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Asignatura: Bioquímica de los Alimentos

Carrera: Ingeniería en Alimentos
Profesoras: Lucía De La Fuente Jiménez
Ayudantes : Betzabé Martínez y Patricia Calistro
PRÁCTICO : ESPECTROFOTOMETRÍA

1. Realización de un Espectro de Absorción o Espectrograma

Cuando la luz incide sobre una sustancia, una parte de la luz es absorbida selectivamente
por la sustancia de acuerdo a su estructura molecular. Todas las sustancias tienen sus propios
niveles de energía que es específica de sus constituyentes moleculares.
Un espectro de absorción se obtiene midiendo el grado de absorción o Absorbancia (A)
de una sustancia a diferentes longitudes de onda (λ) (diferentes bandas de luz monocromática);
el cual se grafica colocando en la ordenada los valores de Absorbancia (A) y en la abscisa la
longitud de onda (nm).
Determine el espectro de absorción de cada colorante, Anaranjado de Metilo y Azul de
Bromofenol, en el rango de luz visible, leyendo Absorbancia (A) en un espectrofotómetro, a
diferentes longitudes de onda según lo indica la siguiente tabla.

Espectro de Absorción: Azul de Bromofenol

Número Longitud de onda (nm) Absorbancia

1 410
2 430
3 450
4 470
5 490
6 510
7 530
8 550
9 570
10 590
11 610
12 630
13 650
14 670
15 690
16 710
Espectro de Absorción: Anaranjado de metilo
Número Longitud de onda (nm) Absorbancia
1 400
2 420
3 440
4 460
5 480
6 500
7 520
8 540
9 560
10 580
11 600
12 620
A partir de los resultados obtenidos en la tabla, realizar las siguientes actividades:

a) Graficar un espectrograma para cada colorante (en papel milimetrado)

b) Indicar la longitud de onda, donde se obtiene el mayor valor de Absorbancia para cada colorante.
c) Buscar información e indicar si lo obtenido en la práctica, corresponde a lo indicado en teoría (color complementario).

2. Curva de calibración
Es una curva donde se estudia la relación entre concentración y absorbancia de una sustancia. La absorbancia
es proporcionalmente lineal a la concentración, si se sigue la ley de Lambert-Beer.
La curva de calibración se determina a la longitud de onda donde se obtuvo la más alta sensibilidad, es decir,
aquella longitud de onda donde se obtuvo el valor mayor de Absorbancia después de haber efectuado el espectro de
absorción.

2.1 Curva de calibración y demostración de la Ley de Lambert-Beer.

A partir de la solución estándar de cada colorante de concentración conocida 10 mg/L, prepare diferentes
concentraciones diluidas de cada uno de los colorantes como lo indica la siguiente tabla:
Batería de tubos (Nº) 1º 2º 3º 4º 5º
Azul de bromofenol (mL) 1 2 3 4 5
Agua destilada (mL) 4 3 2 1 _
Batería de tubos (Nº) 1º 2º 3º 4º 5º
Anaranjado de metilo (mL) 1 2 3 4 5
Agua destilada (mL) 4 3 2 1 _

Nota: Para un mejor trabajo recuerde primero rotular el material a usar (tubos y pipetas)
Efectúe las lecturas de absorbancia según corresponda de cada batería de tubos a la longitud de onda de máxima
absorbancia del respectivo colorante; usando agua destilada como blanco para la calibración del espectrofotómetro
(el disolvente para disolver los colorantes es agua destilada).

Tubo Concentración en mg/L Absorbancia Concentración en mg/L Absorbancia

de azul de metileno de anaranjado de metilo
1
2
3
4
5
Con los datos de la tabla anterior, grafique la curva de calibración de cada colorante. Como lo indica el siguiente ejemplo.

2.2 Cuantificación de una Muestra Problema.

Se le proporcionará una muestra problema de un colorante a la cual debe determinarle la absorbancia a la

longitud de onda que le corresponda según el colorante.

Absorbancia Muestra problema Colorante = N° =

Cuantifique la concentración del colorante de la muestra problema según la Ley de Lambert- Beer,
mediante cálculos de Regresión Lineal ya sea en calculadora científica o en Excell y en papel milimetrado.

Ley de Lambert-Beer A=abc Donde A = Absorbancia

a = absortividad
b = diámetro del tubo
c = concentración
Ecuación de la recta y = A + Bx Donde y = Absorbancia
x = concentración
A= Intercepto con el eje y
B= Pendiente