XI Congreso SECH. Albacete 2007.

Determinación alélica y establecimiento de grupos de incompatibilidad

polen-pistilo en ciruelo japonés mediante PCR.

ME. Guerra1,2, A.Wünsch1, M. López-Corrales2 y J. Rodrigo1

1
Unidad de Fruticultura, CITA-DGA, Apdo. 727, 50080 - Zaragoza.
2
Departamento de Hortofruticultura. Centro de Investigación 'Finca La Orden-
Valdesequera'. Apdo. 22, 06080 - Badajoz.

RESUMEN
Se han identificado los alelos de incompatibilidad polen-pistilo de 24
variedades de ciruelo japonés mediante PCR. Para ello se han combinado dos
pares de cebadores desarrollados a partir de zonas conservadas de la secuencia
que codifica las S-RNasas de cerezo y ciruelo. La combinación de estos cebadores
ha permitido determinar la composición alélica S, no descrita previamente, de 19
de las variedades estudiadas. Estos resultados han permitido agrupar las 24
variedades analizadas, en 10 grupos de incompatibilidad floral de ciruelo japonés.

Palabras Clave: Alelos S, PCR, Prunus salicina, relaciones de compatibilidad, S-

RNasas

INTRODUCCIÓN
La respuesta de incompatibilidad polen-pistilo en el género Prunus está
determinada por al menos dos genes localizados en el locus S, el cual controla la
especificidad alélica entre polen y el pistilo (McClure y Franklin-Tong, 2006). Durante
la reacción de incompatibilidad, el crecimiento del tubo polínico se ve interrumpido
antes de alcanzar el ovario cuando el grano de polen presenta la misma composición
alélica S que el estilo (de Nettancourt, 1977). Una de las metodologías utilizadas para
identificar los alelos S en cerezo (Tao et al. 1999) se basa en la amplificación mediante
PCR de las S-RNasas. Las S-RNasas de diferentes alelos S tienen intrones de diferentes
tamaños, lo que permite identificar fragmentos de PCR correspondientes a cada alelo S
mediante el uso de cebadores de las zonas conservadas de la secuencia. En ciruelo
japonés (Prunus salicina L.), la identificación de las S-RNasas estilares (Yamane et al.,
1999), ha permitido establecer una metodología similar a la desarrollada en cerezo (Tao
et al. 1999) para determinar la composición alélica S de las diferentes variedades de
ciruelo (Beppu et al., 2002, 2003).
El objetivo de este trabajo es determinar mediante PCR la composición alélica S
de 24 de las variedades de ciruelo japonés más cultivadas en los países productores de
Europa y América cuya composición alélica no ha sido descrita hasta el momento.

MATERIALES Y MÉTODOS
Se ha utilizado la técnica de PCR para identificar los alelos S de 24 variedades
de ciruelo japonés (Tabla 1). Para ello se han utilizado los cebadores Pru-C2 y Pru-T2
(Tao et al., 1999) y PCE-R (Yamane et al., 2001), siguiendo el protocolo descrito por
Beppu et al. (2002) con las siguientes modificaciones. El ADN genómico fue extraído a
partir de hojas utilizando el protocolo de Hormaza (2002) y diluido a una concentración
de 10µg/ml. La PCR fue realizada en un volumen total de 20 µl, constituida por 20 mM
de Tris HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 2 mM de Cl2Mg, 0,1 mM de cada dNTP, 0,2 µM de
cada cebador, 40 ng de ADN genómico y 0,45 unidades de ADN Taq polimerasa
(Invitrogen), siguiendo el programa: un ciclo inicial de 3 min a 94ºC, 35 ciclos de 1 min
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ISBN: 978-84-690-5619-6 109
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a 94ºC, 1 min a 56ºC y 3 min a 72ºC, y un ciclo final de 7 min a 72ºC. Los fragmentos
resultantes de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa
al 1,7 % en TBE, y fueron visualizados con luz ultravioleta después de la tinción con
bromuro de etidio. Para la estimación de los tamaños de los fragmentos se utilizó el
marcador de tamaño 1 Kb (Invitrogen). Los tamaños de los alelos se calcularon
utilizando el programa Quantity One 1-D Análisis Software 4.6.2 (BIO RAD).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se ha determinado mediante PCR la composición alélica S de 24
variedades de ciruelo japonés, lo que ha permitido establecer 10 Grupos de
Incompatibilidad polen-pistilo (Tabla 1).
Inicialmente, la amplificación mediante PCR de los alelos S de 5 variedades de
composición alélica S conocida [‘Red Beaut’ (SaSb), ‘Laroda’ (SbSc), ‘Frontier’ (SbSf),
‘Queen Ann’ (SbSh) y ‘Santa Rosa’ (ScSe) (Beppu et al., 2002, 2003)] permitió
establecer los tamaños de los fragmentos correspondientes a los alelos Sa, Sb (Yamane
et al.,1999), y Sc, Se, Sf, Sh (Beppu et al., 2002), que se corresponden con los tamaños
descritos previamente. Posteriormente, los alelos Sg y Sk fueron identificados en las
variedades ‘Golden Japan’ (SfSg), ‘Songold’ y ‘Golden Plum’ (ShSk), mediante
comparación con los tamaños descritos por Beppu et al. (2002, 2003) para estos dos
alelos en las variedades ‘Honey Rosa’ (SbSg), ‘Harypickstone’ (SbSk), ‘Simka’ (SeSk),
‘White plum’ (SfSg), ‘Bonnie’ (SgSh), ‘Starkgold’ (SgSk) y ‘Combination’ (SgSl). La
amplificación de los alelos fue satisfactoria para todos los alelos (Fig. 1), a excepción de
Sb y Se con los cebadores PruT2-PCER, en los cuales la intensidad fue menor (Fig 1).
El tamaño de amplificación obtenido para el alelo Sk, no descrito anteriormente, fue de
810 pb con los cebadores PruT2-PCER (Tabla 2). Tomando como referencia los
tamaños de los alelos S de estas variedades, a continuación se analizó el resto de
variedades incluidas en el estudio (Tabla 1).
La determinación molecular de la composición alélica de las variedades
estudiadas ha permitido identificar ocho alelos diferentes Sa, Sb, Sc, Se, Sf, Sg, Sh, Sk y
agrupar las variedades en 10 grupos de incompatibilidad (Tabla 2). Los resultados
obtenidos proporcionan información a considerar en la elección varietal para el
establecimiento de nuevas plantaciones y permiten detectar problemas de
incompatibilidad polen-pistilo en plantaciones ya establecidas.

Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología-
FEDER, (proyectos CICYT AGL2003-05318-C02-02 y GL2006-13529-C02-02/AGR)
y por el Gobierno de Aragón (Grupo consolidado de Aragón A-43). Agradecemos a J.L.
Espada (Centro de Técnicas Agrarias - DGA) su colaboración y el suministro de
material vegetal.

Referencias
Beppu, K.; Yamane, H.; Yaegaki, H.; Yamaguchi, M.; Kataoka, I.; Tao, R. 2002.
Diversity of S-RNase genes and S-haplotypes in Japanese plum (Prunus salicina
Lindl.). Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 77(6):658-664.
Beppu, K.; Takemoto, Y.;Yamane, H.; Yaegaki, H.; Yamaguchi, M.; Kataoka, I.; Tao,
R. 2003. Determination of S-haplotypes in Japanese plum (Prunus salicina Lindl.)
cultivars by PCR and cross-pollination tests. Journal of Horticultural Science and
Biotechnology, 78(3):315-318.
De Nettancourt, D. 1977. Incompatibility in Angiosperms. Springer-Verlag, New York.
Actas de Horticultura nº 48. Sociedad Española de Ciencias Hortícolas.
ISBN: 978-84-690-5619-6 110
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Hormaza J.I. 2002. Molecular characterization and similarity relationships among

apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theorical
and applied genetics, 104:321-328.
McClure B.A. y Franklin-Tong V. 2006. Review. Gametophytic self-incompatibility:
understanding the cellular mechanisms involved in “self” pollen tube inhibition.
Planta, 224:233-245.
Tao, R.; Yamane, H.; Sugiura, A.; Maruyama, H.; Sassa, H.; Mori, H. 1999. Molecular
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Yamane, H.; Tao, R.; Sugiura, A. 1999. Identification and cDNA cloning for S-RNases
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Biothechnology, 16:389-396.
Yamane, H; Tao, R.; Sugiura, A.;Hauck, N.R.;Iezzoni, A.F. 2001. Identification and
characaterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of
the American Society for Horticultural Science, 126:661-667.

Tabla 1. Grupos de incompatibilidad y alelos S de las variedades analizadas. En negrita

aparecen las variedades usadas como control.

Grupos de
incompatibilidad Alelos Variedad
I SaSb Red Beaut, 606
II SbSc Black Amber, Fortuna, Laroda, Black Beaut, TC Sun
III SbSf Frontier, Golden Globe
IV SbSh Eldorado, Friar, Nubiana, Queen Ann, Freedom
VI ScSe Casselman, Santa Rosa, Royal Garner
VII ScSh Angeleno, Queen Rosa
VIII SeSh Black Diamond, Laettitia
IX SfSg Golden Japan
X ShSk Songold, Golden Plum

Tabla 2. Tamaño de los fragmentos de PCR obtenidos para los diferentes alelos S con
los cebadores PruC2-PCER y PruT2-PCER en las variedades de ciruelo
japonés analizadas expresados en pb.

Alelos PruC2-PCER PruT2-PCER

Sa 470 940
Sb 1590 1990
Sc 1180 1600
Se 1450 1850
Sf 1110 1540
Sg 1230 n.a
Sh 520 970
Sk 370 810
n.a: no amplificación
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Fig. 1.- Amplificación mediante PCR de las variedades ‘Red Beaut’ (RB), ‘Laroda’ (L),
‘Frontier’ (F), ‘Queen Ann’ (QA), ‘Santa Rosa’ (SR), ‘Queen Rosa’ (QR),
‘Laettitia’ (LT), ‘Golden Japan’ (GJ), con los cebadores PruC2-PCER. 1Kb:
marcador de tamaño.

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