Type of the Paper ( Review)

Fitomejoramiento genético de Trigo (Triticum, Hordeum vulgare)

Stephanie Chimbo 1, Ronald Lima 1, Andrés Llulluma 1 and Heidy Rosales 1*

1
Universidad Politécnica Salesiana 1
* Correspondence: hrosalesr@est.ups.edu.ec; Tel.: (0979106425)

Resumen: La presente revisión bibliográfica sobre el fitomejoramiento del trigo nos va a permitir
tener un estudio más amplio sobre las diferentes técnicas para obtener las mejoras del cultivo en
esta revisión nos vamos a enfocar en tres técnicas la primera que es enfocada a la obtención de trigo
resistente a enfermedades, la principal enfermedad que afecta al trigo es la roya por la cual mediante
marcadores moleculares se ha logrado tener esta Resistencia, donde demuestran que el gen Lr es el
encargado de conceder esta resistencia a la planta. El Segundo proceso que nos vamos a enfocar es
en la obtención de cultivos doblehaploides el cual se puede obtener mediante dos formas, la primera
que es mediante el cultivo de anteras que se lo cultiva hasta obtener callos y posterior a eso el
enraizamiento que mediante la colchicina nos permite tener plantas doble haploide, la segunda
forma es mediante la fecundación en el polen del trigo con maíz para tener un cruzamiento, poste-
rior a eso se lo cultiva hasta la etapa de enraizamiento donde se procede a sumergir las raíces en la
colchicina. El ultimo método de mejoramiento de trigo es la obtención de plantas transgénicas que
nos permite mediante plásmidos y bombardeo de partículas la obtención de estas plantas donde
también interviene el gen GUS.

Palabras claves: plantas transgénicas, doblehaploide, marcadores moleculares, línea pura

Citation: Rosales R; Llulluma, A; Lima,

Ronald, Chimbo, Stephanie. Fitomejora-
miento de trigo. Revista Bionatura 2022,
1. Introducción
13, x. https://doi.org/10.21931/xxxxx

El género Triticum perteneciente a la familia de las Gramíneas tiene diferentes teorías de donde
Academic Editor: Vaca, Ivone
ha sido originario por lo que se cree que los trigos recolectados antiguamente eran Triticum mo-
nococcum o Triticum dicoccum. El género Triticum tiene alrededor de 30 tipos de trigo con di-
Received: 17-08-2022
ferencias genéticas, solo se han reconocido 16 especies de las cuales solo dos son cultivadas a
Accepted: 17-08-2022
gran escala mundialmente, el Triticum aestivum L y Triticum durum 1
Published: 18-08-2022

La tecnología de transformación genética vegetal proporciona un método general y rápido para

mejorar en plantas de cultivo. la ingeniería genética nos brinda una solución para problemas
que existen en las plantas ya que por técnicas moleculares Se pueden obtener la resistencia a
plagas y enfermedades, también se obtienen plantas transgénicas mediante plásmidos, existen
diversos métodos para el fitomejoramiento de las plantas no solo a nivel genético sino también
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mediante semillas sintéticas, plantas doble haploides que nos brindan un beneficio al cultivo de
ted for possible open access publication un-
trigo2
der the terms and conditions of the Creative
Commons Attribution (CC BY) license
La obtención de doble haploide permite obtener líneas homocigotas estables de un hibrido en un
(https://creativecommons.org/licen-
único paso. El cultivo de anteras es la técnica que se ha usado más para inducir doble haploides.
ses/by/4.0/).
Es muy importante la regeneración de plantas a partir de microsporas3

En el fitomejoramiento existen diversas técnicas, la más empleada son los marcadores molecu-
lares ya que es importante en la producción mundial de alimentos. Estos se emplean para el se-
guimiento de variaciones genéticas en muestras del ADN, existen diferentes marcadores

Bionatura 2022, 13, x. http://dx.doi.org/10.21931/RB/xxx www.revistabionatura.com

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moleculares como son los RFLP, RAPD, ALP, SSR, AFLP, STS, SNP, STR. También son empleadas en la construcción de
mapas de vinculación y cartografía 4.

La tecnología DH acorta considerablemente el tiempo del ciclo de mejoramiento del cultivo, pudiéndose obtener nuevas líneas
en 2 o 3 generaciones, lo cual es mucho más rápido que el método de mejoramiento convencional que puede tomar entre 8 a 9
generaciones hasta obtener una nueva línea endogámica5. En el estudio se observa líneas DH las cuales se fue seleccionado en
cada uno de los ambientes, considerando ciclos y altura de planta 6. En otro estudio no toma en cuenta esos aspectos, en lo que
se enfoca es en una línea doble haploide de alto rendimiento7. En el caso del material vegetal utilizado como establece 6, utiliza
105 líneas DH y sus respectivos parentales de origen mexicano con un alto rendimiento, el material vegetal que utiliza son dos
líneas DH que se obtuvieron a partir de los parentales Bacanora y Weebil los cuales tienen resultados superiores a la investigación
de García y otros, porque se enfocan en el alto peso del grano de trigo.

Las líneas doble haploides se han utilizado para seleccionar glutenina de mayor peso molecular, mejora la resistencia a la oxi-
dación, mejora la calidad de la harina. Para la obtención de doble haploide del trigo se tiene dos métodos el primero es el cultivo
de anteras y trigo x maíz 8

Plantas transgénicas de trigo fueron producidas por primera vez en 1992, por el bombardeo de tejidos de callos embriogénicos
con el plásmido pBARGUS, en el que la expresión del gen informador GUS es impulsada por el promotor Adh1 del maíz unido
al intrón 1 Adh 1, y la expresión del gen bar seleccionable que confiere resistencia al herbicida de amplio espectro Basta es
impulsada por el promotor CaMV35S unido al intrón 1 Adh1 del maíz. Se obtuvieron mejoras adicionales en la producción de
plantas de trigo transgénicas mediante el bombardeo directo de embriones inmaduros cultivados con el pAHC25 plásmido en el
que tanto GUS como bar son impulsados por el promotor de ubiquitina 1 de maíz más potente9

Las plantas transgénicas de trigo han sido producidas por la entrega directa de ADN en regenerables tejidos y embriones inma-
duros por partículas de alta velocidad de bombardeo10. Hay diversas técnicas para la obtención, también se ha realizado mediante
transferencia directa de ADN a protoplastos aislados y la captación de ADN por micro proyectiles, estos protoplastos solo se
pueden aislar de cultivos de suspensión y por el uso de polietilenglicol11

2. Materiales y Métodos

2.1. Resistencia a la roya de la hoja

La roya es una enfermedad fúngica que afecta a la producción de trigo, para controlar esta enfermedad se han identificado 60
resistencia de los genes Lr. Los genes de resistencia cualitativas se expresan en la plántula y en la etapa adulta se ven los genes
de resistencias cuantitativa 12.
Los genes que brindan resistencia a la hoja frente a la roya en el trigo suelen ser: Lr68, Lr34, Lr54 y Sr2.
El gen Lr34 se usa como componente de resistencia a roya, predominando en el estado de adultez de la planta. El gen Lr42 tiene
resistencia en ambas etapas, esta línea se a empleado como padre en el mejoramiento debido que es efectivo 13. El gen Lr48 en
plantas adultas es eficaz contra P. triticina, el Lr48 se encuentra en el brazo del cromosoma 2B con marcadores gwm 429b y
barc , se identificó líneas endogámicas recombinantes resistente CSP44 se desarrolló mediante marcadores para la selección
asistida14

El gen Lr34 se usa como componente de resistencia a roya, predominando en el estado de adultez de la planta. El gen Lr42 tiene
resistencia en ambas etapas, esta línea se a empleado como padre en el mejoramiento debido que es efectivo 13. El gen Lr48 en
plantas adultas es eficaz contra P. triticina, el Lr48 se encuentra en el brazo del cromosoma 2B con marcadores gwm 429b y
barc , se identificó líneas endogámicas recombinantes resistente CSP44 se desarrolló mediante marcadores para la selección
asistida 14

Los marcadores moleculares ligados a caracteres de interés permiten la identificación rápida, así como nos ayuda a acelerar el
proceso de obtención de cultivares. El marcador molecular csLv34 tiene dos variantes alélicas, es un marcador codominante y
por ello diferencia genotipos homocigotos de aquellos que son heterocigotos debido a la diferencia de alelos15.

2.1.1. Extracción de ADN

Se emplea el kit Qiagen para la extracción de ADN que se disuelve en 100 ul del tapón de elución, se determina la
pureza mediante el sistema Gen Qunta12. Utiliza para identificar el gen Lr42 otro método el cual consta en extraer el
ADN utilizando el método del bromuro de amonio ya que se encuentra en el cromosoma 1D. Los 27 cebadores SSR en
el cromosoma fueron seleccionados para evaluar el polimorfismo13.
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2.1.2. Detección de genes Lr por marcadores moleculares

Para la resistencia de la hoja a roya utilizó marcadores moleculares de diagnóstico ligados a dicha resistencia; este
marcador molecular no es especifico y adicional se puede usar un especifico. Para que se dé el mejoramiento del trigo,
una planta debe contener el marcador molecular de diagnóstico y el gen Lr34 16.
Se utilizó el marcador molecular csLV34 el cual tiene dos variantes alélicas que se basan en el tamaño de las bandas,
por lo tanto, la diferencia de tamaños de los alelos indicó los cultivares que poseen el gen Lr34, los mismos que son
más cortos de los que no lo poseen. El marcador csLV34 es codominante, diferencia genotipos homocigotos de aquellos
que son heterocigotos, presenta una ventaja frente a los dominantes debido a que una falla en una PCR se puede inter-
pretar como ausencia de un alelo especifico. Al finalizar el análisis se pudo obtener 3 tipos de grupos: genotipos hete-
rocigotos que contienen alelos csLV34a y csLV34b entonces son portadores del gen Lr34, genotipos homocigotos que
presentan un solo alelo csLV34a que no presentan el gen y genotipos en los cuales no se pudo llevar a cabo la amplifi-
cación17.
Los genes Lr34, Lr39, Lr19, Lr46 se va a emplear 30 ng de ADN, 0,25 M de cada primer, 0, 40 uM de 10 primer
especifico. Para la PCR contenía la tableta con los reactivos excepto los primers y el ADN, se completa el volumen a
25L. Las amplificaciones se realizaron en termociclador de gradiente 12. Para el gen Lr42 se empleó 12 ul de mezcla
PCR, 2,5 mM de MgCl2, 200uM desoxirribotrifosfato de nucleótido, 50 nM de cebador M1, ADN polimerasa 13. Este
método también lo empleo 18. Para la identificación del gen Lr48 se utilizaron los marcadores SSR con las condiciones
de Bansal derivados del cromosoma 2BS y RAPD según el método de Samsampour, se analizaron diferentes marca-
dores (gwm429, barc07, barc55, S336, S3 y wmc332)14.
Para el análisis del Lr10 se hizo mediante RFLP mediante el aislamiento del ADN, Southern blot y con siete enzimas
de restricción (Eco RI, Hin dIII,Xba I, Eco RV, Bgl II, Dra I, Bam HI). Nueve sondas de RFLP contienen genes clones
ómicos los cuales se analizaron con el cromosoma 1S para detectar el polimorfismo, se usó para localizar Lr10 y Lrk10,
se los amplifico por PCR 19.

2.2. Obtención de doblehaploide

2.2.1. Cultivo de anteras:

Se utilizan anteras de trigo para el desarrollo de plantas haploides. Estas plantas haploides seguido a la mitad de los
cromosomas o la métricos son muy útiles en estudios genéticos y moleculares. La colchicina se usa para duplicar el número
de cromosomas con el fin de producir plantas doble haploides homocigotos 8.
Para el cultivo de anteras en trigo se utiliza los picos de F1, que se deben seleccionar antes del inicio de la antesis se los
debe almacenar la temperatura fría y en condiciones de oscuridad para inhibir la antesis. la esterilización de las espigas de
trigo se debe de hacer en una solución de hipoclorito de sodio al 2% por 20 minutos, se adiciona el Tween 20 y se enjuaga
con agua esterilizada en autoclave 2-3 veces después de la esterilización las anteras se aíslan de los picos bajo condiciones
asépticas. Las anteras se cultivan en tubo de ensayo con medio N-6 papa modificada con concentraciones variables de
2,4D, BAP, NAA para la inducción de callo, el cultivo se mantiene en oscuridad incubando por 15 días a 28-30°C. Los
callos embrionarios se llevan a cabo en el medio 190-2Cu modificado que contiene minerales se los deja por tres semanas,
cuando los brotes veres alcanzan una altura de 5-10mm se traslada al medio de enraizamiento en un medio semisólido a
25-27°C durante el periodo de regeneración y desarrollo de raíces. La planta se endurece y se lo cambia a una turba. El
tratamiento con colchicina se realiza sumergiendo las raíces cortadas de las plantas haploides se suministra colchicina al
0,1%, DMSO al 2%, Tween 20 al 0,05% a 20°C durante 5 horas, después da como resultado la producción de DH 20

2.2.2. Trigo x maíz

Es un mejor método porque es más eficiente, simple, ahorra tiempo y tiene una mayor regeneración de plantas. Cuando el
polen de maíz poliniza la flor de trigo, el trigo se fertiliza y el cigoto se forma. Inicialmente el cigoto es número haploide.
Donde las espigas F1 del trigo son emasculadas y polinizadas por polen de maíz, estos picos polinizados son colocados
en medios de cultivo de macolla, la mejor hormona para el desarrollo es 2,4D, estas espigas se sumergen en el medio de
cultivo a 20°C durante 14-16 días. El desarrollo del embrión se potencia pulverizando 2,4D y AgNO3 en trigo, el rescate
del embrión se realiza después de los 14 días después de la polinización. Cuando alcanzan una altura suficiente cogen
dureza, por lo que se realiza un tratamiento con colchicina, las raíces de las plantas haploides se cortan 1-1,5 pulgadas
sumergido al 0,1% de colchicina, DMSO al 2%, Tween 20 al 0,05% por 5 horas, se lo deja por cuatro semanas para poder
trasplantar 20

2.3. Plantas transgénicas

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Se hace una inducción de callo y presenta manchas verdes a partir de embriones inmaduros realizados en cultivares de
trigo blando. estos cultivares se cultivaron a 25 °C en medio LS

2.3.1. ADN plásmido

Se utilizaron los plásmidos pARK22, pBI221 y pActl-F. pARK22 contiene la barra genética marcadora seleccionable
(fosfinotricina acetil transferasa) siguiendo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). pBI221 con-
tiene el gen gusA que sigue al promotor CaMV 35S. pActl-F incluye la región codificante de gusA bajo el control de
la región 5' de 1,3 kb del gen 1 de la actina del arroz (Act I). Estos plásmidos se amplificaron en cultivos líquidos de E.
coli, se aislaron mediante lisis alcalina y se purificaron dos veces mediante centrifugación por densidad con bromuro
de etidio CsClI 21

2.3.1.1. Bombardeo de partículas

Los plásmidos de ADN se adsorbieron en partículas de oro (1,6 µm de diámetro). Utilizando el protocolo de Bio-Rad
que consta en el stock de partículas de oro se prepara con 60 mg de partículas de oro (aprox. 1 μm de diámetro) en1 ml
de etanol al 100 % durante 2 min en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, con vórtice. Centrifugar durante 1 min. Descartar el
sobrenadante y resuspender en 1 mLagua destilada estéril por vortex. Lavar dos veces más, y finalmente resuspender
en 1 ml de agua estéril. Alícuota de 25 μL o 50 μL en tubos Eppendorf de 0,5 mL, con vórtice entre alícuotas para
asegurar una mezcla adecuada. Conservar a –20°C. CaCl (2,5 M , esterilizado por filtración) en alícuotas de 1 ml, al-
macenado a –20 °C. Base libre de espermidina (0,1 M , esterilizada por filtración) en alícuotas de 1 ml, almacenada a –
20 °C. Etanol (100%)22 y se administraron a los embriones diana. Dos días después del bombardeo, los embriones
inmaduros se transfirieron a medio de selección LS con 2 mg L-1 de 2,4-D y 5 mg L-I de bialafos. Aproximadamente
1 mes más tarde, el tejido resistente al bialafos se transfirió a medio LS libre de 2,4-D que contenía solo 5 mg L-I de
bialafos para la regeneración de plantas. Después del bombardeo, los embriones inmaduros se incubaron a 26 °C durante
2 días antes de analizar GUS. La actividad GUS se evaluó histoquímicamente y se contó el número promedio de man-
chas azules/embrión en dos experimentos separados. En cada experimento se utilizaron más de 20 embriones inmaduros
por tratamiento21.

En otro estudio las plantas donantes para transformación de embriones y plantas transgénicas se cultivaron en un inver-
nadero bajo control condiciones de troleo con 16 h de día a 18 °C y 8 h de noche a 15 °C. Las semillas inmaduras se
cosecharon 12–14 días post antesis, seguido de esterilización durante 15 min en una solución de hipoclorito de sodio
(20 %) que contiene 1 gota por 200 ml de tween 20. Los embriones inmaduros se aislaron microscópicamente en un
ambiente estéril y el embrión. Se eliminó el eje para evitar una germinación precoz. Ellos se transfirieron a medio de
plasmólisis y se transformaron por bombardeo de partículas utilizando un BioRad PDS 1000 He dispositivo con discos
de ruptura de 900 psi en una distancia objetivo de 7 cm. Microproyectiles de oro (1 mg) de 0,6 lm de diámetro se
sonicaron durante 1 min y se suspendieron en 10 ul de solución de ADN. 20 ul de espermidina 0,1 M y se mezclaron
50 ul de CaCl 2 2,5 M con partículas recubiertas con ADN y se incubó 15 min a temperatura ambiente con una agitación
baja y luego centrifugado durante 1 min. Flotante se eliminó y después de un lavado con etanol al 99,8 %, las balas de
oro se resuspendieron en 100 ul de etanol y 10 ul de suspensión que se utilizó para cada disparo23

3. Resultados

3.1. Resistencia a la roya de la hoja

La eficiencia de los genotipos de trigo que tienen los genes Lr de los cuales los que poseen el resultado deseado es el gen
Lr34, Lr39, Lr19, Lr4612. En la identificación de los genes Lr se detectaron 6 genes de plántulas (Lr9,10,19,24,26,47), dos
en plantas adultas (Lr34,37), donde determina que el Lr9 es útil para la resistencia 18. El gen Lr 42 indica que es susceptible
y que Lr42 en un fragmento de 177 pb en KS93U50 es recesivo 13. Los marcadores SNP para el gen Lr48 (IWB31002,
IWB39832, IWB34324, IWB72894) pueden ser empleados en la selección asistida por marcadores de Lr 4814. Mediante el
mapeo se usó las sondas RFLP ubicadas en el cromosoma 1S de las cuales solo un mostro polimorfismo (PSR549) del
fragmento Lrk10 se encontraron seis fragmentos dando así lugar a nuevos genes candidatos ya que en el gen Lr10 si se
encontró resistencia a la roya19

3.2. Obtención de doble haploide

El sistema trigo x maíz es preferible al cultivo de anteras o al cultivo de microsporas porque tiene menos variaciones game-
toclonales y menos especificidad de genotipos. La menor variación gametoclonal en el sistema de cruzamiento trigo x maíz
se debe a la aparición de menos regeneraciones espontáneas y presencia de menos anomalías cromosómicas en comparación
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con el cultivo de anteras. La mayor eficiencia de la regeneración de plantas verdes haploides en el sistema de cruce de trigo
x maíz que el cultivo de microsporas se debe a cuatro factores principales, que incluyen ausencia de albinismo, mayor tasa
de regeneración y mayor tasa de formación de embriones y en la obtención de plantas haploides de la misma edad en
comparación con el cultivo de anteras, ya que escapa al tiempo consumido en la inducción del callo durante el cultivo de
anteras. Tasas de desarrollo embrionario en algunos estudios son mejores en microspora-antera que el sistema de cruza-
miento trigo x maíz, pero la mayoría de estos embriones del cultivo de anteras no se regeneran o, incluso si se regeneran,
dan como resultado plantas albinas8

3.3. Plantas transgénicas

La mayoría de los callos derivan de tejidos escutelares en el lugar adecuado. Las etapas exhiben síntesis de clorofila locali-
zada con formación ocasional de muchos brotes verdes. Se analiza la inducción de callos y la formación de manchas verdes
a partir de embriones inmaduros para determinar los cultivares adecuados para la transformación de genes. Las etapas más
adecuadas se obtuvieron 13-14 días después de la antesis. Casi todos los embriones inmaduros en la etapa III produjeron
callos, pero las frecuencias de formación de manchas verdes variaron ampliamente con el cultivar. Los embriones inmaduros
mostraron la formación más eficiente de callos con manchas verdes que las de otros cultivares de trigo. Por lo tanto, se
esperaba que los embriones inmaduros de estos cultivares de trigo ser más adecuado para el bombardeo.
Los tejidos escutelares de embriones inmaduros de trigo cultivados durante 1 a 9 d fueron bombardeados con panículas
recubiertas con dos plásmidos, pBI221 o pActl-F, y pARK22. gen GUS expresión se observó 2 días después del bombardeo
usando un ensayo histoquímico

4. Discusión

En estudios anteriores se designa como un gen de resistencia de plantas adultas a Lr 34 que se detecta en etapa de creci-
miento de la plántula, también explica que el mecanismo que tiene la roya de la hoja es poco conocida, pero tiene una mejor
capacidad cuando se combinan genes, en este caso aplican el gen Lr 34 en plantas adultas y Lr26 en plantas jóvenes, se
afirma que en etapa de plántula tiene una mejor resistencia24

Para las líneas puras de doble haploides encontramos un estudio en el cual hace referencia al mejoramiento para aumentar el
rendimiento del trigo donde demostraron que las líneas doble haploides mostraron variabilidad de hileras en tiempo de flora-
ción y en la altura de la planta siendo este método de obtención de plantas doble haploide una de las practicas mas utilizadas
para mejorar las características del trigo25

Existen estudios que aplican otras técnicas de transgénesis directa entre las cuales lo hacen por microinyección, ya que se
aprovecha la inmovilización de la planta. Se incrusta protoplastos en gelificación, esta técnica sobresale la agarosa ya que el
movimiento y el control de la aguja se ve obstaculizado por el mismo. Pero a la final la expresión del gen GUS se detecta en
la prueba de viabilidad26. Otros plantean que el trigo pierde la capacidad de germinar rápidamente por lo que las suspensiones
con Agrobacterium se pipetea directamente a la espiga del trigo, los granos que se obtienen se cultivan en placas con medio de
agar con kanamicina 2

5. Conclusión

Existen diferentes métodos para mejorar el cultivo de trigo, que se han realizado desde años atrás ya que este cultivo es de
gran interés a nivel mundial. Por lo que se implementan nuevas tecnologías para mejorar una de ellas es la utilización de los
marcadores moleculares que nos han ayudado a evaluar la resistencia a la roya identificando el gen de interés que es el Lr de
los cuales tiene varias variantes, pero con la implementación de esta técnica podemos ver cuál es la más efectiva. También
tenemos la obtención de líneas puras para el mejoramiento de trigo en la cual nos indican que el método más empleado es el
de trigo x maíz ya que éste reduce anomalías en los cultivos debido a que se emplea el desarrollo por anteras esta puede causar
lo que es plantas albinas y por último tenemos la planta transgénica de trigo la cual se puede obtener de distintas formas la
más común es la de plásmido con bombardeo de partículas utilizando embriones inmaduros.

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Bionatura 2022, 13, x FOR PEER REVIEW 6

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