado por el
docente a un tubo de ensayo
que contiene 0,5 ml de plasma
citratado de conejo, mezcle
utilizando el asa, y lleve a
incubación de 4 a 8 horas
a37°C.

• Interpretación: La formación
de coágulos es indicativo de
positividad de la prueba.
3.b. Prueba de coagulasa (Describa lo que observa).
B)
Valoración
de la calidad
de reactivos

1. Peróxido de hidrogeno:
Procedimiento: con asa redonda estéril transfiera una asada de
colonias de S. aureus a una lámina portaobjetos inmediatamente
agregue una o dos gotas de peróxido de hidrogeno al 3%. Proceda
de igual forma con colonias de Streptococcus sp. Anote y
esquematice sus observaciones.
 •Procedimiento: con asa redonda
estéril transfiera una asada de
colonias de S. aureus a una lámina
portaobjetos inmediatamente
agregue una o dos gotas de plasma
citratado de conejo al lado de la gota
de suspensión bacteriana, mezcle y
mueva el portaobjetos hacia adelante
y hacia atrás, observando la
inmediata formación de un
precipitado granular de coágulos
blancos indicativo de la positividad de
la prueba.

•Realice el mismo procedimiento con

2. Plasma citratado de cepas de Staphylococcus epidermidis.

conejo:
 3. Reactivo de
Kovacs:
•Procedimiento:
1-tome un tubo que contenga agar SIM, con un asa
estéril en punta realice siembra en picadura con
cepa de E. coli asiganada por el docente, lleve a
incubación a 37°C por24 horas, transcurrido este
tiempo agregue de 3 a 5 gotas de reactivo de
A B Kovacs, la aparición de un anillo rojo indica reacción
positiva. Realice el mismo procedimiento con cepas
de Enterobacter aerogenes.
2-Anote y esquematice sus observaciones.
4. Reactivo de
oxidasa:
Procedimiento: con un asa redonda
estéril transfiera a una cinta de
reactivo de oxidasa, una asada de
colonias de Pseudomona aeruginosa,
un cambio de color en la cinta a azul
oscuro indica prueba positiva,
reacción propia de la bacteria
Pseudomona aeruginosa, realice igual
procedimiento con cepas de E.coli,
anote y esquematice sus
observaciones.
MUCHAS GRACIAS