1 CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA

Este tipo de cromatografía logra su objetivo gracias al desplazamiento de la fase móvil sobre o a través de una fase
estacionaria dispuesta en forma de una superficie plana homogénea y estable.
Esta superficie plana, puede ser simplemente un papel puro anhidro o sea celulosa que es un homopolisacárido de
moléculas de -glucosa de formula general (C6H10O5)n (CLS-en papel) o con un recubrimiento de una fina película
de un líquido (CLL-en papel); como también una capa fina de un material sólido, que repose sobre un soporte (CLS-
en capa fina) y sobre la cual puede también existir un recubrimiento de un líquido (CLL-en capa fina). Por lo
general la fase estacionaria (el sorbente) es más polar que la fase móvil, sin embargo, cuando la superficie plana se
acondiciona para que las polaridades de las fases se inviertan se tiene una cromatografía en fase invertida (R.P-
reversed phase).
Para ejecutar la cromatografía en superficie plana se requiere de una cámara o cubeta de cromatografía y en el caso
de que no se disponga de cubetas comerciales, se puede utilizar un frasco de cristal que posea una tapa hermética.
En el interior de la cubeta, se deposita el eluyente y luego el papel o la placa de capa fina, en las que previamente
son colocadas las muestra ya sea con un aplicador automático, con un capilar, un clip o simplemente un palillo de
dientes, teniendo cuidado de que no entre en contacto con el eluyente, para finalmente proceder con el desarrollar de
la cromatografía.
La información que a continuación se expone es de interés tanto para la cromatografía en papel como también de la
cromatografía en capa fina, dado que se abordará aspectos relacionados básicamente a los componentes que
participan dentro de los procesos cromatográficos, como son, la fase estacionaria o también en ocasiones conocida
como sorbente, el eluyente o conocido también como fase móvil y la muestra con sus componentes y sus
especificidades, que hay que considerar en el momento en que se les somete al proceso de separación.

1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA FASE ESTACIONARIA (SORBENTE)

Las características y los parámetros de la fase estacionaria o también conocido como sorbente, se resume en tres
consideraciones generales:
1). Composición química
Los diferentes sorbentes o fases estacionarias, se clasifican básicamente en dos grandes grupos:
- Fases polares (hidrófilas), también llamadas straight phases o fases normales.
- Fases apolares (lipófilas), también llamadas reversed phases o fases reversas (abreviación RP)
Sin embargo, existen también las fases medianamente polares, que son fases modificadas como por ejemplo las
fases nitriladas, dioladas o aminadas, cuyas propiedades se asemejan a las fases normal o reversa dependiente del
eluyente.
Las fases polares como la celulosa (papel), la silicagel y la alúmina (capa fina) generalmente se combinan con
eluyentes no polares o apolares, mientras que las fases reversas se combinan con eluyentes con alto contenido en
agua, o sea, polares.
Partiendo del gel de sílice (fase estacionaria polar) se obtiene las fases reversas apolares (RP) y se comercializan
sistemas con 2, 8 y 18 átomos de carbono en la cadena principal hidrófoba y se identifican como RP-2, RP-8 y RP-
18. A nivel comercial se venden también placas de poliamida y de silicato de magnesio (florisil- MgO.XSiO 2.H2O).
2). Características de grano y poro.
La eficacia de una separación de un adsorbente está determinada por su estructura geométrica; también forman parte
de ella el tamaño de la partícula y su distribución. La selectividad de un adsorbente depende, por el contrario de la
estructura química del material.
Se considera que mientras más pequeñas sean las partículas y más estrecha sea su distribución, mejor es la eficacia
de la separación.
El diámetro de las partículas debe ser uniforme y el de silicagel a nivel comercial oscila entre 5 a 40 µm, la
superficie de las partículas se expresa en m 2/g. A mayor superficie mayor es la interacción entre la fase estacionaria
y la muestra y el poder de adsorción es mayor, esto es la retención es más fuerte. El área de las partículas de
silicagel a nivel comercial está entre los 400 y 600 m2/g.
El volumen del poro de las partículas se expresa en mL/g y el valor típico es de 0,8 mL/g. Un valor también
relacionado con las partículas es el diámetro del poro que se expresa en nm y el valor típico es de 6 nm.
3). Parámetros de la capa fina.
El espesor de las capas para separaciones analíticas comunes esta entre 100 y 250 µm; sin embargo, para
separaciones preparativas se tienen capas de 0,5 a 2 mm.
También influyen en las propiedades de las capas, los aglomerantes empleados, que aumentan su estabilidad y
fijación. Un aglomerante bastante utilizado es el yeso, pero también existen a nivel comercial otros de tipo orgánico.
1.2. FASE MÓVIL
Además de la fase estacionaria es importante, la elección del eluyente o fase móvil, ya que incide significativamente
en la separación; dado que el eluyente disuelve del sorbente las sustancias a separar, haciéndolas avanzar; por ello
mientras mayor sea la afinidad de la sustancia hacia el eluyente, el poder de elución o desplazamiento de las
sustancias también será mayor.
En calidad de eluyente se puede utilizar un compuesto puro o una mezcla de compuestos para darle características
específicas a la fase móvil.
Para poder elegir el adecuado eluyente se ha considerado importante ordenar a los compuestos en orden a su poder
de elución creciente, a la que se le ha denominado serie eluotrópica, la misma que corresponde básicamente a un
ordenamiento de los eluyentes según su polaridad o constante dieléctrica.
Estrictamente hablando una serie eluotrópica es válida para un sorbente determinado; sin embargo, para el gel de
sílice y la alúmina se pueden utilizar como semejantes, mientras que para las capas de tipo RP, la aplicabilidad de la
serie eluotrópica con buena aproximación se puede aplicar a la inversa que para la sílica y la alúmina.
A continuación, se indica una tabla de una serie eluotrópica de compuestos que han sido establecida específicamente
para el gel de sílice; sin embargo, con una buena aproximación es posible también aplicar la misma para la alúmina.

Índice de Constante Punto de

Compuestos Fórmula polaridad dieléctrica CD ebullición
(según Sneyder) (20 -25 ºC) ( ºC)
n-heptano C7H16 0,01 1,9 98,4
n-hexano C6H14 0,01 1,9 68,9
ciclohexano C6H12 0,02 2,0 80,7
Benceno C6H6 0,32 2,3 80,1
Isooctano C8H18 0,4 1,9 99,2
Tetracloruro de carbono CCl4 1,7 2,2 76,5
Tolueno C6H5CH3 2,3 2,4 110,6
Cloroformo CHCl3 4,4 4,8 61,7
Dicloroetano ClCH2CH2Cl 3,7 10,6 83,4
Diclorometano CH2Cl2 3,4 9,1 40
1-butanol CH3(CH2)3OH 3,9 17,8 117,2
Tetrahidrofurano C4H8O 4,2 7,4 66,0
2-propanol CH3(CH)OHCH3 4,3 18,3 82,4
Acetato de etilo CH3COOC2H5 4,3 6,0 77,1
1,4-dioxano C4H8O2 4,8 2,2 101,0
Etanol C2H5OH 5,2 24,3 78,5
Acetona CH3COCH3 5,4 20,7 56,2
Acetonitrilo CH3CN 6,2 37,5 81,6
Metanol CH3OH 6,6 32,6 65,0
Agua H2O 9,0 80,2 100
Ácido acético CH3COOH >>1 --- 180

2 DETERMINACIÓN DE LAS CONDICIONES ADECUADAS PARA UNA SEPARACIÓN

En la práctica para establecer las mejores condiciones para una buena separación se puede recurrir a la experiencia
propia, ajena y a la información bibliográfica. Sin embargo, a continuación, se indican algunos criterios que pueden
ser útiles. Al considerar los componentes que participan en una separación, esto es la fase estacionaria, la fase móvil
y la muestra, se puede establecer un esquema como el que se indica a continuación.
De acuerdo con el esquema expuesto, cuando se dirige el vértice del triángulo hacia una propiedad dada de uno de
los tres componentes, las propiedades de los otros dos componentes quedan casi automáticamente determinadas.
Este procedimiento no obstante es una aproximación, y por lo tanto es una buena referencia; ya que en la práctica y
en la mayoría de los casos a esta información se debe añadir el buen criterio empírico del analista para resolver con
éxito el problema de condiciones óptimas para una determinada separación cromatográfica.
En la mayoría de las situaciones reales, el procedimiento del establecimiento de las condiciones es netamente
práctico, sin embargo, una verificación, ajustes o correcciones, sin lógica puede conducir a que prevalezca
solamente el empirismo y a hacer las cosas a ciegas sin ningún fundamento teórico - científico.
Una gran ayuda para seleccionar el eluyente más
propicio para una separación cromatográfica,
Hexano constituye la prueba a la mancha, que consiste en
aplicar varias veces y en distintos puntos la muestra
ya sea en un papel o en una capa fina y luego con
Tetracloruro ayuda de un capilar ir añadiendo el eluyente a la
de muestra y finalmente observar con cuál de ellos se ha
Poder de logrado una mejor separación tal como se presenta en
elución el esquema expuesto y en consecuencia ese sería el
Bencen creciente del eluyente que se debería utilizar luego ya en la
eluyente separación real.
Por ejemplo, en el caso del esquema propuesto, sería
Cloruro el benceno el eluyente más apropiado dado que
de objetivamente conduce a una buena separación de los
metileno componentes de la muestra. A la falta del benceno
como eluyente, se podría utilizar otro eluyente
Cloroformo semejante, para lo cual se mucha ayuda podría ser la
+ etanol tabla de la serie eluotrópica de los compuestos con
(1:1) sus diferentes características.

3 DESARROLLO DE LAS CROMATOGRAFÍAS EN SUPERFICIE PLANA

El desarrollo de la cromatografía en superficie plana, se lo puede realizar en forma ascendente como indica la figura
2.1 (a); descendente como indica la figura 2.1. (b), (en el caso de la capa fina, los desarrollos no se los ejecuta en
posición totalmente vertical); bidimensional, que más bien es una combinación de dos desarrollos ya sean
ascendentes, descendentes o combinados, con el propósito de alcanzar una mejor separación y finalmente la radial
como se indica en la figura 2.1. (c).

FIG. 2.1. TIPOS DE DESARROLLOS CROMATOGRÁFICOS SOBRE SUPERFICIES PLANAS

4 REVELADO E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS

Desarrollada la cromatografía, la identificación y ubicación de los componentes separados de la muestra, se lo puede
realizar por medio de los siguientes métodos:
Físicos: Directamente si los componentes de la muestra tienen coloración u observando el cromatograma bajo la
influencia de una radiación Visible, UV-lejana o UV- cercana.
Químicos: Aplicando a la cromatografía desarrollada, un reactivo químico revelador de los componentes separados
por diferentes medios ya sea por pulverizado o por baño (el baño no es aplicable para una capa fina).
Radioquímicos: Este método es aplicable para cuando se están utilizando elementos o sustancias radioisótopas e
inclusive marcadas y que pueden ser identificadas por un detector específico para este tipo de sustancias.
Bioautografía: Estableciendo la influencia que presentan los componentes separados de la muestra, en la cinética
del desarrollo de los microorganismos presentes en un caldo de cultivo.
Una vez revelada la cromatografía,
con fines cualitativos se puede
determinar los coeficientes o factores
de retardo (Rf) para cada componente
con respecto al desplazamiento de la
fase móvil, como se indica en la figura
2.2.(a) o los coeficientes de retardo
relativos (Rfr) con respecto al
desplazamiento de una sustancia
considerada como referencia, como se
indica en la figura 2.2. (b).
a
A).
B).
Rf =
Ecuación Fig. 2.2 a).
b
FIG. 2.2. DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE RETARDO En la ecuación de la Fig. 2.2 a). a -
indica el desplazamiento del
componente y b – el desplazamiento
de la fase móvil

a b
Rf = o Rf =
r x r x
Ecuación Fig. 2.2 b).
En la ecuación de la Fig. 2.2 b). a – indica el desplazamiento del componente, x – el desplazamiento del compuesto
tomado como referencia y b – el desplazamiento de la fase móvil.
Las valoraciones cuantitativas se pueden realizar directamente haciendo uso de un fotodensitómetro, instrumento
que mide la intensidad de coloración que manifiestan los componentes separados, la misma que responde en forma
directa, a la cantidad de sustancia presente de cada uno de ellos.
Al no disponer de este instrumento, se puede realizar una cromatografía preparativa como se indica en la figura 2.3.,
para luego acumular el componente de interés y someterlo a un análisis cuantitativo por el método más adecuado
que el caso amerite.