Universidad de Guadalajara

CUCEI

Practica
Electroforésis vertical
Detección del polimorfismo HaeIII (PTC)
Nombre: Medina Cervantes Judith Equipo:2 Grupo:D03 Cal:

Objetivo: Detectar mediante electroforesis los genotipos de un polimorfismo de longitud de los

fragmentos de restricción (en inglés “RFLP”) asociado con la capacidad de detección del sabor de la
feniltiocarbamida (PTC).

Introducción.
La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN
pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida.
La electroforesis consiste en la separación de moléculas (ácidos nucleicos) a través de una matriz
tamponada (agarosa o acrilamida). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un
campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el
grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que
los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis

En el caso del ADN, generalmente se usan dos tipos de geles: de agarosa y acrilamida, y el grado de
concentración en el gel se seleccionará dependiendo del tamaño del fragmento de ADN por estudiar.

La agarosa se emplea para separar fragmentos de ADN con tamaños de 100 pares de bases hasta 20
kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares de bases. El voltaje aplicado
durante la electroforesis determina la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en

estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Los ácidos
nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes
fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis
comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante
inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es
ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es un reactivo altamente
tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el
laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold,
SYBR Green I, Vistra Green, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de
mutagénesis.

Los geles de poliacrilamida se forman por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis‐
acrilamida (N,N'‐metilén‐bis‐acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina
(TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al
monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar
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por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada
variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. Sin embargo una gran
desventaja es que la acrilamida es neurotóxica, por lo que al preparar geles es necesario usar guantes y
limpiar cualquier derrame. Una vez que polimeriza (es decir, ya en forma de gel) se pierde la toxicidad.
Para su visualización se tiñen con nitrato de plata
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Material
Preparar el baño o termoblock a 37º C
Preparar el gel de poliacrilamida o agarosa
 Buffer cargador
 Marcador de Peso molecular 100pb, 50pb o 25pb
 Gel de Poliacrilamida al 8% o de agarosa al 2%
 Buffer TBE 1X
 Para poliacrilamida utilizar la tinción con Nitrato de plata: Solución Fijadora, de tinción,
reveladora
 Para agarosa utilizar Syber green y observar en transiluminador
Por alumno
 Un contenedor o gradilla con hielo
 Un tubo eppendorf estéril de 1.5 ml con 5 µl de la mezcla de enzima Hae III (mantenerla en el
hielo)
 Micropipeta de 20 µl y puntas

Procedimiento:
Parte 1. Análisis de los productos digeridos mediante electroforesis
El gel y el montaje de la cámara de electroforesis serán realizados por personal de laboratorio.

a. Colocar el gel en la cámara de electroforesis.

b. Llenar los reservorios de la cámara con TBE 1X

1. Poner 2µl de buffer cargador en las muestras (en el caso de la electroforesis en agarosa se
utiliza un colorante como el Gel‐Green)
2. A partir del 2º pozo, cada alumno debe cargar los pozos del gel con 15µl (o lo que el
pozo permita)del producto digerido
3. El personal del laboratorio pondrá en el 1er pozo el marcador de peso molecular y en el
último una muestra de producto de PCR sin digerir.
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4. Deben anotar el orden en que se pusieron las muestras en el gel.

5. Poner la electroforesis a 120 – 130 volts durante 30 a 45 min.
6. Al finalizar el tiempo, apagar la fuente de poder, desconectar los cables y descargar el
buffer.
7. Para sacar el gel, remover los espaciadores y mediante una espátula empujar el vidrio
de arriba para quitarlo dejando el gel sobre el otro vidrio

Parte 2. Tinción del gel con nitrato de plata (si se realizó PAGE)
1. Sumergir el gel en solución reveladora durante 3 min
2. Retirar la solución fijadora y colocar solución de tinción durante 5 min
3. Retirar la solución de tinción y enjuagar con agua destilada durante 2 min
4. Retirar el agua y colocar la solución de revelado hasta que aparezcan las bandas
esperadas.
5. Detener la reacción con agua destilada.
6. Guardar el gel en una bolsa y dibujar los resultados o tomarle foto

Flujograma
Realiza un flujograma con los pasos anteriores

Poner 2µl de buffer cargador en
las muestras (en el caso de la
electroforesis en agarosa se
utiliza un colorante como el
Gel‐Green)
Al finalizar el tiempo, apagar la
fuente de poder, desconectar
los cables y descargar el buffer.
Para sacar el gel, remover los
espaciadores y mediante una
espátula empujar el vidrio de
arriba para quitarlo dejando el
gel sobre el otro vidrio
Detener la reacción con agua
destilada.
Guardar el gel en una bolsa y
dibujar los resultados o tomarle
foto
A partir del 2º pozo, cada
alumno debe cargar los pozos
del gel con 15µl (o lo que el
pozo permita)del producto
digerido
Poner la electroforesis a 120 –
130 volts durante 30 a 45 min.
Sumergir el gel en solución
reveladora durante 3 min
Retirar el agua y colocar la
solución de revelado hasta que
aparezcan las bandas
esperadas.
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El personal del laboratorio
pondrá en el 1er pozo el
marcador de peso molecular y
en el último una muestra de
producto de PCR sin digerir.
Deben anotar el orden en que
se pusieron las muestras en el
gel.
Retirar la solución fijadora y
colocar solución de tinción
durante 5 min
Retirar la solución de tinción y
enjuagar con agua destilada
durante 2 min
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Resultados:
1. Dibuje el gel y anote los resultados observados para todos los carriles

Resultados:
1. PCR-- se puso una PCR (sin digerir) usando un DNA control
2. No hay bandas (no aplicaron la muestra en el gel o no pusieron DNA cuando
prepararon la PCR)
3. Aparecen dos bandas por arriba de los 200pb (posiblemente un inespecífico), es
homocigoto de no corte
4. Aparecen muchas bandas pero estan un poco tenues. Parece que hay algunas
bandas por arriba de los 200, y parece que hay una banda "fantasma" por abajo,
podría ser heterocigoto pero es necesario repetir.
5. Igual que el carril 3, aunque en este caso si se ve gran cantidad de DNA, pero
también es neecesario repetid
es dificil distinguir porque la banda es muy gruesa, podría ser heterocigoto pero la
banda no corresponde bien a ninguno tamaño esperado, necesario repetir
6. No hay bandas (no aplicaron la muestra en el gel o no pusieron DNA cuando
prepararon la PCR)
7. Se ve DNA por arriba de los 200, y parece que hay una banda por abajo. Podría
considerarse que si hay digestión y el genotipo sería heterocigoto (corto una banda
y la otra no)
8. Se ve DNA por arriba de los 200, parece ser homocigoto de no corte
9. Aparecen dos bandas por arriba de los 200pb (posiblemente un inespecífico), es
homocigoto de no corte
10. Aparecen dos bandas por arriba de los 200pb (posiblemente un inespecífico), es
homocigoto de no corte
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11. No hay bandas (no aplicaron la muestra en el gel o no pusieron DNA cuando
prepararon la PCR)
12. No hay bandas (no aplicaron la muestra en el gel o no pusieron DNA cuando
prepararon la PCR)
13. No hay bandas a la altura esperada. Se ve un barrido en la parte superior que
parece ser contaminación del marcador que se puso en el
14. También podría ser DNA que no se amplificó
2. En la tabla anote cual fue el genotipo para cada una de las muestras que se analizó en esta
práctica. (Homocigoto, heterocigoto). Investigue también los fenotipos de todas las muestras

Recuerde: Cuando la enzima reconoce la secuencia y corta corresponde al alelo

(silvestre‐Taster, o polimórfico‐No taster)

Utilice T: Taster‐ Detecta el sabor

t: no taster‐ NO detecta el sabor

NA= No aplica

Muestra Genotipo Fenotipo

# (TT,Tt,tt) (Detector‐No detector)
2 NA NA
3 tt No detector
4 Tt Detector
5 tt No detector
6 NA NA
7 Tt Detector
8 tt No detector
9 tt No detector
10 tt No detector
11 NA NA
12 NA NA

3. Conteste y de un razonamiento sobre su respuesta ¿Los fenotipos se relacionaron con

los genotipos?
Es importante recordar que los fenotipos son igualmente, o incluso a veces
mayormente, influenciados por los factores ambientales que por los efectos
genéticos. Así que un fenotipo puede estar directamente relacionado con un
genotipo, pero no necesariamente. Por lo general no hay una correlación uno
a uno entre un genotipo y un fenotipo. Casi siempre hay factores ambientales,
como lo que uno come, si hace ejercicio, cuánto fuma, etc. Todas esas son
influencias ambientales que también afectan al fenotipo.
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Observaciones:

Conclusione
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