Protocolos. Presentaciones - Pps

Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado
Protocolos para obtencin de

datos, calibrados, uso de hojas
de clculo
Tema 5

Antecedentes Bibliogrficos
Diseo del experimento
Obtencin datos, calibrados, etc.
Exploracin de datos
Anlisis : tests estadsticos,
ajuste de curvas , .
Etapas de una investigacin

Diferentes protocolos para diferentes estudios (1/2)
1) Estudios experimentales (por ej. : Determinar la K
m
y
V
max
de una enzima usando regresin no lineal):
a) Concretar el procedimiento experimental.
b) Preparacin de disoluciones y comprobar su estabilidad en el almacenamiento.
c) Rectas de calibrado:
- Diferencia entre precisin y exactitud. Estimacin de una media
con intervalo de confianza (barras de error)
- Ajuste de una recta a los datos por regresin lineal, bandas de
confianza.
- Prediccin inversa.
d) Hacer las medidas experimentales del estudio, recopilar los datos en una tabla
de EXCEL y hacer una representacin inicial de los datos.

Diferentes protocolos para diferentes estudios (2/2)
2) Estudio observacionales (por ej. comparacin de la
eficacia de un nuevo frmaco en pacientes tratados con
dicho frmaco frente a placebo (test t de student)):
a) Elegir la poblacin objeto del estudio.
b) Establecer el tamao de muestra, el tipo de aleatorizacin,
tipo de ciego.
c) Elaboracin de encuestas o de procedimientos de medida.
d) Hacer las observaciones o medidas.
e) Recopilar los datos en una tabla de EXCEL.
(En lo que sigue nos ocuparemos principalmente de lo
estudios experimentales)

a) Establecer primero el protocolo experimental
Toma de
muestra
1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,24h)
2) 200 L muestra + 400L tampn
Termostatar
Medida de
absorbancia
1) 100 L enzima
2) 100 L sustrato
3) 9.6 mL disolvente
4) 0.2 mL agua
10 mL total
Procedimiento

Se suelen hacer rplicas de muestreo
Se toman
alcuotas
Medida Absorbancia
Enzima
Sustrato
+
Rplicas de muestreo (3 rplicas a cada sustrato)
No suele ser necesario rplicas de tcnica
CV(%) grande!
CV(%) pequeo!

Cuntas rplicas se deben hacer?
1) Cuando se desea estimar la media:
2) Cuando se desea estimar la desviacin estndar:
X
s
n rplicas
CV(%)
1 2 3 4 5
3 > rplicas de n
n rplicas
CV(%)
1 2 3 4 5
5 > rplicas de n
(La media se estabiliza a partir de 3)
(La desviacin estndar se
estabiliza a partir de 5)

b) Preparacin disoluciones en base al protocolo
Se desea en reactor:
[E] = 1 g /mL
1) 100 L enzima
2) 100 L sustrato
3) 9.6 mL disolvente
4) 0.2 mL agua
10 mL total
Procedimiento: A preparar:
[E] = 100 g /mL
[S] = 200 mg /mL
[S] = 2 mg /mL
Hacia atrs
1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,24h)
2) 200 l + 400l tampn
[S] = 0.3 mg/mL
(Multiplicar por 3)
Hacia adelante
0.9 mg/mL

Buenas prcticas experimentales:
Buenas prcticas numricas:
Obtener datos sin artefactos
Elegir unidades para que los valores sean del orden de 1
(por ej. 3.2 M es mejor que 0.0000032 M o 3.2.10
-6
M)

Trabajar con los valores de todas las rplicas (no sus medias),
para que los tests estadsticos en el ajuste de curvas tengan los
grados de libertad correctos.
Hacer bien referencias y controles.

Comprobar exactitud y lnea base de aparatos

Recordatorio de cifras significativas
Dado un nmero, se entiende por cifra significativa cualquier dgito no nulo (1 al 9), cualquier
cero situado entre dgitos no nulos y cualquier cero situado a la derecha del nmero.
Ejemplos:
0.0000689 = 6.89 10
-5
3 cifras significativas
0.00208 = 2.08 10
-3
0.002080 = 2.080 10
-3
Concepto de cifra significativa :

Recordatorio de reglas para los clculos
4
10 5 . 3
2) Si se quiere redondear un nmero que tiene cifras significativas superfluas, aumntese en

una unidad la ltima cifra retenida si la primera cifra desechada es 5 o mayor.
3) Cuando se suman o se restan nmeros, el resultado se da con tantas cifras decimales como
tenga el nmero con menor nmero de decimales.
Ejemplo: 0.12 + 12.2324 + 1.568 = 13.9204 (mal)
= 13.92 (bien)
4) Al multiplicar y dividir nmeros, el resultado se da con las cifras significativas necesarias
para que su incertidumbre sea semejante a la incertidumbre relativa del factor que menos
cifras significativas tenga. En la prctica viene a ser equivalente a expresar el resultado con el
mismo numero de cifras significativas que las que tenga el factor con menos cifras
significativas. (Obsrvese que este criterio se refiere a las cifras significativas, no a los decimales de los
nmeros).
Ejemplo: imaginemos el siguiente clculo
(Por dnde cortar?)
1.5780.0182
81
= 3.54562963.10
4
?
1) Al registrar el valor numrico de una magnitud, se escriben slo las cifras significativas
adecuadas (se supone que la incertidumbre en la medida es de en la ltima cifra 1
significativa dada). Ej: con un termmetro de dcimas se anotara 25.2 C (no 25 ni 25.20).

Diferencia entre precisin y exactitud.
Precisin
Hace referencia a la repetitibilidad de una medida. As, se dice que unas medidas
repetidas son precisas cuando presentan pequeas diferencias entre si y son
reproducibles. La precisin de unas medidas repetidas se cuantifica con los
procedimientos de la Estadstica Descriptiva, principalmente con la llamada
desviacin estndar de la muestra.
Exactitud
Hace referencia a la concordancia de la medida con el valor verdadero o exacto. Se
dice que una medida es tanto ms exacta cuanto ms se acerca a su valor
verdadero. La exactitud de una medida se cuantifica en base a patrones y curvas
de calibrado.

Simil para diferencia entre precisin y exactitud.
Imaginemos el tiro con carabina a una diana:
Error absoluto y error relativo
Error absoluto:
Error relativo:

Poblacin: nios espaoles al nacer
Estimacin de una media con intervalo de confianza
???
Variable: Peso en kg
Intervalo de confianza
Lmites de confianza
) % ( confianza de al IC 95
Muestra grande
3.5
3.7
2.8
3.3
..
4 3. = x ???
Poblacin: clulas en un cultivo
Variable: n clulas/mL
Rplicas
6.2 10
6

6.8 10
6
5.9 10
6

6
10 3 6 = . x ???
Muestra pequea

( )
2
2
2
2
1
) (
o
t o
|
.
|
\
|
=
x
e x f
Normal:
2
2
2
1
) (
z
e z f
|
.
|
\
|
=
t
Normal estandarizada:
o
) (
=
i
i
x
z
: ados estandariz valores
Recordatorio de la distribucin normal
o 2 : en veces las de 95% caer muestra una de do valor saca cualquier tanto por
Basado en J.P. Domnech (Bioestadstica)

Poblacin origen (x)
Se toman infinitas muestras
al azar de tamao n
Poblacin medias ( ) x
=
=
2
o
varianza
media
: normal Dist.
: sigue x variable La
=
=
=
n media est err
n
o
o
. .
2
varianza
media
: normal Dist.
: siguen x medias Las
) ( n : en veces 95% caer muestral media cualquier tanto por o 2
Comportamiento de las medias de diferentes muestras
sacadas de una poblacin (Teorema del lmite central)
Adaptado de J.P. Domnech (Bioestadstica)

: , luego
n
intervalo en veces 95% el caa muestra cualquier de media la que vimos
o
2
n
s
z x
o
En general la estima de de la
poblacin desde una muestra
grande:
Donde:

o
z
desvo para riesgo o,
normalmente:
o=0.05 ((1o)=0.95 (95) )
2 96 1 ~ = .
o
z
Donde:

) , ( o u
t
t Student con v grados
de libertad y riesgo o
v= n1
o=0.05 ((1o)=0.95 (95) )
n
s
t x
) , ( o u
La estima de de poblacin
desde una muestra pequea:
Generalizacin para la estimacin de una media por intervalo

Ejemplo: estimacin de una medias por intervalos al 95%
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 83
Muestra 3
5 %

Simulamos al azar: 7 muestras de
10 datos:

26 2
05 0 9
.
) . , (
) , (
=
t
n
s
t x
o u
Ejemplo: simulacin de medias con intervalos al 95%
5 0 10 . = = o
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 6
Muestra 5
Muestra 7

n
s
t x
n
s
t x
n
s
t x s x
3 datos
LC 95%
3 datos
barras 1s
s x s x
7 datos
LC 95%
7 datos
barras 1s
30 datos
LC 95%
30 datos
barras 1s
Otros tipos de lmites de confianza (barras de error)

Clculo de lmites de confianza (SIMFIT)
Statistics > Statistical calculations > Estimate parameter confidence limits

Clculo de lmites de confianza (SIMFIT)
Nmero de sujetos: n = 20
Media en la muestra:
Desviacin estandar muestra:
% de confianza: 95
Ejemplo:
15 = x
4 = s
13.1-------15.0------16.9 15.0 1.9
O tambin:

Ajuste de una recta por regresin lineal simple y bandas de confianza
El llamado mtodo de Allen se utiliza para medir concentraciones de fosfato en base a una reaccin
coloreada con molibdato. Para ello hay que hacer primero la recta de calibrado o ley de Beer a partir
de unos patrones de fosfato.
c) Rectas de calibrado y prediccin inversa
Prediccin inversa
Evaluacin
SIMFIT

Evaluacin y prediccin inversa
c) Rectas de calibrado y prediccin inversa.
0.231
0.472
Evaluacin: Se introduce la x y se desea la y (no suele tener inters)
Prediccin inversa: Se introduce la y y se desea la x (es lo que
interesa, medir la absorbancia de una muestra y estimar la [fosfato])
SIMFIT

d) Hacer las medidas experimentales del estudio de que se
trate, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una
representacin inicial de los datos.

Abble bits (Merge Tables wizard)
Aspectos avanzados de la hoja de
clculo Excel: uso de macros
SIMFIT6.XLS

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