EXPERIMENTO 3

Punto Isoeléctrico de aminoácidos y proteínas

1. Objetivos:

1.1. Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no

polar, mediante titulación con álcali.

1.2. Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del

gráfico de pH vs volumen de base.

1.3. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante la técnica de

precipitación.

2. Introducción:

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas

positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables
de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En
los aminoácidos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino,
fenólicos y tiólicos.
PKa PKa
Aminoácido Abrev Letra alfa-COOH alfa-NH3 pKaR
Glicina Gly G 2.35 9.78
Alanina Ala A 2.35 9.87
Valina Val V 2.29 9.74
Leucina Leu L 2.33 9.74
Isoleucina Ile I 2.32 9.76
Metionina Met M 2.13 9.28
Prolina Pro P 1.95 10.64
Fenilalanina Phe F 2.20 9.31
Triptofano Trp W 2.46 9.41
Serina Ser S 2.19 9.21
Treonina Thr T 2.09 9.1
Asparragina Asn N 2.14 8.75
Glutamina Gln Q 2.17 9.13
Tirosina Tyr Y 2.20 9.21 10.46 Fenol
Cisteína Cys C 1.92 10.7 8.37 Sulfhidrilo
Lisina Lys K 2.16 9.06 10.54-Amino
Arginina Arg R 1.82 8.99 12.48 Guanidinio
Histidina His H 1.80 9.33 6.04 Imidazol
Acido aspáratico Asp D 1.99 9.90 3.90 -COOH
Acido glutámico Glu E 2.10 9.47 4.07 -COOH
TABLA 1: Valores de pKa de los grupos ionizables de los α-aminoácidos.
Fuente: Bioquímica de Harper

El pI de los α-aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está

cercano a pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuación:
pKa1 + pKa2
pl =
2
X

El pI de los α-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un pH

intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de los α-
aminoácidos diamino-monocarboxílicos entre los valores de pKa de los grupos
amino.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el

comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de
grupos ionizables en éstas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la
solubilidad.

Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico

si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones
dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese
pH.

3. Materiales y reactivos:

3.1. Buretas, soportes, pinzas de bureta, matraces de 125 mL y 250 mL, pipetas
de 25 ml, potenciómetro de pH.

3.2. Soluciones de ác. glutámico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M; NaOH 0.2M; HCl
2%; leche de vaca, de cajita; etanol 95%; éter.

4. Procedimiento:

4.1. Titulación de aminoácidos:

Coloque una alícuota de 25 ml de la solución de aa. en un vaso químico de
250 mL y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada vez,
midiendo el pH antes de cada adición con un potenciómetro de pH, hasta alcanzar el
pH de 10. Grafique sus resultados y reporte los valores de pKa de los aminoácidos
analizados y calcule el pI en cada caso.
 4.1.1. Punto isoeléctrico y solubilidad: Verifique la solubilidad de varios
aminoácidos en medio acuoso, en medio ácido y en medio alcalino. Prepare varios
tubos de ensayo con 3 ml de los medios mencionados y añade una pequeña
cantidad de aminoácido. Agite para observar si se solubiliza. Anote sus
observaciones.

4.2. Determinación del pI de la caseína de la leche.

Mida 50 mL de leche y colóquelos en un vaso químico de 400 mL. Diluya

con 150 mL de agua destilada. Titule con HCl al 2% hasta alcanzar el pH de 4.8
contra un potenciómetro de pH. Si se tiene cuidado, se observa fácilmente el punto
en el cual empieza a precipitar la proteína de la leche (caseína). Se agita durante 10
minutos, se deja sedimentar media hora y se anotan los resultados.

4.2.1. Separación de la caseína : (opcional) Se decanta el sobrenadante de

la leche precipitada en el punto 4.2. El precipitado se lava dos veces por suspensión
con 100 mL de agua destilada y nueva decantación. Se succiona toda el agua por
filtración en embudo Büchner. El residuo húmedo se pasa a un vaso químico y se
prepara una suspensión final de caseína en 50 mL de etanol al 95% y se agita con
fuerza durante 5 minutos y se decanta. Se repite otra vez el extracto con alcohol y
luego se extrae dos veces con 30 mL de éter. NOTA: descarte el éter en un
recipiente para residuos orgánicos. Se filtra la suspensión y se deseca sobre una
placa porosa. Se debe obtener un polvo blanco muy ligero.

4.3. Cuestionario:

1. ¿Por qué no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se
prepararon los aa.?

2. Cómo se puede preparar 500 mL de una solución amortiguadora 0.2 M de pH

6.5 con el aminoácido serina. Presente todos los cálculos si usted cuenta con
Serina sólido grado reactivo analítico y soluciones de NaOH y HCl 1.0 M.

3. Compare los puntos isoeléctricos de la glicina y los péptidos glicil-glicina y

glicil-glicil-glicina. ¿Qué concluye sobre estos resultados?

4. Por qué las moléculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el
punto isoeléctrico.

5. En la precipitación de la caseína qué pasaría si se añade muy rápido el ácido

y se alcanza un pH más bajo que 4.8. Qué se debe hacer en este caso?