Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Microbiología Industrial
Ingeniería Bioquímica
Seminario: Producción de Insulina

Integrantes Grupo
Arenas Pérez Edna Citlali
Gurrola Granados Mitzi Yareli 6IM2
Sánchez Juárez Luis Enrique
Profesora: Dra. Fortunata Santoyo

Fecha de entrega: 28 de mayo del 2019. Firma del profesor: ____________________

Introducción.

La diabetes mellitus es una de las enfermedades con mayor impacto en la sociedad. Esta
problemática provoca que las personas presenten niveles de glucosa elevada en la sangre, a esto se le
llama hiperglucemia, y otras alteraciones que cambian el metabolismo. Esta se caracteriza por tener
una insuficiente producción de insulina por células denominadas beta del páncreas.

En el caso de los individuos genéticamente predispuestos, la obesidad y el sedentarismo conducen a

la resistencia a la insulina, estado que precede a la diabetes y además suele acompañarse por otros
factores de riesgo cardiovasculares como la dislipidemia, la hipertensión y factores protrombóticos y
otras alteraciones como la debilidad, sueño, delgadez, obesidad, infarto, ceguera o insuficiencia renal.

La diabetes de tipo 1, a veces denominada diabetes con dependencia de insulina o diabetes juvenil
puede surgir a cualquier edad, pero ocurre con más frecuencia en niños, adolescentes y adultos
jóvenes. Con la diabetes de tipo 1, el páncreas de la persona no produce insulina o produce poca, por
lo que se requiere tratamiento con insulina toda la vida.

No se conocen todas las causas de la diabetes de tipo 1. En la mayoría de los casos, el sistema
inmunitario del cuerpo ataca y destruye la parte del páncreas que produce insulina. Debido a que la
diabetes de tipo 1 es una enfermedad autoinmune, es más probable que se presente en personas con
otros trastornos, como la enfermedad de Hashimoto o la enfermedad de Addison.

La diabetes de tipo 2, a veces denominada diabetes de adultos, generalmente se desarrolla en la

adultez, pero a veces puede presentarse en niños y adolescentes con sobrepeso. Con la diabetes de
tipo 2, el páncreas produce insulina, pero posiblemente no produzca suficiente, o el cuerpo no la
pueda utilizar eficazmente. No siempre es necesario tratarla con insulina, como ocurre con la diabetes

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de tipo 1. La diabetes de tipo 2 es más común que la de tipo 1, y con mayor frecuencia está vinculada
al sobrepeso u obesidad.

Los síntomas de la diabetes de tipo 1 pueden parecerse a los de otros trastornos o problemas médicos.
(Physicians, 2018)

Insulina

La insulina es una hormona producida por las células beta del páncreas, concretamente en los islotes
de Langerhansel. Su importancia radica en que es la única hormona hipoglucemiante y que
contribuye a regular los niveles de glucosa en sangre. Esta hormona es vital para el transporte y
almacenamiento de la glucosa en las células.

La insulina actúa como una llave para permitir que la glucosa acceda a las células. Si la glucosa no
puede entrar en las células, se acumula en la sangre. (Insulclock, 2018)

El páncreas produce de dos formas diferentes la insulina:

 Una lenta y continua que ayuda a que los niveles de glucosa se mantengan siempre estables
entre 70-100 mg/dl conocida como secreción basal.

 Otra rápida y en mayor cantidad secretada generalmente cuando la glucosa sanguínea se

encuentra en valores altos después de los alimentos, conocida como secreción pulsátil.

Síntesis de insulina.
Preproinsulina Proinsulina Insulina
Esta proteína, como todas las
proteínas, se sintetiza en los
ribosomas, el paso de ARN a
proteína genera una cadena de Cadena B
aminoácidos que llamamos
preproinsulina, puesto que
todavía tiene que ser procesada
para ser funcional (sintetizar las
proteínas no activas es un
mecanismo muy común, cuya
Péptido señal Cadena C
finalidad es poder almacenar una
Fig. 1. Síntesis de Insulina
gran cantidad de proteína para poder
activarla y liberarla rápidamente en el momento de recibir la señalización de que son necesarias). La
preproinsulina pasa al retículo endoplásmico liso (REL) donde es procesada, pierde un trozo de la
cadena de aminoácidos del extremo C Terminal, transformándose en proinsulina, que presenta 3
cadenas: B-C-A donde la cadena C une a las otras dos.

Es en este punto en el que se forman los puentes disulfuro S-S. Siguiendo el camino habitual de la
síntesis y procesado de proteínas la proinsulina pasa al Golgi donde irá adquiriendo una estructura
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más estable y al salir del Golgi se empaquetará en vesículas de secreción listas para salir de la célula,
aunque todavía en forma de proinsulina. Es en las primeras vesículas, las vesículas recubiertas de
clatrina que se desprenden del Golgi, donde comienza la escisión del péptido C. Estas vesículas
tienen en su membrana las bombas de protones que introducen H+ que produce una bajada del pH
dentro de la vesícula, esto estimula la activación de las peptidasas (enzimas) presentes en la vesícula,
y cuyo objetivo es escindir el péptido C transformando la proinsulina en insulina madura, lista para
actuar. Las vesículas van perdiendo su cubierta de clatrina hasta transformarse en vesículas no
recubiertas, que son las que presentan una mayor cantidad de insulina madura. Ésta se vierte al
torrente sanguíneo por exocitosis.

Regulación de la síntesis de insulina.

Su síntesis se ve activada por altas concentraciones de glucosa en sangre, detectada por las propias
células beta. La respuesta primera es la secreción rápida de insulina. Secundariamente se activa la
síntesis para generar nueva preproinsulina. Además, la arginina, algunos ácidos grasos, hormonas
gastrointestinales y el propio Sistema nervioso parasimpático pueden activar su síntesis o su
liberación.

Por otra parte, su síntesis se ve inhibida por catecolaminas (como la adrenalina), que son estimuladas
por el sistema nervioso simpático, el cual actúa en situaciones de estrés en las que hace falta tener
glucosa disponible (la glucosa es la molécula energética preferida por el organismo, siendo la de más
rápida degradación y muy accesible por el torrente sanguíneo). Es por eso por lo que en estas
situaciones en las que es importante tener glucosa en sangre no conviene tener insulina, que la
conduce a la formación de glucógeno y glucólisis. (Contreras, 2013)

Anatomía funcional del páncreas.

El páncreas es una glándula propia de los animales vertebrados que en la mayoría de ellos es
compacta o lobulada. La glándula está situada junto al intestino delgado y tiene uno o varios
conductos excretores que desembocan en el duodeno. Existen cúmulos de células, llamados islotes,
que se distinguen por el tipo de hormona que secretan. Las principales hormonas que producen los
islotes pancreáticos son insulina y glucagón. Estas hormonas son reguladoras del metabolismo, juntas
coordinan la índole del consumo de nutrientes procedentes de los alimentos, así como el flujo de
sustratos endógenos durante el ayuno mediante acciones sobre el hígado, tejido adiposo y masa
muscular.

Las células que producen la insulina y el glucagón están entremezcladas en pequeños islotes
distribuidos por todo el páncreas. Esta proximidad les permite ejercer una influencia mutua sobre sus
secreciones. Los islotes están formados por un 60% de células beta, productoras de insulina y un 25%
de células alfa, productoras de glucagón. El resto de las células de los islotes secretan diversos
péptidos con funciones gastrointestinales.

El metabolismo de la glucosa en las células beta estimula la secreción de insulina.

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El estimulador más importante de la liberación de la insulina es la glucosa. El mecanismo es el
siguiente:
1. Un transportador específico de glucosa (GLUT2), facilita su rápida difusión al interior de las
células beta y mantiene una concentración intracelular de glucosa idéntica a la del fluido
intersticial.
2. La enzima glucocinasa actúa como sensor de la glucosa, controlando su tasa de utilización.
3. Los productos del metabolismo de la glucosa, incluidos ATP, NADH y la forma reducida de
NADH (NADPH), aumentan y cierran un canal K+ sensible al ATP.
4. Esto desencadena la apertura de canales Ca++ regulados por voltaje. La elevación de Ca++
intracelular incrementa y desencadena la
exocitosis, proceso de expulsión de moléculas
del interior de la célula.
5. Además de provocar la liberación de insulina, la
glucosa estimula la síntesis de la hormona al
acelerar la tasa de transcripción del gen de la
insulina y la tasa de traducción de su ARN
mensajero maduro.
Receptor de insulina
El receptor está formado por dos unidades, cada
una de las cuales consta de una subunidad Alfa y
Beta unidas por un puente disulfuro. Las dos
subunidades alfa están en el exterior de la célula
y se unen para formar el sitio de unión de la
insulina. Cada subunidad Beta se encuentra en el
interior de la célula y posee un dominio de
proteína quinasa.
Activación del receptor
Fig. 2. Regulación de la secreción de insulina por
Cuando las dos subunidades beta se juntan,
la célula beta. los dominios quinasa catalizan la adición de
Las acciones biológicas de la insulina se inician
grupos fosforilo del ATP a los residuos de
al activar su receptor de membrana, el cual
tirosina del bucle de activación. La
desencadena múltiples vías de señalización que
fosforilación de los residuos de tirosina
median sus acciones biológicas.
induce un cambio conformacional. La
reestructuración del bucle convierte a la quinasa en una conformación activa, por lo tanto, la unión de
la insulina en el exterior de la célula origina la activación de una quinasa asociada a la membrana en
el interior celular.
Finalización de acción de la insulina.
Hay tres tipos de enzimas en la terminación de la vía de señalización:
Las fosfatasas de tirosina proteicas que eliminan grupos fosforilo de residuos de tirosina en el
receptor de insulina y las proteínas adaptadoras IRS, las fosfatasas lipídicas que hidrolizan PIP3 a

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PIP2 y las fosfatasas de serina proteicas que eliminan grupos fosforilo de proteínas quinasas
activadas. ( (Lubert Stryer, Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, 2016)
Importancia en México
La resistencia a la insulina es una de las principales características de las manifestaciones patológicas
asociadas con la diabetes mellitus tipo 2 (DM2), una de las primeras causas de muerte en México y
en todo el mundo. En años
recientes, se ha identificado que
condiciones como la
inflamación, el estrés del
retículo endoplásmico (ER) y la
disfunción mitocondrial
promueven la resistencia a la
insulina.
En general, se han identificado
varios mecanismos celulares
extrínsecos e intrínsecos que
presentan una relación de causa-
efecto entre el aumento de peso
y la resistencia periférica a la
insulina. Las vías celulares
intrínsecas incluyen la
disfunción mitocondrial, el
Fig. 3. Estadística de diabetes en México, Periódico Excélsior,
estrés oxidativo y el estrés del
ER, mientras que las alteraciones en los niveles de adipocinas y ácidos grasos y la aparición de
inflamación en el tejido metabólico son los mecanismos extrínsecos dominantes que modulan las
acciones periféricas de la insulina. (Citlaly Gutiérrez Rodelo, Adriana Roura Guiberna y Jesús
Alberto Olivares Reyes, 2017)
Los hallazgos más relevantes incluyen la identificación de una variante génica de riesgo metabólico,
exclusiva de los mexicanos, que altera la función del transportador de colesterol ABCA1, y provoca
una disminución en los niveles de colesterol “bueno”, o HDL, encargado de limpiar las arterias.
Este gen, cuya función es obtener colesterol de las células para formar HDL, presenta un cambio de
aminoácido (arginina por cisteína en la posición 230) que sólo se ha encontrado en poblaciones con
componente indígena o mestizo. (Samuel Canizales Quinteros, 2012)
De acuerdo con el informe bianual Health at a Glance 2017, la prevalencia de diabetes tipos 1 y 2 en
el país es una alerta de mortalidad, en comparación con Estonia, Irlanda, Luxemburgo, Suecia y el
Reino Unido, donde sólo 5% de la población adulta padece este mal. Los países que le siguen en
cuanto a altos índices de la enfermedad son: Turquía con 12.8%, Estados Unidos con 10.8%, Brasil
con 10.8% y Colombia con 10.4%.

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La única ventaja que tiene el país frente a otras naciones del mundo con respecto a la diabetes es con
el infantil tipo 1, que en México equivale al 0.4%, cuando el promedio de la organización es de 1.2%.
(Mejía, 2017).
Desde el año 2000, la diabetes mellitus en México es la primera causa de muerte entre las mujeres y
la segunda entre los hombres (Rojas Martínez, 2015) . En 2010, esta enfermedad causó cerca de 83
000 muertes en el país.
La diabetes mellitus aumenta el riesgo de cardiopatías y accidentes cerebrovasculares (como
embolia). Además, a largo plazo puede ocasionar:
A) Ceguera (debido a las lesiones en los vasos sanguíneos de los ojos).
B) Insuficiencia renal (por el daño al tejido de los riñones).
C) Impotencia sexual (por el daño al sistema nervioso).
D) Amputaciones (por las lesiones que ocasiona en los pies). (Instituto Nacional de Salud
Pública, 2016)
México dobla a los países de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos
(OCDE) en la prevalencia de diabetes, con 15.8% de su población entre los 20 y 79 años con esta
enfermedad, cuando el promedio entre los países miembros es de 7%.
 Existe un número muy limitado de productores de
insulina a escala global. México no tiene industrias Sanofi Aventis
13%
que produzcan insulina, solo se dedica a distribuir
la que compra a otros países.
De acuerdo con las estimaciones, el líder de
mercado danés NovoNordisk posee más del 50%
de la cuota de mercado mundial de insulina. Junto Eli25%
Lilly

con la francesa Sanofi-Aventis y la norteamericana

Eli Lilly, Novo Nordisk controla un 80% del NovoNo
mercado. rdisk
63%
Otros autores incluyen los proveedores de
segmento en los países emergentes, como el Fig. 4. Industrias líderes mundiales en producción
fabricante indio Biocon, el mayor productor de de insulina.
insulina de Asia. Wanbang Biopharma, por
ejemplo, es el principal fabricante de insulina del mercado doméstico chino, con casi la mitad del
mercado total asiático, (Homann, 2014)
Técnicas DNA recombinante.
La producción se realiza a través de un ADN recombinante, esto consiste en la creación de una
molécula de ADN artificial que al producir una modificación genética permite la adición de nuevos
rasgos a ese organismo, es decir, se produce una proteína recombinante que no estaba presente en ese
organismo. En la actualidad, a través de este método, se clonan ciertas proteínas humanas en
organismos adecuados para su fabricación comercial, entre ellos, la insulina.
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Al principio, se utilizaba la insulina porcina, pues la similitud entre esta y la humana era
prácticamente igual, sólo se diferencian en un aminoácido. Aunque problemas a largo plazo en
pacientes tratados que rechazaban con el tiempo el
tratamiento con este tipo de insulina hizo que se
recurriera a otros métodos para su obtención. Por tanto,
mediante ingeniería genética se modificaron bacterias
de E. coli con un plásmido que contenía el gen aislado
de la insulina humana. Cultivos de esta bacteria en
grandes cantidades producen insulina sintética
humana que no se diferencia en nada a la producida por
humanos y no produce rechazo a largo plazo. Además,
es más barata y fácil de obtener. (Prada, 2017)
Técnica general.
SeFig. 5. Vector
utilizan genético
enzimas insertado
especiales paraen
insertar genes humanos en el DNA de las bacterias. Los genes
plásmido bacteriano. humanos hacen que las bacterias elaboren un nuevo
material, que no eran capaces de producir anteriormente.
Con condiciones adecuadas, los microorganismos se multiplican en un corto periodo de tiempo, de
esta forma los genes que controlan la producción de insulina humana se pueden colocar en una célula
bacteriana, con el fin de que los microorganismos elaboren la insulina humana. Esta sustancia es
extraída del cultivo de bacterias y preparada para su uso.
Método recombinante para la producción de insulina.
Se clonan los genes beta-galactosidasa en el plásmido pbr322. La recombinación de los plásmidos
son amplificados en E. coli. Se lleva a cabo una transformación de la bacteria, en dos nucleótidos
diferentes, luego la reacción entre la proteína B-gal y el gen de la insulina con la metionina y
produciendo al final la insulina con menos aminoácidos que al inicio del proceso por el método de
recombinación (Ladisch y Kohlmann, 1992)
El mecanismo de la separación de la insulina es a través del sistema RP-HPLC (Reversed Phase High
Performance Liquid Chromatography), la cal es utilizada para separarla insulina de otras especies,
basada en una gran variedad de diferentes aminoácidos y gracias a la hidrofobicidad de la insulina
con otros componentes.
Plásmidos bacterianos.
En la naturaleza, las enzimas de restricción cortan en una secuencia de nucleótidos, llamadas “vista
de restricción”, la cual representa de 4.8 nucleótidos largos. La secuencia en la cadena de DNA que
se presenta en las bacterias se complementa con un grupo metílico en donde la adenina y la citosina
evitan que la enzima de restricción actúe de forma adecuada.
El DNA que en algún momento es externo es dividido en secciones a través de la enzima de
restricción.

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La enzima de restricción se usa para cortar el plásmido abierto, la misma enzima se utiliza para cortar
el gen deseado fuera del cromosoma. Esto hace dos cortes que emparejan y cuando se combina el gen
y el plásmido forman un enlace temporal, sellado por el DNA ligasa.
Los plásmidos que comienzan el procedimiento se llaman vectores reproductivos que es una
molécula que puede llevar el DNA externo a una célula y replegarla en esta misma. Este plásmido
también incluye un gen que le confiere resistencia a la ampicilina y un segundo gen denominado Lac
Z. El sitio de restricción en donde la enzima de restricción realiza un corte se localiza en el gen LacZ,
si el DNA externo se inserta en el gen lacZ donde la enzima de restricción realizó su corte, el gen
lacZ da como terminado su función.
En donde se inducen las bacterias que interactúan con los plásmidos, las bacterias cambian de color,
después de multiplican en un medio de ampicilina.
Tomará un color azulado cuando un grupo de bacterias tome un plásmido que tiene el gen intacto de
lacZ. Cuando no toman ningún plásmido, no tendrá capacidad de crecer en ampicilina. Aquellas
bacterias que tomaron el plásmido crecerán, y aquellas que tomaron el gen lacZ tendrán una
apariencia blanquecina.
Para realizar los marcadores de forma radiactiva o con un marcador fluorescente en el DNA
desnaturalizado de las bacterias se puede efectuar con variaciones de temperatura o con productos
químicos.
Cuando estas son marcadas la cadena complementaria del DNA de la bacteria se enlaza con el gen
de la insulina. De esta manera sabemos cuál es la bacteria que tiene el gen deseado de la insulina, en
donde esta misma puede colocarse como medio de cultivo para que pueda duplicar el gen de la
insulina. (Viridiana Rosabelhi Soto Pol, Javier Hernández Guzmán, Yazmín Morales Hernández,
Onésimo Dios de la Cruz , 2008)
Antecedentes
Hasta el año 1923 el único tratamiento que había para los diabéticos era controlar la dieta de forma
que los picos de glucosa en sangre fueran lo más suaves posibles, hasta que en 1921 los canadienses
F.G. Banting y C.H. Best consiguieron aislar insulina a partir de páncreas de animales.
Los ensayos clínicos se llevaron a cabo en 1922 y al año siguiente Eli Lilly lanzó al mercado la
primera insulina comercial con el nombre de “Iletin”
Europa, la fábrica alemana de colorante Hoechst fue la primera en producirla solo un año después
bajo la dirección de Oskar Minkowski, quien en 1889 había descubierto la relación entre el páncreas
y la diabetes. Pero la insulina de origen animal comenzó a tener problemas, su costo era muy elevado
y comenzó a provocar alergias en sus consumidores.
Las enzimas de restricción fueron descubiertas en 1968, las cuales son parte importantes durante el
proceso de producción de insulina. (Viridiana Rosabelhi Soto Pol, Javier Hernández Guzmán,
Yazmín Morales Hernández, Onésimo Dios de la Cruz , 2008)

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En 1973 Cohen y Boyer habían creado la primera bacteria transgénica que era capaz de expresar un
gen foráneo. Para eso hacía falta identificar el gen que codificaba la insulina en el genoma humano,
algo que consiguieron W. Gilbert y Lydia Villa-Komaroff en 1977. No obstante, todavía había que
solventar un inconveniente. La insulina se produce a partir de una única cadena que se corta en varios
sitios hasta quedar convertida en dos cadenas unidas por los enlaces disulfuro. Las bacterias o las
levaduras son capaces de sintetizar el precursor, pero no de procesarlo, por lo que el resultado era a
todas luces inútil.
Por suerte no siempre hay que hacer las cosas como la naturaleza. La solución elegida fue sintetizar
las dos cadenas por separado y unirlas por métodos químicos. Los primeros en conseguirlo en 1977
fueron Riggs, Itaura y Boyer.
En 1996 se produjo la Humalog, una versión de la insulina que, cambiando de posición dos
aminoácidos conseguía aumentar la velocidad del efecto. Por otra parte, alargando una de las cadenas
con dos aminoácidos y sustituyendo una glicina por una arginina se produjo la glargina,
comercializada bajo la marca Lantus. Esta versión tenía la particularidad de estabilizar la forma
hexamérica, por lo que era poco soluble, lo que provocaba que su efecto se alargara a lo largo del día
y no de forma inmediata. (Naukas, 2013)
La producción de proteína recombinante (PR) en bacterias es una tecnología que surgió hace cerca de
30 años y respondió a una necesidad de proveer proteína de uso terapéutico con un abasto asegurado
(que no dependiera de fuentes animales) y calidad constante. La primera PR aprobada para su uso en
humanos fue la insulina humana producida en Escherichia coli por la empresa Genentech.  Desde
entonces, la tecnología de producción de PR ha tenido un avance muy importante. (R, 2011)
Producción de insulina.
La bacteria E. coli sigue siendo una plataforma ampliamente usada para la producción de PR, ya que
presenta una serie de ventajas importantes:
1. Su genoma es conocido desde hace varios años, lo que amplía considerablemente las
posibilidades de su manipulación genética.
2. Existe una gran cantidad de conocimiento acumulado sobre su fisiología y metabolismo.
3. Se tienen varios vectores bien establecidos para la producción de PR.
4. Puede crecer rápido en medios muy simples, con altos niveles de producción de PR.
Actualmente, cerca del 30 % de las PR de uso terapéutico son producidas empleando E. coli.
La información genética de la proteína a producir usualmente se inserta en un vector (plásmido) de
expresión. El tamaño del plásmido es muy variable. En general, se prefieren plásmidos de alto
número de copias (por arriba de 500 copias por célula). El número de copias es, en principio, función
del origen de replicación del plásmido (aunque las condiciones ambientales del cultivo y el estado
fisiológico de la bacteria tienen una fuerte influencia sobre el número de copias. Generalmente se
asume que un alto número de copias del plásmido resulta en un alto número de copias del gen de
interés, y por lo tanto, la cantidad de PR producida será mayor cuanto mayor sea el número de copias.
Modificaciones al origen de replicación de pMBl (por ejemplo, la familia de plásmidos pUC) son
muy empleadas en la producción de PR. Sin embargo, el empleo de plásmidos con alto número de
copia también induce una alta carga metabólica para la célula (observada como una reducción en la
velocidad de crecimiento y en el rendimiento de biomasa en sustrato). También se ha observado que
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una alta concentración de ARN mensajero pude conducir a destrucción de los ribosomas y muerte
celular. Un número de copias menor al de los plásmidos pUC puede favorecer una mayor producción
de PR (Jones y col, 2000). En este punto, también influyen factores como la estabilidad del ARN
mensajero.
Existen varios promotores que han sido usados en experimentos de laboratorio, muchos de los cuales
son poco prácticos para la producción industrial de PR.
Un problema encontrado con varios de estos promotores es la expresión basal (expresión del gene
heterólogo en condiciones no inducidas). Idealmente el promotor a usar debería ser completamente
regulable, muy fuerte, con una expresión basal mínima, a la vez que permitiera diferentes grados de
inducción, preferentemente mediante un cambio en las condiciones de cultivo, para minimizar
efectos tóxicos y maximizar la formación de PR. Mientras que los promotores lac y trp se han usado
para experimentos de laboratorio durante mucho tiempo, son poco habituales a escala industrial. El
promotor lac requiere la adición de un inductor que no es metabolizado (IPTG) y que es altamente
tóxico. Esto representa una gran desventaja para procesos industriales, ya que se debe garantizar que
dicho inductor sea completamente eliminado del producto, y además no debe ser enviado a aguas
residuales municipales. En el caso del promotor trp (al igual que el promotor PhoA), la inducción
ocurre cuando se agota un nutriente (triptófano en el caso del primero, fosfatos en el segundo caso).
Esto dificulta el control de la fisiología bacteriana y determinar el momento preciso de la inducción.
También impone una restricción en la formulación de los medios de cultivo. En el caso de que se
aplique un inductor metabolizable, como la arabinosa, el cultivo está sujeto a adaptar su metabolismo
a dicha fuente de carbono, que puede no ser la óptima para la producción de una PR.
Normalmente el plásmido de expresión contiene un gene que proporciona resistencia a antibiótico.
Esto permite emplear una presión de selección para asegurar que se cultivan únicamente las células
que contienen plásmidos, ya que debido a efectos de segregación, el plásmido podría perderse y las
células libres de plásmido crecerían más rápido (al carecer de la carga metabólica impuesta por el
plásmido), desplazando a las células portadoras del mismo, con la consecuente pérdida de
productividad. Sin embargo, la expresión del gene de resistencia al antibiótico es probablemente el
origen principal de carga metabólica. Con la finalidad de reducir la carga metabólica, se han
desarrollado sistemas que permiten seleccionar durante el cultivo a las células portadoras de
información genética, contenida en el plásmido, que complemente alguna auxotrofía, por ejemplo, a
algún aminoácido. Dichas estrategias han mostrado ser muy eficientes, y también resultan en una
reducción de costos en los cultivos industriales.
Selección de la cepa de producción.
Un paso importante para alcanzar altas productividades consiste en la selección de la cepa de
producción adecuada. Para ello deben considerarse aspectos cinéticos, el genotipo y el fenotipo de las
cepas. En general se buscan cepas con baja tasa de mutación o de inserción de secuencias
provenientes del plásmido. Las cepas derivadas de E. coli K–12 y E. coli B son las más empleadas.
Los avances en el conocimiento de la fisiología de E. coli y en el desarrollo de herramientas
moleculares han permitido la obtención de cepas diseñadas específicamente para la producción de
proteína recombinante. En particular, la cepa BL21 es preferida en el ámbito industrial. Además de
carecer de las proteasas Lon y Omp–t (lo cual reduce considerablemente la degradación de la PR
dentro de la bacteria), produce bajas cantidades de acetato (un subproducto metabólico altamente
indeseable del que se hablará más adelante), lo que resulta ampliamente atractivo. Otras cepas
derivadas de BL21 incluyen versiones carentes de la RNAsa E (BL21 Star–pLysS), versiones
diseñadas para incrementar la producción de PR que requieren el uso de codones raros en E.
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coli (cepa denominada Rosetta) y versiones que contienen copias extra de los genes argU,
ileY y leuW que codifican para ARN's de transferencia y que reconocen codones poco usuales en E.
coli (cepa denominada BL21–CodonPlus). La cepa AD494 es una mutante de K–12 en la tioredoxina
reductasa (trxB) que permite la formación de enlaces disulfuro en citoplasma, que usualmente son
reducidos en E. coli, lo que es un cuello de botella para el plegamiento de las PR. La
cepa Origami (también derivada de K–12) contiene además una mutación en la glutationa reductasa
(gor), para facilitar más la formación de enlaces disulfuro.
Todas las cepas modificadas que se han mencionado están disponibles comercialmente. La elección
de una cepa en particular dependerá de varios factores, incluyendo el tamaño de la PR a producir, la
presencia de enlaces (o puentes) disulfuro, la posibilidad de optimizar el uso de codones, entre otros.
Es importante señalar que en los últimos años ha existido una intensa investigación para mejorar las
capacidades de producción de PR en cepas de E. coli mediante ingeniería metabólica. Ese punto será
tratado más adelante.
Las bacterias Gram–positivas como Bacillus subtilis y Bacillus megaterium también se han usado
para la producción de PR. De hecho, B. subtilis es muy importante en la producción industrial de
proteasas y de algunas vitaminas. Al carecer de membrana externa, estas bacterias pueden secretar
una gran cantidad de proteínas plegadas al medio extracelular y contienen una baja cantidad de
pirógenos (Fu y col., 2007). Sin embargo, los plásmidos recombinantes son poco estables en B.
subtilis, y los rendimientos de PR son menores que en bacterias Gram–negativas, principalmente
debido a la alta actividad de proteasas, cuya producción aumenta cuando B. subtilis encuentra
condiciones de estrés, que también pueden conducir su esporulación. A pesar de las ventajas que
dichas bacterias pueden tener en la producción de PR, es poco probable que en el corto plazo sean
relevantes para el mercado farmacéutico. Por el contrario, su importancia en la industria de enzimas y
química fina probablemente crezca.
Cultivo bacteriano.
Para maximizar la productividad de PR, se prefiere alcanzar altas densidades celulares en el
biorreactor. En un biorreactor de escala de laboratorio, se pueden alcanzar rutinariamente densidades
mayores a los 100 g/L de biomasa empleando las condiciones de cultivo adecuadas. Existen, sin
embargo, limitaciones en la escala industrial que hacen que valores tan altos de biomasa no sean
alcanzables. Se ha acumulado una considerable experiencia en el cultivo de E. coli, lo que ha
permitido mejorar notoriamente las productividades de los cultivos.
A pesar de los considerables avances, hay todavía muchas dificultades técnicas que superar.
Enseguida se detallan algunos de los aspectos más importantes para el diseño y operación de cultivos
de alta densidad celular de E. coli.
a. Medio de cultivo.
El medio de cultivo debe estar balanceado para la producción de biomasa y PR. Para ello, debe
tomarse en cuenta la composición de la biomasa. Los principales componentes incluyen la fuente de
carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, y magnesio. Es necesario también incluir cofactores
enzimáticos como Mb, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entre otros. Los factores de crecimiento como la
tiamina son necesarios para un adecuado crecimiento. Aunque en cultivos en matraz agitado se
agregan mono y di fosfato de potasio para formar un amortiguador de pH, esto no es necesario en
cultivos en biorreactor, en los que el pH es controlado mediante la adición de ácido o base. También
debe observarse que varios de los componentes del medio pueden resultar tóxicos a ciertas
concentraciones; por ejemplo, el amonio es tóxico a partir de 3 g/L. Esta cantidad de amonio puede
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ser limitante para cultivos de alta densidad celular si se agrega en su totalidad al inicio del cultivo.
Sin embargo, el pH puede controlarse con hidróxido de amonio, que además de servir como base es
una fuente de amonio fácilmente asimilable, reduciendo con ello la acumulación de iones amonio. El
medio de cultivo puede contener fuentes complejas de nitrógeno, como extracto de levadura o
aminoácidos. No obstante, existe una clara tendencia a eliminar el uso de componentes complejos, ya
que no permiten un control adecuado de la fisiología, y reducen la reproducibilidad del cultivo.
b. Transferencia de oxígeno al biorreactor
Los cultivos de E. coli para la producción de PR son llevados a cabo bajo condiciones aerobias. De
esta manera se obtienen mayores rendimientos de biomasa y producto, debido a que la generación de
energía es mayor que bajo condiciones anaerobias. Además, bajo condiciones anaerobias la glucosa o
fuente de carbono es oxidada sólo parcialmente por E. coli, lo que conlleva a la acumulación de
subproductos de fermentación ácido–mixta, que resultan tóxicos. La demanda de oxígeno para la
oxidación completa de glucosa a CO2 es una función directa de la velocidad de crecimiento de la
bacteria conocida como velocidad específica de consumo de oxígeno.
Para evitar que la bacteria esté limitada por oxígeno, se requiere suministrar oxígeno al biorreactor a
una velocidad que sea al menos igual que la velocidad de consumo. La velocidad de transferencia de
oxígeno (VTO) al biorreactor es una función de muchas variables de operación del biorreactor, como
la velocidad de agitación, potencia volumétrica suministrada, constante de transferencia de masa
(kLa), temperatura, presión, composición del gas de entrada al biorreactor, entre otros.
Los parámetros operacionales como la velocidad de agitación no se pueden incrementar más allá de
un límite económicamente permisible, por lo que la VTO en biorreactores normalmente no excede
los 0.15 mmolCh/g h. Esta VTO permitiría mantener condiciones aerobias a un cultivo de E. coli de
no más de 40 g/L, creciendo a una velocidad de 0.4 h–1. Evidentemente, la VTO de los biorreactores
convencionales no permitiría el desarrollo de altas densidades celulares en cultivos de E. coli.  Para
mantener condiciones aerobias en un biorreactor se puede recurrir a otras estrategias. Por ejemplo,
emplear aire enriquecido con oxígeno u oxígeno puro para aumentar la solubilidad del oxígeno y con
ello la VTO. También se puede manipular parámetros operacionales del biorreactor para incrementar
la solubilidad del oxígeno. Por ejemplo, se ha reportado una VTO de casi 1 mol O2/L h en un
biorreactor operado a una presión de 10 bar. Se ha demostrado que el uso de presiones elevadas en
los biorreactores no afecta la fisiología ni la productividad de cultivos de E. coli recombinante
(Lara y col, en prensa). La VTO máxima del biorreactor puede llegar a ser el parámetro que
determine la biomasa alcanzable. También puede manipularse la fisiología del cultivo para reducir la
VTO, como se explica más adelante.
c. Modo de operación y sobre flujo metabólico.
Como se mencionó anteriormente, la producción de acetato bajo condiciones aerobias es un problema
constante en los cultivos de E. coli.  La producción de acetato es indeseable ya que representa un
derroche de esqueletos carbonados, afecta el pH y el gradiente de protones transmembranal, entre
otros efectos.
La producción de acetato bajo condiciones aerobias se atribuye a un desbalance entre los flujos de
carbono proveniente de glucosa (la cual es transportada a través del sistema de fosfotransferasa, PTS)
en la glicólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, lo que conduce a una acumulación de acetil
coenzima A, la cual se transforma a acetato que se transporta hacia afuera de la célula.
Este fenómeno de producción de acetato es conocido como sobre flujo metabólico. Una manera de
evitar el sobre flujo metabólico es restringir la velocidad de consumo de glucosa mediante la adición
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controlada de una solución concentrada al biorreactor. Esto puede hacerse mediante esquemas de
alimentación constante, alimentación con incremento lineal, con incremento exponencial, o
empleando algoritmos de control más sofisticados para controlar el consumo mediante efectos
indirectos del metabolismo, como la variación de la tensión de oxígeno disuelto (TOD) o el pH.
Un enfoque diferente ha permitido eliminar el acetato producido por E. coli mediante el uso de
membranas semi–permeables (enfoque denominado como biorreactor con diálisis). Con ésta técnica
se ha logrado la producción de más de 190 g/L de biomasa. Este enfoque, sin embargo, no impide el
desperdicio de carbono ni contempla el control de la fisiología en el biorreactor.
El método de cultivo más empleado para alcanzar densidades celulares altas y evitar la producción de
acetato es el cultivo alimentado exponencialmente. En este cultivo se utiliza una fase lote corta, para
acumular biomasa a una velocidad de crecimiento máxima. Una vez agotada la fuente de carbono del
lote (usualmente menos de 15 g/L de glucosa o glicerol), se inicia la alimentación de una solución
concentrada de glucosa (de hasta 700 g/L). La velocidad de adición de glucosa se incrementa
exponencialmente para mantener una velocidad de crecimiento constante (y con ello condiciones
fisiológicas bien definidas). Para evitar el sobre flujo metabólico, debe mantenerse una tasa de
consumo de glucosa menor al valor umbral que dispara el sobre flujo metabólico. Este valor
dependerá de la cepa, el medio de cultivo y la temperatura del mismo, pero es común que
corresponda a valores de velocidad específica de crecimiento menores a 0.15 h–1.
Al reducir la tasa de consumo de sustrato se reducirá por consecuencia la demanda de oxígeno para
oxidarlo, lo que permite alcanzar densidades celulares mayores a las que se alcanzarían en un cultivo
por lote, pero sin limitación por oxígeno. Ya que la variable objetivo en este tipo de sistemas es la
velocidad de crecimiento (una variable macroscópica que se puede medir con mayor facilidad que la
velocidad específica de consumo glucosa), los cultivos por lote alimentado se operan utilizando una
bomba programable.
d. Heterogeneidades ambientales.
Otro problema común en los cultivos industriales es la existencia de gradientes espaciales en
parámetros relevantes como pH, TOD, concentración de sustrato, CO2 disuelto, entre otros. Esto se
debe principalmente a que el escalamiento ascendente de los biorreactores generalmente conduce a
un incremento en el tiempo de circulación (tc), definido como el tiempo que una partícula en el
biorreactor tarda en dar un recorrido al mismo y regresar al punto de partida.
En biorreactores industriales, las bacterias viajan cíclicamente entre regiones con alta y baja
concentración de sustrato. Como resultado, su metabolismo sufre desviaciones con exposiciones a
gradientes de sustrato de duración tan corta como 2 s. Otro parámetro importante que presenta
gradientes es la TOD, cuya importancia ya ha sido explicada. La exposición cíclica de E. coli a
gradientes de TOD desata procesos transcripcionales en tiempos tan cortos como 17 s. Esto
demuestra la importancia de las heterogeneidades en la producción de PR por E. coli, que debe ser
tomada en cuenta durante el escalamiento de los procesos productivos, para un diseño más informado
de las cepas y procesos.
Purificación de PR.
La purificación de las PR producidas por E. coli puede seguir varias vertientes dependiendo de la
localización de la PR, la cual también proporciona ciertas ventajas según cada caso.
Si la PR fue acumulada en el citoplasma, el primer paso es la ruptura celular, la cual se puede llevar a
cabo empleado medios mecánicos o químicos. La homogeneización a alta presión es una operación
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escalable para este fin. La acumulación de PR en el citoplasma con frecuencia lleva a la acumulación
de cuerpos de inclusión, lo cual depende de factores como la secuencia de la proteína, la fuerza del
promotor, la temperatura, velocidad de crecimiento, entre otros factores, pero hasta el momento no es
fácil predecir su formación. En ocasiones es deseable la formación de cuerpos de inclusión (incluso
se agregan proteínas de fusión para conducir a su formación), ya que protegen a la PR de la
proteólisis, y pueden ser separados por centrifugación continua. Sin embargo, los cuerpos de
inclusión pueden tener agregadas grandes cantidades de contaminantes como ADN, ARN y
chaperonas, haciendo que la proporción de PR en el cuerpo de inclusión llegue a ser tan baja como el
60 %. En la industria se han establecido protocolos de separación de estos contaminantes por
centrifugación. En el caso de productos solubles en el citoplasma, deben tomarse medidas para evitar
la proteólisis del producto, como reducir la temperatura o agregar agentes acomplejantes. Si las
proteínas son acumuladas en el espacio periplásmico, la aplicación de un choque osmótico permite la
extracción de la proteína a la vez que causa muy poco daño a las células.
La recuperación de la proteína puede llevarse a cabo empleando filtros de diversos tamaños y/o con
superficie cargada. La filtración también es escalable y está bien establecida en la escala industrial.
Los ácidos nucleicos pueden ser removidos mediante extracciones o bien agregando agentes
policatiónicos como la polietinilamina. La proteína puede ser capturada o precipitada selectivamente
empleando una variedad de materiales que han sido desarrollados para este propósito, como algunas
resinas de interacción hidrofóbica.
En el caso de obtener cuerpos de inclusión, la proteína debe replegarse. La eficiencia de este paso es
la influencia más fuerte para la productividad del proceso. La proteína obtenida de los pasos
anteriores tiene diferentes estados conformacionales. Para obtener la proteína correctamente plegada
y en su caso, los puentes disulfuro, el método más empleado es disolver el agregado con agentes
caotrópicos, detergentes, o alcalinizar. Manipulando correctamente el estado de oxidación–reducción
de la solución, es posible promover tanto el plegamiento correcto como la formación de los puentes
disulfuro.
La purificación final de la proteína puede hacerse mediante métodos cromatográficos como
intercambio amónico y catiónico, interacción hidrofóbica y cromatografía de fase reversa. Una
revisión completa de estos métodos está fuera del alcance de este trabajo. La PR purificada debe
además tener un contenido mínimo de proteína bacteriana, particularmente de endotoxinas. Es común
también la eliminación de uno o dos aminoácidos terminales (p. ej. Metionina) que no pertenecen a la
secuencia original de la proteína. La adición de polietilénglicol (PEGilacióri) a la proteína permite
reducir reacciones inmunogénicas adversas. (R, 2011)

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